Name: Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Poznaj metodę kowalencyjnej immobilizacji białek na powierzchniach tlenku krzemu przy użyciu heterobifunkcyjnego czynnika sprzegającego silanowego do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TB i HG dziękują za wsparcie finansowe Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych "Cellufuel, Advanced Grant No. 294438". HCS przyjmuje do wiadomości wsparcie finansowe ze strony Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych za pośrednictwem Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt), SS potwierdza wsparcie finansowe ze strony Bawarskiego Ministerstwa Nauki i Edukacji w ramach programu badawczego "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - CANTER". Dziękujemy Conny Hasselberg-Christoph i Martinie Hörig za wsparcie techniczne

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force+Spectroscopy%3A+Optical+Tweezers%2C+Magnetic+Tweezers+and+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force Spectroscopy: Optical Tweezers, Magnetic Tweezers and Atomic Force Microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy%2C+a+Powerful+Tool+in+Microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy, a Powerful Tool in Microbiology.</a> Journal of Bacteriology. 184 (19), 5205-5213 (2002).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+as+a+Multifunctional+Molecular+Toolbox+in+Nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy as a Multifunctional Molecular Toolbox in Nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Localization+of+Single+Molecular+Recognition+Events+Using+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and Localization of Single Molecular Recognition Events Using Atomic Force Microscopy.</a> Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).</li>
<li>Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticky+Microbes%3A+Forces+in+Microbial+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sticky Microbes: Forces in Microbial Cell Adhesion.</a> Trends in Microbiology. 23 (6), 376-382 (2015).</li>
<li>Yakovenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FimH+Forms+Catch+Bonds+That+Are+Enhanced+by+Mechanical+Force+Due+to+Allosteric+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FimH Forms Catch Bonds That Are Enhanced by Mechanical Force Due to Allosteric Regulation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (17), 11596-11605 (2008).</li>
<li>Casillas-Ituarte, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+Acid+Polymorphisms+in+the+Fibronectin-Binding+Repeats+of+Fibronectin-Binding+Protein+A+Affect+Bond+Strength+and+Fibronectin+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino Acid Polymorphisms in the Fibronectin-Binding Repeats of Fibronectin-Binding Protein A Affect Bond Strength and Fibronectin Conformation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (21), 8797-8810 (2017).</li>
<li>Hilleringmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Architecture+of+Streptococcus+Pneumoniae+TIGR4+Pili%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular Architecture of Streptococcus Pneumoniae TIGR4 Pili.</a> The EMBO Journal. 28 (24), 3921-3930 (2009).</li>
<li>Izore, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+Host+Cell+Recognition+by+the+Pilus+Adhesin+from+Streptococcus+Pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of Host Cell Recognition by the Pilus Adhesin from Streptococcus Pneumoniae.</a> Structure. 18 (1), 106-115 (2010).</li>
<li>Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pneumococcus%3A+Epidemiology%2C+Microbiology%2C+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), a010215(2013).</li>
<li>Henderson, B., Nair, S., Pallas, J., Williams, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+a+Multidomain+Host+Adhesin+Targeted+by+Bacterial+Fibronectin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: a Multidomain Host Adhesin Targeted by Bacterial Fibronectin-Binding Proteins.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (1), 147-200 (2011).</li>
<li>Becke, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+Two-Domain+Binding+Mode+of+Pilus-1+Tip+Protein+RrgA+of+Streptococcus+Pneumoniae+to+Fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Force Spectroscopy Reveals Two-Domain Binding Mode of Pilus-1 Tip Protein RrgA of Streptococcus Pneumoniae to Fibronectin.</a> ACS nano. 12 (1), 549-558 (2018).</li>
<li>Herman-Bausier, P., Pietrocola, G., Foster, T. J., Speziale, P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Activates+the+Capture+of+Human+Plasminogen+by+Staphylococcal+Fibronectin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Activates the Capture of Human Plasminogen by Staphylococcal Fibronectin-Binding Proteins.</a> mBio. 8 (5), e01067(2017).</li>
<li>Vitry, P., Valotteau, C., Feuillie, C., Bernard, S., Alsteens, D., Geoghegan, J. A., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-Induced+Strengthening+of+the+Interaction+between+Staphylococcus+aureus+Clumping+Factor+B+and+Loricrin%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Force-Induced Strengthening of the Interaction between Staphylococcus aureus Clumping Factor B and Loricrin.</a> mBio. 8 (6), e01748(2017).</li>
