Name: Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj model płuc ex vivo do badania progresji nowotworowej z wykorzystaniem szczura. Ta metoda umożliwia izolację komórek nowotworowych i ocenę skuteczności terapii spersonalizowanej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Min P. Kim otrzymał wsparcie grantowe od Second John W. Kirklin Research Scholarship, American Association for Thoracic Surgery, Graham Research Foundation, Houston Methodist Specialty Physician Group Grant oraz Michael M. and Joann H. Cone Research Award. Dziękujemy Ann Saikin za redakcję językową manuskryptu.

Protokoły eksperymentów na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Houston Methodist Research Institute i przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi przepisami, obowiązującymi prawami, wytycznymi i politykami.
1. Żniwa z płuc szczurów
<ol>
	<li>Znieczulić 4- do 6-tygodniowego samca szczura Sprague-Dawley poprzez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) w bok. Zapewnij znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma ruchu, gdy palec u nogi tylnej kończyny jest ściśnięty kleszczami. </li>
	<li>Po 10 minutach ogolić klatkę piersiową i brzuch oraz przetrzeć skórę wacikiem z chlorheksydyną.</li>
	<li>Usuń skórę, podnosząc ją kleszczami i nacinając jednorazowym skalpelem. Po otwarciu jamy klatki piersiowej poprzez nacięcie skalpelem należy wykonać torakotomię obustronną, przecinając nożyczkami przednią stronę klatki piersiowej po lewej i prawej stronie przepony. 
	UWAGA: Jest to operacja niezapewniająca przeżycia.</li>
	<li>Przytrzymaj klatkę piersiową i wstrzyknij 2 ml heparyny (1000 jednostek/ml) do prawej komory bijącego serca za pomocą igły 27 G. 
	UWAGA: Zapobiegnie to tworzeniu się skrzepów krwi w płucach.</li>
	<li>Całkowicie usuń klatkę piersiową nożyczkami i umieść igłę 18 G w lewej komorze jako odpowietrznik, aż wypłynie krew. Następnie wstrzyknąć 15 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (12,5 jednostki/ml; heparynizowany PBS) do prawej komory za pomocą igły 25 G.</li>
	<li>Przeciąć żyłę główną dolną i górną, dwie duże żyły po prawej stronie serca i przepłukać płuca dodatkowymi 10 ml heparynizowanego PBS w prawej komorze za pomocą igły 27 G. 
	UWAGA: Żyła główna dolna jest wizualizowana pod dnem serca jako duże naczynie wypełnione czerwoną krwią. Podobnie, żyła główna górna jest wizualizowana w górnej części serca jako duże naczynie.</li>
	<li>Przetnij tchawicę u podstawy tarczycy. Ostrożnie usuń aortę zstępującą na poziomie żyły hemiazygotycznej i gałęzie aorty na łuku.</li>
	<li>Wyjmij blok płuco-serce z jamy klatki piersiowej i reszty ciała szczura.</li>
	<li>Wykonaj ventriculotomię, przecinając połowę prawej i lewej komory i umieszczając specjalnie wykonaną, wstępnie napełnioną kaniulę igłową ze stali nierdzewnej 18 G przez prawą komorę do głównej tętnicy płucnej (PA).</li>
	<li>Zabezpiecz kaniulę jedwabnym opaską 2-0 i ostrożnie odsłoń prawą komorę i przedsionek.</li>
	<li>Umieść żeńską gródź Luer w lewej komorze i zabezpiecz ją jedwabnym krawatem 2-0.</li>
	<li>Przepłukać blok płuco-serce 20 ml heparynizowanego PBS przez kaniulę PA i umieścić go w probówce o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę hodowlaną lub heparynizowany PBS. 
	UWAGA: W przypadku modelu komórkowego przejdź do kroku 3.1, aby skonfigurować bioreaktor. W przypadku modelu bezkomórkowego przejdź do kroku 2.1 dotyczącego decelularyzacji.</li>
</ol>
2. Decelularyzacja płuc
<ol>
	<li>Przygotowanie jednostki decelularyzacji
	<ol>
		<li>Przygotuj każdą komorę/butelkę decelularyczną, przebijając dwa otwory w nakrętki butelki i wsuwając w nie żeński Luer (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A i 1B). Zabezpiecz go czarnym nylonowym pierścieniem po drugiej stronie. Podobnie, wywierć pojedynczy otwór w innej zakrętce butelki na nasadkę zestawu dożylnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: <silna klasa="xfig">Rysunek 1A i 1B przedstawiają te same nakrętki z dwóch różnych stron. Rysunek 1C przedstawia inną nasadkę z pojedynczym otworem, jak podano powyżej w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Przymocuj 0,5-calową rurkę (na końcu tętnicy płucnej lub PA) i 6-calowe rurki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1J) do żeńskiej Luer od wewnątrz nakrętek butelek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A i 1B) i przymocuj męską blokadę Luer na końcach. Ustaw zamek z butelką o pojemności 500 ml jako komorą/butelką do decelularyzacji.</li>
		<li>Podłącz jeden koniec dwóch rurek o długości 2 stóp (które są połączone męskim zamkiem Luer) do obu końców rurki pompy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1H), która jest przymocowana do głowicy pompy (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1E i 1F) za pomocą wkładu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1G) z żeńską blokadą Luer (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 1I).</li>
		<li>Podłącz drugie końce rurek o długości 2 stóp (z kroku 2.1.3) do żeńskiej głowicy Luer lock na komorze decelularyzacyjnej/nakrętce butelki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1L).</li>
		<li>Ustaw butelkę PBS o pojemności 250 ml (z 200 ml PBS), zawieszając odwróconą butelkę na stojaku z bliższym końcem zestawu dożylnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D) włożoną do nakrętki butelki i dystalnym końcem zastępującym rurkę o długości 2 stóp podłączoną do komory/butelki decelularyzacyjnej na końcu PA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Podłącz tę rurkę o długości 2 stóp do butelki jednorazowego użytku. 
		UWAGA: Butelki są umieszczone w kartonie, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1K. Rurki dożylne wychodzą z wiszących butelek w celu dozowania odczynników w rusztowaniu płuc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Proces decelularyzacji płuc
	<ol>
		<li>Uruchom heparynizowany PBS przy fizjologicznym ciśnieniu perfuzji 30 mm Hg (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1K), aż zacznie swobodnie przepływać w komorze / butelce decelularyzacyjnej, a następnie przymocuj blok płuco-serce do końca PA przez kaniulę PA.</li>
		<li>Kontynuuj ciągłą pracę pompy, aby nadmiar bufora/roztworu wewnątrz komory/butelki decelularyzacyjnej został wyrzucony.</li>
		<li>Przeprowadź heparynizowany PBS przez PA przez 15 minut przy ciśnieniu perfuzji 30 mm Hg dla początkowego płukania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1K).</li>
		<li>Zastąp heparynową butelkę PBS 0,1% dodecylosiarczanem sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej i perfaktoruj płuca przez 2 godziny w celu decelularyzacji.</li>
		<li>Po decelularyzacji perfuzja dejonizowanej autoklawizowanej wody przez rusztowanie płuc przez 15 minut.</li>
		<li>Następnie perfaktor 1% detergentu niejonowego należy mieszać w wodzie dejonizowanej przez 10 min.</li>
		<li>Zastąp komorę/butelkę decelularyzacyjną 500 ml autoklawizowanego PBS uzupełnionego 1x antybiotykami (penicylina-streptomycyna, amfoterycyna), pozostawiając wiszące płuco w stanie nienaruszonym z nakrętką wewnątrz butelki.</li>
		<li>Wyrzuć zestaw dożylny, umieść rurkę o długości 2 stóp przymocowaną do pojemnika do wyrzucania z powrotem do końca tętnicy płucnej komory decelularyzacyjnej i uruchom pompę z prędkością 6 ml / min (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1L).</li>
		<li>Perfuzja płuc przez 72 godziny i wymiana PBS z antybiotykami co 12 godzin 
		UWAGA: Płuco bezkomórkowe jest gotowe do natychmiastowego użycia. Może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Jeśli w płatach płuc można wyraźnie uwidocznić różowe plamy lub skrzepy krwi, wyrzuć płuco. Możliwe jest losowe badanie DNA lub histopatologii. Kompletne bezkomórkowe płuco nie będzie miało komórek, a 99,9% DNA zostanie zmyte. 
