Kwantyfikacja zawartości białka rozpuszczalnego w roślinach i strawnych węglowodanów na przykładzie kukurydzy (Zea mays)

Metoda ta pozwala naukowcom zajmującym się naukami o roślinach i ekologią żywienia na dokładny pomiar stężeń rozpuszczalnych białek i strawnych węglowodanów w tkance roślinnej. Główną zaletą tych technik jest to, że oferują one szybką i łatwą metodę ilościowego oznaczania tych dwóch niezwykle ważnych makroskładników odżywczych z dużą dokładnością. Techniki te mają silne implikacje dla dziedziny ekologii, ponieważ białka roślinne i węglowodany stanowią podstawę lądowych sieci pokarmowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej technice mogą mieć problemy, ponieważ istnieje kilka kroków i niektóre techniki, które nie są powszechnie wykonywane w laboratorium ogólnego użytku. Na początek odważ powtórzone próbki każdej tkanki do oznakowanych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie zapisz dokładną masę każdej próbki.

Za pomocą mikropipetera dodać 500 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu do każdej probówki. Zamknij szczelnie pokrywki i podgrzewaj rurki sonicznie przez 30 minut. Następnie umieść rurki w podgrzanej gorącej kąpieli wodnej na 15 minut.

Następnie odwirować probówki o stężeniu 15 000 G przez 10 minut. Odpipetować supernatant do nowych, oznakowanych probówek do mikrowirówek, używając nowej końcówki pipety do każdej próbki. Dodaj 300 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu do osadu i powtórz wirowanie przez 10 minut.

Następnie usunąć sklarowany osad i przenieść go do probówek zawierających supernatant z pierwszego odwirowania. Aby zneutralizować pH supernatantu, dodaj 11 mikrolitrów 5,8-molowego kwasu solnego. Użyj papierka lakmusowego, aby potwierdzić, że pH wynosi około siedmiu.

Następnie dodaj 90 mikrolitrów 100% kwasu trichlorooctowego do każdej probówki. Następnie inkubuj probówki na lodzie przez 30 minut. Odwirować próbki o sile 13 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie użyj przewodu próżniowego i szklanej końcówki mikropipety, aby usunąć kwas trójchlorooctowy. Bądź bardzo ostrożny, aby nie naruszyć pelletu końcówką ssącą. Następnie umyj granulat 100 mikrolitrami acetonu schłodzonego do 20 stopni Celsjusza, a następnie pozwól acetonowi odparować w dygestorium.

Rozpuść osad białkowy w jednym mililitrze wodorotlenku sodu. Mogą być wymagane dodatkowe rundy podgrzewania, wirowania i ogrzewania dźwiękowego. Dodać 160 mikrolitrów każdego roztworu wzorcowego IGG do 96-dołkowej płytki w trzech kroplach, zaczynając od pozycji A1 Następnie w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra dodać 50 mikrolitrów każdego roztworu próbki do 950 mikrolitrów wody destylowanej.

Następnie dodać 60 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do płytki dołka w trzech egzemplarzach, zaczynając od pozycji H1. Dodaj 100 mikrolitrów wody destylowanej do wszystkich ślepych i nieznanych studzienek na próbki. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 40 mikrolitrów barwnika białkowego Coomassie Brilliant Blue G-250 do każdego dołka płytki.

Za pomocą igły rozbij wszelkie bąbelki znajdujące się w studzienkach. Następnie pozostaw płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie użyj spektrofotometru do mikropłytek, aby zarejestrować wartości chłonności dla każdej studzienki przy 595 nanometrach.

Najpierw odważ powtórzenia z każdej próbki tkanki do szklanych probówek o pojemności 15 mililitrów. Oznaczyć probówki i zanotować dokładną masę każdej próbki. Następnie dodaj jeden mililitr 0,1 molowego kwasu siarkowego do każdej probówki i szczelnie zamknij nakrętki.

Następnie umieść probówki we wrzącej łaźni wodnej na godzinę. Przenieś rurki do letniej łaźni wodnej, aby ostygły. Następnie wlej zawartość probówek do oznaczonych 1,5 mililitrowych probówek do mikrowirówek

Następnie odwirować probówki o natężeniu 15 000 G przez 10 minut. Za pomocą mikropipety przenieś supernatant do nowych, oznakowanych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Za pomocą pipety przenieś 15 mikrolitrów każdej nieznanej próbki do własnej probówki.

Następnie dodaj 385 mikrolitrów wody destylowanej do każdej probówki. W dygestorium dodaj 400 mikrolitrów 5% fenolu do każdej standardowej i nieznanej probówki z próbką. Natychmiast po tym dodaj dwa mililitry kwasu siarkowego do każdej probówki.

Upewnij się, że dodałeś kwas siarkowy na powierzchnię roztworu. Po inkubacji probówek przez 10 minut, zwiruj probówki. Następnie inkubuj probówkę przez dodatkowe 30 minut.

Przenieś 800 mikrolitrów z każdej probówki na próbkę do trzech polistyrenowych półmikrokuwet o pojemności 1,5 mililitra. Następnie ustaw spektrofotometr na odczyt 490 nanometrów i skalibruj za pomocą ślepej kuwety. Na koniec przepuść każdą kuwetę przez spektrofotometr i zapisz chłonność.

Korzystając z tego protokołu, przeanalizowano zawartość rozpuszczalnego białka i strawnych węglowodanów w czterech różnych tkankach polowych i kukurydzy cukrowej z trzech regionów geograficznych. Zaobserwowano znaczące różnice w zawartości białka rozpuszczalnego między regionami, co spowodowało konieczność przeprowadzenia oddzielnych analiz dla każdego regionu. W różnych regionach stwierdzono kilka różnic w zawartości rozpuszczalnego białka i strawnych węglowodanów między tkankami.

W Minnesocie tkanki różniły się tylko zawartością rozpuszczalnego białka, podczas gdy tkanki Karoliny Północnej różniły się zarówno rozpuszczalnym białkiem, jak i strawnymi węglowodanami. Zmienność zawartości makroskładników odżywczych w tkankach w Teksasie zależała od odmiany. Technika ta pozwoli naukowcom zajmującym się naukami o roślinach i ekologią żywienia na precyzyjny pomiar rozpuszczalnego białka roślinnego i strawnych węglowodanów, zamiast ekstrapolacji na podstawie pomiarów elementarnych.

Nie zapominaj, że praca z ciekłym azotem, stężonymi kwasami i zasadami, może być bardzo niebezpieczna. Dlatego zawsze stosuj środki ostrożności, takie jak rękawice, okulary ochronne, fartuchy i buty z zakrytymi palcami podczas pracy z tymi chemikaliami.