Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Celem tego protokołu jest wygenerowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, które wyrażają endogenne białka fuzyjne połączone z końcowymi znacznikami fluorescencyjnymi N lub C. Aby osiągnąć pożądany efekt knock-in, używamy systemu CRISPR-Cas9 i podejścia opartego na rybonukleoproteinach przy użyciu białka Cas9 S.pyogenes typu dzikiego oraz syntetycznego dwuczęściowego CRSPR RNA i tracrRNA. Ten RNP jest dostarczany jednocześnie z pożądaną sekwencją znaczników fluorescencyjnych jako plazmid dawcy za pomocą elektroporacji.

Przypuszczalnie edytowane komórki, wyrażające białko znakowane fluorescencyjnie, są wzbogacane przez FACS. Następnie generowane są linie klonalne w celu analizy precyzyjnych wyników edycji. Ten protokół edycji genów ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi konstruktami nadekspresji.

Ponieważ znacznik fluorescencyjny jest wprowadzany do genomu, subkomórkowa lokalizacja i dynamika powstałego białka fuzyjnego mogą być badane pod endogenną kontrolą regulacyjną. Tutaj używamy indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych jako systemu modelowego, ponieważ pozwala nam to badać znakowane białka w diploidalnych komórkach nietransformowanych. Dodatkowo, ponieważ komórki mogą być różnicowane w wiele typów komórek, takich jak pokazane tutaj komórki kardiomiocytów, podejście to daje możliwość tworzenia i badania znakowanych białek w różnych izogenicznych kontekstach komórkowych.

Jednak przy starannej optymalizacji protokół ten można dostosować do edycji genomów innych typów komórek ssaków. Cześć, nazywam się Amanda Haupt, należę do zespołu zajmującego się komórkami macierzystymi i edycją genów w Allen Institute for Cell Science. Obecnie zastosowaliśmy to podejście do wygenerowania ponad 35 różnych linii komórkowych wykazujących ekspresję endogennych białek fuzyjnych.

Używamy ich do badania szerokiej gamy unikalnych struktur i procesów komórkowych. Podejście to okazało się skuteczne w przypadku nawet 95% loci, które do tej pory próbowano umówić się z naszą grupą. Metoda ta będzie szczególnie przydatna dla biologów komórkowych, którzy są zainteresowani lepszym zrozumieniem dynamiki białka w żywych komórkach.

Jednak po wygenerowaniu edytowanych linii klonalnych możliwości badań są nieograniczone. Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie konsekwentnie identyfikować klony, które mają monoalleliczne znaczniki białek fluorescencyjnych, bez żadnych innych zakłóceń w sekwencji genomu. Od czasu do czasu jesteśmy również w stanie uzyskać klony edytowane biallelicznie.

W tym filmie pokażemy niektóre z kluczowych etapów transfekcji, wzbogacania FACS i izolowania klonalnych linii komórkowych, które wyrażają endogennie regulowane fluorescencyjne białka fuzyjne. Dwie do trzech godzin przed transfekcją potraktuj hiPSC dziesięcioma mikromolowymi inhibitorami ROCK uzupełnionymi do pożywek wzrostowych. Ułatwi to przeżycie po elektroporacji.

Po tym zabiegu komórki będą miały kolczasty wygląd. Komórki powinny być usunięte z płytki zamykającej tkankę za pomocą pojedynczego obszaru dysocjacji komórek, a zawiesina komórek powinna być zebrana w stożkowej probówce przed transfekcją. Przygotować podwielokrotność 1,84 razy 10 do sześciu komórek dla każdego warunku doświadczalnego, który ma być transfekowany.

Przygotuj probówki kompleksu rybonukleoproteinowego do każdej transfekcji, dodając 2,88 mikrolitra 10 mikromolowych przewodników RNA i 2,88 mikrolitrów 10 mikromolowych Cas9 do probówki 1,5 mil. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut, maksymalnie jedną godzinę. Podwielokrotność komórki przygotowaną w poprzednim kroku osadzać w proporcji 211 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie odessaj supernatant i ścigaj się, aby zakręcić osad ogniwa w 220 mikrolitrach buforu do elektroporacji. Dodaj 220 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek do wcześniej przygotowanej probówki o objętości 1,5 mil kompleksu RNP. Dodaj 4,6 mikrolitra jednego mikrograma na mikrolitr plazmidu dawcy.

Za pomocą końcówki do nukleofekcji i pipety wymieszać dwie zawartość dwa do trzech razy, a następnie przenieść sto mikrolitrów zawiesiny do przygotowanego urządzenia do elektroporacji. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do końcówki. Zastosuj trzysta woltów przez jeden impuls trwający trzydzieści milisekund.

Delikatnie przenieść zawiesinę do przygotowanej płytki sześciodołkowej ruchem wirującym. Rozproszyj komórki, delikatnie przesuwając płytkę z boku na bok i z przodu do tyłu. Po powtórzeniu dla wszystkich warunków eksperymentalnych i kontroli, inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, zmieniając pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową bez inhibitora ROCK po 24 godzinach.

Następnie kontynuuj karmienie hiPSC co 24 godziny przez 72 do 96 godzin, monitorując ich zbieganie się. Gdy hiPSC osiągną konfluencję od 68 do 80%, przejdź do wzbogacania FACS. Dwie do trzech godzin przed transfekcją należy potraktować hiPSC 10-mikromolowym inhibitorem ROCK uzupełnionym do pożywki wzrostowej, aby zwiększyć przeżycie po wzbogaceniu FACS.

Aby posortować komórki, usuń je z płytki za pomocą odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek, a następnie przefiltruj zawiesinę hiPSC przez filtr siatkowy o wielkości 35 mikronów do polistyrenowych probówek z okrągłym dnem. Sortuj komórki za pomocą rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego, w tym: wysokość w stosunku do szerokości, trojaczków, szczątków i dubletów. Użyj komórek kontrolnych tylko bufora na żywo, aby ustawić bramkę dodatnią FP, na przykład mniej niż 1.1% komórek tylko buforowych znajduje się w bramce.

Podczas sortowania komórek macierzystych dostosuj ustawienia instrumentu, aby promować przeżycie komórek, zgodnie z sugestią w sekcji dyskusji. Typowa wydajność spalania stukowego, określona przez procent komórek FP dodatnich przez FACS, może wynosić od 0,1% do 5%Sortuj komórki do probówki polipropylenowej o grubości od 1,5 do 15 mil zawierającej od 0,5 do 2 mil pożywki wzrostowej o temperaturze pokojowej uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 211 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach pożywki wzrostowej uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK. Przenieś do trzech tysięcy różnych komórek do jednego dołka świeżej płytki 96-dołkowej pokrytej matrycą. Inkubować posortowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez 24 godziny, zmieniając pożywkę na pożywkę wzrostową uzupełnioną 5 mikromolowym inhibitorem ROCK po 24 godzinach.

Następnie po 48 godzinach kontynuuj karmienie komórek regularną pożywką wzrostową, bez inhibitora ROCK co 24 godziny przez 72 do 96 godzin, monitorując zbieg. Gdy komórki osiągną wystarczającą dojrzałość, aby można je było wyprowadzić z płytki 96-dołkowej, zalecamy stopniowe przekazywanie ich do większych płytek. Na przykład z jednego dołka na płytce 96-dołkowej przenieś je do jednego do dwóch dołków na płytce 24-dołkowej.

A następnie stamtąd do płytki 6-dołkowej i tak dalej, aż będziesz mieć wystarczającą liczbę komórek do dalszych celów. Zwykle minimum trzy do czterech milionów komórek. Aby wygenerować linie klonalne z wzbogaconej przez FACS populacji karnie edytowanych komórek, należy przejść do zawiesiny pojedynczej komórki i umieścić dziesięć tysięcy komórek na 10-centymetrowej płytce i pozwolić koloniom rosnąć przez pięć do siedmiu dni.

Kiedy kolonie są widoczne makroskopowo, są wystarczająco duże, aby można je było wyizolować. Na mikroskopie preparacyjnym użyj pipety P200, aby delikatnie zeskrobać i odessać poszczególne kolonie z powierzchni płytki. Przenieść objętość zawierającą kolonię do pojedynczego dołka na płytce 96-dołkowej.

Po przeniesieniu wszystkich kolonii inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny. Po 24 godzinach należy zmienić pożywkę na zwykłą pożywkę wzrostową bez inhibitora ROCK. Następnie kontynuuj karmienie komórek co 24 godziny przez 72 do 96 godzin, aż kolonie w przybliżeniu potroją swoją wielkość.

Komórki będą musiały zostać wyhodowane i pasażowane w 96-dołkowych płytkach, aby mieć wystarczającą liczbę komórek do krioprezerwacji antalizacji w celu ekstrakcji genomowego DNA. Więcej informacji można znaleźć w pisemnym protokole. Aby przejść przez 96-dołkowe płytki, użyj ośmiokanałowego aspiratora, aby usunąć i wyrzucić pożywkę z pierwszej kolumny.

Za pomocą pipety wielokanałowej P200 dodaj około 200 mikrolitrów DPBS do pierwszej kolumny płytki, aby umyć komórki. Za pomocą aspiratora ośmiokanałowego wyjmij i wyrzuć płyn do płukania DPBS z pierwszej kolumny. Następnie dodaj 40 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego do pierwszej kolumny.

Powtórz te kroki, pracując po jednej kolumnie na raz, w sumie do sześciu kolumn płytki 96-dołkowej. Zmień wskazówki, aby upewnić się, że nie zanieczyszczasz studni krzyżowo. Umieścić płytkę w inkubatorze na trzy do pięciu minut od momentu dodania odczynnika dysocjacyjnego do pierwszej kolumny.

Gdy komórki w pierwszej kolumnie płytki zaczną odrywać się od dna, użyj pipety wielokanałowej P200, aby dodać 160 mikrolitrów DPBS do pierwszej kolumny i delikatnie rozcierać komórki w pozycjach godziny 12, 3, 6 i 9 każdej studzienki. Przenieść całą objętość z zawiesiną komórek na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V. Powtórz te kroki dla pozostałych kolumn, w których znajduje się odczynnik dysocjacyjny, zmieniając końcówki, aby nie zanieczyszczać studzienek krzyżowo.

Obracać dolną płytkę w kształcie litery V w wirówce pod ciśnieniem 385 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Sub pokazany do tego momentu dla pasażowania 96 dołków jest wykonywany w ten sam sposób za każdym razem, gdy komórki są pasażowane w tym formacie płytki. Następnie pokażemy Ci, jak postępować, jeśli jesteś gotowy do krioprezerwacji komórek w formacie 96 dołków.

Więcej informacji można znaleźć w pisemnym protokole. Po etapie wirowania pokazanym w poprzednim rozdziale, odessać supernatant za pomocą pipety wielokanałowej P200, a następnie ponownie zawiesić w 60 mikrolitrach pożywki wzrostowej uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Powtórz dla wszystkich studzienek, zmieniając końcówki, aby nie zanieczyszczać krzyżowo.

Przenieś 30 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej pokrytą 96 dołkami. Przenieś pozostałe 30 mikrolitrów zawiesiny na siostrzaną płytkę, a następnie szybko dodaj 170 mikrolitrów buforu zamrażającego do każdej studzienki bez mieszania. Należy zauważyć, że proces ten odbywa się na zduplikowanych płytkach siostrzanych, tak aby po rozmrożeniu jednej z pojedynczych płytek istniała zapasowa populacja komórek.

Umieszczenie komórek kriokonserwowanych tylko w co drugiej kolumnie płytki 96-dołkowej pozwala na szybsze rozmrażanie. Owiń talerz parafolią i umieść go w styropianowym pudełku o temperaturze pokojowej z pokrywką. Umieść całe pudełko w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach talerze można wyjąć z pudełka styropianowego i sortować w temperaturze minus 86 stopni Celsjusza przez okres do czterech tygodni. Kriokonserwacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie 96 dołków pozwala na czasową przerwę w hodowli komórkowej. Badacz może przeprowadzić testy walidacji genomu na kopalniach klonów, aby zidentyfikować genetycznie pożądane klony do rozmrożenia do przyszłych badań.

Cztery dni po transfekcji linii hiPSC WTC z docelowym specyficznym białkiem przewodnikowym RNA Cas9 i starannie zaprojektowanym plazmidem matrycy dawcy, zaobserwowano, że 0,95% komórek wykazuje ekspresję GFP. FACS wykorzystano do posortowania wszystkich komórek GFP dodatnich jako wzbogaconej populacji. Wstępne badania mikroskopowe ujawniły oczekiwaną lokalizację białka fuzyjnego laminy jądrowej B1 mEGFP w otoczce jądrowej.

Białko znakowane fluorescencyjnie zaobserwowano w około 95% komórek z różną intensywnością. Po wygenerowaniu linii klonalnej uzyskano klony o jednolitej intensywności mEGFP i poddano je dalszej analizie w celu precyzyjnej edycji. Podsumowując, pokazaliśmy metodę transfekcji do edycji genów indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu ekspresji endogennie regulowanych fluorescencyjnych białek fuzyjnych.

Ponieważ typowa nieefektywność stukania jest niska, niektóre strategie wzbogacania, takie jak pokazana tutaj metoda FACS, skutkują populacją przypuszczalnie edytowanych komórek wykazujących ekspresję białka fuzyjnego. Wzbogaconą populację można wykorzystać do badań biologicznych lub wygenerować linie klonalne zgodnie z opisem w tej metodzie, co umożliwia identyfikację linii komórkowych, które są precyzyjnie edytowane genowo. Ważne jest, aby pamiętać, że wywołane przez Cas9 podwójne pęknięcia nici w genomie są często naprawiane nieprecyzyjnie, pomimo włączenia znacznika do zamierzonego locus.

Dodatkowo w klonach edytowanych monoallelicznie nieoznakowany allel często zawiera indele najprawdopodobniej spowodowane niehomologiczną naprawą łączenia końców. Odkrycia te podkreślają znaczenie walidacji genetycznej po tym, jak CRISPR Cas9 ujawnił się dopiero w wyniku analizy genomu klonalnych linii komórkowych. Sama ekspresja oczekiwanego białka fuzyjnego nie gwarantuje precyzyjnej edycji.

Korzystając z tego protokołu do edycji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, należy przestrzegać zaleceń wyszczególnionych w pisemnym protokole, aby zapewnić delikatne obchodzenie się z komórkami w celu optymalnego przeżycia komórek i zminimalizowania spontanicznego różnicowania. Mamy nadzieję, że ten film oraz związany z nim protokół i lista materiałów pomogą Ci przeprowadzić podobne eksperymenty we własnym laboratorium na Twoim ulubionym białku. Dzięki za oglądanie.