<li>Milles, L. F., Schulten, K., Gaub, H. E., Bernardi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanism+of+Extreme+Mechanostability+in+a+Pathogen+Adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanism of Extreme Mechanostability in a Pathogen Adhesin.</a> Science. 359 (6383), 1527-1533 (2018).</li>
<li>Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Receptor-Ligand+Systems+of+the+Cellulosome+with+AFM-Based+Single-Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Receptor-Ligand Systems of the Cellulosome with AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50950(2013).</li>
<li>Stetter, F. W., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Single+Molecule+Adhesion+by+Atomic+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e52456(2015).</li>
<li>Schmidt, S. W., Christ, T., Glockner, C., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Coupling+Chemistry+Linking+Carboxyl-Containing+Organic+Molecules+to+Silicon+Oxide+Surfaces+under+Acidic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Simple Coupling Chemistry Linking Carboxyl-Containing Organic Molecules to Silicon Oxide Surfaces under Acidic Conditions.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 26 (19), 15333-15338 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-Based%2C+Site-Specific+and+Covalent+Immobilization+of+Biomolecules+for+Single-Molecule+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thiol-Based, Site-Specific and Covalent Immobilization of Biomolecules for Single-Molecule Experiments.</a> Nature Protocols. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Ott, W., Jobst, M. A., Schoeler, C., Gaub, H. E., Nash, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force+Spectroscopy+on+Polyproteins+and+Receptor-Ligand+Complexes%3A+The+Current+Toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force Spectroscopy on Polyproteins and Receptor-Ligand Complexes: The Current Toolbox.</a> Journal of Structural Biology. 197 (1), 3-12 (2017).</li>
<li>Ott, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-like+Polypeptide+Linkers+for+Single-Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy.</a> ACS nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).</li>
<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New%2C+Simple+Method+for+Linking+of+Antibodies+to+Atomic+Force+Microscopy+Tips%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New, Simple Method for Linking of Antibodies to Atomic Force Microscopy Tips.</a> Bioconjugate Chemistry. 18 (4), 1176-1184 (2007).</li>
<li>Kufer, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+Immobilization+of+Recombinant+Fusion+Proteins+with+hAGT+for+Single+Molecule+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Covalent Immobilization of Recombinant Fusion Proteins with hAGT for Single Molecule Force Spectroscopy.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 35 (1), 72-78 (2005).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schilcher, K., Schindler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Localization+of+Individual+Antibody-Antigen+Recognition+Events+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection and Localization of Individual Antibody-Antigen Recognition Events by Atomic Force Microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (8), 3477-3481 (1996).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Schilcher, K., Gruber, H. J., Schindler, H. Conjugation of Biomolecules to Tip and Probe Surfaces for Molecular Recognition in Atomic Force Microscopy. European Journal of Cell Biology. 74, 72(1997).</li>
<li>Riener, C. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267003011061">Heterobifunctional Crosslinkers for Tethering Single Ligand Molecules to Scanning Probes.</a> Analytica Chimica Acta. 497 (1-2), 101-114 (2003).</li>
<li>Metwalli, E., Haines, D., Becker, O., Conzone, S., Pantano, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Mono-%2C+Di-%2C+and+Tri-Aminosilane+Treated+Glass+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Mono-, Di-, and Tri-Aminosilane Treated Glass Substrates.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 298 (2), 825-831 (2006).</li>
<li>Beyer, D., Knoll, W., Ringsdorf, H., Elender, G., Sackmann, E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040609095084568">Covalently Attached Polymer Mono- and Multilayers on Silanized Glass Substrates.</a> Thin Solid Films. 284, 825-828 (1996).</li>
<li>Hermanson, G. T. Chapter 13 - Silane Coupling Agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. 3, Academic Press. 535-548 (2013).</li>
<li>Howarter, J. A., Youngblood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Silica+Silanization+by+3-aminopropyltriethoxysilane%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Optimization of Silica Silanization by 3-aminopropyltriethoxysilane.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (26), 11142-11147 (2006).</li>
<li>Hermanson, G. T. Chapter 6 - Heterobifunctional Crosslinkers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+GT+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. 3, Academic Press. 299-339 (2013).</li>
<li>Sehgal, D., Vijay, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+High+Efficiency+of+Water-Soluble+Carbodiimide-Mediated+Amidation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A Method for the High Efficiency of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Amidation.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 87-91 (1994).</li>
