Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z progresją nowotworu. Bezkomórkowy i komórkowy model płuc ex vivo pozwala na tworzenie się guza pierwotnego, który rośnie z czasem i tworzy krążące komórki nowotworowe oraz zmiany przerzutowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie progresji raka w skróconym czasie i wzrostu różnych typów komórek nowotworowych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą spersonalizowaną terapię, ponieważ komórki nowotworowe od pacjentów mogą być wykorzystywane w modelu do oceny skuteczności leków terapeutycznych, w tym komórek odpornościowych. Zacznij od głęboko znieczulonego szczura. Ogol klatkę piersiową i brzuch, a następnie przetrzyj skórę wacikiem z chlorheksydyną.

Po otwarciu jamy klatki piersiowej należy wykonać torakotomię obustronną, przecinając przednią stronę klatki piersiowej po lewej stronie po prawej stronie przepony. Przytrzymaj klatkę piersiową do góry i wstrzyknij dwa mililitry heparyny po 1000 jednostek na mililitr do prawej komory bijącego serca za pomocą igły o rozmiarze 27, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi w płucach. Po usunięciu klatki piersiowej umieść igłę o rozmiarze 18 G w lewej komorze jako odpowietrznik, aby umożliwić wydostanie się krwi, a następnie użyj igły o rozmiarze 25, aby wstrzyknąć 15 mililitrów 12,5 jednostek na mililitr heparynizowanego PBS do prawej komory.

Następnie przetnij tchawicę u podstawy tarczycy i ostrożnie usuń aortę zstępującą na poziomie żyły hemiazygotycznej i gałęzi aorty na łuku. Po usunięciu bloku płuco-serce z jamy klatki piersiowej należy odciąć połowę prawej i lewej komory, a następnie umieścić specjalnie wykonaną kaniulę igłową ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18 przez prawą komorę do głównej tętnicy płucnej. Zabezpiecz kaniulę jedwabną opaską 2-0 i ostrożnie odsłoń prawą komorę i przedsionek.

Zacznij od uruchomienia heparynizowanego PBS przy fizjologicznym ciśnieniu perfuzji 30 milimetrów słupa rtęci, aż swobodnie wpłynie do butelki jednostki decelularyzacyjnej, a następnie podłącz blok płuco-serce do jednostki decelularyzacji na końcu tętnicy płucnej przez kaniulę tętnicy płucnej. Po 15 minutach mycia heparynizowanym PBS zastąp heparynizowaną butelkę PBS na butelkę zawierającą 0,15% dodecylosiarczanu sodu i wodę dejonizowaną i perfuzję płuc przez dwie godziny w celu decelularyzacji. Po decelularyzacji perfaktoryzowaną autoklawowaną wodę perfektywną przez rusztowanie płuc przez 15 minut, a następnie 1% niejonowy detergent w wodzie dejonizowanej przez 10 minut.

Na koniec zastąp butelkę 500 mililitrami autoklawizowanego PBS uzupełnionego antybiotykami. Uruchom pompę z prędkością sześciu mililitrów na minutę i wykonuj płuca przez 72 godziny, po czym bezkomórkowe płuco jest gotowe do natychmiastowego użycia. Rozpyl 70% etanol na wkład pompy i ustaw natleniacz, podłączając końcówkę odpływową natleniacza do rurki pompy, a drugi koniec do rurki o długości 1,5 stopy w bioreaktorze.

Ustaw butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach aseptycznych. Przymocuj trójkierunkowy kran do główki żeńskiej zamka Luer, aby kontrolować przepływ przez tętnicę płucną, a następnie podłącz jednokierunkowy kran do innej żeńskiej grodzi Luer lock w celu wysiewu komórek przez tchawicę. Podłącz dwucalową rurkę na zewnątrz i sześciocalową rurkę po wewnętrznej stronie butelki, aby zapewnić cyrkulację medium.