		UWAGA: Podczas pracy z komórkowym modelem płuc pomiń decelularyzację. Pobrane płuco (krok 1) można umieścić bezpośrednio w bioreaktorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja bioreaktora
<ol>
	<li>Przygotuj butelkę bioreaktora i elementy potrzebne do konfiguracji.
	<ol>
		<li>Wywierć trzy otwory w jednej zakrętce butelki o pojemności 500 ml w równej odległości i zamocuj żeński Luer we wszystkich trzech otworach, używając czarnych nylonowych pierścieni (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A i 2B). 
		UWAGA: W dwóch otworach końce zamka Luer są skierowane na zewnątrz, podczas gdy jeden koniec jest skierowany do wnętrza butelki.</li>
		<li>Wytnij rurkę pompy 6 cali, rurkę 2 cale, rurkę 6 cali, rurkę 1.5 stopy, rurkę 2 stopy i rurkę natleniacza 10 stóp na bioreaktor</li>.
		<li>Wytnij igłę ze stali nierdzewnej o wadze 18 G i ponownie połącz końce za pomocą biokompatybilnej rurki do kaniuli tchawiczej.</li>
		<li>Owiń rurkę natleniacza, ze złączami Luer lock na końcach, na siatce drucianej elektromagnesu za pomocą taśm autoklawu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Wyżej wymienione przedmioty należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w świetle UV przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw pompę wewnątrz zwykłego inkubatora do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) z zachowaniem odpowiednich odstępów między tacami, aby z łatwością zmieścić butelkę o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Rozpyl 70% etanolu na wkład pompy i połącz rurkę pompy z żeńskimi złączami Luer lock na obu końcach pompy.</li>
	<li>Ustaw natleniacz owinięty wokół siatki drucianej elektromagnesu wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych, łącząc jeden koniec (odpływ) natleniacza z rurką pompy, a drugi koniec z rurką o długości 1,5 stopy w bioreaktorze.</li>
	<li>Ustaw butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach aseptycznych.
	<ol>
		<li>Podłącz 3-drogowy kran (żółty) do głowy jednej z samic Luer, aby kontrolować przepływ przez PA.</li>
		<li>Podłącz jednokierunkowy kran (niebieski) do innej żeńskiej grodzi Luer lock w celu wysiewu komórek przez tchawicę (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F).</li>
		<li>Podłącz 2 rurki wejściowe na zewnątrz (białe) i 6 przewodów po wewnętrznej stronie butelki, aby rozprowadzić media na zewnątrz. Zamontuj męski zamek Luer do rury o długości 2 stóp i przymocuj żeński trójnik w stylu Luer Lug, aby zapewnić dostęp do dodawania lub usuwania czegokolwiek.</li>
		<li>Przymocuj jednokierunkowy kran odcinający do jednego z otworów łącznika trójdrożnego (żeński trójnik z uchem Luer).</li>
		<li>Przymocuj męski zamek Luer i żeński zamek Luer do rur o długości 2 stóp.</li>
		<li>Dodać 200 ml RPMI1640 z 10% FBS i 1% antybiotykową pożywką do hodowli komórkowych (w zależności od zapotrzebowania na komórki) i przenieść bioreaktor do inkubatora. Podłącz rurkę natleniacza do dwóch otwartych końców (jednokierunkowy kran i złącze trójnikowe), aby uczynić z niej bioreaktor z zamkniętą pętlą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom pompę z prędkością 6 ml/min wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych z pożywką do hodowli komórkowych, aby napełnić natleniacz i rurki, tak aby w rurkach nie było pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Po napełnieniu probówek pożywką zamknij zawór odcinający i wyjmij butelkę bioreaktora z inkubatora, odłączając natleniacze z obu końców butelki bioreaktora.</li>
	<li>Umieść butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przepuść pożywkę hodowlaną przez zawór odcinający i przymocuj kaniulę PA rusztowania płuc (bezkomórkowego lub komórkowego) do kranu przez męskie złącze Luer. 
