Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie efferocytozy, takie jak rola cząsteczek sygnałowych w pośredniczeniu w wychwytywaniu komórek apoptotycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wyraźną ocenę ilościową wychwytu komórek apoptotycznych, w tym częściowego lub fragmentarycznego wychwytu komórek apoptotycznych, co nie zawsze jest widoczne w przypadku innych metod. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w efferocytozę komórek odpornościowych, może być również stosowana do innych typów komórek, takich jak komórki nabłonkowe lub rakowe.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z optymalizacją ustawień akwizycji mikroskopu. Po przygotowaniu ludzkich makrofagów i apoptotycznych komórek Jurkata użyj hemocytometru, aby policzyć komórki apoptotyczne. Następnie przenieś wystarczającą ilość komórek apoptotycznych do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Granulować komórki Jurkat przez odwirowanie w ilości 500 razy g przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach PBS. Podczas gdy komórki Jurkata znajdują się w wirówce, wlej 10 mikrolitrów DMSO do nowej probówki do mikrowirówki.

Następnie rozpuść minimalną ilość NHS-Biotyny w DMSO. Następnie przenieś 500 mikrolitrów komórki apoptotycznej i zawiesiny PBS do probówki zawierającej DMSO i NHS-Biotynę. Następnie należy rozcieńczyć odpowiedni barwnik śledzący komórki zgodnie z instrukcjami producenta.

Zawiesinę komórkową inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Następnie dodaj równą objętość RPMI 1640 z 10% FBS i inkubuj zawiesinę w temperaturze pokojowej w ciemności przez dodatkowe pięć minut. Następnie osadzać komórki przez wirowanie 500 razy g przez pięć minut.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś wybarwione komórki w 100 mikrolitrach RPMI 1640 z 10% FBS. Dodaj kroplami 100 mikrolitrów barwionej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki makrofagów. Następnie odwirować płytkę 200 razy g przez jedną minutę.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po odpowiednim okresie inkubacji wyjąć komórki z inkubatora. Następnie umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem PBS.

Następnie dodaj rozcieńczoną streptawidynę sprzężoną z FITC do każdej studzienki. I inkubuj płytkę przez 20 minut w ciemności. Umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem PBS i delikatnie potrząsaj próbkami przez pięć minut po każdym płukaniu.

Następnie utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórki raz PBS, aby usunąć nadmiar PFA. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku obrazowym i przenieś szkiełko do mikroskopu fluorescencyjnego.

Przechwyć stosy Z zawierające wystarczającą liczbę komórek do oceny ilościowej. Bardzo ważne jest, aby ustawić odległość między tymi sekcjami w taki sposób, aby wykryć cały pochłonięty materiał apoptozyjny. Maksymalna odległość między tymi sekcjami nie powinna być większa niż głębokość ogniskowej soczewki obiektywu, zwykle od 0.5 do jednego mikrometra.

Załaduj jeden ze stosów Z do oprogramowania za pomocą funkcji Importuj. Następnie wybierz opcję Gęstość zintegrowana jako opcję pomiaru w panelu Ustaw pomiary. Analizę najłatwiej przeprowadzić, jeśli zarówno kanały barwnika śledzącego streptawidynę, jak i komórki są wyświetlane jako nakładka.

Każdy obiekt z barwieniem streptawidyny w dowolnym miejscu na obwodzie powinien być uznany za streptawidynę dodatni, a zatem nie powinien być oznaczany ilościowo jako streptawidyna ujemna. Po załadowaniu obrazu, za pomocą streptawidyny i narzędzia Freehand lub narzędzia do zaznaczania wielokątów, zakreśl wszystkie komórki śledzące barwnik dodatni streptawidyny materiał ujemny w jednej płaszczyźnie stosu Z. Następnie zmierz zintegrowaną intensywność barwnika śledzącego komórki w regionie.

W tej samej sekcji Z użyj barwienia streptawidyną i narzędzia do zaznaczania odręcznego lub wielokąta, aby zakreślić cały materiał dodatni do śledzenia barwnika streptawidyny śledzącej komórki. Na koniec zmierz zintegrowaną intensywność tego regionu. Dzięki tej procedurze ponad 95% komórek Jurkat leczonych staurosporyną przeszło apoptozę.

W większości eksperymentów frakcja komórek apoptotycznych, które są zniewieśłe, wzrastała w sposób zależny od czasu. Optymalizując ten protokół dla różnych typów komórek efferocytarnych lub różnych celów komórek apoptotycznych, ważne jest, aby przetestować zakres proporcji komórek apoptotycznych do komórek efferocytarnych. Zwykle najlepiej sprawdzają się proporcje 10 do jednego lub 30 do jednego.

Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu śledzenia aktywacji cząsteczki sygnałowej lub transportu wewnątrzkomórkowego poprzez ekspresję fluorescencyjnych genów reporterowych w komórkach efferocytarnych, co pozwala na obrazowanie tych procesów podczas efferocytozy.