Przygotuj rurkę do podłączenia butelki bioreaktora do natleniacza. Zamontuj męski zamek Luer do rury o długości dwóch stóp i przymocuj żeński uchwyt Luer typu T, aby zapewnić dostępność, a następnie przymocuj męski zamek Luer i żeński zamek Luer do dwóch rur stopowych. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych i przenieść bioreaktor do inkubatora.

Podłącz rurkę natleniacza do dwóch otwartych końców, aby uczynić z niej bioreaktor z zamkniętą pętlą. Uruchom pompę z prędkością sześciu mililitrów na minutę, aby napełnić natleniacz i probówki pożywką hodowlaną, tak aby w rurce nie było pęcherzyków powietrza. Po napełnieniu probówek medium zamknij kran i odłącz natleniacze z obu końców butelki bioreaktora.

Umieść butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przepuść pożywkę hodowlaną przez zawór odcinający i przymocuj kaniulę płucną rusztowania płuc. Jeśli pracujesz z komórkowym modelem płuc, pomiń decelularyzację. Pobrane płuco można diadycznie umieścić w bioreaktorze.

Przepuść pożywkę hodowlaną przez jednokierunkowy zawór odcinający, aby usunąć powietrze i przywiąż kaniulę tchawicy jedwabną nicią do tchawicy, a następnie zamknij nakrętkę butelki bioreaktora. Przenieś bioreaktor do inkubatora i uruchom pompę. Uruchom pożywkę hodowlaną przez 10 do 15 minut, aby upewnić się, że wszystkie płaty są napompowane, a płuca wyglądają na w dobrym stanie.

Zmodyfikuj bezkomórkowe lub komórkowe rusztowanie płuc w następujący sposób dla modelu przerzutowego. Otwórz nasadkę bioreaktora z wiszącym rusztowaniem płuc i użyj strzykawki Luer lock, aby przepuścić pięć mililitrów pożywki hodowlanej przez tchawicę. Użyj kleszczy kątowych, aby przepuścić jedwab 2-0 przez tchawicę w punkcie rozwidlenia.

Przywiązać tchawicę prowadzącą do prawego płuca w punkcie rozwidlenia i sprawdzić swobodny przepływ pożywki przez tchawicę do lewego płuca, przepuszczając pożywkę hodowlaną. Przygotuj 50-mililitrową objętość komórek raka płuc, takich jak A549 lub H1299, w kompletnych pożywkach hodowlanych RPMI 1640 o stężeniu od dwóch do trzech milionów komórek na mililitr. Umieść 20-mililitrową strzykawkę Luer lock na wierzchu kaniuli tchawicy i dodaj 15 mililitrów komórek do strzykawki.

Pozwól, aby zawiesina komórkowa przeszła przez płaty płuc grawitacyjnie. Dodaj resztę komórek, zanim przejdą przez nie pęcherzyki powietrza. Po wysianiu wyjmij strzykawkę i odczekaj 15 minut, a następnie dodaj świeżą pożywkę do bioreaktora.

Umieść go z powrotem w inkubatorze i po usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza wykonaj perfuzję rusztowania płuc z prędkością sześciu mililitrów na minutę. Histopatologia nienaruszonego płuca pokazuje pęcherzyki płucne i pneumocyty. Jak widać tutaj, decelularyzacja prowadzi do całkowitego usunięcia komórek płuc, a histopatologia bezkomórkowych płuc ujawnia nienaruszoną błonę podstawną.

Plama pentachromu i elastyny Movata w pozbawionym komórek płucu ujawnia obecność kolagenu, fibryny i elastyny z nienaruszonym unaczynieniem i oskrzelami. Analiza DNA pozbawionego komórek płuca wykazuje zmniejszenie zawartości DNA o ponad 99%Płuco bezkomórkowe może być wykorzystywane bezpośrednio w bioreaktorze do hodowli komórek. Analiza histologiczna wykazuje obecność wzrostu guza.

Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o wstrzyknięciu heparyny do prawej komory serca. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania zmian genetycznych i epigenetycznych prowadzących do przerzutów komórek nowotworowych w raku płuc.