	UWAGA: W tym przypadku możliwe jest użycie modelu bezkomórkowego (po procesie decelularyzacji) lub świeżo pobranego bloku płuco-serce (tj. modelu komórkowego, ponieważ zachowuje on natywne komórki szczura).</li>
	<li>Przepuścić pożywkę hodowlaną przez jednokierunkowy zawór odcinający, aby usunąć powietrze i przywiązać kaniulę tchawicy jedwabną nicią do tchawicy.</li>
	<li>Upewnij się, że nie skręcasz PA i tchawicy. Zamknąć nakrętkę butelki bioreaktora z rusztowaniem płuc w środku i ponownie aseptycznie przenieść bioreaktor do inkubatora i uruchomić pompę z prędkością 6 ml/min.</li>
	<li>Uruchom pożywkę hodowlaną przez 10 - 15 minut, aby upewnić się, że wszystkie płaty są napompowane, a płuca wyglądają na w dobrym stanie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2G).</li>
</ol>
4. Model przerzutów i wysiewanie komórek
UWAGA: Przejdź do wysiewu komórek za pomocą powyższego modelu płuc w celu przeprowadzenia badania wzrostu guza pierwotnego. Zmodyfikuj rusztowanie płuc (bezkomórkowe lub komórkowe) w następujący sposób dla modelu przerzutowego.
<ol>
	<li>Wyjąć bioreaktor z rusztowaniem płuc z inkubatora i umieścić go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Użyj strzykawki typu Luer lock, aby przepuścić 5 ml pożywki hodowlanej przez tchawicę i otwórz pokrywę bioreaktora z wiszącym rusztowaniem płuc (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F).</li>
	<li>Na tym etapie potrzebna jest jeszcze jedna osoba, która pomoże w modyfikacji płuca do modelu przerzutowego.</li>
	<li>Przygotuj jedwab 2-0 i użyj kleszczy kątowych, aby przejść przez tchawicę w punkcie rozwidlenia.</li>
	<li>Przywiąż tchawicę biegnącą do prawego płuca w punkcie rozwidlenia i sprawdź swobodny przepływ pożywki przez tchawicę do lewego płuca, przepuszczając pożywkę hodowlaną. 
	UWAGA: Gdy tchawica zostanie związana w punkcie rozwidlenia, komórki wysiane przez tchawicę zostaną automatycznie skierowane do zasiewu do lewych płatów. Można go przetestować przed wysiewem komórek, przepychając pożywkę hodowlaną przez tchawicę. W modelu przerzutowym podłoże przesunie się tylko do lewego płata, który zostanie napompowany, a nie do prawego płat<a sup class="xref">10.</li>
	<li>Umieść strzykawkę Luer lock o pojemności 20 ml na kaniuli tchawicy i dodaj komórki raka płuc ATCC (A549, H1299) w 50 ml RPMI1640 kompletnej pożywki hodowlanej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Wykonaj wysiew komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dodać 15 ml komórek do strzykawki i pozwolić jej przejść grawitacyjnie przez płaty płuc. Dodaj resztę komórek, zanim przejdą przez nie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>W przypadku bezkomórkowego wysiewu płuc zbierz perfundowane podłoże spływające do butelki bioreaktora i pozwól mu ponownie przejść przez tchawicę 3x. 
	UWAGA: Perfuzja pożywki czasami ma wysiane komórki rakowe. Dlatego, aby zapewnić efektywny wysiew, należy ponownie umieścić pożywkę w tchawicy przez strzykawkę.</li>
	<li>Po wysianiu wyjmij strzykawkę, odczekaj 15 minut, dodaj świeżą pożywkę i włóż bioreaktor z powrotem do inkubatora. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z rurki.</li>
	<li>Uruchom pompę, aby perfuzjować pożywkę z prędkością 6 ml/min.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+Statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li>
<li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+don%27t+we+get+more+cancer%3F+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308(2012).</li>
<li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li>
<li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Płuco 4-D ex vivo daje możliwość badania wzrostu guza i przerzutów w warunkach laboratoryjnych. Natywna macierz płucna to złożony system, który zapewnia wsparcie dla normalnej tkanki i utrzymuje interakcje komórka-komórka, interakcje komórka-macierz, różnicowanie komórkowe i organizację tkanek. Daje to możliwość dodania dowolnych składników mikrośrodowiska guza w celu zbadania ich wpływu na wzrost guza i interakcję z innymi komórkami. 
Pobranie płuc jest kluczowym etapem dla 4-wymiaro...

Przerzuty raka są przyczyną większości zgonów związanych z rakiem i stanowią największe wyzwanie w walce z rakiem. Ogólnym celem tej metody jest zaprojektowanie protokołu dla czterowymiarowej (4-D) hodowli komórkowej, która oprócz trójwymiarowego (3D) wzrostu komórek ma wymiar przepływu. Reprezentuje trzy odrębne fazy procesu przerzutów [tj. guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe (CTC) i zmiany przerzutowe].
W ciągu ostatnich trzech dekad naukowcy na całym świecie dostarczyli niezrównanego bogactwa informacji, aby zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw progresji przerzutów w różnych nowotworach, co zwiększyło perspektywę wyleczenia lub przeżycia wolnego od progresji. Leczenie kliniczne niektórych nowotworów, takich jak rak piersi, uległo znacznej poprawie1; Jednak niektóre nowotwory, takie jak rak płuc, nadal mają niską przeżywalność2. Modele zwierzęce in vitro i in vivo odegrały zasadniczą rolę w uzyskaniu nowych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw rozwoju choroby. W ciągu ostatnich kilku lat ksenoprzeszczepy pochodzące z linii komórkowych (CDX) i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) stały się bardziej interesujące, ponieważ zachowują wiele istotnych cech pierwotnego ludzkiego nowotworu3, takich jak kinetyka wzrostu, cechy histologiczne, cechy behawioralne i odpowiedź na terapię. Jednak każdy model ma swoje ograniczenia, aby zrozumieć mechanizm powstawania CTC i przerzutów do odległego narządu4,5,6.
Niedawno opracowaliśmy model 4-D ex vivo raka płuc, wykorzystując koncepcję reinżynierii narządów i hodowli komórkowej opartej na perfuzji. Naśladuje wzrost ludzkiego raka płuc poprzez tworzenie perfuzyjnych guzków nowotworowych, które rosną z czasem przy podobnej produkcji białek wydzielanych przez ludzkiego raka7. Reprezentuje sygnaturę ekspresji genu, która przewiduje słabe przeżycie u pacjentów z rakiem, a także pokazuje odpowiedź terapeutyczną poprzez regresję guza po leczeniu cisplatyną8,9. Model płuc został dodatkowo zmodyfikowany tak, aby mógł tworzyć zmiany przerzutowe. CTC rozwijają się z guza pierwotnego i są wewnątrznaczyniowe do układu krwionośnego, a następnie wynaczynione do płuca przeciwległego, tworząc zmiany przerzutowe10. Badania ekspresji genów sugerują odrębny profil ekspresji guza pierwotnego, CTC i zmian przerzutowych oraz regulację w górę podzbioru genów wymaganych dla fenotypu10. Ten proces przerzutowy zachodzi z powodu obecności warunków biologicznych obserwowanych u pacjentów z rakiem. Zaletą tego modelu jest obecność naturalnej matrycy i architektury oraz perfuzja składników odżywczych, która prowadzi do powstawania guzków nowotworowych. Ponadto daje również możliwość zbadania wpływu różnych składników mikrośrodowiska guza lub leków na progresję guza w czasie. Model ten może być wykorzystany do hodowli szeregu komórek nowotworowych (rak płuc, rak piersi, mięsak itp.) w warunkach laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>męski</td></tr><tr><td>wacik z chlorheksydyną</td><td>Prevantics, Nowy Jork, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>igła o rozmiarze 18 McMaster</td><td>Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 jedwabny krawat</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Głowica pompy Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Wkład pompy Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Rurka</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Stany Zjednoczone</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>Rurka pompy MasterFlex</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, Stany Zjednoczone</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>Złącza żeńskie luer lock</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>Męskie złącza luer lock</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>nylonowy pierścień</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw dożylny</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Dotleniacz silikonowy</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-Siatka</td></tr> <tr><td>druciana</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>Nowy Jork Drut</td></tr><tr><td>żeński luer Lug Style TEE</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>Męski zintegrowany pierścień blokujący luer do 200series Barb</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik żeński z gwintem luer</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Clave</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo & handel; 4-drogowy kran z obrotowym męskim ślusarzem luer</td><td>MX9341L</td><td></td><td>medycznym</td></tr><tr><td>MasterFlex Rurka pompy</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-13</td><td>do kaniuli</td></tr></tbody></table>

bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Trudno jest wyizolować komórki nowotworowe w różnych punktach progresji nowotworu. Stworzyliśmy model płuc ex vivo, który może pokazać interakcję komórek nowotworowych z naturalną macierzą i ciągłym przepływem składników odżywczych, a także model, który pokazuje interakcję komórek nowotworowych z normalnymi składnikami komórkowymi i naturalną matrycą. Bezkomórkowy model płuc ex vivo jest tworzony przez wyizolowanie bloku płuco-serce szczura i usunięcie wszystkich komórek w procesie decelularyzacji. Prawe oskrzele główne jest wiązane, a komórki nowotworowe są umieszczane w tchawicy za pomocą strzykawki. Komórki poruszają się i zasiedlają lewe płuco. Płuco jest następnie umieszczane w bioreaktorze, w którym tętnica płucna otrzymuje ciągły przepływ mediów w obiegu zamkniętym. Guz wyrosły na lewym płucu jest guzem pierwotnym. Komórki nowotworowe, które są izolowane w krążących pożywkach, są krążącymi komórkami nowotworowymi, a komórki nowotworowe w prawym płucu są zmianami przerzutowymi. Komórkowy model płuc ex vivo jest tworzony przez pominięcie procesu decelularyzacji. Każdy model może być wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na różne pytania badawcze.

Płuca pobrane od szczura zachowują nienaruszoną układ naczyń krwionośnych i pęcherzyki płucne11 (Rycina 3A i 3B). Po decelularyzacji zachowane zostają składniki macierzy zewnątrzkomórkowej acellularnych płuc, takie jak kolagen, fibronektyna i elastyna11 (Rycina 3C, 3D, 3E i 3F). Decelularyzacja prowadzi do całkowite...

