Przygotowanie wysokiej jakości pierwotnej hodowli komórkowej z przysadki mózgowej ryb
28 sierpnia 2018
Tutaj opisujemy protokół przygotowania i utrzymania pierwotnych hodowli komórek przysadki mózgowej z medaka (Oryzias latipes). Zoptymalizowane warunki w tym protokole uwzględniają ważne parametry, takie jak temperatura, osmolalność i pH, naśladując warunki fizjologiczne ryb, umożliwiając w ten sposób fizjologicznie bardziej znaczące wyniki.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny endokrynologii dotyczące funkcjonowania i interakcji komórek przysadki mózgowej w kontrolowanym środowisku. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że promuje ona fizjologicznie znaczące wyniki dla medaka i stanowi przewodnik referencyjny do tworzenia pierwotnych kultur komórkowych z innych gatunków. Zacznij od przymocowania głowy medaki do płytki woskowej za pomocą jednej cienkiej igły umieszczonej nad ustami i po jednej z każdej strony głowy za mózgiem.
Umieść rybę pod mikroskopem preparacyjnym i użyj cienkich kleszczy z ukośną końcówką, aby delikatnie zeskrobać łuski z czubka głowy. Ostrożnie włóż kleszcze pod skórę z boku głowy i powoli przesuwaj kleszcze w kierunku ust, aby zdjąć dach czaszki. Całkowicie odetnij rdzeń kręgowy za pomocą kleszczy i ostrożnie odwróć mózg w kierunku ust, aby odsłonić przysadkę.
Zbierz gruczoł czystymi kleszczami z prostą końcówką do plastikowej rurki zawierającej 1,5 mililitra zmodyfikowanego DPBS na lodzie. Po zebraniu wszystkich przysadek należy odwirować tkanki za pomocą mikrowirówki przez jedną do dwóch sekund w temperaturze pokojowej i użyć szklanej pipety, aby ostrożnie usunąć DPBS, uważając, aby nie naruszyć osadu przysadki mózgowej. Przemyj tkankę jednym mililitrem roztworu trypsyny przez kolejną jedną do dwóch sekund w mikrowirówce i użyj szklanej pipety, aby zassać większość supernatantu.
Gdy cała trypsyna zostanie usunięta, dodaj kolejny mililitr trypsyny do próbki i inkubuj tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 30 minut, od czasu do czasu delikatnie trzepiąc. Pod koniec inkubacji odwirować przysadki mózgowe przez jedną do dwóch sekund i użyć szklanej pipety, aby usunąć większość trypsyny bez naruszania tkanki. Następnie przemyj próbkę jednym mililitrem roztworu inhibitora trypsyny, aby dezaktywować trypsynę i odwirować przez jedną do dwóch sekund.
Po usunięciu supernatantu dodać kolejny mililitr roztworu inhibitora trypsyny do probówki i inkubować próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 26 stopni Celsjusza przez 20 minut z trzebaniem. Podczas inkubacji tkanki dodaj dwa mililitry pożywki L-15 do 35-milimetrowego naczynia do hodowli komórkowej kodowanej poli-D-lizyną z centralnym szklanym dnem i równoważ płytkę w temperaturze 26 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla przez co najmniej 10 minut. Pod koniec inkubacji odwirować przysadki mózgowe przez jedną do dwóch sekund i ostrożnie odessać cały roztwór inhibitora trypsyny z probówki.
W kapturze z przepływem laminarnym dodaj jeden mililitr lodowato zmodyfikowanego DPBS do kawałków tkanki przysadki mózgowej i użyj pipety ze szkła polerowanego ogniowo, aby delikatnie rozcierać tkanki sześć do siedmiu razy na lodzie, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Po kolejnym odwirowaniu od jednej do dwóch sekund, delikatnie przenieś około jednego mililitra zdysocjowanej komórki zawierającej górną warstwę DPBS do nowej 15-mililitrowej probówki na lodzie. Powtórz triturację i pobranie zdysocjowanych komórek jeszcze dziewięć razy, aż wszystkie 10 mililitrów DPBS zostanie zużyte, zaczynając od końcówki pipety ze średniej wielkości otworem i zmieniając ją na końcówkę pipety z mniejszym otworem na ostatnie trzy do czterech mililitrów DPBS.
Mechaniczna dysocjacja za pomocą szklanej pipety jest krytycznym krokiem tego protokołu i wymaga pewnego treningu, aby osiągnąć dobry wynik. Delikatnie pipetować roztwór komórkowy, aby uniknąć uszkodzenia delikatnych, zdysocjowanych komórek. Po 10. roztarciu zaznacz stronę każdej probówki, w której będzie znajdować się osad i odwiruj próbkę we wstępnie schłodzonej wirówce.
Pod koniec wirowania ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki i za pomocą szklanej pipety natychmiast, ale delikatnie przenieść supernatant do plastikowej probówki o pojemności 15 mililitrów, uważając, aby usunąć większość supernatantu bez naruszania małej, często niewidocznej osadki, a następnie ostrożnie ponownie zawiesić osad w 50 do 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej L-15. Ostrożnie wlać zdysocjowane komórki do środka wcześniej przygotowanego naczynia do hodowli komórkowych i pozwolić komórkom opaść na dno naczynia na około pięć minut przed przeniesieniem szalki do inkubatora, aby uniknąć rozprzestrzenienia się komórek poza zapadnięty obszar szklanego dna. Po 30 minutach w temperaturze 26 stopni Celsjusza i 1% dwutlenku węgla sprawdź komórki za pomocą mikroskopii świetlnej, aby potwierdzić, że przyczepiły się do dna naczynia i zwróć zdysocjowaną hodowlę komórek przysadki mózgowej do inkubatora na nie dłużej niż siedem dni.
Zebranie około 10 dorosłych przysadek medaka zwykle skutkuje zagęszczeniem około 50 000 do 100 000 komórek na naczynie po wysianiu. Liczba umierających komórek jest prawie stała w czasie, przy czym ponad 95% komórek jest zdolnych do życia po jednym dniu, a ponad 90% nadal żyje po trzech dniach, z niewielkim spadkiem żywotności obserwowanym po jednym tygodniu hodowli. Elektrofizjologiczne zapisy komórek gonadotropowych hormonu luteinizującego wykazujące ekspresję GFP pokazują, że zdysocjowane komórki przysadki mózgowej są w stanie spontanicznie wystrzelić potencjały czynnościowe po czterech dniach w hodowli.
Ponadto, po stymulacji hormonu uwalniającego gonadotropiny, po początkowej przejściowej hiperpolaryzacji błony komórkowej następuje dramatyczny wzrost częstotliwości wypalania, który towarzyszy depolaryzacji i wydłużeniu czasu trwania potencjałów czynnościowych. Podczas próby tej procedury, Ważne jest, aby pamiętać, aby pracować w precyzyjny i skuteczny sposób, aby utrzymać komórki przysadki mózgowej w zdrowym stanie. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak qPCR lub zaawansowane techniki obrazowania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak określone zabiegi mogą zmienić fizjologię komórek przysadki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przygotowywania i hodowli pierwotnych kultur komórek przysadki ryby medaka (Oryzias latipes). Metoda ta optymalizuje warunki poprzez uwzględnienie temperatury, osmolalności i pH w celu symulacji środowisk fizjologicznych, co umożliwia uzyskanie istotnych informacji na temat funkcji przysadki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Endokrynologia
- Techniki hodowli komórkowych
- Modelowanie fizjologiczne
Wstęp
- Pierwotne hodowle komórek przysadki mózgowej ryb nie są szeroko rozpowszechnione.
- Protokół ma na celu odwzorowanie warunków fizjologicznych w celu uzyskania bardziej miarodajnych danych.
- Zrozumienie oddziaływań między komórkami przysadki jest kluczowe dla endokrynologii.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody badania fizjologii komórek przysadki mózgowej.
- Ustanowienie punktu odniesienia dla tworzenia kultur z innych gatunków.
- Ułatwienie badań nad regulacją hormonów i oddziaływaniami komórkowymi.
Zastosowane metody
- Metodyka hodowli komórkowej dostosowana specjalnie do tkanki przysadki mózgowej ryby medaka.
- Obejmuje staranną dyssekcję oraz enzymatyczną dysocjację tkanek.
- Komórki są utrzymywane w kontrolowanym środowisku w temperaturze 26°C i przy 1% CO2.
- Kluczowe etapy obejmują dysocjację mechaniczną oraz ostrożną manipulację w celu zachowania żywotności komórek.
Główne wyniki
- Testy żywotności wykazują ponad 90% przeżywalności komórek do trzech dni hodowli.
- Zdysocjowane komórki wykazują potencjały czynnościowe i reakcje na stymulację hormonalną.
- Metoda umożliwia przeprowadzenie analizy końcowej, takiej jak qPCR, w celu dalszego zbadania fizjologii komórek.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia niezawodny protokół badania funkcji przysadki u ryby medaka.
- Metodologia dostarcza informacji możliwych do zastosowania u innych gatunków oraz w badaniu funkcji endokrynnych.
- Wyniki wspierają analizę działania hormonów i pogłębiają zrozumienie dynamiki komórkowej w endokrynologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Tworzenie fizjologicznie istotnych pierwotnych kultur komórkowych z gatunków nienależnych do ssaków umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w walidacji celów endokrynnych, zapewniając kontrolowany układ do badania szlaków sygnalizacji hormonalnej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając ilościową ocenę odpowiedzi komórkowych na hormon uwalniający gonadotropiny oraz inne modulatory. Protokół ten oferuje przekazywalne ramy adaptacji technik kultur pierwotnych do różnorodnych systemów modelowych, co usprawnia ekstrapolację międzygatunkową w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji komórek przysadki oraz ich odpowiedzi hormonalnej w kontrolowanym środowisku.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system oceny zmian elektrofizjologicznych indukowanych przez ligandy w komórkach gonadotropowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie zdysocjowanych komórek pierwotnych odpowiednich do testów żywotności oraz pomiarów elektrofizjologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną gęstość komórek (50 000–100 000 komórek/szalkę) dla standaryzowanego wysiewu do analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie żywotności i funkcji komórek przez okres do jednego tygodnia.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zastosowanie dalszych analiz, takich jak qPCR i zaawansowane obrazowanie, w celu oceny wpływu leczenia na fizjologię przysadki.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając biologicznie istotnego modelu komórkowego do badania szlaków endokrynnych przed rozpoczęciem prac nad identyfikacją związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów sygnalizacji komórkowej przysadki oraz regulacji hormonalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza wyników ilościowych, w tym wartości procentowych przeżywalności i pomiarów częstotliwości potencjałów czynnościowych.
- Analityka: Umożliwia odczyty elektrofizjologiczne i molekularne, które wspierają analizę porównawczą różnych warunków.
- Badania translacyjne: Pozwala na utrzymanie funkcjonalnych komórek przysadki w długotrwałej hodowli, co wspiera badania przedkliniczne zorientowane na biomarkery.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy adaptowalną platformę hodowli pierwotnej, możliwą do zastosowania u innych gatunków niemmowych po wprowadzeniu odpowiednich dostosowań środowiskowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów endokrynnych dzięki zastosowaniu fizjologicznie istotnych modeli komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym procedurom dysocjacji, wysiewania i inkubacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnej oceny wpływu związków na funkcję komórek przysadki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów endokrynnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane odpowiedzi komórkowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrosekcji oraz enzymatycznej dysocjacji tkanek.
- Zależne od dostępu do inkubatorów z kontrolą temperatury, ustawionych na 26°C i 1% CO2.
- Wymaga standaryzowanego składu pożywki, dostosowanego do osmolalności i pH właściwego dla ryb.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania protokołu przy przenoszeniu go na inne gatunki o odmiennych parametrach fizjologicznych.
- Ograniczone przez delikatność dysocjowanych komórek przysadki, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z nimi podczas etapów mechanicznej tryturacji.