<li>Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Thiol-Gold+Interactions+Towards+the+Efficient+Strength+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantifying Thiol-Gold Interactions Towards the Efficient Strength Control.</a> Nature Communications. 5, 4348(2014).</li>
<li>Butt, H. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0957-4484/6/1/001/meta">Calculation of Thermal Noise in Atomic Force Microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1367-2630/1/1/006/meta">Single Molecule Force Spectroscopy by AFM Indicates Helical Structure of Poly(ethylene-glycol) in Water.</a> New Journal of Physics. 1 (1), 6(1999).</li>
<li>Gugutkov, D., Gonzalez-Garcia, C., Rodriguez Hernandez, J. C., Altankov, G., Salmeron-Sanchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Activity+of+the+Substrate-Induced+Fibronectin+Network%3A+Insight+Into+the+Third+Dimension+Through+Electrospun+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+Journal+of+Surfaces+and+Colloids%22%5BJournal%5D)">Biological Activity of the Substrate-Induced Fibronectin Network: Insight Into the Third Dimension Through Electrospun Fibers.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 25 (18), 10893-10900 (2009).</li>
<li>Rief, M., Oesterhelt, F., Heymann, B., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Force+Spectroscopy+on+Polysaccharides+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Force Spectroscopy on Polysaccharides by Atomic Force Microscopy.</a> Science. 275 (5304), 1295-1297 (1997).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Marszalek, P. E., Oberhauser, A. F., Pang, Y. P., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+Elasticity+Governed+by+Chair-Boat+Transitions+of+the+Glucopyranose+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide Elasticity Governed by Chair-Boat Transitions of the Glucopyranose Ring.</a> Nature. 396 (6712), 661-664 (1998).</li>
<li>Clausen-Schaumann, H., Rief, M., Tolksdorf, C., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Stability+of+Single+DNA+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical Stability of Single DNA Molecules.</a> Biophysical Journal. 78 (4), 1997-2007 (2000).</li>
<li>Schmidt, S. W., Filippov, P., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Force-Clamp+Experiments+Reveal+Kinetics+of+Mechanically+Activated+Silyl+Ester+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Force-Clamp Experiments Reveal Kinetics of Mechanically Activated Silyl Ester Hydrolysis.</a> ACS nano. 6 (2), 1314-1321 (2012).</li>
<li>Schmidt, S. W., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Strength+of+the+Silicon-Carbon+Bond+Observed+Over+Three+Decades+of+Force-Loading+Rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dynamic Strength of the Silicon-Carbon Bond Observed Over Three Decades of Force-Loading Rates.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (11), 3664-3668 (2008).</li>
<li>Schmidt, S. W., Kersch, A., Beyer, M. K., Clausen-Schaumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+Activated+Rupture+of+Single+Covalent+Bonds%3A+Evidence+of+Force+Induced+Bond+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanically Activated Rupture of Single Covalent Bonds: Evidence of Force Induced Bond Hydrolysis.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (13), 5994-5999 (2011).</li>
<li>Schmidt, S. W., Pill, M. F., Kersch, A., Clausen-Schaumann, H., Beyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+Induced+Silyl+Ester+Cleavage+Under+Acidic+Conditions+Investigated+by+AFM-Based+Single-Molecule+Force+Spectroscopy+in+the+Force-Ramp+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Mechanically Induced Silyl Ester Cleavage Under Acidic Conditions Investigated by AFM-Based Single-Molecule Force Spectroscopy in the Force-Ramp Mode.</a> Faraday Discussions. 170, 357-367 (2014).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+Forces+of+Titin+and+Fibronectin+Domains+Directly+Measured+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Unfolding Forces of Titin and Fibronectin Domains Directly Measured by AFM.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 481, 129-136 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od czasu wprowadzenia SMFS opartego na AFM, przekształcił się on w szeroko stosowaną technikę bezpośredniego badania sił wewnątrz- i międzycząsteczkowych poszczególnych białek, kwasów nukleinowych i innych biomolekuł 3,4,5. Aby eksperymenty z SMFS zakończyły się sukcesem, warunkiem wstępnym jest odpowiednia strategia sprzężenia powierzchniowego. Aby zbadać siły wewnątrzcząsteczkowe w polimerach naturalnych i syntetycznych, polimery mogą być bezpośrednio sprzężone z powierzchnią podłoża i końcówką AFM 36,38,39,40,41. Do badania oddziaływań międzycząsteczkowych, takich jak wiązania molekularne, zaleca się jednak stosowanie elastycznych cząsteczek łączących, takich jak hetero-bifunkcyjne łączniki PEG lub łańcuchy polipeptydowe, w celu przyłączenia partnerów interakcji do końcówki AFM i powierzchni substratu, aby umożliwić prawidłową orientację partnerów wiążących, przezwyciężyć siły powierzchniowe krótkiego zasięgu oraz uniknąć denaturacji i rozwijania się białek21, 22,23,24,25,26,27,42. Dlatego opisaliśmy prosty i nieskomplikowany protokół kowalencyjnej immobilizacji białek poprzez ich dostępne aminy pierwszorzędowe przy użyciu hetero-bifunkcyjnych przekładek PEG.
Wykazaliśmy jego przydatność, badając siły interakcji między adhezyną RrgA z S. pneumoniae a białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej Fn, jak niedawno szczegółowo opisano w innym miejscu13.
Chemia powierzchni jest dobrze znana i analizowana, a podobne podejścia zostały z powodzeniem zastosowane w wielu eksperymentach SMFS 19,42,43,44,45. Eter sililowy używany do sprzęgania polimeru silanowego z powierzchnią ulega hydrolizie. Stopień hydrolizy zależy od ilości powstających wiązań siloksanowych, które można kontrolować podczas procesu silanizacji. Jeżeli podczas pomiarów SMFS spodziewane są duże siły oddziaływania (≥ 1000 pN), silanizację należy przeprowadzić poprzez osadzanie w fazie gazowej30, co skutkuje powstaniem ciągłej warstwy siloksanów. Podobnie jak w przypadku wielu eksperymentów (np. wielu oddziaływań białko – białko), siły oddziaływania mieszczą się w zakresie kilkuset pN, a opisana procedura, w której tworzenie siloksanów odbywa się poprzez osadzanie z fazy wodnej, a niezwiązane silany organiczne są starannie zmywane etanolem (krok 1.1.7), a następnie utwardzane ciepłem (krok 1.1.8), jest wystarczający.
Kolejnym krytycznym krokiem jest wypłukanie pozostałych cząsteczek EDC i NHS z powierzchni (krok 1.2.3), ponieważ resztki doprowadzą do aktywacji grup karboksylowych na białkach. Może to spowodować sieciowanie białek na tej samej powierzchni, co może zmienić ich funkcjonalność lub kowalencyjnie sprzęgnąć aktywowane białka z innymi białkami na przeciwnej powierzchni. Może to prowadzić do zaciśnięcia białek między powierzchnią a końcówką AFM, co skutkuje dużymi siłami zrywania, którym może towarzyszyć rozwijanie domen (patrz Rysunek 3b, ślad 1, 4 i 5, rozwijanie domen Fn)46. Ten sam problem może wystąpić, jeśli aktywne estry NHS przekładki PEG pozostaną nienasycone. Dlatego zaleca się inkubację z buforowaną solą fizjologiczną Tris (krok 1.2.6), ponieważ pierwszorzędowa amina Tris wygasza pozostałe grupy aminoworeaktywne.
Postępowanie zgodnie z protokołem krok po kroku prowadzi do jednorodnego rozkładu Fn na powierzchni szkła silanizowanego (patrz rysunek 2), pozostawiając dimeryczną formę białka. Przypomina to strukturę Fn w roztworze i jest zgodne z wcześniejszymi danymi AFM na innych powierzchniach próbek37. Dodatkowo uzyskuje się odpowiednie stężenie RrgA na końcówce AFM, co generuje wartość docelową ~20% dobrze zdefiniowanych zdarzeń interakcji podczas pomiarów SMFS (Rysunek 3 i Rysunek 4). Innym eleganckim sposobem kontrolowania ilości cząsteczek sprzężonych z substratem próbki i końcówką wspornika, oprócz różnicowania stężenia białka i/lub czasu inkubacji, jest połączenie silanów z różnymi drugorzędowymi grupami funkcyjnymi. Zmieniając stosunek grup reaktywnych białek rozciągających się od polimeru PEG, można kontrolować liczbę immobilizowanych białek 15,16,17,18.
Opisany tutaj protokół może być również wykorzystany do unieruchomienia innych cząsteczek zawierających -NH2 lub może być dostosowany do łączenia białek z inną powierzchnią tlenku krzemu poza szkłem i azotkiem krzemu. W zależności od projektu białka, grupa karboksylowa reaktywna aminy może zostać zmieniona na grupę reaktywną sulfhydrylu (np. maleimid lub disiarczek orto-pirydylu) w celu sprzężenia białka za pośrednictwem jego wolnych grup –SH. W przypadku Fn daje to predefiniowaną orientację 13,17,20.
Podsumowując, protokół ten może być dostosowany do różnych wymagań i nadaje się do innych zastosowań biofizycznych poza eksperymentami ze spektroskopią sił pojedynczych cząsteczek.

Oprócz pęsety optycznej i magnetycznej, mikroskop sił atomowych (AFM)1,2 okazał się użytecznym narzędziem do analizy i manipulowania cząsteczkami oraz badania ich właściwości i funkcji, w tym ich reakcji na siłę zewnętrzną3,4. W przeciwieństwie do metod takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) lub mikrowaga kryształu kwarcu (QCM), AFM pozwala mierzyć interakcje na pojedynczej cząsteczce (SMFS)5 i na poziomie pojedynczej komórki (SCFS)6. Technologie te dostarczyły cennych informacji na temat mechanizmów wiązania, takich jak wiązania chwytliwe znalezione dla interakcji białka pilus E. coli FimH z mannose7, lub powtórzenia tandemu β-zipper utworzone przez białka wiążące Fn z S. aureus po związaniu z Fn8. Niedawno udało nam się wykazać, że adhezyna pilus-1 RrgA9,10 z bakterii Gram-dodatniej Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 jest w stanie wiązać się z fibronektyną12 za pomocą swoich dwóch domen końcowych. W ten sposób odkryto nowy dwudomenowy mechanizm wiązania, który różni się od tandemowego β-zipper i może umożliwić piliowanym pneumokokom tworzenie i utrzymywanie przejściowego kontaktu z powierzchniami gospodarza zawierającymi fibronektynę13.
Sukces eksperymentów SMFS zależy przede wszystkim od funkcjonalnego i natywnego unieruchomienia biomolekuł na powierzchniach stałych i końcówkach AFM. Ponieważ podczas pomiarów SMFS mogą wystąpić duże siły, białka powinny być koencyjnie sprzężone z powierzchnią. Istnieje wiele różnych metod sprzęgania do immobilizacji białek i innych biomolekuł, a także całych komórek na (nieorganicznych) powierzchniach ciał stałych, nanocząstkach i innych urządzeniach opisanych w literaturze14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Protokoły te często wykorzystują substancje niebezpieczne, są trudne do wykonania i/lub wymagają specjalnego sprzętu (np. czyszczenia plazmowego). Prostym sposobem na sprzężenie cząsteczek ze szkłem jest dołączenie grubszej warstwy polimeru heterobifunkcyjnych środków sieciujących z grupą reagującą silanem po jednej stronie i grupą aminowo-reaktywną po drugiej stronie. W zależności od zastosowania, środki sprzęgające mogą składać się z elastycznych łańcuchów węglowodorowych o zmiennej długości, np. glikolu polietylenowego (PEG). Tłumią one niespecyficzne oddziaływania modyfikowanych powierzchni (np. oddziaływania hydrofobowe, elektrostatyczne i van-der-Waalsa) i mogą zapewniać sprzężoną cząsteczce swobodę rotacyjną.
Tutaj opisujemy ogólny protokół kowalencyjnego sprzężenia białek zawierających jedną lub więcej wolnych grup aminowych (-NH2) z powierzchniami szklanymi i końcówkami AFM z azotku krzemu za pomocą heterobifunkcyjnego etoksysilanu-PEG-karboksylu (-COOH). Protokół ten może być stosowany w eksperymentach SMFS, czego przykładem jest interakcja RrgA i białka macierzy zewnątrzkomórkowej Fn (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 dla przeglądu).
Pierwszym krokiem jest silanizacja powierzchni28,29,30,31. Polega na hydrolizie grup etoksylowych czynnika sprzęgającego w celu wytworzenia wysoce reaktywnych grup SiOH. Mogą one reagować z grupami SiOH na podłożu. W pierwotnym etapie kondensacji silanole te tworzą wiązania wodorowe i rozprzestrzeniają się na podłożu. W reakcji kondensacji wtórnej (która zwykle wymaga ciepła lub próżni w celu usunięcia wody) powstają wiązania siloksanowe. W ten sposób powstaje kowalencyjnie przyczepiona warstwa krzemoorganiczna.
Drugim krokiem jest sprzężenie białek z grupami funkcyjnymi (-COOH), które rozciągają się od polimeru32. Po pierwsze, kwas jest przekształcany w reaktywny półprodukt estru N-hydroksysukcynimidu (NHS), który jest uzyskiwany przez dobrze znaną chemię NHS / EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimid<klasa sup = "xref">33 i ulega podstawieniu nukleofilowemu, aby ostatecznie utworzyć wiązanie amidowe z pierwszorzędowymi aminami na białkach.
W ten sposób, RrgA został sprzężony z końcówkami AFM z azotku krzemu, a ludzki Fn ze szklanymi podłożami w losowej orientacji, a ich siły oddziaływania zostały przeanalizowane na poziomie pojedynczej cząsteczki. Z uzyskanych przez nas wyników wynika, że opisana chemia powierzchni prowadzi do jednorodnego rozkładu Fn na powierzchni szkła oraz do odpowiedniego stężenia RrgA na końcówce, co przejawia się w docelowej wartości do 20% zdarzeń oddziaływań podczas pomiarów SMFS. Ta chemia redukuje niespecyficzne interakcje tła, podlega niewielkim zmianom podczas pozyskiwania danych i dlatego doskonale nadaje się do precyzyjnych eksperymentów SMFS.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; czystość analityczna</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>podwójnie destylowana</tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&ge; 99,8 %; czystość analityczna</td></tr><tr><td>Kwas etoksysilanowy glikol polietylenowy</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; do syntezy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Cząsteczka sondy np. Fibronektyna, osocze ludzkie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczka sondy np. RrgA</td><td></td><td></td><td>Wyprodukowano w laboratorium</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminometan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %; TRIS; Klasa bufora</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</silny></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nóż</td><td></td><td></td><td></td>do szkła</tr><tr><td>Szkiełka</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator gazów obojętnych</td> Mikroskop odwrócony <td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie JPK NanoWizard SPM i DP</td><td>JPK Instruments Piec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoryjny</td><td>Spoiwo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułka Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>do<td>mikrowirówek</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Marka</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>pH-metr</td> Pipety <td>bibelotowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Starlab</td><td></td><td>10-100 i mikro; l, 50-200 i mikro; l, 100-1000&nbsp; &mikro; l</td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wspornik z azotku krzemu - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>Stała sprężystości &le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>Kąpiel sonizacyjna</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Słoik</td><td></td><td></td><td></td>do barwienia</tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki precyzyjne Kimtech science</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>Widmo rtęci o energii pierwotnej 254&nbsp; nm</td></tr><tr><td>Eksykator</td><td></td><td></td><td></td>próżniowy</tr><tr><td>Pompa</td><td></td><td></td><td></td>próżniowa</tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier wagowy</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

W ostatnich latach spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM) poszerzyła nasze zrozumienie właściwości i funkcji molekularnych. Dało nam to możliwość bardziej szczegółowego zbadania wielu mechanizmów biofizycznych, np. tego, w jaki sposób adhezyny bakteryjne wiążą się z receptorami na powierzchni gospodarza. Powodzenie eksperymentów SMFS zależy między innymi od funkcjonalnego i natywnego unieruchomienia interesujących biomolekuł na powierzchniach stałych i końcówkach AFM. W tym miejscu opisujemy prosty protokół kowalencyjnego sprzężenia białek z powierzchniami krzemu za pomocą karboksyli silan-PEG i dobrze znanego składu chemicznego N-hydroksysukcynimidu/1-etylo-3-(3-dimetylo-aminopropylo)karbodimidu (EDC/NHS) w celu zbadania interakcji adhezyny pilus-1 RrgA z bakterii Gram-dodatniej Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) z białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyną (Fn). Nasze wyniki pokazują, że funkcjonalizacja powierzchni prowadzi do jednorodnego rozkładu Fn na powierzchni szkła oraz do odpowiedniego stężenia RrgA na końcówce wspornika AFM, widocznego przez wartość docelową do 20% zdarzeń interakcji podczas pomiarów SMFS i ujawniło, że RrgA wiąże się z Fn ze średnią siłą 52 pN. Protokół można dostosować do parowania za pomocą wolnych grup tiolowych specyficznych dla danego miejsca. Powoduje to predefiniowaną orientację białka lub cząsteczki i nadaje się do innych zastosowań biofizycznych poza SMFS.

