Name: In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę samoorganizacji białek MinD i MinE na podpartych dwuwarstwach lipidowych w mikroprzestrzeniach PDMS. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę warunków wpływających na formowanie wzorców białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Michaelowi Heymannowi i Frankowi Siedlerowi za produkcję wafli krzemowych, Core Facility MPI-B za pomoc w oczyszczaniu białek oraz Simonowi Kretschmerowi i Leonowi Harringtonowi za komentarze do manuskryptu.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
<li>Roberts, M. A. J., Wadhams, G. H., Hadfield, K. A., Tickner, S., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ParA-like+protein+uses+nonspecific+chromosomal+DNA+binding+to+partition+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ParA-like protein uses nonspecific chromosomal DNA binding to partition protein complexes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (17), 6698-6703 (2012).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> Elife. 2, e00116(2013).</li>
<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy protokół rekonstytucji in vitro samoorganizacji MinCDE na dwuwarstwach lipidowych podpartych planarnie oraz w strukturach 3D pokrytych dwuwarstwami lipidowymi, na przykładzie mikrostruktur PDMS w kształcie pręcików. Aby uzyskać cenne dane z tych testów, najważniejszymi czynnikami, które należy kontrolować, są jakość białka i błony.
Aby zapewnić jakość białka, masę białka należy potwierdzić za pomocą SDS-PAGE i spektrometrii mas. Ponadto należy sprawdzić, czy białka są rozpuszczalne, a nie agregowane, za pomocą analitycznej filtracji żelowej lub dynamicznego rozpraszania światła. Filtracja żelowa może być stosowana do usuwania dowolnej zagregowanej frakcji białek. Staranne dostosowanie pH i jakości dodanych nukleotydów ma kluczowe znaczenie, ponieważ dodanie nieskorygowanych lub częściowo zdegradowanych nukleotydów do zapasów białek lub testów samoorganizujących się jest wystarczające do wyeliminowania aktywności białka, a tym samym zniesienia samoorganizacji.
Obok jakości białka, jakość błony jest najbardziej krytyczna, a niewłaściwe tworzenie błony jest najczęściej przyczyną wadliwej samoorganizacji i powstawaniem artefaktowych struktur powierzchniowych.
Podczas wykonywania protokołu po raz pierwszy pomocne jest oznaczenie obsługiwanych dwuwarstw lipidowych poprzez włączenie znakowanych lipidów, takich jak Atto-655-DOPE lub DiI, o niskiej zawartości molowej (0,05%). W ten sposób można bezpośrednio ocenić właściwości i jakość membrany. Za pomocą FRAP można ocenić płynność membrany. Co więcej, można bezpośrednio ocenić jakość mycia SLB, ponieważ albo będzie zbyt wiele pęcherzyków, albo nie będzie płynnej membrany, albo w ogóle nie będzie membrany, jeśli została zmyta. Podejście z otwartą komorą pozwala na rygorystyczne umycie membrany, a co za tym idzie również na usunięcie pęcherzyków, które przyklejają się do powierzchni SLB. Najważniejszymi czynnikami dla uzyskania płynnych i jednorodnych dwuwarstw lipidowych są czystość i hydrofilowość powierzchni nośnej oraz prawidłowy rozmiar i jednorodność SUVs. Pomocne może być sprawdzenie rozmiaru i rozkładu wielkości SUV-a za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. W przypadku wąskich rozkładów wielkości zalecamy wytłaczanie pęcherzyków, a nie ich sonikację. Inne metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych, np. zabiegi mocnymi bazami, podstawowymi detergentami, czy stosowanie szkiełek nakrywkowych bezpośrednio po spłukaniu wodą, mogą przynieść dobre rezultaty, w zależności od zastosowania i mieszanki lipidów.
Pierwsza połowa przedstawionego tutaj protokołu, rekonstytucja in vitro na dwuwarstwach lipidowych na płaskim podparciu w otwartych komorach, ma tę zaletę, że sprawia, że powierzchnia jest dostępna dla mikroskopii optycznych, takich jak mikroskopia TIRF30, analiza FRAP6, śledzenie pojedynczych cząstek34, a także technik sondowania powierzchni, takich jak mikroskopia sił atomowych26. Duży, jednorodny obszar pozwala na lepsze statystyki przy zdefiniowanych stężeniach. Ponadto podejście z otwartą komorą pozwala na precyzyjną kontrolę stężenia białka oraz szybkie i proste dodawanie kolejnych składników, co pozwala na miareczkowanie stężenia białka w jednej komorze20. Test można również rozszerzyć poprzez dodanie innych składników bakteryjnych, takich jak FtsZ22,35, ZipA22 lub chimeryczne białko FtsZ-YFP-MTS10,35.