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z progresją nowotworu. Bezkomórkowy i komórkowy model płuc ex vivo pozwala na tworzenie się guza pierwotnego, który rośnie z czasem i tworzy krążące komórki nowotworowe oraz zmiany przerzutowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie progresji raka w skróconym czasie i wzrostu różnych typów komórek nowotworowych.Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą spersonalizowaną terapię, ponieważ komórki nowotworowe od pacjentów mogą być wykorzystywane w modelu do oceny skuteczności leków terapeutycznych, w tym komórek odpornościowych. Zacznij od głęboko znieczulonego szczura. Ogol klatkę piersiową i brzuch, a następnie przetrzyj skórę wacikiem z chlorheksydyną.Po otwarciu jamy klatki piersiowej należy wykonać torakotomię obustronną, przecinając przednią stronę klatki piersiowej po lewej stronie po prawej stronie przepony. Przytrzymaj klatkę piersiową do góry i wstrzyknij dwa mililitry heparyny po 1000 jednostek na mililitr do prawej komory bijącego serca za pomocą igły o rozmiarze 27, aby zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi w płucach. Po usunięciu klatki piersiowej umieść igłę o rozmiarze 18 G w lewej komorze jako odpowietrznik, aby umożliwić wydostanie się krwi, a następnie użyj igły o rozmiarze 25, aby wstrzyknąć 15 mililitrów 12,5 jednostek na mililitr heparynizowanego PBS do prawej komory.Następnie przetnij tchawicę u podstawy tarczycy i ostrożnie usuń aortę zstępującą na poziomie żyły hemiazygotycznej i gałęzi aorty na łuku. Po usunięciu bloku płuco-serce z jamy klatki piersiowej należy odciąć połowę prawej i lewej komory, a następnie umieścić specjalnie wykonaną kaniulę igłową ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18 przez prawą komorę do głównej tętnicy płucnej. Zabezpiecz kaniulę jedwabną opaską 2-0 i ostrożnie odsłoń prawą komorę i przedsionek.Zacznij od uruchomienia heparynizowanego PBS przy fizjologicznym ciśnieniu perfuzji 30 milimetrów słupa rtęci, aż swobodnie wpłynie do butelki jednostki decelularyzacyjnej, a następnie podłącz blok płuco-serce do jednostki decelularyzacji na końcu tętnicy płucnej przez kaniulę tętnicy płucnej. Po 15 minutach mycia heparynizowanym PBS zastąp heparynizowaną butelkę PBS na butelkę zawierającą 0,15% dodecylosiarczanu sodu i wodę dejonizowaną i perfuzję płuc przez dwie godziny w celu decelularyzacji. Po decelularyzacji perfaktoryzowaną autoklawowaną wodę perfektywną przez rusztowanie płuc przez 15 minut, a następnie 1% niejonowy detergent w wodzie dejonizowanej przez 10 minut.Na koniec zastąp butelkę 500 mililitrami autoklawizowanego PBS uzupełnionego antybiotykami. Uruchom pompę z prędkością sześciu mililitrów na minutę i wykonuj płuca przez 72 godziny, po czym bezkomórkowe płuco jest gotowe do natychmiastowego użycia. Rozpyl 70% etanol na wkład pompy i ustaw natleniacz, podłączając końcówkę odpływową natleniacza do rurki pompy, a drugi koniec do rurki o długości 1,5 stopy w bioreaktorze.Ustaw butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego w warunkach aseptycznych. Przymocuj trójkierunkowy kran do główki żeńskiej zamka Luer, aby kontrolować przepływ przez tętnicę płucną, a następnie podłącz jednokierunkowy kran do innej żeńskiej grodzi Luer lock w celu wysiewu komórek przez tchawicę. Podłącz dwucalową rurkę na zewnątrz i sześciocalową rurkę po wewnętrznej stronie butelki, aby zapewnić cyrkulację medium.Przygotuj rurkę do podłączenia butelki bioreaktora do natleniacza. Zamontuj męski zamek Luer do rury o długości dwóch stóp i przymocuj żeński uchwyt Luer typu T, aby zapewnić dostępność, a następnie przymocuj męski zamek Luer i żeński zamek Luer do dwóch rur stopowych. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych i przenieść bioreaktor do inkubatora.Podłącz rurkę natleniacza do dwóch otwartych końców, aby uczynić z niej bioreaktor z zamkniętą pętlą. Uruchom pompę z prędkością sześciu mililitrów na minutę, aby napełnić natleniacz i probówki pożywką hodowlaną, tak aby w rurce nie było pęcherzyków powietrza. Po napełnieniu probówek medium zamknij kran i odłącz natleniacze z obu końców butelki bioreaktora.Umieść butelkę bioreaktora w komorze bezpieczeństwa biologicznego, przepuść pożywkę hodowlaną przez zawór odcinający i przymocuj kaniulę płucną rusztowania płuc. Jeśli pracujesz z komórkowym modelem płuc, pomiń decelularyzację. Pobrane płuco można diadycznie umieścić w bioreaktorze.Przepuść pożywkę hodowlaną przez jednokierunkowy zawór odcinający, aby usunąć powietrze i przywiąż kaniulę tchawicy jedwabną nicią do tchawicy, a następnie zamknij nakrętkę butelki bioreaktora. Przenieś bioreaktor do inkubatora i uruchom pompę. Uruchom pożywkę hodowlaną przez 10 do 15 minut, aby upewnić się, że wszystkie płaty są napompowane, a płuca wyglądają na w dobrym stanie.Zmodyfikuj bezkomórkowe lub komórkowe rusztowanie płuc w następujący sposób dla modelu przerzutowego. Otwórz nasadkę bioreaktora z wiszącym rusztowaniem płuc i użyj strzykawki Luer lock, aby przepuścić pięć mililitrów pożywki hodowlanej przez tchawicę. Użyj kleszczy kątowych, aby przepuścić jedwab 2-0 przez tchawicę w punkcie rozwidlenia.Przywiązać tchawicę prowadzącą do prawego płuca w punkcie rozwidlenia i sprawdzić swobodny przepływ pożywki przez tchawicę do lewego płuca, przepuszczając pożywkę hodowlaną. Przygotuj 50-mililitrową objętość komórek raka płuc, takich jak A549 lub H1299, w kompletnych pożywkach hodowlanych RPMI 1640 o stężeniu od dwóch do trzech milionów komórek na mililitr. Umieść 20-mililitrową strzykawkę Luer lock na wierzchu kaniuli tchawicy i dodaj 15 mililitrów komórek do strzykawki.Pozwól, aby zawiesina komórkowa przeszła przez płaty płuc grawitacyjnie. Dodaj resztę komórek, zanim przejdą przez nie pęcherzyki powietrza. Po wysianiu wyjmij strzykawkę i odczekaj 15 minut, a następnie dodaj świeżą pożywkę do bioreaktora.Umieść go z powrotem w inkubatorze i po usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza wykonaj perfuzję rusztowania płuc z prędkością sześciu mililitrów na minutę. Histopatologia nienaruszonego płuca pokazuje pęcherzyki płucne i pneumocyty. Jak widać tutaj, decelularyzacja prowadzi do całkowitego usunięcia komórek płuc, a histopatologia bezkomórkowych płuc ujawnia nienaruszoną błonę podstawną.Plama pentachromu i elastyny Movata w pozbawionym komórek płucu ujawnia obecność kolagenu, fibryny i elastyny z nienaruszonym unaczynieniem i oskrzelami. Analiza DNA pozbawionego komórek płuca wykazuje zmniejszenie zawartości DNA o ponad 99%Płuco bezkomórkowe może być wykorzystywane bezpośrednio w bioreaktorze do hodowli komórek. Analiza histologiczna wykazuje obecność wzrostu guza.Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać o wstrzyknięciu heparyny do prawej komory serca. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania zmian genetycznych i epigenetycznych prowadzących do przerzutów komórek nowotworowych w raku płuc.

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Celem tego protokołu jest badanie nowotworów piersi. Dzięki tej technice guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Dołączony jest protokół ekstrakcji płuc do badania przerzutów do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy z zarodka myszy.

Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Zdolność klonów przerzutowych do kolonizacji odległych miejsc zależy od ich zdolności do proliferacji i/lub zdolności do przetrwania w mikrośrodowisku gospodarza bez znaczącej proliferacji. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który umożliwia ilościową wizualizację obu typów kolonizacji wątroby przez klony z przerzutami.

Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj model płuc ex vivo do badania progresji nowotworowej z wykorzystaniem szczura. Ta metoda umożliwia izolację komórek nowotworowych i ocenę skuteczności terapii spersonalizowanej.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów