Name: Ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Poznaj ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania dla wirusologii i diagnostyki. Ta metoda umożliwia szybką i dokładną analizę dużej liczby próbek, wspierając badania nad fagami terapeutycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez PhRMA Foundation Research Starter Grant oraz grant National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health pod numerem R01HL138251.

1. Projektowanie i analiza starterów dla genomowego DNA faga T7
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji genomowego DNA faga T7. 
	UWAGA: Startery F (forward) i R (reverse) (patrz Tabela materiałów) amplifikują sekwencję DNA T7 znajdującą się powyżej zmiennego regionu biblioteki (Rycina 1).</li>
	<li>Wybierz odpowiedni program do analizy starterów, aby ocenić ich parametry, w tym temperaturę topnienia (Tm), zawartość GC (GC%), tworzenie dimerów starterów, struktur spinek oraz przydatność do PCR (Rycina 1).</li>
	<li>Zamów oligonukleotydy starterów, a po ich otrzymaniu rozpuść liofilizowane oligosy w ultra czystej wodzie wolnej od DNaz i RNaz, aby przygotować roztwory stokowe o stężeniu 100 µM w probówkach wirówkowych 1,5 mL, i przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj kilka aliquotów (około 50 µL w każdej probówce 1,5 mL) z roztworu stokowego starterów 100 µM. 
	UWAGA: Krok ten ma na celu zapobieganie częstym cyklom zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie standardów do ilościowego oznaczenia genomowego DNA bakteriofaga T7
<ol>
	<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenia 10-krotne referencyjnego DNA faga T7 o stężeniu 0,1 µg/µL (1,0 x 108 fg/µL) (zakupiony; o znanym stężeniu 0,1 µg/µL, patrz materiały) w zakresie od 1,0 x 106 do 1,0 x 100 fg/µL, wykorzystując ultra-czystą H2O w probówkach PCR 0,2 mL. Przygotuj każde stężenie w całkowitej objętości 20 µL (Rysunek 2).</li>
	<li>Wymieszaj probówki PCR na wirówce typu vortex, aby zapewnić dokładne wymieszanie na każdym etapie rozcieńczania. Należy również zmieniać końcówki przy przenoszeniu próbki DNA do kolejnego rozcieńczenia. 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie nowej serii standardów DNA do krzywej wzorcowej dla każdej partii eksperymentu qPCR.</li>
	<li>Użyj równania 1 (poniżej), aby przeliczyć stężenia referencyjnego DNA faga T7 z fg/µL na kopie genomu (gc)/µL (Rysunek 2).</li>
	<li>Stężenie DNA faga T7 w gc/µL= 
	<img alt="Wzór na stężenie DNA T7 w fg/µL; równanie do obliczeń molekularnych w badaniach." src="/files/ftp_upload/58165/58165eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> (1) 
	UWAGA: bp: para zasad; referencyjne genomiczne DNA T7 ma długość 37314 bp.</li>
</ol>
3. Obróbka wstępna próbek fagowych przed przygotowaniem reakcji qPCR
<ol>
	<li>(Opcja 1) Pipetować 20 µL jednego klonu T7 (faga) wyselekcjonowanego podczas biopanningu przeciwko modelowi śluzu przypominającego mukowiscydozę (CF) in vitro do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mL. Do każdej próbki 20 µL dodać 1,25 jednostki DNazy I (0,5 µL). 
	UWAGA: Biblioteka heptapeptydów T7 ograniczonych cysteiną (CX7C) była poddawana biopanningowi przeciwko śluzowi przypominającemu CF naniesionemu na wkłady membranowe z 24 dołkami (patrz Tabela materiałów) przez 15 min. Dalsze szczegóły znajdują się w sekcji wyników. Z eluatu wybrano jeden klon T7 do przygotowania próbki do qPCR.