Inne grupy przyjęły podobne podejście do odtworzenia systemu Min in vitro, ale używają komory przepływowej zamiast otwartej komory 17,18,19. Komórki przepływowe mają pewne zalety, w szczególności, gdy potrzebne jest całkowicie zamknięte środowisko 3D18, badany jest wpływ przepływu 17,19,23 lub składu błony23 na wzorce MinCDE lub jeśli wzorce białek mają być obserwowane w warunkach ograniczających białka19. Niemniej jednak lokalna kontrola stężeń molekularnych jest trudniejsza. Składniki białkowe, zwłaszcza MinD, silnie wiążą się z błoną, z którą po raz pierwszy się zetkną18,19. Z naszego doświadczenia wynika, że białka często wykazują niespecyficzne wiązanie z rurkami, wlotami, strzykawkami i innymi częściami mikroprzepływowymi. W związku z tym lokalne stężenia białek różnią się od stężeń wejściowych18, a także różnią się w zależności od długości komórki przepływowej, co skutkuje różnorodnością różnych wzorców białek na błonie między wlotem a wylotem, jak zaobserwowano przez innych19.
Druga połowa przedstawionego tutaj protokołu, rekonstytucja in vitro w mikrostrukturach w kształcie pręcików, przy użyciu podejścia z otwartą komorą na wzorzystym podłożu pokrytym dwuwarstwami lipidowymi, pozwala na proste naśladowanie zachowania białek in vivo , nawet jeśli precyzyjna kontrola nad stężeniami białek jest tracona z powodu usunięcia buforu. Należy zauważyć, że ponieważ długość fali MinDE jest o około jeden rząd wielkości większa in vitro niż in vivo , mikrokompartmenty w kształcie pałeczek są również o jeden rząd wielkości większe (10 x 30 μm) niż komórka E. coli w kształcie pałeczki.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na precyzyjną kontrolę wszystkich warunków, w tym stężenia białka, składu buforu i właściwości błony. Zastosowanie strukturalnych nośników 3D umożliwia badanie reakcji w zamknięciu przestrzennym, naśladując zachowanie in vivo bez konieczności stosowania skomplikowanego sprzętu mikroprzepływowego.

Wzorce czasoprzestrzenne są niezbędne w przyrodzie, regulując złożone zadania zarówno na poziomie wielokomórkowym, jak i komórkowym, od morfogenezy do regulowanego podziału komórek1,2. Systemy reakcjonacyjno-dyfuzyjne odgrywają ważną rolę w ustalaniu tych wzorców, ale nadal nie są dobrze poznane. Doskonałym przykładem systemu reakcyjnie dyfuzyjnego i najlepiej scharakteryzowanym systemem biologicznym do tej pory jest system MinCDE Escherichia coli3,4,5,6,7. System MinCDE oscyluje od bieguna komórki do bieguna komórki w E. coli, aby określić środek komórki jako przyszłe miejsce podziału. System ten opiera się na ATPazie MinD, białku aktywującym ATPazę MinE oraz błonie jako przestrzennej macierzy reakcji8. MinC nie jest częścią mechanizmu tworzenia wzorca, ale jest rzeczywistym czynnikiem funkcjonalnym: inhibitorem głównego białka divisom FtsZ5,6. MinC wiąże się z MinD i dlatego podąża za oscylacjami, co skutkuje uśrednionym w czasie gradientem stężenia białka, który jest maksymalny na biegunach komórki i minimalny w środku komórki, umożliwiając polimeryzację FtsZ tylko w midcell9,10. System MinCDE jest częścią większej rodziny ATPaz Walker A, które są kluczowe dla organizacji czasoprzestrzennej u bakterii2, do pozycjonowania i transportu kompleksów białkowych11 i plazmidów12 oraz do regulacji podziału komórek13 i segregacji chromosomów14. W związku z tym system reakcjacyjno-dyfuzyjny MinCDE nie tylko reprezentuje archetypowy system reakcyjny-dyfuzyjny, ale przyciągnął również uwagę ze względu na jego znaczenie dla organizacji czasoprzestrzennej u bakterii.
