In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące organizacji komórek i błon, na przykład, jaką rolę odgrywają w tym procesie wskazówki geometryczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na precyzyjną kontrolę nad wszystkimi aspektami wpływającymi na tworzenie wzorca, takimi jak stężenie białek. Na początek wygeneruj pęcherzyki wielopłytkowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Teraz zamrażaj i rozmrażaj lipidy przez siedem do 10 cykli, najpierw przygotowując zlewkę z wodą o temperaturze od 70 do 99 stopni Celsjusza na gorącej płycie, a także pojemnik z ciekłym azotem. Trzymaj fiolkę w ciekłym azocie za pomocą dużej pęsety, aż azot przestanie wrzeć. Następnie przenieść fiolkę do gorącej wody, aż roztwór całkowicie się rozmrozi

Powtarzaj te kroki, aż mieszanina lipidów stanie się przezroczysta dla oka, w zależności od mieszaniny. Następnie zmontuj wytłaczarkę lipidową i wstępnie przepłucz układ buforem Min. Wytłaczaj mieszaninę lipidów od 35 do 41 razy przez membranę o wielkości porów 50 nanometrów.

Upewnij się, że kończysz na nieparzystej liczbie przejść, aby uniknąć agregatów, które nigdy nie przeszły przez membranę. Rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na odwróconej szklanej szalce Petriego lub innej obojętnej powierzchni. Za pomocą szklanej pipety dodaj siedem kropli stężonego kwasu siarkowego do środka każdego szkiełka nakrywkowego.

Następnie dodaj dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka kropli kwasu. Przykryj reakcję i inkubuj przez co najmniej 45 minut. Teraz podnieś szkiełka nakrywkowe pojedynczo za pomocą pęsety i spłucz kwas ultraczystą wodą.

Umyte szkiełka nakrywkowe należy umieścić w nieprzywierającym uchwycie lub podobnym urządzeniu transportowym. Teraz dokładnie spłucz każde szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą i osusz powierzchnię gazem pod ciśnieniem. Zaznacz czystą stronę szkiełka nakrywkowego markerem permanentnym.

Aby zmontować komorę, najpierw odetnij i wyrzuć pokrywę i stożkową część rurki reakcyjnej o pojemności 0,5 mililitra ostrymi nożyczkami. Następnie nałóż klej UV na górną krawędź tubki i równomiernie rozprowadź klej za pomocą końcówki pipety. Przyklej tubkę do góry nogami do czystej strony szkiełka nakrywkowego.

Na koniec utwardź klej UV, umieszczając wiele komór pod lampą 360 nanometrów lub diodą LED na pięć do 15 minut. W celu wsparcia tworzenia dwuwarstwowej warstwy lipidowej podgrzej blok grzewczy do 37 stopni Celsjusza i inkubuj dwie mililitrowe probówki reakcyjne z buforem Min lub SLB po jednej probówce na komorę. Wdmuchnij azot do zmontowanych i utwardzonych komór, aby usunąć kurz lub inne cząstki, które mogły osiąść podczas utwardzania i montażu UV.

Następnie umieść komory na bloku grzewczym. Rozcieńczyć 20 mikrolitrów klarownych lipidów 130 mikrolitrami buforu Min, budując stężenie robocze 0,53 miligrama na mililitr. Dodaj 75 mikrolitrów mieszaniny lipidów do każdej komory.

Teraz ustaw minutnik na trzy minuty. W czasie inkubacji pęcherzyki pękają na powierzchni szkła hydrofilowego i łączą się, tworząc spójny SLB. Po upływie 60 sekund dodaj 150 mikrolitrów buforu Min do każdej komory.

Po pozostałych 120 sekundach umyj każdą komorę, dodając 200 mikrolitrów buforu Min lub SLB, ostrożnie pipetując kilka razy w górę iw dół, usuwając i dodając kolejne 200 mikrolitrów. Po jednokrotnym umyciu każdej komory przystąp do dokładnego mycia pierwszej komory, aż do zużycia dwóch mililitrów buforu. Mycie podpartych dwuwarstw lipidowych wymaga pewnego doświadczenia, aby udoskonalić zakres ruchów w komorze i znaleźć odpowiednią intensywność mycia.

Aby wytworzyć mikrostruktury PDMS z wzorzystych wafli krzemowych, najpierw użyj plastikowego kubka do zważenia 10 gramów zasady PDMS i jednego grama środka sieciującego PDMS. Użyj urządzenia mieszającego, aby wymieszać i odgazować mieszaninę PDMS. Teraz użyj końcówki pipety, aby upuścić niewielką ilość PDMS bezpośrednio na strukturę płytki krzemowej.

Natychmiast umieść 1 szkiełko nakrywkowe na kropli PDMS i weź górny koniec czystej końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do płytki silikonowej. PDMS powinien rozprowadzać się cienko między szkiełkiem nakrywkowym a płytką krzemową. Umieść wafel z szkiełkami nakrywkowymi w piekarniku i utwardzaj PDMS przez trzy do czterech godzin lub przez noc w temperaturze 75 stopni Celsjusza.

Następnie wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą żyletki ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z dołączonym PDMS z płytki silikonowej. Teraz przymocuj plastikową komorę do PDMS, jak opisano wcześniej dla szkła.

Weź szkiełka nakrywkowe z dołączoną komorą i umieść w myjce plazmowej z tlenem jako gazem procesowym. Wyczyść szkiełka nakrywkowe plazmą. W tej pracy użyto 30% mocy i ciśnienia tlenu 0,3 milibara przez jedną minutę.

Teraz przygotuj SLB w komorze, jak opisano wcześniej na szkle. Aby przeprowadzić test samoorganizacji, dostosuj objętość buforu w komorze do 200 mikrolitrów buforu Min, pomniejszoną o ilość białka i roztworu ATP. Następnie dodaj MinD, oznaczone MinD, MinE i, w razie potrzeby, MinC i delikatnie wymieszaj składniki, pipetując.

Teraz dodaj 2,5 milimolowego ATP, aby rozpocząć samoorganizację MinDE. W ciągu następnych 10 do 30 minut sprawdź, czy pod mikroskopem fluorescencyjnym nie ma regularnego tworzenia się wzoru MinDE i prawidłowo uformowanych mikrostruktur. Gdy uformują się regularne wzory MinDE, delikatnie pipetuj w górę i w dół dwa razy, aby wymieszać składniki.

Usuń dużą ilość buforu za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów, a następnie ostrożnie usuń resztę za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Aby umożliwić dłuższy czas obrazowania, włóż zwilżony kawałek gąbki do komory. Upewnij się, że gąbka nie styka się z powierzchnią szkiełka nakrywkowego.

Natychmiast zamknąć komorę pokrywą, aby uniknąć wysuszenia resztkowego buforu w mikrostrukturach. Przed obrazowaniem mikrostruktur należy upewnić się, że samoorganizacja MinDE jest zatrzymana na mikrostrukturze PDMS, podczas gdy białka w mikrojamach oscylują. W tym reprezentatywnym filmie obrazowanie dwukolorowe pokazuje, w jaki sposób MinD i MinE samoorganizują się w przemieszczające się fale powierzchniowe, które dostosowują się do spiralnych wzorów na obsługiwanych dwuwarstwach lipidowych.

W tym przypadku obrazowanie jednokolorowe pokazuje, że MinD i MinE wykonują oscylacje między biegunami w mikrostrukturach PDMS. Oscylacje ustalają uśredniony w czasie gradient stężenia MinD z maksymalnym stężeniem na biegunach komory i minimalnym stężeniem w środku komory. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie pojedynczych cząstek, w celu określenia kinetyki wiązania błony i czasu przebywania.

Nie zapominaj, że praca z roztworem piranii może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.