Name: Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Poznaj metodę endogennego znakowania białek w ludzkich komórkach iPSC przy użyciu CRISPR/Cas9 i elektroporacji. Technika umożliwia badanie dynamiki białek pod kontrolą endogennej regulacji genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Daphne Dambournet za wiele wnikliwych dyskusji i porad dotyczących edycji genów, Thao Do za ilustrację, Angelique Nelson za krytyczną lekturę manuskryptu i Andrew Tuckerowi za wygenerowanie linii komórkowej Laminy B1 oznaczonej mEGFP. Pragniemy podziękować zespołom ds. komórek macierzystych oraz edycji genów i rozwoju testów w Allen Institute for Cell Science za ich wkład w proces edycji genów i kontroli jakości. Linia WTC, której użyliśmy do stworzenia naszej linii komórkowej z edytowanymi genami, została dostarczona przez Laboratorium Bruce'a R. Conklina w Gladstone Institutes i UCSF. Dziękujemy założycielowi Allen Institute for Cell Science, Paulowi G. Allenowi, za jego wizję, zachętę i wsparcie.

<ol><li>Wood, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+across+species+using+ZFNs+and+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs.</a> Science. 333 (6040), 307(2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Dambournet, D., Hong, S. H., Grassart, A., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+endogenous+loci+for+live-cell+fluorescence+imaging+and+molecule+counting+using+ZFNs%2C+TALENs%2C+and+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Tagging endogenous loci for live-cell fluorescence imaging and molecule counting using ZFNs, TALENs, and Cas9.</a> Methods in Enzymology. , 139-160 (2014).</li>
<li>Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+endogenous+protein+tagging+for+RESOLFT+super-resolution+microscopy+of+living+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells.</a> Sci Rep. 5, 9592(2015).</li>
<li>Hendriks, W. T., Warren, C. R., Cowan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Approaches%2C+Pitfalls%2C+and+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells: Approaches, Pitfalls, and Solutions.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 53-65 (2016).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Doyon, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+fluorescently+labeled%2C+endogenous+RNA+Polymerase+II+in+living+cells+with+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of fluorescently labeled, endogenous RNA Polymerase II in living cells with CRISPR/Cas9-mediated gene editing.</a> Sci Rep. 6, 35949(2016).</li>
<li>White, C. W., Vanyai, H. K., See, H. B., Johnstone, E. K. M., Pfleger, K. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+nanoBRET+and+CRISPR%2FCas9+to+monitor+proximity+to+a+genome-edited+protein+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Using nanoBRET and CRISPR/Cas9 to monitor proximity to a genome-edited protein in real-time.</a> Sci Rep. 7 (1), 3187(2017).</li>
<li>Roberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gene+tagging+using+CRISPR%2FCas9+in+human+stem+cells+to+illuminate+cell+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization.</a> Mol Biol Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+isogenic+pluripotent+stem+cells+differing+exclusively+at+two+early+onset+Parkinson+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations.</a> Cell. 146 (2), 318-331 (2011).</li>
<li>Young, J. E., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+in+a+dish%3A+promises+and+challenges+of+human+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease in a dish: promises and challenges of human stem cell models.</a> Human Molecular Genetics. 21 (R1), R82-R89 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 931-939 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gene%2C+NCBI-+National+Center+for+Biotechnology+Information%22">Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information</a>. , U.S. National Library of Medicine. 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gene%2C+NCBI-+National+Center+for+Biotechnology+Information%22">Gene, NCBI- National Center for Biotechnology Information</a>. , UCSC Genome Browser. 
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Allen+Cell+Methods%3A+Single+cell+passaging+human+iPS+cells%22">Allen Cell Methods: Single cell passaging human iPS cells</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc">https://www.youtube.com/watch?v=wao2UcMFPMc</a> (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Allen+Cell+Explorer%22">Allen Cell Explorer</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.allencell.org/">http://www.allencell.org/</a> (2017).</li>
<li>Lingeman, E., Jeans, C., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Purified+CasRNPs+for+Efficacious+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of Purified CasRNPs for Efficacious Genome Editing.</a> Curr Protoc Mol Biol. 120, 31-31 (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Michael+Davidson+Fluorescent+Protein+Collection%22">Michael Davidson Fluorescent Protein Collection</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/davidson/</a> (2017).</li>
<li>Cox, D. B., Platt, R. J., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+genome+editing%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic genome editing: prospects and challenges.</a> Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).</li>
<li>Haas, S. A., Dettmer, V., Cathomen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+genome+editing+with+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Hamostaseologie%22%5BJournal%5D)">Therapeutic genome editing with engineered nucleases.</a> Hamostaseologie. 37 (1), 45-52 (2017).</li>
<li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3 (Bethesda). 3 (4), 657-664 (2013).</li>
<li>Orlando, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-finger+nuclease-driven+targeted+integration+into+mammalian+genomes+using+donors+with+limited+chromosomal+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), e152(2010).</li>
<li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. 121-122, 9-15 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22+CRISPOR+V4.3%22"> CRISPOR V4.3</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://crispor.tefor.net/">http://crispor.tefor.net/</a> (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+non-canonical+PAMs+for+CRISPR%2FCas9-mediated+DNA+cleavage+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells.</a> Sci Rep. 4, 5405(2014).</li>
<li>Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+linkers%3A+property%2C+design+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Fusion protein linkers: property, design and functionality.</a> Adv Drug Deliv Rev. 65 (10), 1357-1369 (2013).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li>
<li>Baker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Genetic+Mosaicism+in+Cultures+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Detecting Genetic Mosaicism in Cultures of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 7 (5), 998-1012 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj metoda generowania endogennie regulowanych fuzji białek fluorescencyjnych w hiPSC jest wszechstronnym i potężnym podejściem do generowania linii komórkowych z edytowanymi genami o zastosowaniach od obrazowania żywych komórek po różne badania funkcjonalne i modele "choroby w naczyniu" przy użyciu linii hiPSC pochodzących od pacjenta 13,14,15. Chociaż metoda ta została wykorzystana do wprowadzenia dużych znaczników FP do N- lub C-końca endogennych białek, może być potencjalnie wykorzystana do wprowadzenia innych znaczników lub małych zmian genetycznych w celu modelowania lub korygowania mutacji powodujących chorobę22,23. W przypadku mniejszych insertów rozmiar ramienia homologii może być zmniejszony, ale ogólne podejście do edycji przedstawione w tej metodzie może nadal mieć zastosowanie24,25. Chociaż zdecydowanie zaleca się stosowanie hiPSC ze względu na ich ogromną użyteczność, przy starannej optymalizacji, protokół ten może zostać dostosowany do edycji genomów innych linii komórkowych ssaków.
Podczas identyfikacji genu będącego przedmiotem zainteresowania do znakowania FP, oszacowania obfitości transkryptów (na podstawie danych z mikromacierzy lub RNA-Seq) są dobrym punktem wyjścia do oceny, czy gen lub izoforma będąca przedmiotem zainteresowania jest wyrażana, chociaż poziomy transkryptów nie zawsze korelują z poziomami białka. Opisana tutaj strategia wzbogacania FACS będzie działać najlepiej w przypadku genów, które są co najmniej umiarkowanie dobrze wyrażone w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Strategia ta okazała się również skuteczna w selekcji fuzji, które wykazują punktowe i/lub dyskretne wzorce lokalizacji, takie jak centryna, desmoplakina i paxillina, gdzie stosunek sygnału do tła jest bardzo niski12,19. Geny, które nie są wysoce eksprymowane lub ulegają ekspresji tylko w pochodnych typach komórek, mogą wymagać dodatkowych strategii selekcji.
Punktem wyjścia dla projektów plazmidów crRNA i matryc dawcy stosowanych w ludzkich liniach komórkowych powinien być ludzki genom referencyjny (GRCh38). Ponieważ genomy różnych linii komórkowych mogą różnić się w obrębie tego samego gatunku, a CRISPR/Cas9 jest specyficzny dla sekwencji, niezwykle pomocne jest zidentyfikowanie wariantów specyficznych dla linii komórkowej (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu lub insercje/delecje (indele), które różnią się od genomu referencyjnego i włączenie ich do projektu. Gwarantuje to, że crRNA będą kompatybilne z genomem gospodarza i że ramiona homologii plazmidu matrycy dawcy zachowają wszelkie warianty specyficzne dla linii komórkowej. Sugerowaną strategią jest włączenie wariantów homozygotycznych do crRNA i ramion homologii plazmidu matrycy dawcy podczas procesu projektowania. Włączenie wariantów heterozygotycznych jest opcjonalne. Konkretne odczynniki używane w dużych eksperymentach knock-in i inne kluczowe kwestie dotyczące tego protokołu omówiono poniżej.
Białko Cas9
Główną korzyścią ze stosowania białka Cas9 jest to, że wykazano, że wprowadzenie Cas9 i gRNA jako kompleksu RNP powoduje ograniczony czas trwania aktywności nukleazy w porównaniu z podejściami opartymi na plazmidach, w których ekspresja Cas9 i gRNA może trwać przez kilka dni i prowadzić do większej aktywności na miejscu i poza celem26,27. Dodatkową korzyścią płynącą ze stosowania białka Cas9 jest to, że jest ono łatwo dostępne do rozszczepienia po wejściu do komórek. Kontrastuje to z bardziej konwencjonalnymi metodami wykorzystania mRNA Cas9 lub plazmidu Cas9 / gRNA, które wymagają transkrypcji, translacji i przetwarzania białek26,28. Białko Cas9 S. pyogenes typu dzikiego jest obecnie dostępne z wielu źródeł komercyjnych.
Przewodnik RNA
Istnieje wiele publicznie dostępnych narzędzi do znajdowania celów crRNA w pobliżu pożądanego miejsca insercji FP, które mają zero lub niewiele przewidywanych celów poza celami w genomie gospodarza 29,30,31,32. Wydajność HDR i precyzja wyniku HDR różnią się znacznie między celami crRNA stosowanymi w danym locus12. Z tego powodu zaleca się testowanie kilku crRNA (2-4 i najlepiej w odległości 50 pz od pożądanego miejsca insercji) na locus, ponieważ może to zwiększyć prawdopodobieństwo udanego eksperymentu edycyjnego. Obecne możliwości dostarczania gRNA obejmują syntetyczne 2-częściowe crRNA i tracrRNA, syntetyczne pojedyncze gRNA (sgRNA), transkrybowane in vitro sgRNA lub dostarczanie plazmidu do komórek wyrażających sgRNA z promotora U6. Protokół ten nie został zoptymalizowany pod kątem wysokiej aktywności rozszczepienia. Niezmodyfikowane 2-częściowe crRNA i tracrRNA (patrz tabela materiałów) zostały użyte w celu wygenerowania monoallelicznych linii komórkowych znakowanych FP przy jednoczesnym powodowaniu najmniejszych potencjalnych zakłóceń w komórkach.
Plazmid szablonu dawcy
Ponieważ część sekwencji ramienia homologicznego dostarczonej w plazmidzie matrycy dawcy zostanie włączona do genomu gospodarza podczas zdarzenia HDR, należy wprowadzić mutacje punktowe w miejscach rozpoznawania crRNA, aby zapobiec dalszemu rozszczepianiu przez Cas9 po HDR. Często najprostszą destrukcyjną zmianą jest mutacja sekwencji PAM. Ponieważ niektóre niekanoniczne sekwencje PAM mogą być nadal rozpoznawane przez dziki typ S. pyogenes Cas9, najlepiej jest unikać używania NGG, NAG lub NGA33. Podczas mutacji ramienia homologicznego należy unikać mutacji niesynonimicznych i wprowadzania rzadkich kodonów. Jeśli synonimiczna zmiana sekwencji PAM nie jest możliwa, rozważ wykonanie trzech synonimicznych mutacji punktowych w regionie nasiennym (10 pz proksymalnie do PAM) miejsca wiązania crRNA. Należy zachować szczególną ostrożność przy wprowadzaniu tych zmian w regionie nieulegającym translacji 5ʹ (UTR), ponieważ regiony te mogą zawierać ważne sekwencje regulatorowe. Zapoznanie się z bazą danych o ochronie genetycznej, taką jak ścieżki genomiki porównawczej UCSC Genome Browser, może dostarczyć wskazówek w takich przypadkach, ponieważ zmiany w niekonserwatywnych zasadach mogą być lepiej tolerowane niż zmiany w wysoce konserwatywnych zasadach17. Czasami samo wprowadzenie sekwencji FP wystarczy, aby zakłócić miejsce wiązania crRNA (jak na rysunku 1); jednak nowo dołączoną sekwencję należy sprawdzić pod kątem trwałości wiązania crRNA i sekwencji PAM.
Łączniki aminokwasowe między FP a białkiem natywnym są zalecane w celu zachowania funkcji białka fuzyjnego34. Często łącznik aminokwasów może być wybrany ze względu na jego konkretny ładunek lub rozmiar. Jeśli fuzja cDNA o konstrukcji podobnej do docelowego endogennego białka fuzyjnego została dobrze zbadana, ta sama sekwencja łącznikowa może być wykorzystana w eksperymencie knock-in CRISPR/Cas9 12,19. Jeśli takie informacje nie są dostępne, z powodzeniem zastosowano również krótki linker, taki jak GTSGGS12. Inne badania wykazały sukces z generyczną małą sekwencją łącznika 3-aminokwasowego dla różnych celów35.
Transfekcja i wzbogacanie FACS
Wiele dostępnych na rynku odczynników do transfekcji jest opracowanych do dostarczania określonych typów cząsteczek do komórek, podczas gdy system elektroporacji może być używany do dostarczania odczynników o szerokim zakresie rozmiarów, ładunków i składu. Oprócz tego, że jest powszechną metodą transfekcji dla komórek trudnych do transfekcji, takich jak hiPSC, elektroporacja niesie ze sobą również korzyść w postaci dostarczania wszystkich trzech składników do knock-inu FP za pośrednictwem CRISPR/Cas9, jak opisano w tej metodzie. Stwierdzono, że elektroporacja daje najlepsze wyniki w porównaniu z innymi dostępnymi na rynku odczynnikami podczas opracowywania tej metody (dane nie pokazane), a także była stosowana przez innych do dostarczania RNP 26,28,36.
Podczas korzystania z tego protokołu do edycji hiPSC należy zwrócić szczególną uwagę na zapewnienie delikatnego obchodzenia się z komórkami przed i po procesie edycji genów w celu optymalnego przeżycia komórek i zminimalizowania spontanicznego różnicowania. W szczególności metody wzbogacania FACS powinny być dostosowane do sortowania komórek macierzystych przy użyciu możliwie największej dyszy (130 μm), niskiego natężenia przepływu (≤24 μl/min), płynu osłonkowego bez konserwantów (takiego jak sól fizjologiczna, patrz tabela materiałów) i niskiego ciśnienia próbki (10 psi). Zamiast sortowania pojedynczych komórek, które skutkuje nieoptymalną żywotnością komórek macierzystych, hiPSC wzbogacone w FACS są sortowane luzem i namnażane jako populacja w celu optymalizacji żywotności komórek i integralności komórek macierzystych. Jednak sortowanie pojedynczych komórek może być odpowiednie dla mniej wrażliwych typów komórek. Aby zapewnić przetrwanie komórek, komórki są zwracane do hodowli nie później niż godzinę po pobraniu w celu wzbogacenia FACS i utrzymywane w temperaturze pokojowej przez cały proces sortowania. W przypadku niektórych typów komórek przeżywalność komórek może być również zwiększona przez inkubację komórek w lodzie (4°C) przez cały proces sortowania.
Masowa ekspansja komórek FP-dodatnich daje możliwość oceny populacji poprzez analizę obrazową lokalizacji białka fuzyjnego przed wygenerowaniem linii klonalnych. Chociaż uzyskana w ten sposób wzbogacona populacja komórek może być wystarczająca dla niektórych badań, populacje te często wykazują sygnał FP o różnej intensywności. Izolowane linie klonalne mają jednolity sygnał (ryc. 3), co czyni je bardziej odpowiednimi do eksperymentów funkcjonalnych12.
Generowanie klonalnej linii komórkowej 
W całym procesie edycji i generowania linii klonalnych ważne jest monitorowanie morfologii komórki. Rodziny hiPSC hodowane w warunkach bezkarmowych powinny charakteryzować się gładkimi krawędziami i równym, dobrze upakowanym środkiem 12,18,19. Zróżnicowane komórki należy obserwować w mniej niż 5% hodowli. Wybierając poszczególne kolonie, wybieraj te, które wykazują dobrą morfologię. Podczas pasażowania płytki 96-dołkowej należy sprawdzić klony pod kątem morfologii i przerwać te, które przerosły, ponieważ może to prowadzić do różnicowania lub wskazywać na niestabilność genetyczną.
Generowanie klonalnych linii komórkowych pozwala na genetyczne potwierdzenie precyzyjnej edycji, co jest ważne, ponieważ wywołane przez Cas9 podwójne pęknięcia nici w genomie są często naprawiane nieprecyzyjnie, pomimo włączenia znacznika do pożądanego locus. Wcześniej opisane testy oparte na PCR wykazały, że łącznie w dziesięciu unikalnych loci genomowych wiele (45%) klonów wykazujących ekspresję FP cierpiało na integrację szkieletu plazmidu dawcy w docelowym locus lub (rzadko) losowo w genomie12. Ponadto stwierdzono, że 23% klonów GFP-dodatnich (n = 177) w dziesięciu unikalnych loci zawiera mutacje w przewidywanym miejscu cięcia crRNA w nieoznakowanym allelu lub w jego pobliżu, najprawdopodobniej z powodu NHEJ12. Ta analiza genetyczna wielu linii klonalnych (~100 klonów / edycję) podkreśliła znaczenie walidacji genetycznej, która nie jest możliwa w populacji komórek, ponieważ sama ekspresja FP i oczekiwana lokalizacja białka fuzyjnego nie gwarantują precyzyjnej edycji12. Ponadto te testy oparte na PCR nie mogą być przeprowadzone na wzbogaconej populacji komórek z całą pewnością, co uzasadnia potrzebę generowania linii klonalnej przed zakończeniem miarodajnej analizy. Genetyczne potwierdzenie wstawionego znacznika FP i weryfikacja integralności genetycznej nieedytowanego allelu (w monoallelicznym edytowanym klonie) są niezbędne, aby zapewnić precyzyjną edycję w docelowym locus poza ekspresją znacznika.
Do tej pory przy użyciu tej metody zaobserwowano niski wskaźnik edycji biallelicznej i brak mutacji poza celem (zgodnie z testem Sangera i sekwencjonowaniem egzomu) (dane niepublikowane)12. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami opisującymi zastosowanie krótkotrwałego RNP w eksperymentach CRISPR/Cas926,27. Brak klonalnych linii komórkowych z edycjami bi-allelicznymi może być również specyficzny dla locus lub wynikać z niezdolności komórki do tolerowania dwóch oznakowanych kopii niezbędnego białka, jak sugerowano z wcześniej opublikowanych eksperymentów, w których zaobserwowano przypuszczalne komórki edytowane bi-allelic dla jednego locus (LMNB1), ale nie dla innego (TUBA1B)12. Bi-alleliczne, w pełni zwalidowane klonalne linie komórkowe zostały wygenerowane przy użyciu tej metody w celu znakowania ST6 beta-galaktozydu alfa-2, 6-sjalilotransferazy 1 (ST6GAL1) i rodziny onkogenów RAB5A RAS (RAB5A) za pomocą mEGFP19.
Oprócz potwierdzenia precyzji edycji genomu, istnieje wiele testów kontroli jakości, które można wykorzystać do dalszego scharakteryzowania linii klonalnej i identyfikacji klonów, które spełniają wszystkie kryteria komórek macierzystych, genomu i biologii komórki do wykorzystania w przyszłych badaniach. Testy biologiczne i funkcjonalne komórek można wykorzystać do potwierdzenia odpowiedniej ekspresji, lokalizacji i funkcji białka fuzyjnego12. Porównanie z nieedytowaną kontrolą rodzicielską pomoże ocenić wpływ procesu edycji na lokalizację, dynamikę i funkcję. Inne testy, takie jak analiza wzrostu i testy stabilności genomu, mogą również pomóc w ustaleniu, czy oznakowane białko zakłóca działanie komórki. W przypadku stosowania hiPSC w tym protokole ocena markerów pluripotencji i potencjału różnicowania może mieć kluczowe znaczenie w określeniu klonu, który jest cenny dla dalszych badań12. Ponieważ wykazano, że rozszerzona hodowla hiPSC prowadzi do niestabilności genetycznej, ważne jest również monitorowanie tempa wzrostu i kariotypu linii komórek klonalnych 12,37. Jednak ostateczne przeznaczenie edytowanych komórek ostatecznie określi poziom i zakres analizy kontroli jakości i będzie się różnić w zależności od zastosowania.

Wykorzystanie strategii edycji genomu, zwłaszcza CRISPR/Cas9, do badania procesów komórkowych staje się coraz bardziej dostępne i wartościowe1,2,3,4,5,6,7. Jednym z wielu zastosowań CRISPR/Cas9 jest wprowadzanie (poprzez naprawę kierowaną homologią (HDR)) dużych sekwencji egzogennych, takich jak GFP, do określonych loci genomowych, które następnie służą jako reportery dla aktywności genu lub produktu białkowego8. Technika ta może być wykorzystana do połączenia fluorescencyjnej sekwencji białka z endogenną otwartą ramką odczytu, w której powstałe endogennie regulowane białko fuzyjne może być wykorzystane do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji i dynamiki białka będącego przedmiotem zainteresowania5,6,9,10,11. Podczas gdy endogennie znakowane białka oferują wiele korzyści w porównaniu z systemami nadekspresji, wprowadzanie dużych sekwencji do ludzkiego genomu jest nieefektywnym procesem, zwykle wymagającym strategii selekcji lub wzbogacania w celu uzyskania populacji komórek, które można łatwo zbadać5,12.
Ten protokół opisuje insercję sekwencji DNA kodującej białko fluorescencyjne (FP) do pożądanego locus genomu. Protokół obejmuje zaprojektowanie i dostarczenie plazmidu matrycy dawcy oraz kompleksu rybonukleoproteiny (RNP) (białko Cas9 typu dzikiego S. pyogenes w połączeniu z syntetycznym CRISPR RNA (crRNA) i transaktywującym crRNA (tracrRNA)). Opisano również wzbogacanie przypuszczalnie edytowanych komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i proces generowania klonalnej linii komórkowej. Do tej pory metoda ta była stosowana do generowania linii hiPSC z monoallelicznymi lub (rzadko) dwuallelicznymi znacznikami białka zielonej fluorescencji (GFP) znakującymi dwadzieścia pięć białek reprezentujących główne struktury komórkowe. Potwierdzono, że uzyskane w wyniku tych wysiłków edytowane komórki mają oczekiwaną insercję genetyczną, wyrażają prawidłowo lokalizujące białko fuzyjne i utrzymują pluripotencję oraz stabilny kariotyp12 (i dane niepublikowane). Metoda ta została również wykorzystana do wygenerowania wielu innych pojedynczych i podwójnych (dwa różne białka oznaczone w tej samej komórce) edytowanych populacji hiPSC (dane niepublikowane).
Ludzkie iPSC pochodzące od zdrowego dawcy zostały wybrane do edycji genomu, ponieważ, w przeciwieństwie do wielu konwencjonalnych linii komórkowych, są one diploidalne, kariotypowo stabilne, nieprzekształcone i proliferacyjne. Właściwości te stanowią atrakcyjny model do badania podstawowej biologii komórki i modelowania chorób. Co więcej, potencjał różnicowania hiPSC daje możliwość równoległego badania wielu etapów rozwojowych w różnych liniach i typach komórek przy użyciu komórek izogenicznych, w tym organoidów, tkanek i modeli "choroby w naczyniu"13,14,15. Chociaż protokół ten został opracowany dla hiPSC (linia WTC), może być przydatny do opracowania protokołów wykorzystujących inne linie komórkowe ssaków.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters lub podobne</td><td></td><td>oprogramowanie bioinformatyczne do in silico projekt plazmidu dawcy</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT lub podobny</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 lub podobny</td><td>ThermoFisher Scientific lub podobny</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipety (1000 &mikro; L, 200 i mikro; L, 20 i mikro; L, 10 i mikro; L, 2 i mikro; L)</td> <td>Rainin lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>końcówki do pipet (1000 &micro; L, 200 i mikro; L, 20 i mikro; L)</td> <td>Pipeta wielokanałowa Rainin lub podobna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 &micro; L)</td> <td>Rainin lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipety serologiczne (25 ml, 10 ml, 5 ml)</td> <td>Costar lub podobne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-kanałowe rozdzielacze BRAND do Quiksip, autoklawowalne</td><td>Millipore Sigma lub podobne</td><td>BR704526-1EA</td><td>do użytku z niefiltrowanymi końcówkami do pipet, takie jak końcówki do pipet o niskiej retencji Molecular Bioproducts, Pure 10, poniżej</td></tr><tr><td>końcówek do pipet o niskiej retencji Molecular Bioproducts, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, lub podobny</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Kontroler pipet</td><td>Drummond lub podobny</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura</td><td>VWR lub podobny</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>klasa II, szafa bezpieczeństwa biologicznego typu A2</td><td>CELLGARD lub podobny</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, obniżony współczynnik wzrostu</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lot testowany przed użyciem z hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (czerwień fenolowa)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>na zimno, do rozcieńczania Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media Zalecane</td> podłoża wzrostowe <td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>dla linii WTC hiPSC</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Linia hiPSC WTC</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>linia hiPSC stosowana w tym protokole jest dostępna za pośrednictwem Coriell</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS) bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polistyrenu stożkowy</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( Inhibitor