	<ol>
		<li>Opcja 2: Pipetować 200 µL klonu T7 do probówek 1,5 mL i dodać 5 jednostek DNazy I 
		(2 µL) do każdej próbki. 
		UWAGA: Objętość próbki fagów wybrana na tym etapie zależy od objętości zebranej podczas biopanningu. Choć protokół skupia się na qPCR fagów po biopanningu, kroki biopanningu są szczegółowo opisane w protokole użytkownika zestawu do fagów T7 (patrz Tabela materiałów)13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakręcić probówki z próbkami fagów T7 (krok 3.1) i inkubować je w 37 °C przez 10 min w suchej kąpieli grzewczej (tj. bloku grzejnym).</li>
	<li>Inkubować probówki (z kroku 3.2) w 100 °C przez 15 min w suchej kąpieli grzewczej (Rysunek 3A). 
	UWAGA: Ponieważ podczas etapu ogrzewania zachodzi parowanie i kondensacja, należy upewnić się, że probówki wirówkowe 1,5 mL są całkowicie zakręcone.</li>
	<li>Wirować poddane obróbce termicznej fagi z kroku 3.3 przy 18 534 x g przez 10 s. Wymieszać fagi, umieszczając probówkę na wirówce typu vortex ustawionej w trybie aktywacji dotykowej na 10 s, a następnie ponownie wirować przy 18 534 x g przez 10 s. 
	UWAGA: Cykl wirowanie-mieszanie-wirowanie ma na celu zapewnienie dokładnego wymieszania podgrzanych próbek fagów.</li>
	<li>Ostudzić probówki z próbkami w temperaturze pokojowej (RT), pozostawiając je na stole laboratoryjnym, lub przechowywać w temperaturze 4 °C w lodówce przez noc. 
	UWAGA: Eksperyment można przerwać na tym etapie.</li>
</ol>
4. Przygotowanie reakcji qPCR
UWAGA: Jedna reakcja PCR przypada na jedną próbkę. Każda reakcja PCR zawiera 5 µL qPCR master mix (patrz materiały), 1 µL 5 µM mieszaniny par starterów, 2 µL H2O oraz 2 µL obrobionej termicznie próbki faga T7. W przypadku wielu reakcji PCR wszystkie odczynniki, z wyjątkiem próbki faga, miesza się wstępnie w jednej probówce o pojemności 1,5 mL. Objętość każdego odczynnika w mieszaninie wstępnej zależy od liczby próbek faga do qPCR.
<ol>
	<li>Przygotuj premiks qPCR dla 10 próbek fagów z biopanningu o nieznanym stężeniu oraz 7 próbek o stężeniach wzorcowych w trzech powtórzeniach. W rezultacie otrzymujemy łącznie 51 próbek, a tym samym 51 reakcji qPCR (tj. jedną reakcję na próbkę). Dla 51 reakcji przygotuj premiks składający się z 255 µL master mixu qPCR (51x 5 µL), 51 µL starterów (51x 1 µL) oraz 102 µL H2O (51x 2 µL). 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie kilku dodatkowych reakcji PCR, aby zrekompensować ubytek objętości podczas rozdzielania mieszaniny PCR do poszczególnych dołków płytki qPCR 96-dołkowej.</li>
	<li>Rozdziel po 8 µL premiksu PCR do każdego dołka płytki qPCR 96-dołkowej, łącznie do 51 dołków (tj. 51 reakcji qPCR). Podczas rozdzielania nie ma potrzeby zmiany końcówek.</li>
	<li>Do każdego dołka dodaj 2 µL obrobionych termicznie próbek faga T7 (krok 3.4) lub referencyjnego DNA faga T7 (krok 2.1) (Rysunek 3B); zmieniaj końcówki podczas dodawania różnych próbek DNA do dołków, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej. Próbki 2 µL DNA należy dozować pod powierzchnię premiksu qPCR (tj. do 8 µL premiksu PCR).</li>
	<li>Uszczelnij płytkę qPCR folią klejącą. 
	UWAGA: Krok ten jest krytyczny, niezależnie od rodzaju płytki qPCR. Użyj zalecanego zestawu, aby całkowicie uszczelnić płytkę; w przeciwnym razie każdy nieszczelny obszar płytki spowoduje ubytek objętości podczas cykli PCR.</li>
	<li>Owiń płytkę qPCR folią aluminiową, aby zminimalizować fotowyblaknięcie fluorescencji, a następnie umieść ją w urządzeniu do qPCR.</li>
</ol>
5. Warunki cyklizacji qPCR
UWAGA: Warunki cykli qPCR zostały ustawione na specjalistycznym sprzęcie do qPCR (patrz Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przeprowadź reakcję na 96-dołkowej płytce qPCR za pomocą urządzenia do qPCR. W menu urządzenia wybierz ustawienia, aby skonfigurować następujące warunki eksperymentalne (Rycyna 3C).</li>
	<li>Dla objętości próbki 10 µL ustaw następujące warunki cykliczności: jeden cykl w 50 °C przez 2 min, jeden cykl w 95 °C przez 2 min, a następnie 40 cykli (95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min). Następnie uruchom ustawienia krzywej topnienia: jeden cykl obejmujący 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min i 95 °C przez 15 s.</li>
	<li>Przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w kroku 6.</li>
</ol>
6. Analiza surowych danych qPCR i przeliczenie wartości Ct z qPCR na gc/µL dla bakteriofagów T7
<ol>
	<li>Przeanalizuj surowe dane qPCR i oceń ich jakość, analizując charakterystyczne wykresy danych surowych (Rysunek 4). 
	UWAGA: Wykres amplifikacji, wykres wieloskładnikowy oraz wykres krzywej topnienia są kluczowymi wykresami charakterystycznymi służącymi do walidacji jakości danych qPCR.</li>
	<li>Oblicz średnie wartości cyklu progowego (Ct) z prób wykonanych w trzech powtórzeniach dla każdego stężenia krzywej wzorcowej (krok 2.1).
	<ol>
		<li>Nanieś średnie Ct (Y) w funkcji log (gc/µL) (X), aby uzyskać krzywą liniową Y = kX + b (gdzie k to nachylenie krzywej liniowej, a b to punkt przecięcia z osią Y).</li>
		<li>Oblicz współczynnik liniowości14 R2 (R2 musi być &gt;0,99).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystaj krzywą wzorcową Y = kX + b do obliczenia liczby fagów T7 w próbkach z biopanningu (t.j. fagów wyselekcjonowanych przeciwko śluzowi typu CF) w gc/µL (Rysunek 5). 
	UWAGA: k jest nachyleniem krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Oblicz wydajność amplifikacji za pomocą następującego równania 
	<img alt="Wzór na obliczanie wydajności, przedstawiony jako wyrażenie matematyczne do analizy danych naukowych." src="/files/ftp_upload/58165/58165eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> (2) 
	UWAGA: k jest nachyleniem krzywej wzorcowej wygenerowanej z qPCR referencyjnego DNA. Idealny zakres wydajności amplifikacji wynosi 90–110%.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11848876">Phage Display.</a> Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).</li>
<li>Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+technologies%3A+Application+for+the+discovery+of+drug+and+gene+delivery+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).</li>
<li>Dias-Neto, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20020040">Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis.</a> PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).</li>
<li>Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+M13+and+T7+bacteriophages+by+TaqMan+and+SYBR+green+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR.</a> Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).</li>
<li>Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+detection+of+T7+bacteriophages+using+paper+based+sandwich+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).</li>
<li>Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+highly+amplified+enzyme-linked+immunosorbent+assay+signals+from+genetically+engineered+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage.</a> Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).</li>
<li>Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+phage+peptide+interaction+with+antibody+using+phage+mediated+immuno-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR.</a> J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).</li>
<li>Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenous+M13+bacteriophage+quantification+assay+using+switchable+lanthanide+fluorescence+probes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes.</a> BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).</li>
<li>Schlaman, H. R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+of+signaling+proteins+with+phage-displayed+ligands+by+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).</li>
