Ekstrakcja kofeiny, aktywność enzymatyczna i ekspresja genów syntazy kofeiny z zawiesin komórek roślinnych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chemii analitycznej, biochemii i biotechnologii. Na przykład, jakie są zmiany, które zachodzą w biosyntezie kofeiny. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do modeli roślinnych in vitro, które wytwarzają kofeinę.

Na początek dodaj 10 mililitrów acetonu do liofilizowanych komórek i zamknij kolbę przed zmieszaniem z mieszalnikiem wirowym przez 30 sekund. Następnie mieszać próbkę z prędkością 100 obr./min z rotatorem przez pięć godzin w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić próbkę za pomocą 25 mikrolitrów acetonu.

Najpierw nałóż jeden mikrolitr wcześniej przygotowanego ekstraktu kofeinowego na płytki żelu krzemionkowego. Następnie rozwinąć TLC w komorze chromatograficznej z 10 mililitrami fazy ruchomej, acetonu cykloheksanu. Wizualizuj pasma kofeiny w ultrafiolecie o krótkiej długości fal za pomocą kompaktowej lampy UV.

Następnie określ ilościowo poziom kofeiny za pomocą densytometrii na 273 nanometrach. Za pomocą bibuły filtracyjnej przefiltruj próżniowo wcześniej przygotowaną zawiesinę komórek. Następnie za pomocą zaprawy porcelanowej należy zmacerować próbkę komórki ciekłym azotem i odczynnikiem izolacyjnym RNA, aż do jej homogenizacji.

Następnie przenieś 500 mikrolitrów próbki do sterylnej probówki z mikrowirówką. Następnie dodaj 300 mikrolitrów chloroformowego alkoholu izoamylowego i 300 mikrolitrów zrównoważonego fenolu. Wymieszaj próbkę z mieszalnikiem wirowym i odwiruj ją w temperaturze 20 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieś 300 mikrolitrów górnej fazy do czystej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów izopropanolu i inkubuj probówkę przez godzinę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr etanolu do granulki.

Następnie odwirować probówkę o sile 12 000 G przez 10 minut i zdekantować fazę ciekłą. Następnie suszyć próbkę przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić ekstrakt RNA w 25 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC.

Najpierw dodaj dwa mikrogramy całkowitego ekstraktu RNA do sterylnej probówki z mikrowirówką. Następnie dodać jeden mikrolitr 10-krotnego buforu reakcyjnego i jeden mikrolitr DNazy. Doprowadzić końcową objętość reakcji do 10 mikrolitrów wodą uzdatnioną DEPC.

Następnie wymieszać próbkę i odwirować w temperaturze 2 000 G przez jedną minutę. Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj jeden mikrolitr 50-mikromolowego tetraoctanu disodu disodowego, aby zatrzymać reakcję.

Inkubować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie nałóż 100 nanogramów RNA na żel agarozowy i uruchom żel. Wizualizacja integralności RNA za pomocą systemu dokumentacji fotograficznej żelu.

Najpierw dodaj 2,5 mikrograma całkowitego RNA do mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj jeden mikrolitr startera oligo deoksytymidyny i napełnij probówkę do końcowej objętości 13 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz. Wymieszać próbkę i odwirować ją pod ciśnieniem 2 000 G przez jedną minutę.

Inkubować próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. A potem w czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Następnie dodaj do próbki cztery mikrolitry buforu reakcyjnego 5X, dwa mikrolitry mieszanki dNTP i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy do próbki.

Następnie delikatnie wymieszaj próbkę i odwiruj w temperaturze 2 000 G przez jedną minutę. Następnie inkubować próbkę w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 50 minut, a następnie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Dodaj 7,5 mikrolitra polimerazy DNA 2X Taq i 0,1 mikromola RAX do probówki wirówki mikro PCR.

Następnie dodaj po 0,75 mikrolitra startera do przodu i do tyłu, aby wzmocnić gen CCS1. Następnie dodaj 600 nanogramów matrycy CDNA. Przeprowadzić reakcję amplifikacji w czasie rzeczywistym PCR, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania PCR. Odważ jeden gram materiału komórkowego i zapakuj go w folię aluminiową. Po maceracji próbki przenieść ją do szklanej fiolki i dodać 2,5 mililitra buforu ekstrakcyjnego.

Następnie odwirować próbkę w temperaturze 20 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 500 mikrolitrów podwielokrotności do fiolek kriogenicznych. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć stężenie białka w próbce przy 562 nanometrach przy użyciu testu kwasu bicinchoninowego, z albuminą surowiczą bydlęcą jako wzorcem.

Najpierw przygotuj mieszaninę reakcyjną w mikroprobówce wirówkowej, zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie zwiększ całkowitą objętość do 200 mikrolitrów za pomocą 100 milimolowych tris HCL. Pamiętaj, że dla własnego bezpieczeństwa konieczne jest przestrzeganie odpowiednich środków ostrożności podczas przygotowywania mieszaniny reakcyjnej z materiałem radioaktywnym.

Trzymaj probówkę z mikrowirówką na lodzie i dodaj objętość frakcji rozpuszczalnej, zawierającej od siedmiu do dziewięciu miligramów białka. Następnie zwiruj mieszaninę i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować próbki w temperaturze 11 000 G przez pięć minut.

Następnie ostrożnie odzyskaj objętość 900 mikrolitrów i przenieś próbki do fiolki scyntylacyjnej. Następnie odparuj chloroform do całkowitego wyschnięcia w okapie w temperaturze pokojowej. Dodać pięć mililitrów płynu scyntylacyjnego do fiolki.

Na koniec przeanalizuj radioaktywność zawartą w kofeinie za pomocą licznika scyntylacyjnego. W tym protokole wzorzec absorbancji kofeiny analizowano za pomocą densytometrii TLC, poprzez widmo światła widzialnego i odczyt maksymalnej absorpcji przy 273 nanometrach. Krzywa separacji kofeiny na płytce TLC wykazała RF między 0,34 a 0,39.

RNA pochodzące z zawieszonych komórek wykazuje wyraźne rozdzielenie podjednostek RRNA 28s, 18s i 5s, co wskazuje, że próbki były wysokiej jakości. Na koniec uzyskano krzywą topnienia z analizy QPCR, pokazując pojedynczy produkt amplifikacji genu syntazy kofeiny. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biotechnologii i biochemii do zbadania wtórnego metabolizmu kultur tkankowych z kawy, herbaty i kokosa.

Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością i patologią molekularną może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie rękawic, okularów i specjalnego sprzętu do materiałów radioaktywnych.