ROCK)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Syntetyczny crRNA, niezmodyfikowany (sekwencja niestandardowa)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Syntetyczny tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany typ dziki Streptococcus pyogenes Białko oczyszczone Cas9-NLS, 40 i mikro; M</td><td>Uniwersytet Kalifornijski-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy plazmid dawcy (PriorityGENE)</td><td>Projekt wkładki dawcy Genewiz został zsyntetyzowany i sklonowany do szkieletu pUC57 za pomocą probówki Genewiz</td><td></td> DNA LoBind 1,5 ml Eppendorf 22431021 NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50 System transfekcji neonowej ThermoFisher <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Naukowy</td><td></td> system transfekcji neonowej MPK5000<td></td></tr><tr><td>, 100 i mikro; Zestaw L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitka do komórek</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa rurka polipropylenowa o wysokiej czystości</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACSDiva</td><td>Wersja BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>Bank krwi TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Sól fizjologiczna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>używany jako bezkonserwantowy bufor FACS</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Olympus SZX7 lub podobny</td><td>Olympus lub podobny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych, 96-dołkowa</td><td>płytka do</td> hodowli komórkowych Falcon <td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków, V-Bottom</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>stosowany jako bufor do kriokonserwacji komórek w formacie płytki 96-dołkowej</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Przedstawiono protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), które wyrażają endogenne białka połączone z N- lub C-końcowymi znacznikami fluorescencyjnymi w ramce. Prokariotyczny system CRISPR/Cas9 (zgrupowany regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne/CRISPR-associated 9) może być używany do wprowadzania dużych sekwencji egzogennych do loci genomu poprzez naprawę ukierunkowaną homologią (HDR). Aby osiągnąć pożądany efekt domina, protokół ten wykorzystuje podejście oparte na rybonukleoproteinach (RNP), w którym białko Cas9 Streptococcus pyogenes typu dzikiego, syntetyczny 2-częściowy przewodnik RNA (gRNA) i plazmid matrycy dawcy są dostarczane do komórek za pomocą elektroporacji. Przypuszczalnie edytowane komórki wyrażające fluorescencyjnie znakowane białka są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Następnie generowane są linie klonalne, które można analizować w celu uzyskania precyzyjnych wyników edycji. Wprowadzając znacznik fluorescencyjny w genomowym locus genu będącego przedmiotem zainteresowania, wynikająca z tego subkomórkowa lokalizacja i dynamika białka fuzyjnego mogą być badane pod endogenną kontrolą regulacyjną, co stanowi kluczową poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi systemami nadekspresji. Wykorzystanie hiPSC jako modelowego systemu znakowania genów daje możliwość badania znakowanych białek w diploidalnych, nietransformowanych komórkach. Ponieważ hiPSC mogą być różnicowane w wiele typów komórek, takie podejście daje możliwość tworzenia i badania znakowanych białek w różnych izogenicznych kontekstach komórkowych.

Celem niniejszego eksperymentu było stworzenie białka fuzyjnego mEGFP (monomerycznego wzmocnionego GFP) z białkiem laminy jądrowej B1 poprzez wprowadzenie sekwencji mEGFP na koniec 5ʹ genu LMNB1 (N-koniec białka). Wybrano linker (sekwencja aminokwasowa SGLRSRAQAS) w oparciu o wcześniejsze konstrukty cDNA z kolekcji białek fluorescencyjnych Michaela Davidsona21. Ponieważ region wiązania crRNA w plazmidzie matrycy donorowej dla każdego kandydującego crRNA został przerwany po insercji in silico mEGFP i sekwencji linkera, nie było potrzeby wprowadzania mutacji punktowych w celu zablokowania potencjalnego rozpoznania przez crRNA i cięcia sekwencji donorowej przez Cas9 (Rycina 1). Sekwencja donorowa zawierała 1 kb ramiona homologii flankujące oba końce sekwencji mEGFP-linker. Powstały fragment DNA o długości 2 734 bp został sklonowany do szkieletu pUC57, zweryfikowany sekwencyjnie, a otrzymany plazmid matrycy donorowej został oczyszczony metodą maxi prep bez endotoksyn. Przeprowadzono transfekcję plazmidu matrycy donorowej i kompleksu RNP, dokonano wzbogacenia domniemanie edytowanych komórek, a lokalizację białka fuzyjnego mEGFP-lamina jądrowa B1 potwierdzono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rycina 2). Opisano tutaj wyniki tylko dla transfekcji crRNA1, mimo że obie sekwencje crRNA doprowadziły do powstania domniemanie edytowanych populacji12.
W porównaniu z kontrolą negatywną, w której reakcja elektroporacji nie zawierała gRNA, białka Cas9 ani plazmidu matrycy donora (sam bufor), komórki transfektowane crRNA1 LMNB1 zawierały 0,95% komórek mEGFP-dodatnich, reprezentujących prawdopodobnie edytowaną populację mEGFP-jądrowej laminy B1 (Rysunek 3a). Wynik ten mieścił się w zakresie wydajności knock-in obserwowanych w wielu loci genomicznych przy zastosowaniu tej metody, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami12.
Komórki mEGFP-dodatnie wyizolowano metodą FACS i poddano obrazowaniu za pomocą mikroskopii żywych komórek, aby potwierdzić oczekiwaną lokalizację białka fuzyjnego mEGFP-jądrowa laminina B1 w otoczce jądrowej. Po wzbogaceniu metodą FACS, około 90% posortowanych komórek z populacji LMNB1 crRNA1 było mEGFP-dodatnich (co ustalono za pomocą mikroskopii), co sugeruje, że niektóre komórki mEGFP-ujemne zostały współoczyszczone z komórkami GFP-dodatnimi podczas procedury sortowania. Był to akceptowalny poziom wzbogacenia, który pozwolił na wyselekcjonowanie 96 klonów, które następnie można było przebadać genetycznie pod kątem skutecznej edycji. Zazwyczaj granicą uznania wzbogacenia za skuteczne jest 50% komórek GFP-dodatnich.
Większość posortowanej populacji komórek wykazywała fluorescencję w obrębie otoczki jądrowej (peryferii jądra) w komórkach niedzielących się oraz w rozszerzonej laminie jądrowej w cytoplazmie podczas mitozy, co potwierdza poprawność edycji genomowej w locus LMNB1. Wzbogacona populacja zawierała komórki o silnym lub słabym sygnale. Ta różnica w intensywności sygnału może odzwierciedlać kombinację poprawnych i niepoprawnych wyników edycji i podkreśla użyteczność generowania genetycznie zwalidowanej linii klonalnej do dalszych badań (patrz sekcja Dyskusja) (Rycina 3b)12. Po wygenerowaniu linii klonalnej, genetycznie zwalidowane komórki wykazały jednorodną intensywność GFP w eksperymentach mikroskopowych (Rycina 3c).
<img alt="Schemat edycji genów; miejsce insercji GFP; dopasowanie sekwencji z CRISPR; proces modyfikacji genomu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Strategia projektowania znakowania N-końca genu LMNB1 białkiem GFP. Znacznik GFP został zaprojektowany do insercji N-końcowej na 5ʹ względem pierwszego eksonu genu LMNB1 zlokalizowanego na chromosomie 5. Ramiona homologii 5ʹ i 3ʹ mają długość 1 kb każde i stykają się między kodonem start (ATG) a drugim kodonem (ramiona homologii przedstawione na rysunku tylko częściowo). Zaprojektowano dwa kandydackie crRNA, aby naprowadzić Cas9 na cięcie jak najbliżej zamierzonego miejsca insercji, przy jednoczesnym zachowaniu unikalności w genomie. Sekwencja mEGFP oraz linker aminokwasowy zostały wstawione bezpośrednio na 3ʹ od kodonu start (sekwencja mEGFP i linkera nie zachowana w skali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="schemat procesu edycji genów w hiPSC, elektroporacja, FACS, wstępna kontrola jakości i etapy analizy genomowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Schemat tworzenia klonalnych linii hiPSC z endogennym znakowaniem. Elektroporowano komponenty do transfekcji, w tym kompleks RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (przedstawiony jako czerwone białko Cas9 ze złotym crRNA i fioletowym tracrRNA), plazmid matrycy donora zawierający ramiona homologii (HAs, przedstawione w kolorze złotym) oraz sekwencję FP+linker (przedstawioną w kolorze zielonym). Po 4 dniach komórki wykazujące ekspresję FP, uznane za potencjalnie edytowane, zostały wzbogacone metodą FACS, a następnie namnożone jako populacja poprzez wysianie wszystkich posortowanych komórek do jednej studni płytki 96-dołkowej (~1000 komórek) i prowadzenie hodowli do momentu uzyskania populacji roboczej liczącej kilka milionów komórek, którą można było zbadać jako „populację wzbogaconą” (patrz krok 3.8 protokołu). Uzysk podkreślona liczba komórek FP+ różni się w zależności od eksperymentu ze względu na zmienną efektywność HDR.12; pomyślne wzbogacenie może typowo obejmować ok. 300–5000 komórek po transfekcji około 1,6 x 106 komórki hiPS. Wstępne badania obrazowe potwierdziły sygnał i lokalizację białka fuzyjnego w populacji wzbogaconej. Kolonie przeniesiono ręcznie do płytki 96-dołkowej w celu ich namnożenia i kriokonserwacji. Następnie, zgodnie z wcześniejszym opisem, przeprowadzono dalszą kontrolę jakości genomu z wykorzystaniem dropletowej cyfrowej PCR (ddPCR) oraz innych testów opartych na metodzie PCR w celu zidentyfikowania prawidłowo zmodyfikowanych klonów.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej analizy intensywności GFP; obrazy komórek z mikroskopii; różnicowanie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wzbogacenie domniemanych populacji komórek edytowanych. (A) Wykresy cytometrii przepływowej komórek z edytowanym LMNB1 cztery dni po transfekcji. Oś y przedstawia intensywność GFP, a oś x rozproszenie światła przedniego (forward scatter). Bramki sortowania ustawiono na podstawie kontroli z samym buforem. Ze względu na wrażliwość hiPSC na zaburzenia, pominięto barwienie żywe/martwe, a zamiast tego zastosowano bardzo konserwatywną bramkę FSC/SSC. (B) Po wzbogaceniu w populacji komórek z edytowanym LMNB1 Cr1 ok. 90% komórek wykazywało lokalizację GFP w otoczce jądrowej (oczekiwana lokalizacja LMNB1). Populacja zawierała komórki o różnej intensywności GFP, a także niektóre komórki GFP-ujemne. Paski skali wynoszą 10 mikronów. (C) Po wygenerowaniu linii klonalnych komórki wykazywały jednolitą intensywność GFP, z niektórymi różnicami zależnymi od cyklu komórkowego. Pasek skali wynosi 20 mikronów.

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Celem tego protokołu jest wygenerowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, które wyrażają endogenne białka fuzyjne połączone z końcowymi znacznikami fluorescencyjnymi N lub C. Aby osiągnąć pożądany efekt knock-in, używamy systemu CRISPR-Cas9 i podejścia opartego na rybonukleoproteinach przy użyciu białka Cas9 S.pyogenes typu dzikiego oraz syntetycznego dwuczęściowego CRSPR RNA i tracrRNA. Ten RNP jest dostarczany jednocześnie z pożądaną sekwencją znaczników fluorescencyjnych jako plazmid dawcy za pomocą elektroporacji.Przypuszczalnie edytowane komórki, wyrażające białko znakowane fluorescencyjnie, są wzbogacane przez FACS. Następnie generowane są linie klonalne w celu analizy precyzyjnych wyników edycji. Ten protokół edycji genów ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi konstruktami nadekspresji.Ponieważ znacznik fluorescencyjny jest wprowadzany do genomu, subkomórkowa lokalizacja i dynamika powstałego białka fuzyjnego mogą być badane pod endogenną kontrolą regulacyjną. Tutaj używamy indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych jako systemu modelowego, ponieważ pozwala nam to badać znakowane białka w diploidalnych komórkach nietransformowanych. Dodatkowo, ponieważ komórki mogą być różnicowane w wiele typów komórek, takich jak pokazane tutaj komórki kardiomiocytów, podejście to daje możliwość tworzenia i badania znakowanych białek w różnych izogenicznych kontekstach komórkowych.Jednak przy starannej optymalizacji protokół ten można dostosować do edycji genomów innych typów komórek ssaków. Cześć, nazywam się Amanda Haupt, należę do zespołu zajmującego się komórkami macierzystymi i edycją genów w Allen Institute for Cell Science. Obecnie zastosowaliśmy to podejście do wygenerowania ponad 35 różnych linii komórkowych wykazujących ekspresję endogennych białek fuzyjnych.Używamy ich do badania szerokiej gamy unikalnych struktur i procesów komórkowych. Podejście to okazało się skuteczne w przypadku nawet 95% loci, które do tej pory próbowano umówić się z naszą grupą. Metoda ta będzie szczególnie przydatna dla biologów komórkowych, którzy są zainteresowani lepszym zrozumieniem dynamiki białka w żywych komórkach.Jednak po wygenerowaniu edytowanych linii klonalnych możliwości badań są nieograniczone. Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie konsekwentnie identyfikować klony, które mają monoalleliczne znaczniki białek fluorescencyjnych, bez żadnych innych zakłóceń w sekwencji genomu. Od czasu do czasu jesteśmy również w stanie uzyskać klony edytowane biallelicznie.W tym filmie pokażemy niektóre z kluczowych etapów transfekcji, wzbogacania FACS i izolowania klonalnych linii komórkowych, które wyrażają endogennie regulowane fluorescencyjne białka fuzyjne. Dwie do trzech godzin przed transfekcją potraktuj hiPSC dziesięcioma mikromolowymi inhibitorami ROCK uzupełnionymi do pożywek wzrostowych. Ułatwi to przeżycie po elektroporacji.Po tym zabiegu komórki będą miały kolczasty wygląd. Komórki powinny być usunięte z płytki zamykającej tkankę za pomocą pojedynczego obszaru dysocjacji komórek, a zawiesina komórek powinna być zebrana w stożkowej probówce przed transfekcją. Przygotować podwielokrotność 1,84 razy 10 do sześciu komórek dla każdego warunku doświadczalnego, który ma być transfekowany.Przygotuj probówki kompleksu rybonukleoproteinowego do każdej transfekcji, dodając 2,88 mikrolitra 10 mikromolowych przewodników RNA i 2,88 mikrolitrów 10 mikromolowych Cas9 do probówki 1,5 mil. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut, maksymalnie jedną godzinę. Podwielokrotność komórki przygotowaną w poprzednim kroku osadzać w proporcji 211 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Następnie odessaj supernatant i ścigaj się, aby zakręcić osad ogniwa w 220 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Dodaj 220 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek do wcześniej przygotowanej probówki o objętości 1,5 mil kompleksu RNP. Dodaj 4,6 mikrolitra jednego mikrograma na mikrolitr plazmidu dawcy.Za pomocą końcówki do nukleofekcji i pipety wymieszać dwie zawartość dwa do trzech razy, a następnie przenieść sto mikrolitrów zawiesiny do przygotowanego urządzenia do elektroporacji. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do końcówki. Zastosuj trzysta woltów przez jeden impuls trwający trzydzieści milisekund.Delikatnie przenieść zawiesinę do przygotowanej płytki sześciodołkowej ruchem wirującym. Rozproszyj komórki, delikatnie przesuwając płytkę z boku na bok i z przodu do tyłu. Po powtórzeniu dla wszystkich warunków eksperymentalnych i kontroli, inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, zmieniając pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową bez inhibitora ROCK po 24 godzinach.Następnie kontynuuj karmienie hiPSC co 24 godziny przez 72 do 96 godzin, monitorując ich zbieganie się. Gdy hiPSC osiągną konfluencję od 68 do 80%, przejdź do wzbogacania FACS. Dwie do trzech godzin przed transfekcją należy potraktować hiPSC 10-mikromolowym inhibitorem ROCK uzupełnionym do pożywki wzrostowej, aby zwiększyć przeżycie po wzbogaceniu FACS.Aby posortować komórki, usuń je z płytki za pomocą odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, a następnie przefiltruj zawiesinę hiPSC przez filtr siatkowy o wielkości 35 mikronów do polistyrenowych probówek z okrągłym dnem. Sortuj komórki za pomocą rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego, w tym: wysokość w stosunku do szerokości, trojaczków, szczątków i dubletów. Użyj komórek kontrolnych tylko bufora na żywo, aby ustawić bramkę dodatnią FP, na przykład mniej niż 1.1% komórek tylko buforowych znajduje się w bramce.Podczas sortowania komórek macierzystych dostosuj ustawienia instrumentu, aby promować przeżycie komórek, zgodnie z sugestią w sekcji dyskusji. Typowa wydajność spalania stukowego, określona przez procent komórek FP dodatnich przez FACS, może wynosić od 0,1% do 5%Sortuj komórki do probówki polipropylenowej o grubości od 1,5 do 15 mil zawierającej od 0,5 do 2 mil pożywki wzrostowej o temperaturze pokojowej uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 211 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Przenieś do trzech tysięcy różnych komórek do jednego dołka świeżej płytki 96-dołkowej pokrytej matrycą. Inkubować posortowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez 24 godziny, zmieniając pożywkę na pożywkę wzrostową uzupełnioną 5 mikromolowym inhibitorem ROCK po 24 godzinach.Następnie po 48 godzinach kontynuuj karmienie komórek regularną pożywką wzrostową, bez inhibitora ROCK co 24 godziny przez 72 do 96 godzin, monitorując zbieg. Gdy komórki osiągną wystarczającą dojrzałość, aby można je było wyprowadzić z płytki 96-dołkowej, zalecamy stopniowe przekazywanie ich do większych płytek. Na przykład z jednego dołka na płytce 96-dołkowej przenieś je do jednego do dwóch dołków na płytce 24-dołkowej.A następnie stamtąd do płytki 6-dołkowej i tak dalej, aż będziesz mieć wystarczającą liczbę komórek do dalszych celów. Zwykle minimum trzy do czterech milionów komórek. Aby wygenerować linie klonalne z wzbogaconej przez FACS populacji karnie edytowanych komórek, należy przejść do zawiesiny pojedynczej komórki i umieścić dziesięć tysięcy komórek na 10-centymetrowej płytce i pozwolić koloniom rosnąć przez pięć do siedmiu dni.Kiedy kolonie są widoczne makroskopowo, są wystarczająco duże, aby można je było wyizolować. Na mikroskopie preparacyjnym użyj pipety P200, aby delikatnie zeskrobać i odessać poszczególne kolonie z powierzchni płytki. Przenieść objętość zawierającą kolonię do pojedynczego dołka na płytce 96-dołkowej.Po przeniesieniu wszystkich kolonii inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny. Po 24 godzinach należy zmienić pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową bez inhibitora ROCK. Następnie kontynuuj karmienie komórek co 24 godziny przez 72 do 96 godzin, aż kolonie w przybliżeniu potroją swoją wielkość.Komórki będą musiały zostać wyhodowane i pasażowane w 96-dołkowych płytkach, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do krioprezerwacji antalizacji w celu ekstrakcji genomowego DNA. Więcej informacji można znaleźć w pisemnym protokole. Aby przejść przez 96-dołkowe płytki, użyj ośmiokanałowego aspiratora, aby usunąć i wyrzucić pożywkę z pierwszej kolumny.Za pomocą pipety wielokanałowej P200 dodaj około 200 mikrolitrów DPBS do pierwszej kolumny płytki, aby umyć komórki. Za pomocą aspiratora ośmiokanałowego wyjmij i wyrzuć płyn do płukania DPBS z pierwszej kolumny. Następnie dodaj 40 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego do pierwszej kolumny.Powtórz te kroki, pracując po jednej kolumnie na raz, w sumie do sześciu kolumn płytki 96-dołkowej. Zmień wskazówki, aby upewnić się, że nie zanieczyszczasz studni krzyżowo. Umieścić płytkę w inkubatorze na trzy do pięciu minut od momentu dodania odczynnika dysocjacyjnego do pierwszej kolumny.Gdy komórki w pierwszej kolumnie płytki zaczną odrywać się od dna, użyj pipety wielokanałowej P200, aby dodać 160 mikrolitrów DPBS do pierwszej kolumny i delikatnie rozcierać komórki w pozycjach godziny 12, 3, 6 i 9 każdej studzienki. Przenieść całą objętość z zawiesiną komórek na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V. Powtórz te kroki dla pozostałych kolumn, w których znajduje się odczynnik dysocjacyjny, zmieniając końcówki, aby nie zanieczyszczać studzienek krzyżowo.Obracać dolną płytkę w kształcie litery V w wirówce pod ciśnieniem 385 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Sub pokazany do tego momentu dla pasażowania 96 dołków jest wykonywany w ten sam sposób za każdym razem, gdy komórki są pasażowane w tym formacie płytki. Następnie pokażemy Ci, jak postępować, jeśli jesteś gotowy do krioprezerwacji komórek w formacie 96 dołków.Więcej informacji można znaleźć w pisemnym protokole. Po etapie wirowania pokazanym w poprzednim rozdziale, odessać supernatant za pomocą pipety wielokanałowej P200, a następnie ponownie zawiesić w 60 mikrolitrach pożywki wzrostowej uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Powtórz dla wszystkich studzienek, zmieniając końcówki, aby nie zanieczyszczać krzyżowo.Przenieś 30 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą 96 dołkami. Przenieś pozostałe 30 mikrolitrów zawiesiny na siostrzaną płytkę, a następnie szybko dodaj 170 mikrolitrów buforu zamrażającego do każdej studzienki bez mieszania. Należy zauważyć, że proces ten odbywa się na zduplikowanych płytkach siostrzanych, tak aby po rozmrożeniu jednej z pojedynczych płytek istniała zapasowa populacja komórek.Umieszczenie komórek kriokonserwowanych tylko w co drugiej kolumnie płytki 96-dołkowej pozwala na szybsze rozmrażanie. Owiń talerz parafolią i umieść go w styropianowym pudełku o temperaturze pokojowej z pokrywką. Umieść całe pudełko w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach talerze można wyjąć z pudełka styropianowego i sortować w temperaturze minus 86 stopni Celsjusza przez okres do czterech tygodni. Kriokonserwacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie 96 dołków pozwala na czasową przerwę w hodowli komórkowej. Badacz może przeprowadzić testy walidacji genomu na kopalniach klonów, aby zidentyfikować genetycznie pożądane klony do rozmrożenia do przyszłych badań.Cztery dni po transfekcji linii hiPSC WTC z docelowym specyficznym białkiem przewodnikowym RNA Cas9 i starannie zaprojektowanym plazmidem matrycy dawcy, zaobserwowano, że 0,95% komórek wykazuje ekspresję GFP. FACS wykorzystano do posortowania wszystkich komórek GFP dodatnich jako wzbogaconej populacji. Wstępne badania mikroskopowe ujawniły oczekiwaną lokalizację białka fuzyjnego laminy jądrowej B1 mEGFP w otoczce jądrowej.Białko znakowane fluorescencyjnie zaobserwowano w około 95% komórek z różną intensywnością. Po wygenerowaniu linii klonalnej uzyskano klony o jednolitej intensywności mEGFP i poddano je dalszej analizie w celu precyzyjnej edycji. Podsumowując, pokazaliśmy metodę transfekcji do edycji genów indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu ekspresji endogennie regulowanych fluorescencyjnych białek fuzyjnych.Ponieważ typowa nieefektywność stukania jest niska, niektóre strategie wzbogacania, takie jak pokazana tutaj metoda FACS, skutkują populacją przypuszczalnie edytowanych komórek wykazujących ekspresję białka fuzyjnego. Wzbogaconą populację można wykorzystać do badań biologicznych lub wygenerować linie klonalne zgodnie z opisem w tej metodzie, co umożliwia identyfikację linii komórkowych, które są precyzyjnie edytowane genowo. Ważne jest, aby pamiętać, że wywołane przez Cas9 podwójne pęknięcia nici w genomie są często naprawiane nieprecyzyjnie, pomimo włączenia znacznika do zamierzonego locus.Dodatkowo w klonach edytowanych monoallelicznie nieoznakowany allel często zawiera indele najprawdopodobniej spowodowane niehomologiczną naprawą łączenia końców. Odkrycia te podkreślają znaczenie walidacji genetycznej po tym, jak CRISPR Cas9 ujawnił się dopiero w wyniku analizy genomu klonalnych linii komórkowych. Sama ekspresja oczekiwanego białka fuzyjnego nie gwarantuje precyzyjnej edycji.Korzystając z tego protokołu do edycji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, należy przestrzegać zaleceń wyszczególnionych w pisemnym protokole, aby zapewnić delikatne obchodzenie się z komórkami w celu optymalnego przeżycia komórek i zminimalizowania spontanicznego różnicowania. Mamy nadzieję, że ten film oraz związany z nim protokół i lista materiałów pomogą Ci przeprowadzić podobne eksperymenty we własnym laboratorium na Twoim ulubionym białku. Dzięki za oglądanie.

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Tutaj prezentujemy protokół delecji exon23 oparty na Cas9, który przywraca ekspresję dystrofiny w iPSC z mysich fibroblastów skóry Dmdmdx i bezpośrednio różnicuje iPSC w miogenne komórki progenitorowe (MPC) za pomocą systemu aktywacji Tet-on MyoD.

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Tutaj prezentujemy uproszczony protokół endogennego znakowania genów dla Drosophila, który wykorzystuje technikę opartą na PCR do bezmarkerowej identyfikacji udanych modyfikacji genetycznych, ułatwiając rozwój stabilnych linii knock-in.

Jednoetapowa strategia endogennego znakowania genów w oparciu o CRISPR u Drosophila melanogaster

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Przepływ pracy z mikroiniekcją CRISPR/Cas9 do endogennego fluorescencyjnego oznaczania w linii komórkowej Caenorhabditis elegans w celu uzyskania homozygotycznych linii knock-in do analizy lokalizacji białka in vivo lokalizacji białka.

Endogenouszne fluorescencyjne oznaczanie genów specyficznych dla komórek germinalnych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę endogennego znakowania białek w ludzkich komórkach iPSC przy użyciu CRISPR/Cas9 i elektroporacji. Technika umożliwia badanie dynamiki białek pod kontrolą endogennej regulacji genetycznej.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów