Name: Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Poznaj protokół mikroskopii fluorescencyjnej do kwantyfikacji efektozy, czyli fagocytozy komórek apoptotycznych. Metoda umożliwia badanie szlaków sygnałowych i precyzyjną ocenę pobierania komórek przez makrofagi ludzkie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Operating Grant MOP-123419, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant 418194, oraz Ontario Ministry of Research and Innovation Early Research Award dla BH. DGW przyczyniło się do optymalizacji niektórych z prezentowanych obrazów, do optymalizacji protokołów i napisania rękopisu; Był finansowany z grantu na zalewanie pomp z Uniwersytetu w Liverpoolu. CY jest finansowany przez stypendium Vanier Graduate Scholarship i stypendium CIHR MD / PhD. Agencje finansujące nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Metody przedstawione w tym protokole umożliwiają obrazowanie i kwantyfikację dynamicznego procesu efferocytarnego, przy użyciu zarówno metod z komórkami stałymi, jak i żywymi. Podejścia te mają kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami opartymi na cytometrii przepływowej23,24. Zastosowanie barwienia na lewą stronę z ustalonymi próbkami zapewnia bardziej solidną i dokładną ocenę ilościową szybkości i zakresu efferocytozy - w rzeczywistości wiele ...

Apoptoza, czyli zaprogramowana śmierć komórki, jest wysoce regulowanym procesem fizjologicznym, który występuje w większości organizmów wielokomórkowych i jest kluczowy dla ich rozwoju i homeostazy1. Oprócz udziału w prawidłowym obrocie komórkowym i rozwoju embrionalnym, apoptoza umożliwia eliminację zainfekowanych lub uszkodzonych komórek z tkanek i może być wywołana w odpowiedzi na infekcję, stan zapalny, raka, a także przez interwencje medyczne, takie jak radioterapia lub sterydy1. Komórki apoptotyczne eksponują sygnały "zjedz mnie" na powierzchni komórki, które są rozpoznawane przez receptory na szeregu profesjonalnych i nieprofesjonalnych fagocytów, zwanych zbiorczo "efferocytami". Zaangażowanie tych receptorów indukuje wychwyt i degradację komórki apoptotycznej przez efferocyt w procesie znanym jako efferocytoza2,3. Fosfatydyloseryna jest najlepiej scharakteryzowanym sygnałem eat-me napędzającym efferocytozę. Zwykle jest ograniczony do wewnętrznej ulotki błony komórkowej, a apoptoza aktywuje mieszankę lipidową, która zaburza tę asymetrię błony, odsłaniając w ten sposób fosfatydyloserynę na powierzchni komórki4. Fosfatydyloseryna znajduje się na zewnątrzkomórkowej powierzchni niektórych komórek nieapoptotycznych, takich jak dojrzałe makrofagi i aktywowane płytki krwi. Jednak komórki te nie są efferocytozowane ze względu na obecność sygnałów "nie jedz mnie", takich jak CD47, na powierzchni komórki5,6,7. Eksponowana fosfatydyloseryna jest rozpoznawana przez szereg receptorów efferocytarnych wyrażanych przez efferocyty. Wiązanie tych receptorów z fosfatydyloseryną, bezpośrednio lub za pomocą opsonin, aktywuje szlaki sygnałowe, które promują wchłonięcie komórki apoptotycznej do wakuoli związanej z błoną, zwanej efferosomem8,9,10,11,12. Effersom łączy się sekwencyjnie z endosomami i lizosomami, które dostarczają molekularną maszynerię niezbędną do zakwaszenia efferosomu i degradacji komórki apoptotycznej cargo13,14. Po degradacji materiały pochodzące z komórek apoptotycznych są transportowane do endosomu recyklingu — proces, który ogranicza odpowiedzi immunologiczne na antygeny pochodzące z komórek apoptotycznych i który może pozwolić na odzyskanie składników odżywczych z komórki apoptotycznej 13,15. Niepowodzenie w eferocytozie powoduje upośledzenie klirensu komórek apoptotycznych; Te nieoczyszczone komórki w końcu ulegają wtórnej martwicy. Komórki martwicze uwalniają prozapalną zawartość cytozolową, patogeny i autoantygeny do środowiska zewnątrzkomórkowego, napędzając w ten sposób szereg chorób zakaźnych, zapalnych i autoimmunologicznych16,17. Apoptoza i efferocytoza razem ułatwiają usuwanie obumierających i martwych komórek oraz pozwalają na utrzymanie homeostazy tkanek.
Badanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw efferocytozy wymaga metod, które zapewniają jasną kwantyfikację absorpcji komórek apoptotycznych. Tę kwantyfikację komplikuje fakt, że w przeciwieństwie do innych mechanizmów wychwytu, takich jak endocytoza i fagocytoza18,19, efferocytoza może nie prowadzić do pochłonięcia nienaruszonej komórki docelowej, co skutkuje fragmentarycznym wychwytem komórki apoptotycznej przez efferocyty20. Opisany tutaj protokół opisuje test eferocytozy in vitro, który zapewnia dokładne określenie zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych i może być łączony z różnymi podejściami do mikroskopii komórek stałych i żywych. Tradycyjne testy fagocytozy dodają przeciwciała specyficzne dla celu fagocytarnego na końcu eksperymentu w celu oznaczenia niezinternalizowanych celów, gdzie nasza metoda różni się znakowaniem celu apoptotycznego kowalencyjnie połączoną biotyną21,22. Podczas gdy w tym teście można zastosować przeciwciała specyficzne dla komórek apoptotycznych, podejście biotynylacji pozwala na znakowanie dowolnego celu zawierającego białko i pozwala uniknąć potencjalnych problemów z wtórną reaktywnością krzyżową przeciwciał, jeśli przeprowadza się barwienie immunologiczne. W szczególności przedstawiamy przygotowanie apoptotycznych komórek Jurkat, które zostały podwójnie wybarwione zarówno barwnikiem śledzącym komórki, jak i biotyną. Barwnik śledzący komórki pozwala na śledzenie apoptotycznych materiałów pochodzących z komórek podczas efferocytozy, podczas gdy biotynylacja powierzchniowa pozwala na rozróżnienie zinternalizowanych i niezinternalizowanych części efferocytozowanych komórek apoptotycznych. Opisujemy również hodowlę i przygotowanie linii komórkowych J774.2 i THP-1 do stosowania jako mysie i ludzkie efferocyty, makrofagi M2 pochodzące z monocytów jako przykład pierwotnej efferocytozy komórkowej oraz komórki Jurkat do stosowania jako cele efferocytarne. Metody te można łatwo zastosować do innych linii komórkowych lub komórek pierwotnych, do komórek docelowych przechodzących jakąkolwiek formę śmierci komórkowej (np. apoptozy, nekrozy i nekroptozy) oraz do mimików o rozmiarach mikronów, które symulują apoptozę komórek przez powłoki lipidowe lub powłoki z ligandami specyficznymi dla receptora efferocytarnego będącego przedmiotem zainteresowania.
Metoda opisana w tym protokole ma kilka zalet w porównaniu z metodami opartymi na cytometrii przepływowej powszechnie stosowanymi w polu23,24. Poprzez bezpośrednie obrazowanie interakcji fagocytów-komórek apoptotycznych, w połączeniu z wyraźnym znakowaniem zarówno całkowitego, jak i niezinternalizowanego materiału komórek apoptotycznych, można dokonać ilościowych pomiarów efferocytozy. Co więcej, stosowanie fluoroforów niewrażliwych na pH ogranicza czynniki zakłócające, takie jak tłumienie fluorescencji FITC i GFP przy pH lizosomalnym, co zakłóca niektóre alternatywne metody25. Wreszcie, chociaż nie opisano ich szczegółowo, metody te można zastosować przy użyciu efferocytów eksprymujących transgeny znakowane fluorescencyjnie lub przy barwieniu immunologicznym po utrwaleniu, aby umożliwić ilościowe określenie aktywności cząsteczki sygnałowej i monitorowanie procesów komórkowych podczas efferocytozy.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Żubr</td><td>3500-000-EL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Żubr</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Żubr</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Żubr</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe 18 mm #1,5 grubości</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72290-08</td><td>Rozmiar i kształt szkiełka nakrywkowego nie jest krytyczny, ale 18 mm pasuje do studzienek standardowej 12-dołkowej płytki, co upraszcza hodowlę komórkową</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman Chemical</td><td>81590</td><td>Rozpuścić w DMSO przy 1 mM (1,000x roztwór podstawowy)</td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa 488</td><td>ThermoFisher</td><td>R37174</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td>Przechowywać w eksykatorze. Nie należy przygotowywać roztworu podstawowego.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace FarRed</td><td>ThermoFisher</td><td>C34572</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Streptavadin</td><td>ThermoFisher</td><td>SA1001</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfolitowo-polikomórkowej</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5071</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>200-04</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IL-4</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>J774.2 Linia komórkowa makrofagów</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85011428-1VL</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Ludzka linia komórkowa monocytów</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa T Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Badanie regulacji efferocytozy wymaga metod, które są w stanie dokładnie określić ilościowo pobór komórek apoptotycznych oraz zbadać procesy sygnalizacyjne i komórkowe, które kontrolują efferocytozę. Ta kwantyfikacja może być trudna do przeprowadzenia, ponieważ komórki apoptotyczne są często eferocytozowane fragmentarycznie, co wymaga metod, które mogą dokładnie odróżnić zefferocytozowaną część celu apoptotycznego od pozostałych, niepochłoniętych fragmentów komórkowych. Przedstawione w niniejszym dokumencie podejście wykorzystuje podejścia podwójnego znakowania w celu dokładnego ilościowego określenia dynamiki efferocytozy i zdolności efferocytarnej efferocytów, takich jak makrofagi. Cytozol komórki apoptotycznej jest znakowany barwnikiem śledzącym komórkę, aby umożliwić monitorowanie wszystkich materiałów pochodzących z komórek apoptotycznych, podczas gdy biotynylacja powierzchniowa komórki apoptotycznej pozwala na różnicowanie między zinternalizowanymi i niezinternalizowanymi frakcjami komórek apoptotycznych. Zdolność efferocytarną efferocytów określa się poprzez wykonywanie obrazów fluorescencyjnych żywych lub utrwalonych komórek i ilościowe określanie ilości związanych i zinternalizowanych celów, zróżnicowanych przez barwienie streptawidyną. Podejście to ma kilka zalet w porównaniu z metodami takimi jak cytometria przepływowa, a mianowicie dokładne rozgraniczenie nieefferocytozowanych i eferocytozowanych frakcji komórek apoptotycznych, możliwość pomiaru dynamiki efferocytarnej za pomocą mikroskopii żywych komórek oraz zdolność do wykonywania badań sygnalizacji komórkowej w komórkach eksprymujących transgeny znakowane fluorescencyjnie. W połączeniu metody przedstawione w niniejszym protokole służą jako podstawa elastycznego podejścia eksperymentalnego, które można wykorzystać do dokładnego ilościowego określenia aktywności efferocytarnej i zbadania komórkowych szlaków sygnałowych aktywnych podczas efferocytozy.

Nocna hodowla komórek Jurkat z dodatkiem 1 µM staurosporyny prowadzi do apoptozy &gt;95% komórek, co można potwierdzić barwieniem Annexin V (Rysunek 1). Do tych eksperymentów można wykorzystać inne typy komórek, choć stężenie staurosporyny oraz czas trwania inkubacji będą wymagały optymalizacji dla każdej linii komórkowej. W celu wiarygodnej detekcji i kwantyfikacji eferocytozy, &gt;80% komórek powinno znajdować się w stanie apoptozy przed dodaniem ich do efe...

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie efferocytozy, takie jak rola cząsteczek sygnałowych w pośredniczeniu w wychwytywaniu komórek apoptotycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wyraźną ocenę ilościową wychwytu komórek apoptotycznych, w tym częściowego lub fragmentarycznego wychwytu komórek apoptotycznych, co nie zawsze jest widoczne w przypadku innych metod. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w efferocytozę komórek odpornościowych, może być również stosowana do innych typów komórek, takich jak komórki nabłonkowe lub rakowe.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z optymalizacją ustawień akwizycji mikroskopu. Po przygotowaniu ludzkich makrofagów i apoptotycznych komórek Jurkata użyj hemocytometru, aby policzyć komórki apoptotyczne. Następnie przenieś wystarczającą ilość komórek apoptotycznych do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Granulować komórki Jurkat przez odwirowanie w ilości 500 razy g przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś ogniwa w 500 mikrolitrach PBS. Podczas gdy komórki Jurkata znajdują się w wirówce, wlej 10 mikrolitrów DMSO do nowej pr

quantification-of-efferocytosis-by-single-cell-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje metodę ilościowego oznaczania fagocytozy patogennych zarodników grzybów znakowanych FITC przez ludzkie leukocyty. Zarodniki fagocytozowane są odróżniane od zarodników przylegających do komórek poprzez barwienie przeciwstawne, a następnie analizę cytometryczną przepływową.

Ilościowy pomiar fagocytozy zarodników grzybów metodą cytometrii przepływowej przez ludzkie fagocyty

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

W przypadku wielu badań naukowych wymagających analizy biologicznej i chemicznej populacji komórek, komórki te muszą charakteryzować się wysokim stopniem czystości. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest doskonałą metodą pozyskiwania czystych populacji komórek.

Oczyszczanie specyficznej populacji komórek za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)

Poznaj protokół mikroskopii fluorescencyjnej do kwantyfikacji efektozy, czyli fagocytozy komórek apoptotycznych. Metoda umożliwia badanie szlaków sygnałowych i precyzyjną ocenę pobierania komórek przez makrofagi ludzkie.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów