Name: Ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Naucz się ekstrakcji kofeiny i oceny aktywności enzymatycznej syntazy kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L. Ta metoda pozwala badać biosyntezę kofeiny w modelach roślinnych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca naszego laboratorium została sfinansowana z grantu od Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) dla SMTHS. Badania te były również wspierane przez stypendium przyznane RJPK (nr 37938) przez CONACyT i Sistema Nacional de Investigadores (4422). Autorzy dziękują firmie CIATEJ za wykorzystanie jej instalacji podczas pisania tego manuskryptu. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Víctora Manuela Gonzáleza Mendozy za wszystkie zalecenia w sekcji biologii molekularnej oraz Valentína Mendozy Rodrígueza, IFC, UNAM za udogodnienia podczas kręcenia tego artykułu.

1. Ekstrakcja kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L.
<ol>
	<li>Użyj zawiesiny komórek C. arabica9. Utrzymać zawiesiny przez dwutygodniowe subkultury w pożywce Murashige i Skoog o pH 4,3 ze stałą prędkością 100 obr./min, wstrząsając w temperaturze 25 °C w ciągłym świetle (8,3 W/m2).</li>
	<li>Zebrać komórki pod filtracją próżniową za pomocą bibuły filtracyjnej o porach 11 μm i lejka Buchnera.</li>
	<li>Zarejestrować świeżą masę pobranych komórek za pomocą wagi, zawinąć je w folię aluminiową, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.</li>
	<li>Liofilizuj zamrożony materiał komórkowy przez 72 godziny.</li>
	<li>Zarejestruj masę liofilizowanych komórek w celu oszacowania uzysku suchej masy.</li>
	<li>Sproszkowany materiał przechowuj w workach polietylenowych wielokrotnego użytku (9 cm x 7,5 cm). Materiał należy zmacerować na drobny proszek i przechowywać w eksykatorze do czasu użycia.</li>
	<li>Odmierzyć 0,5 g suchej masy komórkowej na skali analitycznej i dodać do szklanej kolby (25 ml).
	<ol>
		<li>Dodaj 10 ml acetonu do liofilizowanych komórek i mieszaj w mieszalniku wirowym przez 30 sekund w celu homogenizacji. Następnie uszczelnić kolbę folią aluminiową.</li>
		<li>Mieszać z prędkością 100 obr./min za pomocą rotatora w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 5 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść cały materiał do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut. Przenieść fazę ciekłą do nowej probówki i zredukować do niej suchość w temperaturze pokojowej w dygestorium.</li>
	<li>Zawiesić próbkę w 25 μl acetonu.</li>
</ol>
2. Warunki oceny kofeiny metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)-densytometrii
<ol>
	<li>Nanieść 1 μl wcześniej zawieszonego ekstraktu kofeiny na fazę stacjonarną. 
	Uwaga: Jako fazę stacjonarną stosuje się płytki z żelem krzemionkowym (F254). Przed nałożeniem próbek, płytki wywołano z 10 ml chloroformu-metanolu [9:1 v/v] w komorze chromatograficznej (14 cm x 12 cm x 9,5 cm), a płytki wysuszono w temperaturze pokojowej. Charakterystyka płytki chromatograficznej, na którą nakładane są próbki, jest pokazana na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Komora była nasycana rozpuszczalnikiem przez 30 minut przed wywołaniem płytki. Płytki TLC należy obsługiwać w rękawiczkach, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Rozwinąć TLC w komorze chromatograficznej z 10 ml cykloheksanu-acetonu w fazie ruchomej [40:50 v/v]. 
	Uwaga: Ta mieszanina pozwala na oddzielenie kofeiny przy współczynniku retencji (Rf) wynoszącym 0,34.
