Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek
18 sierpnia 2018
Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.
Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie efferocytozy, takie jak rola cząsteczek sygnałowych w pośredniczeniu w wychwytywaniu komórek apoptotycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wyraźną ocenę ilościową wychwytu komórek apoptotycznych, w tym częściowego lub fragmentarycznego wychwytu komórek apoptotycznych, co nie zawsze jest widoczne w przypadku innych metod. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w efferocytozę komórek odpornościowych, może być również stosowana do innych typów komórek, takich jak komórki nabłonkowe lub rakowe.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z optymalizacją ustawień akwizycji mikroskopu. Po przygotowaniu ludzkich makrofagów i apoptotycznych komórek Jurkata użyj hemocytometru, aby policzyć komórki apoptotyczne. Następnie przenieś wystarczającą ilość komórek apoptotycznych do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.
Granulować komórki Jurkat przez odwirowanie w ilości 500 razy g przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach PBS. Podczas gdy komórki Jurkata znajdują się w wirówce, wlej 10 mikrolitrów DMSO do nowej probówki do mikrowirówki.
Następnie rozpuść minimalną ilość NHS-Biotyny w DMSO. Następnie przenieś 500 mikrolitrów komórki apoptotycznej i zawiesiny PBS do probówki zawierającej DMSO i NHS-Biotynę. Następnie należy rozcieńczyć odpowiedni barwnik śledzący komórki zgodnie z instrukcjami producenta.
Zawiesinę komórkową inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Następnie dodaj równą objętość RPMI 1640 z 10% FBS i inkubuj zawiesinę w temperaturze pokojowej w ciemności przez dodatkowe pięć minut. Następnie osadzać komórki przez wirowanie 500 razy g przez pięć minut.
Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś wybarwione komórki w 100 mikrolitrach RPMI 1640 z 10% FBS. Dodaj kroplami 100 mikrolitrów barwionej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki makrofagów. Następnie odwirować płytkę 200 razy g przez jedną minutę.
Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po odpowiednim okresie inkubacji wyjąć komórki z inkubatora. Następnie umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem PBS.
Następnie dodaj rozcieńczoną streptawidynę sprzężoną z FITC do każdej studzienki. I inkubuj płytkę przez 20 minut w ciemności. Umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem PBS i delikatnie potrząsaj próbkami przez pięć minut po każdym płukaniu.
Następnie utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz komórki raz PBS, aby usunąć nadmiar PFA. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku obrazowym i przenieś szkiełko do mikroskopu fluorescencyjnego.
Przechwyć stosy Z zawierające wystarczającą liczbę komórek do oceny ilościowej. Bardzo ważne jest, aby ustawić odległość między tymi sekcjami w taki sposób, aby wykryć cały pochłonięty materiał apoptozyjny. Maksymalna odległość między tymi sekcjami nie powinna być większa niż głębokość ogniskowej soczewki obiektywu, zwykle od 0.5 do jednego mikrometra.
Załaduj jeden ze stosów Z do oprogramowania za pomocą funkcji Importuj. Następnie wybierz opcję Gęstość zintegrowana jako opcję pomiaru w panelu Ustaw pomiary. Analizę najłatwiej przeprowadzić, jeśli zarówno kanały barwnika śledzącego streptawidynę, jak i komórki są wyświetlane jako nakładka.
Każdy obiekt z barwieniem streptawidyny w dowolnym miejscu na obwodzie powinien być uznany za streptawidynę dodatni, a zatem nie powinien być oznaczany ilościowo jako streptawidyna ujemna. Po załadowaniu obrazu, za pomocą streptawidyny i narzędzia Freehand lub narzędzia do zaznaczania wielokątów, zakreśl wszystkie komórki śledzące barwnik dodatni streptawidyny materiał ujemny w jednej płaszczyźnie stosu Z. Następnie zmierz zintegrowaną intensywność barwnika śledzącego komórki w regionie.
W tej samej sekcji Z użyj barwienia streptawidyną i narzędzia do zaznaczania odręcznego lub wielokąta, aby zakreślić cały materiał dodatni do śledzenia barwnika streptawidyny śledzącej komórki. Na koniec zmierz zintegrowaną intensywność tego regionu. Dzięki tej procedurze ponad 95% komórek Jurkat leczonych staurosporyną przeszło apoptozę.
W większości eksperymentów frakcja komórek apoptotycznych, które są zniewieśłe, wzrastała w sposób zależny od czasu. Optymalizując ten protokół dla różnych typów komórek efferocytarnych lub różnych celów komórek apoptotycznych, ważne jest, aby przetestować zakres proporcji komórek apoptotycznych do komórek efferocytarnych. Zwykle najlepiej sprawdzają się proporcje 10 do jednego lub 30 do jednego.
Procedurę tę można łatwo zmodyfikować w celu śledzenia aktywacji cząsteczki sygnałowej lub transportu wewnątrzkomórkowego poprzez ekspresję fluorescencyjnych genów reporterowych w komórkach efferocytarnych, co pozwala na obrazowanie tych procesów podczas efferocytozy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół mikroskopii fluorescencyjnej służący do ilościowego oznaczania eferocytozy, czyli procesu fagocytarnego usuwania komórek apoptotycznych. Metoda ta pozwala na ocenę szlaków sygnalizacyjnych eferocytozy i umożliwia precyzyjne określenie ilości pochłoniętych komórek apoptotycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Immunologia
Wstęp
- Eferocytoza jest kluczowa dla utrzymania homeostazy komórkowej.
- Polega ona na rozpoznawaniu i internalizacji komórek apoptotycznych przez fagocyty.
- Zrozumienie mechanizmów eferocytozy może dostarczyć wiedzy na temat różnych chorób.
- Metodę tę można zastosować do różnych typów komórek, w tym komórek odpornościowych i nowotworowych.
Cel badania
- Ilościowe określenie wychwytu komórek apoptotycznych przez komórki odpornościowe.
- Zbadanie roli cząsteczek sygnałowych w eferocytozie.
- Zapewnienie niezawodnej metody badania eferocytozy w różnych typach komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ludzkich makrofagów oraz apoptotycznych komórek Jurkat.
- Liczenie komórek apoptotycznych przy użyciu hemocytometru.
- Mikroskopia fluorescencyjna w celu wizualizacji i kwantyfikacji.
- Optymalizacja ustawień akwizycji mikroskopu dla uzyskania dokładnych wyników.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia precyzyjną kwantyfikację pochłaniania komórek apoptotycznych.
- Możliwa jest ocena częściowego lub fragmentarycznego pochłaniania komórek apoptotycznych.
- Podejście to pozwala na uzyskanie informacji na temat mechanizmów eferocytozy.
- Technika ta ma zastosowanie do różnych typów komórek, nie ograniczając się jedynie do komórek odpornościowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół mikroskopii fluorescencyjnej pogłębia zrozumienie procesu eferocytozy.
- Stanowi on cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się śmiercią i usuwaniem komórek.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne dziedziny badań nad oddziaływaniami międzykomórkowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena eferocytozy za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii jednokomórkowej odpowiada na kluczową potrzebę precyzyjnego pomiaru wychwytu komórek apoptotycznych oraz badania szlaków sygnalizacyjnych w badaniach z zakresu immunologii i onkologii na etapie odkrywania leków. To podejście z podwójnym znakowaniem umożliwia dokładne odróżnienie zinternalizowanego materiału apoptotycznego od materiału związanego z powierzchnią, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów terapeutycznych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych podczas wczesnego etapu odkrywania oraz rozwoju modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczne testowanie hipotez terapeutycznych dotyczących szlaków eferocytozy.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów regulujących usuwanie komórek apoptotycznych.
- Ułatwia analizę mechaniczną w celu ograniczenia ryzyka poprzez kwantyfikację częściowych i pełnych zdarzeń eferocytozy.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy selekcji projektów w portfelu w kontekście komórek odpornościowych i nowotworowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy komórkowe do dalszego screeningu modulatorów eferocytozy.
- Zapewnia reprodukowalne, ilościowe wyniki pozwalające odróżnić cele zinternalizowane od niezinternalizowanych.
- Umożliwia standaryzację i skalowalność testów w celu oceny związków.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w odniesieniu do różnych typów komórek eferocytarnych oraz celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu chorób, umożliwiając ilościowe określenie eferozy w komórkach odpornościowych, nabłonkowych i nowotworowych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację czynników modulujących eferozę.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, łącząc odczyty komórkowe z punktami końcowymi o charakterze translacyjnym.
- Oferuje predykcyjną redukcję ryzyka w przypadku strategii terapeutycznych ukierunkowanych na usuwanie komórek apoptotycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej z podwójnym znakowaniem wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, wspierając weryfikację hipotez, opracowywanie testów oraz badania translacyjne nad efocytozą.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa aktywność i sygnalizację eferocytozy, wyjaśniając rolę szlaków i mechanizmy biologiczne.
- Przesiewanie: Zapewnia wiarygodne, ilościowe wyniki w celu oceny gotowości i powtarzalności testów.
- Analityka: Umożliwia pomiar materiału apoptotycznego związanego w porównaniu do zinternalizowanego na potrzeby analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z modelami przedklinicznymi poprzez wsparcie badań w wielu typach komórek.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną, adaptacyjną platformę do kwantyfikacji eferocytozy w ramach programów B+R.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad eferocytozą.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację, zwiększa powtarzalność i wspiera skalowalne procesy robocze.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych danych biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów celujących w eferocytozę.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu.
- Wymagany jest dostęp do wysokiej jakości aparatury obrazującej oraz oprogramowania analitycznego.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów akwizycji i kwantyfikacji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych typów komórek eferytycznych i apoptotycznych poprzez optymalizację protokołu.
- Optymalizacja proporcji komórek i ustawień obrazowania jest kluczowa dla powtarzalności wyników.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
Quantifying Efferocytic Uptake and Dynamics Using a Fixed Cell Efferocytosis Assay and Inside-out Staining
5:14
Results: Overnight Culture of Jurkat Cells with Staurosporine Results in Apoptosis of Greater than 95% of Cells
5:36
Conclusion