Szczegółowe badania funkcjonalne systemu MinCDE in vivo są skomplikowane, ponieważ manipulacja białkami i delecja genów zazwyczaj prowadzą do defektów podziału komórek. Co więcej, zmiana składu błony lub właściwości cytozolu in vivo jest bardzo trudna15,16. Zmiany w systemie i czynniki wpływające są trudne do zinterpretowania w złożonym środowisku komórki, tym bardziej, jeśli jest ono zaburzone w tak istotnej funkcji, jak podział komórki. W związku z tym my i inni zwróciliśmy się ku podejściu do rekonstytucji in vitro, redukując system do jego podstawowych składników: MinD, MinE, ATP jako źródła energii i wspieranej dwuwarstwy lipidowej jako matrycy reakcyjnej6,17,18. To oddolne podejście pozwala na szczegółowe zbadanie mechanizmu samoorganizacji bez złożoności żywej komórki. Białka tworzą przemieszczające się fale powierzchniowe6 i inne rodzaje wzorców17,19 w tych warunkach, aczkolwiek o długości fali, która jest zwykle o około wielkość większa niż in vivo. Zastosowanie otwartej komory ułatwia precyzyjną kontrolę wszystkich aspektów wpływających na tworzenie wzorca: stężenia białek6, właściwości białek20, skład błony10, skład buforu i stężenie ATP6, a także dodanie innych czynników, takich jak czynniki tłumiące21 i inne białka divisome22. Dla porównania, odtworzenie in vitro systemu MinCDE w komórce przepływowej18,19,23 można wykorzystać do zbadania wpływu flow17,23, warunki ograniczające białko19, skład błony19 i pełne uwięzienie 3D18 na wzorcach białkowych, ale sprawia, że dokładna kontrola stężenia białka/składnika i sekwencyjne dodawanie składników jest znacznie bardziej skomplikowane.
Korzystając z tej otwartej komory, również ukształtowaliśmy podparcie płaskich dwuwarstw lipidowych, dzięki czemu można zbadać, jak granice geometryczne wpływają na tworzenie wzorców21, zjawisko, które ostatnio zostało również zbadane in vivo przy użyciu bakterii uformowanych w mikrostruktury7. Zastosowaliśmy również ten test, aby zbadać, w jaki sposób zdefiniowane mutacje w MinE wpływają na tworzenie wzorca systemu20. Co więcej, ten sam podstawowy format testu został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób tworzenie wzorca może być kontrolowane przez światło, wprowadzając do testu peptyd MinE usieciowany azobenzenem i obrazując za pomocą mikroskopii TIRF24.
Stwierdziliśmy, że kluczem do odtworzenia wzorca MinDE obserwowanego in vivo w systemie in vitro, było zamknięcie. Zastosowanie mikrokompartmentów w kształcie pręcików, o wymiarach dostosowanych do większej długości fali MinDE in vitro (10 x 30 μm), pokrytych podpartą dwuwarstwą lipidową, umożliwiło odtworzenie oscylacji MinDE między biegunami i tworzenie gradientu białek10,25. W tym teście podparte dwuwarstwy lipidowe są osadzane na wzorzystym podłożu PDMS, które zawiera kilkaset replik mikrokompartmentów w kształcie pręcików, które pozostają otwarte na górze. W ten sposób reakcję można zapoczątkować w otwartej komorze, a następnie bufor jest opuszczany do krawędzi mikrokompartmentów, ograniczając w ten sposób reakcję do niewielkiej objętości. Mimo że te komory mają z jednej strony interfejs bufora powietrznego, a zatem nie reprezentują pełnego zamknięcia 3D przez błonę, dynamika białka naśladowała oscylacje in vivo10,25. W porównaniu z pełnym zamknięciem 3D, które daje bardzo podobne wyniki18, otwarty test mikrostruktur jest stosunkowo prosty i łatwy w obsłudze, a także może być wykonywany przez laboratoria, które nie są wyposażone w specjalistyczny sprzęt mikrofluidyczny i pomieszczenia czyste.
Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół odtwarzania formowania wzorca MinCDE na wspieranych dwuwarstwach lipidowych in vitro przy użyciu otwartej komory, który pozwala na kontrolę wszystkich komponentów i łatwy dostęp za pomocą mikroskopii optycznej i, z niewielkimi modyfikacjami, można go również dostosować do technik sondowania powierzchni26. Oprócz dwuwarstw lipidowych podpartych planarnie, pokazujemy również, w jaki sposób można uzyskać uwięzienie białek za pomocą prostych, wzorzystych dwuwarstw lipidowych na mikrostrukturach PDMS w kształcie pręcików. Testy te, choć zoptymalizowane pod kątem systemu MinCDE, mogą być również przenoszone do innych systemów białkowych, które oddziałują w podobny sposób z błoną, takich jak FtsZ27 lub minimalna kora aktynowa28.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z lipidów polarnych E.coli</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5&-trifosforanowa sól disodowa trójwodzian</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól monopotasowa adenozyno-5&prime;-difosforan dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tetraoctan etylenodiaminy</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy 98%</td> <td>Zastosowanie</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 50%</td> <td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glicerol 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB średni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agaroza</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS baza</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr>Dobrze sprawdza się <td>sieciownik PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 i #63</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>stosowany tylko do mikrostruktur PDMS</td></tr><tr><td>0,5 ml probówka reakcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>0030123301</tr><tr><td>kolba hodowlana 2L</td><td>Corning</td><td>np. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences Kolumna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do filtracji żelowej: HiLoad Superdex 75 PG lub 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG kolumna odsalająca</td><td>kolumna z opakowaniem Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>urządzenie do dializy: Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 3,5 tys. MWCO, 0,1 - 0,5 ml lub 0,5-3 ml</td><td>Żyletka</td><td></td> Termo Fisher Scientific 66333 lub 66330 <td></td></tr><tr><td>< mocna>Instrumenty</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultraczysta woda: Milli-Q Typ 1 Systemy wody ultraczystej</td><td>Automatyczny</td> system oczyszczania białek Merck<td></td><td></td></tr>: <tr><td></td> &Auml;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonikator do kąpieli</td><td>Branson</td><td></td><td>np. Model 1510</td></tr><tr><td>Mikser ARE-250</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myjka plazmowa Zepto</td><td>Diener elektroniczne</td><td></td><td>zastosowanie tlenu jako gazu procesowego</td></tr><tr><td>Pipety wyporowe</td><td>Marka</td><td></td><td>Transferpettor z końcówkami</td></tr> <tr><td>szklanymiKonfokalny laserowy mikroskop skaningowy LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Wyposażony w Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 soczewki zanurzeniowe w wodzie</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille</td><td></td><td>kodujący plazmid His-MinD i nieoznakowany MinE w celu poprawy wydajności</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille</td><td></td><td>kodujący plazmid His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille</td><td></td><td>kodujący plazmid His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille</td><td></td><td>kodowanie plazmidu His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille</td><td></td><td>kodujący plazmid His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Wiele aspektów podstawowej czasoprzestrzennej organizacji komórek jest regulowanych przez systemy typu reakcyjno-dyfuzyjnego. Rekonstrukcja takich układów in vitro pozwala na szczegółowe badania mechanizmów leżących u ich podstaw, które nie byłyby możliwe do zrealizowania in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokół rekonstytucji in vitro systemu MinCDE Escherichia coli, który umieszcza przegrodę podziału komórkowego w środku komórki. Test ma na celu dostarczenie tylko składników niezbędnych do samoorganizacji, a mianowicie błony, dwóch białek MinD i MinE oraz energii w postaci ATP. W związku z tym wytwarzamy otwartą komorę reakcyjną na szkiełku nakrywkowym, na którym tworzy się podparta dwuwarstwa lipidowa. Otwarta konstrukcja komory pozwala na optymalne przygotowanie dwuwarstwy lipidowej i kontrolowaną manipulację zawartością sypką. Dwa białka, MinD i MinE, a także ATP, są następnie dodawane do objętości masowej nad błoną. Obrazowanie jest możliwe za pomocą wielu mikroskopów optycznych, ponieważ konstrukcja obsługuje zarówno mikroskopię konfokalną, szerokokątną, jak i TIRF. W odmianie protokołu dwuwarstwa lipidowa jest tworzona na wzorzystym podłożu, na mikrostrukturach PDMS w kształcie komórki, zamiast na szkle. Obniżenie roztworu objętościowego do krawędzi tych przedziałów zamyka reakcję w mniejszej komorze i zapewnia granice, które pozwalają naśladować zachowanie oscylacyjne in vivo. Podsumowując, opisujemy protokoły rekonstrukcji systemu MinCDE zarówno z ograniczeniem przestrzennym, jak i bez niego, co pozwala naukowcom precyzyjnie kontrolować wszystkie aspekty wpływające na tworzenie wzorców, takie jak zakresy stężeń i dodawanie innych czynników lub białek, a także systematycznie zwiększać złożoność systemu w stosunkowo prostej konfiguracji eksperymentalnej.

Oczyszczanie białek zgodnie z naszym protokołem powinno przynieść białka Min o odpowiedniej czystości. Jako punkt odniesienia, Rysunek 1 przedstawia obraz SDS-PAGE białek MinD, fluorescencyjnie znakowanego MinD, MinE oraz MinC. Poszczególne kroki procedury przeprowadzenia testu samoorganizacji MinDE na niepatternowanych lipidowych dwuwarstwach wspieranych opisano na Rysunku 2. Stosując ten protokół, w całej komorze można zaobserwować regularne wędrujące fale powierzchniowe MinDE (Rysunek 3). Długość fali może się nieznacznie różnić w obrębie komory, ale ogólnie wzorce wyglądają podobnie. Krawędzi komory nie należy wykorzystywać do porównań ilościowych, ponieważ membrany tworzące się na kleju UV wydają się mieć inne właściwości niż na powierzchni szkła (patrz Rysunek 3C). Wędrujące fale powierzchniowe można analizować, wykreślając intensywność wzdłuż kierunku propagacji (Rysunek 3B). Podczas gdy fluorescencja MinD osiąga plateau dość szybko od przedniej krawędzi fali, a następnie gwałtownie spada na krawędzi tylnej, fluorescencja MinE wzrasta niemal liniowo od początku fali MinD i osiąga maksimum po MinD na krawędzi tylnej, gdzie wyraźnie opada6.
Obok jakości białek, najbardziej krytyczna dla regularnej samoorganizacji MinCDE jest jakość wspomaganych dwuwarstw lipidowych. Z jednej strony, jeśli membrana zostanie zbyt intensywnie przemyta lub powierzchnia podkładowa została oczyszczona i tym samym zbyt silnie naładowana, w membranie mogą powstać otwory (Rysunek 6A, góra). Z drugiej strony, jeśli membrana nie zostanie odpowiednio przemyta lub powierzchnia podkładowa nie zostanie oczyszczona/zhydrofilizowana, pęcherzyki będą przylegać do membrany lub płynność membrany zostanie zaburzona (Rysunek 6A, dół). Mimo że nie jest to tak oczywiste jak przy bezpośredniej obserwacji membrany za pomocą znakowanych lipidów, problemy te można również wykryć na podstawie sygnału fluorescencji MinD, ponieważ wzory nie są regularne, a fluorescencja w maksimach nie jest jednorodna, lecz zawiera „dziury” lub jasne punkty, jak pokazano na środkowym panelu Rysunku 6A.
Procedura samoorganizacji MinDE w prętowatych mikrostrukturach z PDMS została podsumowana na Rysunku 4. Niektóre etapy protokołu nie wymagają powtórzenia, ponieważ białka i lipidy mogą zostać użyte ponownie. Podobnie jak w przypadku podłoży nieustrukturyzowanych, podłoże jest czyszczone i hydrofilizowane (poprzez czyszczenie plazmowe), na PDMS formowana jest wspierana dwuwarstwa lipidowa, a następnie przygotowywany jest test samoorganizacji w objętości 200 µL. Aby sprawdzić, czy utworzyła się prawidłowa błona i czy MinDE samoorganizuje się na błonie, wykonuje się obrazowanie komór. Po uformowaniu prawidłowej błony MinDE tworzy regularne, wędrujące fale powierzchniowe na powierzchni PDMS pomiędzy poszczególnymi mikrostrukturami, a także samoorganizuje się na dnie mikrostruktur, ponieważ fale mogą swobodnie poruszać się po całej powierzchni pokrytej błoną (Rysunek 5A). Po usunięciu buforu powierzchnia pomiędzy przedziałami nie powinna wykazywać żadnych propagujących wzorów MinDE (Rysunek 5B), ponieważ powinna być całkowicie sucha. Jeśli wzory MinDE nadal się poruszają, należy usunąć więcej buforu. Białka są teraz ograniczone w prętowatych mikroprzedziałach przez pokryty błoną PDMS oraz przez powietrze na górnym interfejsie (Rysunek 5C), gdzie ulegną samoorganizacji. W tych warunkach dwa białka mogą wykonywać oscylacje od bieguna do bieguna, co pokazano na Rysunku 5D. Ponieważ część MinD i MinE jest zawsze związana z błoną, również podczas usuwania buforu, stężenia po usunięciu buforu nie są porównywalne ze stężeniami wejściowymi. Z powodu tego efektu stężenia różnią się również pomiędzy poszczególnymi mikrostrukturami na tym samym szkiełku podstawowym, ponieważ zależą one od położenia wzorów przed usunięciem buforu. Produkcja wafli krzemowych lub formowanie PDMS z wafla krzemowego może prowadzić do powstania niepełnych mikrostruktur, których nie można wykorzystać do analizy (Rysunek 6B). Ponadto, ze względu na usuwanie buforu, mikrostruktury mogą wyschnąć podczas tego procesu, a zatem powinny zostać wykluczone z dalszej analizy (Rysunek 6B). W rezultacie tylko część mikrostruktur w jednej komorze wykazuje pożądane oscylacje od bieguna do bieguna. Aby przeanalizować dynamikę białek w mikrostrukturach, można uzyskać kymograf, kreśląc obszar zaznaczenia nad całą strukturą (Rysunek 5E). Gdy MinCDE oscylują od bieguna do bieguna, MinC i MinD wykażą uśredniony w czasie gradient stężeń z maksymalnym stężeniem na biegunach przedziału i minimalnym stężeniem w środku przedziału (Rysunek 5F).
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej SDS-PAGE dla białek z tagiem His, rozdział prążków według masy cząsteczkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: SDS-PAGE przedstawiająca końcowe produkty oczyszczania białek. Po kolei przedstawiono białka His-MinD (33.3 kDa), His-eGFP-MinD (60.1 kDa), His-mRuby3-MinD (59.9 kDa), His-MinE (13.9 kDa) oraz His-MinC (28.3 kDa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat testu samoorganizacji; formowanie SLB; proces akwizycji i analizy obrazów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat procesu przedstawiający poszczególne kroki i ramy czasowe protokołu samoorganizacji na nieuformowanych wspomaganych dwuwarstwach lipidowych (kroki 1-6). Przerywane ramki wskazują, że do czyszczenia można zastosować jedną z dwóch opcji. Strzałki oznaczone okręgami wskazują miejsca, w których protokół można przerwać i wznowić później. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowy wzór spiralny; wykres intensywności fluorescencji; analiza obrazu prążków interferencyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazowanie testu MinDE za pomocą mikroskopii konfokalnej. A) Regularna spirala Min, z której można wyznaczyć prędkość propagacji fali, wykres intensywności oraz pomiary prędkości. Zastosowane stężenia: 0.6 µM MinD (30% eGFP-MinD), 1.8 µM His-MinE (30% His-MinE-Alexa647) B) Przykład znormalizowanego wykresu intensywności dla obszaru zaznaczonego w A. C) Przegląd całej komory testowej (pasek skali: 1 mm, te same stężenia białek co powyżej). Można zaobserwować spirale obracające się w obu kierunkach, a także wzory docelowe. Powiększony obszar pokazuje, jak wzory fal różnią się na kleju UV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat blokowy procesu analizy obrazu płytki krzemowej: struktury PDMS, SUV, SLB, test samoorganizacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat blokowy procesu przedstawiający poszczególne kroki i ramy czasowe protokołu samoorganizacji w prętowych mikrostrukturach (Kroki 1-5, 7, 8). Szare pola oznaczają etapy, w których można ponownie wykorzystać produkty z protokołu dotyczącego niepatternowanych wspieranych dwuwarstw lipidowych. Strzałki oznaczone kółkami wskazują miejsca, w których protokół można wstrzymać i wznowić w późniejszym czasie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia efektów usuwania buforu na mikrostruktury fluorescencyjne; sekwencja time-lapse, wykres intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki formowania wzorów MinDE w prętowatych mikroprzedziałach z PDMS. A) MinDE samoorganizują się na powierzchni PDMS, tworząc wędrujące fale powierzchniowe (1 µM MinD (30% EGFP-MinD), 2 µM MinE i 2,5 mM ATP). B) Po obniżeniu poziomu buforu do wysokości mikrostruktur, samoorganizacja białek ustaje na płaskiej powierzchni między mikroprzedziałami. C) Schemat jednego prętowatego mikroprzedziału. D) Reprezentatywne obrazy oscylacji MinDE od bieguna do bieguna po usunięciu buforu. E) Kimograf oscylacji wzdłuż wyróżnionej linii pokazanej na D). F) Obraz i profil średniej intensywności fluorescencji serii czasowej pokazanej na D), wyraźnie wykazujące gradient białka, który jest maksymalny przy biegunach mikroprzedziału i minimalny w jego środku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe problemów z membranami, adhezją pęcherzyków i mikroprzedziałami z fluorescencją." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przykłady negatywnych wyników eksperymentalnych. A) Zbyt intensywne płukanie membran prowadzi do powstawania dziur, natomiast nieoptymalne preparaty pęcherzyków i składy lipidowe skutkują ich zlepianiem się. Dwa środkowe panele pokazują kombinację obu tych problemów oraz sposób, w jaki stają się one widoczne podczas obserwacji oscylacji Min. Membrany znakowano Atto655-DOPE 0,05%. (paski skali: 50 µm) B) Górny panel: Wysuszone mikroprzedziały mogą być wynikiem usunięcia zbyt dużej ilości buforu lub odparowania buforu w czasie. Dolny panel: Niekompletne przedziały mogą powstać podczas produkcji wafli lub formowania z PDMS. (paski skali: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Mapa plazmidu dla His-MinD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Mapa plazmidu dla His-EGFP-MinD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Mapa plazmidu dla His-mRuby3-MinD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Mapa plazmidu dla His-MinE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Mapa plazmidu dla His-MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 6: Plik CAD dla wafla krzemowego z mikrokompartmentami w kształcie pręta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące organizacji komórek i błon, na przykład, jaką rolę odgrywają w tym procesie wskazówki geometryczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na precyzyjną kontrolę nad wszystkimi aspektami wpływającymi na tworzenie wzorca, takimi jak stężenie białek. Na początek wygeneruj pęcherzyki wielopłytkowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Teraz zamrażaj i rozmrażaj lipidy przez siedem do 10 cykli, najpierw przygotowując zlewkę z wodą o temperaturze od 70 do 99 stopni Celsjusza na gorącej płycie, a także pojemnik z ciekłym azotem. Trzymaj fiolkę w ciekłym azocie za pomocą dużej pęsety, aż azot przestanie wrzeć. Następnie przenieść fiolkę do gorącej wody, aż roztwór całkowicie się rozmrozi.Powtarzaj te kroki, aż mieszanina lipidów stanie się przezroczysta dla oka, w zależności od mieszaniny. Następnie zmontuj wytłaczarkę lipidową i wstępnie przepłucz układ buforem Min. Wytłaczaj mieszaninę lipidów od 35 do 41 razy przez membranę o wielkości porów 50 nanometrów.Upewnij się, że kończysz na nieparzystej liczbie przejść, aby uniknąć agregatów, które nigdy nie przeszły przez membranę. Rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na odwróconej szklanej szalce Petriego lub innej obojętnej powierzchni. Za pomocą szklanej pipety dodaj siedem kropli stężonego kwasu siarkowego do środka każdego szkiełka nakrywkowego.Następnie dodaj dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka kropli kwasu. Przykryj reakcję i inkubuj przez co najmniej 45 minut. Teraz podnieś szkiełka nakrywkowe pojedynczo za pomocą pęsety i spłucz kwas ultraczystą wodą.Umyte szkiełka nakrywkowe należy umieścić w nieprzywierającym uchwycie lub podobnym urządzeniu transportowym. Teraz dokładnie spłucz każde szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą i osusz powierzchnię gazem pod ciśnieniem. Zaznacz czystą stronę szkiełka nakrywkowego markerem permanentnym.Aby zmontować komorę, najpierw odetnij i wyrzuć pokrywę i stożkową część rurki reakcyjnej o pojemności 0,5 mililitra ostrymi nożyczkami. Następnie nałóż klej UV na górną krawędź tubki i równomiernie rozprowadź klej za pomocą końcówki pipety. Przyklej tubkę do góry nogami do czystej strony szkiełka nakrywkowego.Na koniec utwardź klej UV, umieszczając wiele komór pod lampą 360 nanometrów lub diodą LED na pięć do 15 minut. W celu wsparcia tworzenia dwuwarstwowej warstwy lipidowej podgrzej blok grzewczy do 37 stopni Celsjusza i inkubuj dwie mililitrowe probówki reakcyjne z buforem Min lub SLB po jednej probówce na komorę. Wdmuchnij azot do zmontowanych i utwardzonych komór, aby usunąć kurz lub inne cząstki, które mogły osiąść podczas utwardzania i montażu UV.Następnie umieść komory na bloku grzewczym. Rozcieńczyć 20 mikrolitrów klarownych lipidów 130 mikrolitrami buforu Min, budując stężenie robocze 0,53 miligrama na mililitr. Dodaj 75 mikrolitrów mieszaniny lipidów do każdej komory.Teraz ustaw minutnik na trzy minuty. W czasie inkubacji pęcherzyki pękają na powierzchni szkła hydrofilowego i łączą się, tworząc spójny SLB. Po upływie 60 sekund dodaj 150 mikrolitrów buforu Min do każdej komory.Po pozostałych 120 sekundach umyj każdą komorę, dodając 200 mikrolitrów buforu Min lub SLB, ostrożnie pipetując kilka razy w górę iw dół, usuwając i dodając kolejne 200 mikrolitrów. Po jednokrotnym umyciu każdej komory przystąp do dokładnego mycia pierwszej komory, aż do zużycia dwóch mililitrów buforu. Mycie podpartych dwuwarstw lipidowych wymaga pewnego doświadczenia, aby udoskonalić zakres ruchów w komorze i znaleźć odpowiednią intensywność mycia.Aby wytworzyć mikrostruktury PDMS z wzorzystych wafli krzemowych, najpierw użyj plastikowego kubka do zważenia 10 gramów zasady PDMS i jednego grama środka sieciującego PDMS. Użyj urządzenia mieszającego, aby wymieszać i odgazować mieszaninę PDMS. Teraz użyj końcówki pipety, aby upuścić niewielką ilość PDMS bezpośrednio na strukturę płytki krzemowej.Natychmiast umieść 1 szkiełko nakrywkowe na kropli PDMS i weź górny koniec czystej końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do płytki silikonowej. PDMS powinien rozprowadzać się cienko między szkiełkiem nakrywkowym a płytką krzemową. Umieść wafel z szkiełkami nakrywkowymi w piekarniku i utwardzaj PDMS przez trzy do czterech godzin lub przez noc w temperaturze 75 stopni Celsjusza.Następnie wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą żyletki ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z dołączonym PDMS z płytki silikonowej. Teraz przymocuj plastikową komorę do PDMS, jak opisano wcześniej dla szkła.Weź szkiełka nakrywkowe z dołączoną komorą i umieść w myjce plazmowej z tlenem jako gazem procesowym. Wyczyść szkiełka nakrywkowe plazmą. W tej pracy użyto 30% mocy i ciśnienia tlenu 0,3 milibara przez jedną minutę.Teraz przygotuj SLB w komorze, jak opisano wcześniej na szkle. Aby przeprowadzić test samoorganizacji, dostosuj objętość buforu w komorze do 200 mikrolitrów buforu Min, pomniejszoną o ilość białka i roztworu ATP. Następnie dodaj MinD, oznaczone MinD, MinE i, w razie potrzeby, MinC i delikatnie wymieszaj składniki, pipetując.Teraz dodaj 2,5 milimolowego ATP, aby rozpocząć samoorganizację MinDE. W ciągu następnych 10 do 30 minut sprawdź, czy pod mikroskopem fluorescencyjnym nie ma regularnego tworzenia się wzoru MinDE i prawidłowo uformowanych mikrostruktur. Gdy uformują się regularne wzory MinDE, delikatnie pipetuj w górę i w dół dwa razy, aby wymieszać składniki.Usuń dużą ilość buforu za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów, a następnie ostrożnie usuń resztę za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Aby umożliwić dłuższy czas obrazowania, włóż zwilżony kawałek gąbki do komory. Upewnij się, że gąbka nie styka się z powierzchnią szkiełka nakrywkowego.Natychmiast zamknąć komorę pokrywą, aby uniknąć wysuszenia resztkowego buforu w mikrostrukturach. Przed obrazowaniem mikrostruktur należy upewnić się, że samoorganizacja MinDE jest zatrzymana na mikrostrukturze PDMS, podczas gdy białka w mikrojamach oscylują. W tym reprezentatywnym filmie obrazowanie dwukolorowe pokazuje, w jaki sposób MinD i MinE samoorganizują się w przemieszczające się fale powierzchniowe, które dostosowują się do spiralnych wzorów na obsługiwanych dwuwarstwach lipidowych.W tym przypadku obrazowanie jednokolorowe pokazuje, że MinD i MinE wykonują oscylacje między biegunami w mikrostrukturach PDMS. Oscylacje ustalają uśredniony w czasie gradient stężenia MinD z maksymalnym stężeniem na biegunach komory i minimalnym stężeniem w środku komory. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie pojedynczych cząstek, w celu określenia kinetyki wiązania błony i czasu przebywania.Nie zapominaj, że praca z roztworem piranii może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.

in-vitro-reconstitution-self-organizing-protein-patterns-on-supported

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Tutaj prezentujemy dwa ultraszybkie protokoły do rekonstytucji białek błonowych w fuzogenne proteoliposomy oraz fuzji takich proteoliposomów z docelowymi dwuwarstwami lipidowymi w celu bezdetergentowego dostarczania tych białek błonowych do dwuwarstwy pofuzyjnej. Połączenie tych podejść umożliwia szybki i łatwy w obsłudze montaż złożonych, wieloskładnikowych systemów membranowych.

Ultraszybka rekonstytucja białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych bez użycia fusogenicznych proteoliposomów naładowanych komplementarnie.

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Tutaj opisany jest protokół do generowania regulowanych światłem i odwracalnych wzorców białkowych z wysoką precyzją czasoprzestrzenną na sztucznych błonach lipidowych. Metoda polega na zlokalizowanej fotoaktywacji białka iLID (ulepszonego dimeru indukowanego światłem) unieruchomionego na błonach modelowych, które w świetle niebieskim wiąże się ze swoim białkiem partnerskim Nano (SspB typu dzikiego).

Dynamiczne wzorce białek indukowane światłem na błonach modelowych

Poznaj metodę samoorganizacji białek MinD i MinE na podpartych dwuwarstwach lipidowych w mikroprzestrzeniach PDMS. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę warunków wpływających na formowanie wzorców białkowych.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Przeglądaj więcej filmów