	<ol>
		<li>Wyjmij płytkę TLC z komory i pozostaw do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja pasm kofeiny w świetle ultrafioletowym o krótkiej długości fali (UV, 254 nm). Użyj kompaktowej lampy UV. Dodatkowo na tym etapie użyj gogli z ochroną przed promieniowaniem UV.</li>
	<li>Określ ilościowo poziom kofeiny za pomocą densytometrii przy 273 nm. Przyrząd jest sterowany za pomocą oprogramowania chromatograficznego.</li>
</ol>
3. Izolacja kwasu rybonukleinowego (RNA)
<ol>
	<li>Pobrać zawiesiny komórek z kroku 1.1 i przefiltrować próżniowo za pomocą bibuły filtracyjnej (porów o wielkości 11 μm).</li>
	<li>Zebrać materiał komórkowy z bibuły filtracyjnej, odważyć 0,5 g materiału komórkowego na wadze analitycznej i zapakować w folię aluminiową. Zamrażać próbkę ciecząN2.</li>
	<li>Próbkę komórkową należy macerować w porcelanowym moździerzu z ciekłym azotem i dodawać 1 ml odczynnika do izolacji RNA aż do homogenizacji. 
	Uwaga: Sterylizować moździerze porcelanowe w piecu muflowym w temperaturze 300 °C przez 6 godzin. Odczynnik do izolacji RNA zawiera fenol, izotiocyjanian guanidyny i inne składniki.
	<ol>
		<li>Przenieść 500 μl próbki do sterylnej probówki mikrowirówkowej (1,5 ml). Dodać 300 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1) i 300 μl zrównoważonego fenolu (pH 8,0).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać próbkę z mieszalnikiem wirowym, a następnie odwirować ją przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 300 μl górnej fazy do probówki mikrowirówkowej. Dodać 200 μl izopropanolu. Inkubować probówkę przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zdekantować fazę ciekłą.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml etanolu (70%), aby utworzyć osad w probówce. Odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut i zdekantować. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć próbkę przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C). Zawiesić ekstrakt RNA w 25 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). 
	Uwaga: Do ekstrakcji RNA należy użyć wody uzdatnionej 0,1% DEPC v/v.</li>
</ol>
4. Inkubacja transkryptu RNA z deoksyrybonukleazą (DNazą)
<ol>
	<li>Do sterylnej probówki do mikrowirówki dodaj 2 μg całkowitego ekstraktu RNA. Dodać 1 μl 10x buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 1 mM CaCl2). Dodać 1 μl 1 U/μL DNazy.
	<ol>
		<li>Doprowadzić reakcję do końcowej objętości 10 μl za pomocą wody uzdatnionej DEPC. Wymieszać próbkę i krótko odwirować przy 2 000 x g przez 1 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Przerwać reakcję przez dodanie 1 μl 50 mM disodowego etylenodiaminotetraoctanu disodowego dwuwodnego (Na2EDTA) i inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przeanalizuj integralność RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
	<ol>
		<li>Przygotuj standardowy 1% żel agarozowy i zabarwij go 1 μl 3x interkalacyjnego roztworu barwienia kwasu nukleinowego.</li>
		<li>Nałóż 500 ng RNA na żel agarozowy i uruchom żel.</li>
		<li>Wizualizacja integralności RNA za pomocą systemu dokumentacji fotograficznej żelu.</li>
		<li>Użyj RNA jako matrycy do syntezy cDNA przez odwrotną transkryptazę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Komplementarna synteza kwasu dezoksyrybonukleinowego (cDNA)
<ol>
	<li>Dodać 2,5 μg całkowitego RNA do probówki mikrowirówkowej. Dodać 1 μl startera oligodeoksytyminy (dT) i napełnić probówkę do 13 μl końcowej objętości wodą wolną od nukleaz. Wymieszać próbkę, a następnie odwirować 2 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 4 μl 5x buforu reakcyjnego używanego do odwrotnej transkryptazy, 2 μl mieszaniny trifosforanów deoksynukleotydów (dNTP) (10 mM każdego dNTP) i 1 μL odwrotnej transkryptazy (200 U/μL). Delikatnie wymieszać i odwirować przy 2 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 45 °C przez 50 minut, a następnie w temperaturze 70 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru UV.</li>
	<li>Użyj cDNA jako matrycy dla reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). 
	Uwaga: Bufor reakcyjny został użyty odpowiednio jako 10x (krok 4.1.1) i 5x razy skoncentrowany (krok 5.3).</li>
</ol>
6. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) w celu amplifikacji genu CCS1
<ol>
	<li>Dodać 7,5 μl polimerazy DNA Taq 2x (0,1 U/ml) i 0,1 μM 5-karboksy-X-rodaminy (ROX) do probówki mikrowirówkowej PCR. 
	Uwaga: Gorący start Taq DNA polimeraza 2x została użyta jako roztwór 2x skoncentrowany.
	<ol>
		<li>Dodaj 5 μl wody bez nukleaz</li>.
		<li>Dodaj po 0,75 μl startera 10 μM do przodu i do tyłu, aby amplifikować gen CCS1 (AB086414) (do przodu: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' i odwrotnie: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Użyj starterów dla tubuliny jako genu utrzymania domu w oddzielnej reakcji (do przodu: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' i odwrotnie: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9.</li>
		<li>Dodaj 600 ng matrycy cDNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję amplifikacji w temperaturze 50 °C przez 2 minuty i w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Inkubować reakcję w systemie real-time PCR przez 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, w temperaturze 60 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 30 s.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 50 °C przez 30 s i w temperaturze 20 °C przez 10 s.</li>
	<li>Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania PCR.</li>
	<li>Oblicz wyrażenie względne metodą 2-ΔΔCT opisaną przez Livaka i Schmittgena (2001)12. 
	Uwaga: Przeanalizuj reakcję kontrolną, która zawiera wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA (brak kontroli matrycy, NTC), aby odrzucić zanieczyszczone odczynniki lub dimery starterów amplifikacji.</li>
</ol>
7. Całkowity ekstrakt białkowy z zawiesin komórkowych C. arabica L.
<ol>
	<li>Zawiesiny komórek filtracyjnych pod próżnią za pomocą bibuły filtracyjnej o średnich porach.</li>
	<li>Zważ 1 g materiału komórkowego i zapakuj go w folię aluminiową.
	<ol>
		<li>Zamrażać próbkę ciekłym azotem. Próbkę należy zmacerować w wysterylizowanym moździerzu porcelanowym, aby uzyskać drobny proszek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść próbkę do szklanej fiolki i dodać 2,5 ml buforu ekstrakcyjnego (400 mM chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) o pH 8,0, zawierającego 10 mM β-merkaptoetanolu, 5 mM Na2EDTA i 0,5% (w/v) askorbinianu sodu.
	<ol>
		<li>Mieszać próbkę w mieszalniku wirowym przez 2 minuty 
		Uwaga: Ważne jest, aby próbka była przechowywana na lodzie, aby zapobiec denaturacji białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przenieść 500 μl podwielokrotności do fiolek kriogenicznych (2 ml). Próbki należy przechowywać w temperaturze -72 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w próbce przy długości fali 562 nm w spektrofotometrze, stosując test kwasu bicinchoninowego z albuminą surowicy bydlęcej jako wzorcem.</li>
</ol>
8. Test enzymatyczny dla syntazy kofeiny
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną w probówce mikrowirówkowej zawierającej 200 μM SAM, 4,07 kBq metylu [3H]-SAM, 200 μM teobrominy, 200 μM MgCl2 i 5 μM kofeiny. Zwiększ objętość do 200 μl za pomocą 100 mM Tris-HCl przy pH 8,0.</li>
	<li>Trzymaj probówkę do mikrowirówki na lodzie i dodaj objętość frakcji rozpuszczalnej zawierającej 7-9 mg białka. Następnie wymieszać wirowo i inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C w łaźni termostatycznej/cyrkulatorze. W przypadku partii kilku próbek, każdą próbkę należy inkubować w dwóch egzemplarzach w okresach 1 minuty, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na zatrzymanie reakcji dla wszystkich próbek w dokładnym okresie 30 minut.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml chloroformu, aby zatrzymać reakcję, a następnie wstrząsnąć próbką za pomocą mieszalnika wirowego. Potrząsać próbką za pomocą mieszalnika wirowego przez 3 minuty w celu usunięcia radioaktywnej kofeiny z rozpuszczalnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 11 000 x g przez 5 minut i ostrożnie odzyskać objętość 900 μl. Następnie przenieść próbki do fiolek scyntylacyjnych.</li>
	<li>Odparować chloroform do całkowitego wyschnięcia w okapie w temperaturze pokojowej 25 °C. Dodać 5 ml płynu scyntylacyjnego do fiolki i wymieszać próbkę.</li>
	<li>Przeanalizuj radioaktywność zawartą w kofeinie w liczniku scyntylacyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Ferruzzi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+beverage+composition+on+delivery+of+phenolic+compounds+from+coffee+and+tea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolgy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea.</a> Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).</li>
<li>Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814607001422">Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts.</a> Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).</li>
<li>Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+of+caffeine+against+plant+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria.</a> Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).</li>
<li>Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+in+the+management+of+patients+with+headache%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Headache+and+Pain%22%5BJournal%5D)">Caffeine in the management of patients with headache.</a> Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+caffeine+and+coffee+on+our+health%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impact of caffeine and coffee on our health.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).</li>
<li>Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+production+in+tobacco+plants+by+simultaneous+expression+of+three+coffee+N-methyltrasferases+and+its+potential+as+a+pest+repellant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant.</a> Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+genome+provides+insight+into+the+convergent+evolution+of+caffeine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis.</a> Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).</li>
<li>Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945296045888">Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture.</a> Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).</li>
<li>Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+aluminum+stress+and+caffeine+biosynthesis+in+suspension+cells+of+Coffea+arabica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).</li>
<li>Huang, R., O'Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+caffeine+in+plants+by+co-option+of+exapted+ancestral+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).</li>
<li>Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+new+dual-functional+caffeine+synthase+gene+encoding+an+enzyme+for+the+conversion+of+7-methylxanthine+to+caffeine+from+coffee+%28Coffea+arabica+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.).</a> FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).</li>
<li>Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+caffeine+synthase+from+tea+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves.</a> Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Method. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022998000817">The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).</li>
<li>Sartor, R. M., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-89132000000100009">Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei.</a> Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).</li>
<li>Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945206000963">Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits.</a> Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).</li>
<li>Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+characterization+of+caffeine+synthase+and+purine+alkaloid+concentration+in+guarana+fruit%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit.</a> Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).</li>
<li>Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+caffeine+metabolism+in+Coffea+arabica+%28Arabica%29+and+Coffea+canephora+%28Robusta%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta).</a> Planta. 241 (1), 179-191 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono tutaj optymalne warunki do oceny zawartości kofeiny, aktywności CS i poziomów transkryptów w kulturze tkanek roślinnych in vitro, takich jak zawiesiny komórkowe C. arabica. Wcześniejsze doniesienia potwierdziły, że utrzymywanie komórek w warunkach lekkiego napromieniania i w obecności teobrominy w pożywce hodowlanej jest odpowiednim parametrem do zwiększenia poziomu kofeiny, co umożliwia ocenę metod rozdzielania kofeiny za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami...

Kofeina jest metabolitem wtórnym, który jest biosyntetyzowany przez rośliny z rodzaju Coffea1. Alkaloid ten należy do rodziny metyloksantyny i jest uważany za chemiczną obronę roślin, ponieważ może działać przeciwko niekorzystnym skutkom patogenów i roślinożerców2,3. Ponadto metabolit ten jest odpowiedzialny za stymulujące właściwości napoju kawowego, który jest powszechnie spożywany na całym świecie4,5. Ze względu na jego właściwości kilka grup badawczych jest zainteresowanych badaniem szlaku biosyntezy i katabolizmu kofeiny6,7. Obecnie roślinne hodowle komórek/tkanek in vitro służą jako alternatywa do oceny akumulacji kofeiny w ramach różnych strategii biotycznych i abiotycznych8,9.
Biosynteza kofeiny polega na hydrolitycznym uwalnianiu 7-metyloksantyny z odpowiedniego nukleozydu rybozy, po którym następują uporządkowane N-metylacje w pozycjach 3 i 1. Specyficzna N-metylotransferaza zależna od S-adenozylometioniny (SAM) katalizuje metylację w pozycji 7, podczas gdy syntaza teobrominy (TS) i CS są zaangażowane odpowiednio w metylacji 3 i 1, wytwarzając teobrominę i kofeinę. Badanie genów kodujących różne NMT pozwoliło zrozumieć mechanizm regulujący produkcję kofeiny10,11. CS, który ma aktywność N-metylotransferazy, katalizuje ostatnie dwa etapy szlaku biosyntezy kofeiny11. W siewkach kawowca wykazano, że promieniowanie świetlne może zwiększać aktywność CS, co skutkuje wzrostem biosyntezy kofeiny. Ostatnio wykazaliśmy, że utrzymanie zawiesin komórkowych C. arabica L. pod wpływem promieniowania świetlnego jest optymalnym warunkiem do oceny efektów, które wytwarzają abiotyczne czynniki stresowe wpływające na szlak biosyntezy kofeiny8. Informacje uzyskane w tych badaniach mogą mieć zastosowanie w inżynierii metabolicznej i biologii systemowej w celu maksymalizacji badania szlaku biosyntezy kofeiny w takich systemach in vitro.
Biorąc pod uwagę korzyści płynące z uzyskania odpowiedniego modelu do badania biosyntezy kofeiny, zoptymalizowaliśmy warunki ekstrakcji kofeiny na zawiesinach komórkowych C. arabica L. Udało się również opracować użyteczny protokół do badania aktywności enzymatycznej, a także kroki metodologiczne do oceny poziomu transkryptów genów syntazy kofeiny Coffea 1 (CCS1) kodujących ten enzym. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół ekstrakcji i ilościowego oznaczania kofeiny w zawiesinach komórek C. arabica za pomocą chromatografii cienkowarstwowej i densytometrii (densytometria TLC).

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog Mieszanina soli bazowej</td><td>Laboratoria fitotechnologiczne</td><td>M524</td><td>Wielkość opakowania: 50 L Odczynnik (mg/L) Azotan amonu (1650) Kwas borowy (6.2) Chlorek wapnia, bezwodny (322,2) Chlorek kobaltu i byk; H2O (0,025) Siarczan miedzi i byk; 5H2O (0,025) Na2EDTA&bull; 2H2O (37.26) Siarczan żelazawy&bull; 7H2O (27,8) Siarczan magnezu, bezwodny (180,7) Siarczan manganu&bull; H2O (16,9) Kwas molibdenowy (sól sodowa) i byk; 2H2O (0,25) Jodek potasu (0,83) Azotan potasu (1900) Fosforan potasu, jednozasadowy (170) Siarczan i byk; 7H2O (8,6) Uzupełniony mio-inozytolem (100) tiaminą (10) cysteiną (25) sacharozą (30000) kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (3) puryna 6-benzyloaminowa (1)</td></tr><tr><td>Kofeina</td><td>SIGMA</td><td>C0750-5G</td><td>STANDARD-5g</td></tr><tr><td>Teobromina</td><td>SIGMA</td><td>T4500</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Skaner TLC CAMAG-4</td><td>Oprogramowanie CAMAG</td><td>27.62</td><td></td></tr><tr><td>WinCATS Planar Chromatography Manager Oprogramowanie</td><td>CAMAG</td><td>1.4.10</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izoamylowy (24:1)</td><td>SIGMA</td><td>C-0549</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Cykloheksan</td><td>JALMEX</td><td>C4375-13</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>J.T. BAKER</td><td></td> 900643 <td>4 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. BAKER</td><td>9093-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>JALMEX</td><td>C-4425-15</td><td>3,5 l</td></tr><tr><td>żel krzemionkowy TLC 60 F254</td><td>Merck</td><td>1.05554.0001</td><td>Płytka TLC</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>M6250</td><td>SIGMA</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>(+)-sodu L-askorbinian</td><td>A4034</td><td>SIGMA</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>SIGMA</td><td>T6066</td><td>1 Kg</td></tr><tr><td>Kwas solny 36,5-38%</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td>2,5 l</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td> Zestaw <td>do 232227</td><td>Thermo scientific</td><td>Methyl</td></tr><tr><td>[3H]-S-adenozylometionina</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155</td><td>Specyficzna aktywność 15 Ci/mmol</td></tr><tr><td>Fiolki do płynnego scyntylacji</td><td>SIGMA</td><td>Z253081</td><td></td></tr><tr><td>Termostatyczna kąpiel/cyrkulator</td><td>Cole Parmer</td><td>60714</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka</td> <td>wirówkowaEppendorf</td><td></td><td>Probówka z</td></tr><tr><td>fiolkami kriogenicznymi</td> 1,5 ml <td>Heathrow Scientific</td><td>HS23202A</td><td>Wirówka 2 ml</td></tr><tr><td>5804</td><td>Eppendorf</td><td>5804 000925</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vortex Thermolyne</td><td>LR 5947</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz porcelanowy</td><td>Fisherbrand</td><td>FB961B</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>Z274844</td><td>Porowatość</td></tr><tr><td>Picofuge</td><td>Stratagene</td><td>400550</td><td>2000 x g</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>AND</td><td>HR-120</td><td>Model HR-120</td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny</td><td>Beckman Coulter</td><td>6500</td><td></td></tr><tr><td>Żelowy system dokumentacji fotograficznej</td><td>Bio-Rad</td><td>Chemic XRS</td><td>Model Chemic XRS</td></tr><tr><td>Kompaktowa lampa UV</td><td>UVP</td><td>95002112</td><td>UVGL-25</td></tr><tr><td>Scienceware HDPE Lejek Buchnera</td><td>Mieszalnik SIGMA</td><td>2419907</td><td>Typ 37600</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Thermo scientific</td><td>15596-018</td><td>200 mL</td></tr><tr><td>ReverdAid Odwrotna transkryptaza</td><td>Thermo scientific</td><td>#EP0441</td><td>10000 U</td></tr><tr><td>Oligo (dT)18 podkład</td><td>Thermo scientific</td><td>#S0131</td><td>100 &micro; M</td></tr><tr><td>DNaza I, bez RNaz</td><td>Thermo scientific</td><td>#EN0525</td><td>1000 U</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1,25 mL</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0525</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermo scientific</td><td>R0191</td><td>R0191</td></tr><tr><td>SYBR Green qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo scientific</td><td>K0251</td><td>Na 200 reakcji 25 &mikro; L</td></tr><tr><td>PikoReal</td><td>Thermo scientific</td><td>2.2</td><td>Oprogramowanie</td></tr><tr><td>Fenol, pH 8,0, zrównoważony, klasa biologii molekularnej, ultraczysty</td><td>USB</td><td>J75829</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>alkoholu izopropylowego</td><td>Karal</td><td>2040</td><td>1 l</td></tr><tr><td>alkoholu etylowego</td><td>SIGMA</td><td>64175</td><td>1 l</td></tr><tr><td>pirowęglan dietylu</td><td>SIGMA</td><td>D5758</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Rotator laboratoryjny</td><td>LW Mod</td><td>. Naukowy Zobacz materiał LW210</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kofeina (1,3,7-trimetyloksantyna) to alkaloid purynowy obecny w popularnych napojach, takich jak kawa i herbata. Ten wtórny metabolit jest uważany za obronę chemiczną, ponieważ ma działanie przeciwdrobnoustrojowe i jest uważany za naturalny środek owadobójczy. Kofeina może również wywoływać negatywne efekty allelopatyczne, które uniemożliwiają wzrost otaczających roślin. Ponadto ludzie na całym świecie spożywają kofeinę ze względu na jej działanie przeciwbólowe i pobudzające. W związku z zainteresowaniem technologicznymi zastosowaniami kofeiny rozwinęły się badania nad szlakiem biosyntezy tego związku. Badania te koncentrowały się przede wszystkim na zrozumieniu mechanizmów biochemicznych i molekularnych, które regulują biosyntezę kofeiny. Hodowla tkankowa in vitro stała się użytecznym systemem do badania tego szlaku biosyntezy. W tym artykule opisano krok po kroku protokół oznaczania ilościowego kofeiny i pomiaru poziomów transkryptu genu (CCS1) kodującego syntazę kofeiny (CS) w zawiesinach komórkowych C. arabica L., a także jego aktywności.

Ekstrakty kofeiny uzyskane za pomocą przedstawionego tutaj procesu przeanalizowano metodą densytometrii TLC, poddając próbki chromatografii płytkowej zgodnie ze schematem pokazanym na Rysunku 1. Aby określić poziom kofeiny w ekstraktach komórkowych, wykorzystano krzywą z różnymi stężeniami komercyjnego standardu tego związku (Rysunek 2A). Profil absorbancji kofeiny przeanalizowano w widmie światła widzialnego (UV-VIS), wykorzystu...

Ten protokół opisuje efektywną metodologię ekstrakcji i kwantyfikacji kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L. oraz eksperymentalny proces oceny aktywności enzymatycznej syntazy kofeiny z poziomem ekspresji genu kodującego ten enzym.

Ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chemii analitycznej, biochemii i biotechnologii. Na przykład, jakie są zmiany, które zachodzą w biosyntezie kofeiny. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do modeli roślinnych in vitro, które wytwarzają kofeinę.Na początek dodaj 10 mililitrów acetonu do liofilizowanych komórek i zamknij kolbę przed zmieszaniem z mieszalnikiem wirowym przez 30 sekund. Następnie mieszać próbkę z prędkością 100 obr./min z rotatorem przez pięć godzin w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić próbkę za pomocą 25 mikrolitrów acetonu.Najpierw nałóż jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego ekstraktu kofeinowego na płytki żelu krzemionkowego. Następnie rozwinąć TLC w komorze chromatograficznej z 10 mililitrami fazy ruchomej, acetonu cykloheksanu. Wizualizuj pasma kofeiny w ultrafiolecie o krótkiej długości fal za pomocą kompaktowej lampy UV.Następnie określ ilościowo poziom kofeiny za pomocą densytometrii na 273 nanometrach. Za pomocą bibuły filtracyjnej przefiltruj próżniowo wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek. Następnie za pomocą zaprawy porcelanowej należy zmacerować próbkę komórki ciekłym azotem i od

caffeine-extraction-enzymatic-activity-gene-expression-caffeine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Ten artykuł przedstawia metodę wykrywania i kwantyfikacji kwasów organicznych z materiału roślinnego za pomocą swobodnej strefowej elektroforezy kapilarnej. Podano przykład potencjalnego zastosowania tej metody, określającej wpływ wtórnej fermentacji na poziom kwasów organicznych w nasionach kawy.

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Ta praca przedstawia protokół tworzenia kultury zawiesiny komórkowej pochodzącej z liści herbaty (Camellia sinensis L.), która może być wykorzystana do badania metabolizmu zewnętrznych związków, które mogą być pobierane przez całą roślinę, takich jak insektycydy.

Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Naucz się ekstrakcji kofeiny i oceny aktywności enzymatycznej syntazy kofeiny w zawiesinach komórkowych C. arabica L. Ta metoda pozwala badać biosyntezę kofeiny w modelach roślinnych in vitro.

Ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych

Przeglądaj więcej filmów