<li>Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enumeration+of+phage+in+monodisperse+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions.</a> Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).</li>
<li>Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+quantitation+of+bacteriophage+M13+using+desalting+spin+columns+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR.</a> Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).</li>
<li>T7Select Biopanning Kit. , Millipore Sigma. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP ">https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit,EMD_BIO-70018#anchor_USP </a> (2018).</li>
<li>Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21116397">Linear Regression Analysis.</a> Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimun+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemitry%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Fittipaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+infectious+bacteriophage+T4+virus+by+propidium+monoazide+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).</li>
<li>Lodder, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+bacteriophage+MS2+by+filtration+and+irradiation+determined+by+culture+and+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR.</a> Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Brown-Jaque, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29180282">Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).</li>
<li>Naveca, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+reverse+transcription+real-time+polymerase+chain+reaction+for+simultaneous+detection+of+Mayaro%2C+Oropouche%2C+and+oropouche-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).</li>
<li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+differentiation+of+human+parvovirus+B19+and+human+parvovirus+4+by+an+internally+controlled+multiplex+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR.</a> Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).</li>
<li>Bliem, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triplex+quantitative+pcr+strategy+for+quantification+of+toxigenic+and+nontoxigenic+Vibrio+cholerae+in+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).</li>
<li>Wan, Z., Goddard, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+Between+Conjugation+and+M13+Phage+Infection+in+Escherichia+coli+in+the+Absence+of+Selection+Pressure%3A+A+Kinetic+Study%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy metody qPCR do ilościowego oznaczania genomowego DNAfagowego 5, a tutaj opisaliśmy i dostosowaliśmy metodę qPCR do zliczania fagów T7 wybranych na tle bariery śluzowej podobnej do mukowiscydozy. Wytyczne dotyczące minimalnych ilości informacji do publikacji ilościowych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym (MIQE) zostały dostosowane do opracowania i walidacji metody qPCR do oznaczania liczby fagów T715. Opracowany przez nas protokół ilościowego oznaczania fa...

Technologia wyświetlania bakteriofagów (fagów), opracowana przez George'a Smitha w 1985 roku, jest potężnym, wysokowydajnym podejściem do identyfikacji ligandów peptydowych lub białkowych przeciwko celom lub receptorom z błony komórkowej, antygenom chorobowym, organellom komórkowym lub określonym narządom i tkankom w ciągu ostatnich dwóch dekad1,2. W tym przypadku losowe biblioteki polipeptydów lub przeciwciał jednołańcuchowych są wyświetlane na białkach płaszcza fagów (zwykle M13 lub T7), a specyficzne ligandy można zidentyfikować na podstawie płukania przeciwko unieruchomionym białkom w systemach biologicznych in vitro lub in vivo w iteracyjnym procesie selekcji. Następnie ligandy mogą być sprzężone z obrazowaniem lub środkami terapeutycznymi do diagnozowania i leczenia chorób3,4. Bardzo ważne jest dokładne wyliczenie fagów podczas wielu etapów biopanowania: (1) w celu ilościowego określenia fagów, które wiążą się z substratem i (2) w celu ilościowego określenia fagów, aby określić, czy następuje wzbogacenie w każdej rundzie selekcji (wzbogacenie fagów wskazuje na powinowactwo biopanowanych fagów do celu). Obecny złoty standard kwantyfikacji, dwuwarstwowy test płytki nazębnej, stawia przed nami wiele wyzwań; Jest to żmudne, kłopotliwe i potencjalnie niedokładne w przypadku dużej liczby próbek. Dlatego nasza grupa opracowała czułą, powtarzalną, dokładną i efektywną czasowo ilościową metodę reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) do zliczania cząstek fagów M13 i T7 z biopanningu5.
qPCR jest atrakcyjną i wykonalną metodą dokładnego oznaczania fagów T7 i M13. Ponieważ każda pojedyncza cząstka faga może zawierać tylko jedną kopię genomowego DNA (dsDNA lub ssDNA), jeden genom faga jest równoważny jednej cząstce faga; Określając ilościowo liczbę genomów fagów, możliwe jest ilościowe określenie liczby fagów. Podczas qPCR fluorescencyjne barwniki reporterowe wiążą genomowe DNA faga niespecyficznie lub specyficznie poprzez startery specyficzne dla sekwencji podczas amplifikacji PCR, a sygnał fluorescencyjny wzrasta z każdą rundą amplifikacji. Gdy sygnał fluorescencji osiągnie próg, ta runda/cykl wzmocnienia jest zapisywany jako cykl progowy (Ct). Znane stężenia referencyjnego DNA fagowego są wykreślane w stosunku do ich wartości Ct w celu ustalenia krzywej standardowej. Korzystając z krzywej wzorcowej z wartościami Ct próbek DNA, można interpolować stężenia fagów.
Chociaż wiele strategii zostało już wcześniej opracowanych i szeroko stosowanych do ilościowego oznaczania fagów z biopanningu, każda z nich ma specyficzne wyzwania. Najpopularniejszą i najbardziej konwencjonalną metodą jest dwuwarstwowy test płytki nazębnej. Tutaj bakterie gospodarza są zakażone fagami przygotowanymi w seryjnych rozcieńczeniach, są powlekane na stałym podłożu agarowym i pokrywane agarem; Fagi są wyliczane za pomocą liczby utworzonych blaszek (tj. jednostek tworzących płytki nazębne lub PFU) na płytce agarowej. Test płytki nazębnej jest czuły, ale żmudny, czasochłonny i niedokładny, szczególnie w przypadku wielu próbek i o wysokich stężeniach5. Dodatkowo, testy immunoenzymatyczne (ELISA) zostały przystosowane do zliczania cząstek fagów M13 i T76,7,8. W tym przypadku fagi w różnych rozcieńczeniach są wiązane i wychwytywane na stałym podłożu (tj. Mikropłytce), badane za pomocą przeciwciał specyficznych dla fagów i wykrywane za pomocą reporterów (np. wrażliwych na enzymy substratów chromogennych, fluoroforów) w celu określenia liczby obecnych cząstek fagów. Odczyty (np. fluorescencja, absorbancja) próbek mogą być wykorzystane do ilościowego określenia nieznanych stężeń w stosunku do wzorców fagowych przy znanych stężeniach. Opracowano różne testy ELISA oparte na fagach, ale mają one potencjalne ograniczenia. Jedna grupa opracowała papierowy test ELISA kanapkowy z zakresem kwantyfikacji obejmującym siedem rzędów wielkości (10,2-10,9 pfu/ml); Jednak ta metoda wymagała wielu etapów powlekania przeciwciałami i trwała do całego dnia w teście<Klasa SUP="xref">8. Nasza grupa opracowała również metodę ELISA do ilościowego oznaczania cząstek faga M13, ale miała mniej czuły zakres wykrywania od 10,6 do 10,11 pfu/ml5. Opracowano przełączalne sondy fluorescencyjne lantanowców do oznaczania liczby M13, a dane ilościowe można uzyskać w ciągu 20 minut; jednak ten test ma wąski zakres dynamiki od 109 do10 12 pfu/mL9. Jedna grupa użyła mikroskopii sił atomowych do zliczenia cząstek faga M13 w roztworze, ale wymagało to zaawansowanej mikroskopii elektronowej i działało tylko w wąskim zakresie stężeń10. W innym badaniu wykorzystano emulsje monodyspersyjne do wychwytywania fluorescencyjnych fagów reporterowych M13 i T4 oraz liczenia fagów według liczby kropelek fluorescencyjnych; jednak podejście to wykazało również wąski zakres kwantyfikacji od 102 do 106 pfu/mL11. Podczas gdy kropelkowy cyfrowy PCR został wykorzystany do ilościowego oznaczania fagów M13, podejście to nie jest w stanie rozróżnić liczby zakaźnych i niezakaźnych cząstek fagów12.
Nasza grupa niedawno opracowała metody qPCR do zliczania fagów T7 i M13 zidentyfikowanych podczas biopanowania na modelu komórkowym bariery krew-mózg przy użyciu dwóch różnych fluorescencyjnych barwników reporterowych5. W porównaniu z wyżej wymienionymi metodami kwantyfikacji, opracowane przez nas metody qPCR charakteryzowały się wysoką przepustowością i efektywną czasowo oznaczalnością wielu próbek oraz były w stanie odróżnić fagi zakaźne od niezakaźnych za pomocą wstępnej obróbki próbek fagów za pomocą DNazy I. Co ważne, podejście to pozwala na powtarzalne i dokładne ilościowe określenie bakteriofagów M13 i T7 na podstawie próbek biopanujących. Aby poprowadzić początkujących badaczy w dziedzinie qPCR fagów, opisujemy szczegółową metodę qPCR do zliczania cząstek faga T7 z biblioteki ograniczonej cysteiną (CX7C) zestawionych z barierą śluzową mukowiscydozy in vitro. Dzięki tym pracom metoda qPCR może zostać rozszerzona o ilościowe oznaczanie cząstek fagów z innych rodzajów biopanowania i z innych źródeł, w tym wody, gleby i płynów ustrojowych.

<table><tbody><tr><td>Materiały i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery do genomowego DNA T7 IDT</td><td></td><td></td><td>F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT</td></tr><tr><td>T7 Select kontrola pakowania DNA</td><td>EMD Millipore</td><td>69679-1UG</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix</td><td>Applied biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw optycznych folii samoprzylepnych MicroAmp</td> Zestaw do klonowania <td>ThermoFisher Scientific</td><td>4313663</td><td></td></tr><tr><td>T7Select 415-1 EMD</td><td>Millipore</td><td>70015</td><td>Protokoły użytkownika: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP</td></tr><tr><td>Roztwór DNase I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90083</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNazo-Free Destylowana H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 System PCR w czasie rzeczywistym z szybkim 96-dołkowym blokiem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Heraeus Pico 21</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002415</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Cyfrowy mikser wirowy Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>HERMO SCIENTIFIC Grzałka Multi-Blok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Model: 2001</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend X1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>M-20 Wirnik kubełkowy z mikropłytkami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75003624</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio Oprogramowanie do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>v1.2</td></tr><tr><td>Projekt startera qPCR w czasie rzeczywistym</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowy pcr bakteriofaga t7 z biopanowania

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Ten protokół opisuje użycie ilościowego PCR (qPCR) do wyliczania fagów T7 z eksperymentów selekcji fagów (np. "biopanning"). qPCR to oparte na fluorescencji podejście do ilościowego oznaczania DNA, a tutaj jest przystosowane do ilościowego oznaczania genomów fagów jako zamiennika dla cząsteczek fagów. W niniejszym protokole opisano łatwą metodę przygotowania DNA fagowego przy użyciu ogrzewania w wysokiej temperaturze bez dodatkowego oczyszczania DNA. Metoda wymaga jedynie niewielkich objętości fagów poddanych obróbce cieplnej i niewielkich objętości reakcji qPCR. qPCR jest wysokoprzepustowy i szybki, jest w stanie przetworzyć i uzyskać dane z 96-dołkowej płytki reakcji w ciągu 2–4 godzin. W porównaniu z innymi podejściami do liczenia fagów, qPCR jest bardziej efektywny czasowo. W tym przypadku qPCR służy do zliczania fagów T7 zidentyfikowanych na podstawie biopanowania w stosunku do modelu śluzu podobnego do mukowiscydozy in vitro. Metodę qPCR można rozszerzyć w celu ilościowego określenia fagów T7 z innych eksperymentów, w tym z innych rodzajów biopanacji (np. unieruchomione wiązanie białka, badania przesiewowe fagów in vivo) i innych źródeł (np. układów wodnych lub płynów ustrojowych). Podsumowując, protokół ten może być modyfikowany w celu ilościowego określenia dowolnych wirusów zamkniętych w DNA.

Do projektowania starterów do qPCR można wykorzystać różne narzędzia do projektowania primerów. Zazwyczaj programy do projektowania starterów posiadają wbudowane algorytmy służące do obliczania i walidacji kluczowych parametrów starterów, np. zawartości GC%, Tm, tworzenia dimerów starterów lub spinek, itp. Generalnie kluczowe kryteria są podobne w różnych narzędziach do projektowania starterów, a primery można projektować zgodnie z ich instrukcjami. Do potwierdzenia swoi...

Powtarzalna, dokładna i efektywna czasowo metoda ilościowego PCR (qPCR) do oznaczania bakteriofagów T7 jest opisana tutaj. Protokół jasno opisuje przygotowanie genomowego DNA fagowego, przygotowanie reakcji PCR, warunki cykliczne qPCR i analizę danych qPCR.

Ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie wirusologii i mikrobiologii związanych z liczeniem bakteriofagów ze złożonych próbek oraz diagnostyką i terapią opartą na bakteriofagach. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona efektywne czasowo i dokładne oznaczanie ilościowe dużej liczby próbek z eksperymentów biopanoramowania z wyświetlaczem fagów, które nie są możliwe w przypadku tradycyjnych testów. Procedurę zademonstrują Rashmi Mohanty i Jasmim Leal, doktorantki z mojego laboratorium.Po zaprojektowaniu starterów i stworzeniu stężenia podstawowego należy uzyskać referencyjne DNA faga T7 w stężeniu 0,1 mikrograma na mikrolitr. Używając ultraczystej wody, seryjnie rozcieńcz to DNA dziesięciokrotnie, od miliona femtogramów na mikrolitr do jednego femtograma na mikrolitr w 0,2 mililitrowych probówkach PCR. Przygotuj 20 mikrolitrów każdego stężenia, pamiętając o zmianie końcówek pipet i wirowaniu probówek między każdym etapem rozcieńczania.Następnie przelicz referencyjne stężenie DNA faga T7 z femtogramów na mikrolitr na kopie genomu na mikrolitr. Najpierw pipetuj 200 mikrolitrów próbki klonu faga T7 do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej dla każdej z 10 pożądanych próbek. Dodaj dwa mikrolitry DNazy po jednym do każdej probówki.Zakryj probówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut w podgrzewanej suchej kąpieli. Następnie inkubować w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 15 minut w podgrzewanej suchej kąpieli. Odwirować probówki zawierające fagi poddane obróbce cieplnej pod ciśnieniem 18 534 g przez 10 sekund.Umieść odwirowane probówki na mieszalniku wirowym ustawionym w trybie aktywacji dotykowej na 10 sekund, aby wymieszać fagi. Wiruj ponownie z prędkością 18 534 razy g przez 10 sekund. Następnie pozostaw próbki na stole laboratoryjnym na około godzinę, aby schłodzić je do temperatury pokojowej.Przygotować premiks qPCR dla 10 biopanowanych próbek fagów o nieznanym stężeniu i siedmiu próbek o standardowych stężeniach w trzech egzemplarzach. Otrzymujemy premiks na 51 próbek zawierający 255 mikrolitrów głównej mieszanki qPCR, 51 mikrolitrów starterów i 102 mikrolitry wody. Porcję ośmiu mikrolitrów przygotowanego PCR wymieszać do 51 dołków 96-dołkowej płytki qPCR.Następnie dodaj dwa mikrolitry próbek fagów T7 poddanych obróbce cieplnej do każdej z tych studzienek, dozując je pod powierzchnię premiksu qPCR. Za pomocą folii samoprzylepnej uszczelnij płytkę. Owiń płytkę folią aluminiową, aby zminimalizować wybielanie fluorescencyjne, a następnie przystąp do uruchamiania płytki na sprzęcie qPCR.Ustaw warunki cykliczne i ustawienia krzywej topnienia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po uruchomieniu qPCR na podstawie surowych danych analizowany jest wykres amplifikacji, wykres krzywej topnienia i wykres wieloskładnikowy. Wykres amplifikacji wskazuje, czy amplifikacja PCR każdej próbki zakończyła się sukcesem, czy nie.Wykres wieloskładnikowy przedstawia wzmocnienie i zanik sygnału fluorescencyjnego w cyklach wzmacniania. Podczas gdy wykres krzywej topnienia służy do walidacji specyficzności starterów, ponieważ każdy produkt PCR ma jedną unikalną temperaturę topnienia. Krzywa wzorcowa jest następnie generowana na podstawie referencyjnego DNA.Tutaj wydajność amplifikacji oblicza się na 92,4%Reprezentatywne dane z badania qPCR są następnie porównywane z tymi samymi fagami, które zostały określone ilościowo za pomocą dwuwarstwowego testu płytki nazębnej w badanym zakresie od 10 do 10 milionów kopii genomu na mikrolitr. Jak widać tutaj, liczba fagów w ilościowym oznaczaniu qPCR jest wyższa niż w teście płytki. Powtarzalność metody qPCR reprezentowana przez współczynnik wariancji ma wartości od 2,85 do 27,2%Próbując tej procedury, należy pamiętać, że istnieje wiele czynników związanych z opracowaniem i stosowaniem qPCR w celu dokładnego ilościowego określenia fagów, w tym staranna obróbka i przygotowanie próbek oraz kalibracja odpowiedniego sprzętu.Zgodnie z tą metodą można zastosować inne techniki w celu zliczenia cząstek fagów w różnych zastosowaniach obejmujących biopanowanie in vivo, przygotowanie DNA biblioteki fagów oraz sekwencjonowanie nowej generacji i wykrywanie fagów w złożonych próbkach środowiskowych. Nie zapominaj, że fagi są uważane za zagrożenie biologiczne w laboratorium, a środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej, w tym rękawice i fartuchy laboratoryjne, powinny być zawsze noszone podczas wykonywania zabiegu.

quantitative-pcr-of-t7-bacteriophage-from-biopanning

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie omawiamy ilościową reakcję łańcuchową polimerazy, qPCR, w celu wyliczenia bakteriofagów T7 poprzez kwantyfikację DNA. Barwnik fluorescencyjny w mieszaninie PCR wiąże się z nowo zsyntetyzowanymi niciami DNA i emituje fluorescencję, która jest mierzona.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu zliczenia bakteriofagów

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Biopanowanie oparte na biosensorach mikrowagi kwarcowej do badania interakcji białko-lek

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Ten protokół umożliwia ujawnienie wpływu profagów na ich gospodarzy. Kultury bakteryjne są synchronizowane w warunkach, które najlepiej wspierają stan lizogeniczny, ograniczając spontaniczną indukcję. RT-qPCR jednoznacznie odróżnia geny ograniczone do profagów i te niesprzężone z kontroli fagów od tych, które ulegają ekspresji podczas cyklu replikacji litycznej.

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania dla wirusologii i diagnostyki. Ta metoda umożliwia szybką i dokładną analizę dużej liczby próbek, wspierając badania nad fagami terapeutycznymi.

Ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania

Przeglądaj więcej filmów