Opisany tutaj protokół prowadzi do kowalencyjnej immobilizacji białek poprzez ich dostępne grupy aminowe pierwotne z przypadkową orientacją (Rysunek 1). Rysunek 2 przedstawia obraz AFM silanizowanej powierzchni szklanej z immobilizowanym białkiem Fn (po lewej) i bez niego (po prawej), zarejestrowany po dehydratacji próbek pod łagodnym strumieniem azotu. Warstwa polimeru silanowego wykazuje jedynie niewielkie pofalowania powierzchni o wysokości około 2-5 nm (Rysunek 2, prawa strona), natomiast na powierzchni funkcjonalizowanej białkiem Fn widoczne są cząsteczki Fn o wysokości około 10 nm (Rysunek 2, lewa strona). Na powiększeniach można rozpoznać dimeryczną strukturę Fn. Cząsteczki Fn wydają się być zwarte, o wysokości 4-5 nm nad powłoką powierzchniową z PEG i długości ~ 120 nm (patrz wstawki).
Aby zbadać siły oddziaływania RrgA z Fn, które zostały niedawno szczegółowo opisane przez nasz zespół13, RrgA przymocowano do końcówki AFM z azotku krzemu, a ludzką Fn do podłoża szklanego (Rycina 3a). Rycina 3 przedstawia reprezentatywne krzywe separacji końcówki od próbki dla oddziaływania RrgA z Fn, zarejestrowane przy prędkości wyciągania 1 µm s-1. Zastosowana chemia powierzchni zapewniła niskie oddziaływania tła oraz dobrze zdefiniowane pojedyncze (lub podwójne) zdarzenia oddziaływania (Rycina 3a), które dopasowano za pomocą modelu rozciągliwego łańcucha przypominającego robaka (eWLC, czerwone krzywe). Wykres wyników dopasowania (siła i długość zerwania, patrz Rycina 4) pokazuje, że po pokonaniu niespecyficznych oddziaływań powierzchniowych między końcówką AFM a podłożem oraz rozciągnięciu linkerów PEG (&gt; 70 nm), do ~19% krzywych siły wykazywało zdarzenia zerwania ze średnią siłą zerwania dla oddziaływania RrgA - Fn wynoszącą ~ 52 pN przy odległościach końcówka-próbka około 10 nm. W przeciwieństwie do tego, niewłaściwa chemia powierzchni (tutaj: pominięcie procesu blokowania roztworem soli buforowanej Tris Rycina 3b) utrudni jasną ocenę pojedynczych zdarzeń oddziaływania z powodu niespecyficznych oddziaływań, wielokrotnego wiązania białek (ślad 2 i 3) i/lub kowalencyjnego sprzęgania białek między powierzchnią próbki a końcówką ramienia AFM. Prowadzi to do wysokich sił zerwania (ślad 1), którym może towarzyszyć rozfałdowanie domen białka (Fn) (ślad 4 i 5).
<img alt="Hydroliza silanu, schemat procesu kondensacji, etoksylowany silan PEG karboksylowy, ester reaktywny wobec amin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Przegląd chemii powierzchni. Hydrolizie etoksy silanu-PEG-karboksylu towarzyszy jego kondensacja na uwodnionej powierzchni szkła oraz tworzenie wiązań sieciujących siloksanowych. Reakcja EDC z grupami karboksylowymi prowadzi do powstania reaktywnego o-acylizomocznik, reaktywny w stosunku do amin produkt pośredni o niezwykle krótkim okresie półtrwania w roztworze wodnym (hydroliza). Produkt pośredni jest stabilizowany poprzez tworzenie estru NHS, który ulega substytucji nukleofilowej, co prowadzi do ostatecznego utworzenia wiązania amidowego z aminami pierwszorzędowymi w białkach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii sił atomowych (AFM) przedstawiający analizę topografii powierzchni wraz z wykresami profilu wysokości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Immobilizacja fibronektyny na podłożu szklanym poprzez heterobifunkcyjny etoksylowy silanowy PEG-owy czynnik sprzęgający z grupą karboksylową. Obrazy AFM funkcjonalizowanych powierzchni szklanych z Fn (po lewej) i bez Fn (po prawej). Numery wskazują poszczególne cząsteczki Fn, które są jednorodnie rozmieszczone na powierzchni podłoża (wstawki). Cząsteczki przyjmują strukturę dimeryczną i kompaktową o wysokości 4-5 nm ponad powłoką PEG i długości &gt;10 nm. Przypomina to strukturę Fn w roztworze i jest zgodne z wcześniejszymi danymi AFM uzyskanymi na innych powierzchniach, np. mika (skala wstawk = 500 nm)37Poniżej obrazów AFM znajdują się profile wysokości wzdłuż linii zaznaczonych na obrazach AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat spektroskopii sił AFM z łącznikiem PEG, białkiem RrgA oraz wykresami oddziaływań z fibronektyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Ilustracja eksperymentu SMFS oraz reprezentatywne krzywe siła-odległość dla oddziaływania RrgA – Fn. (a) RrgA i Fn zostały powiązane kowalencyjnie poprzez heterobifunkcyjny czynnik sprzęgający etoksysilan PEG-karboksylowy odpowiednio do końcówki przetwornika AFM z azotku krzemu oraz powierzchni szklanej. Reprezentatywne krzywe siła-odległość SMFS uzyskane dla oddziaływania RrgA – Fn przy prędkości wycofania wynoszącej 1 µm s-1 przedstawiono opisaną immobilizację RrgA i Fn. Czerwone krzywe reprezentują dopasowania modelu rozciągliwego łańcucha przypominającego robaka (extensible worm-like chain), zastosowane w celu wyznaczenia sił i długości zerwania. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Becke, i wsp., ACSnano 201813(b) Reprezentatywne krzywe siła-odległość SMFS otrzymane dla oddziaływania RrgA – Fn bez gaszenia za pomocą soli buforowej Tris. W tym przypadku pierwotna amina Tris była nieobecna, przez co pozostałe aktywne estry NHS pozostały nienasycone podczas eksperymentu. Doprowadziło to do wielokrotnego wiązania białek (ślad 2 i 3) oraz zakleszczenia białek między powierzchnią a końcówką AFM, co skutkowało wysokimi siłami zerwania towarzyszącymi rozwijaniu domen (Fn-) (ślad 1, 4 i 5; zwróć uwagę na różne skale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histogramy przedstawiające częstotliwość występowania siły zerwania (pN) i długości zerwania (nm) w analizie molekularnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Rozkład siły i długości dla pojedynczych oddziaływań RrgA – Fn. Histogramy siły zerwania i odpowiadającej jej długości zerwania uzyskane z pomiarów oddziaływania RrgA – Fn SMFS (n = 140) przy prędkości wycofania wynoszącej 1 µm s-1Histogramy ujawniają najbardziej prawdopodobną siłę zerwania fMP wynoszącej 51,6 pN (dopasowanie Gaussa, czarna linia) oraz kumulacji długości pęknięć w okolicach 10 nm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Becke, i wsp., ACSnano, 201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofizyki, takie jak siła pojedynczego białka w interakcjach białkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do unieruchomienia szerokiej gamy różnych biomolekuł. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ obsługa sondy wspornikowej mikroskopu sił atomowych i sama obsługa mikroskopu sił atomowych może być wyzwaniem.Na początek załóż rękawice kwasoodporne, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Pod wyciągiem używaj izopropanolu w niestrzępiących się chusteczkach precyzyjnych. Usuń gruboziarnisty kurz i zanieczyszczenia z kilku szkiełek podstawowych.Przenieś czyste szkiełka do stojącego słoika wypełnionego kwasem solnym rozcieńczonym podwójnie destylowaną wodą. Zamknij słoik odpowiednią pokrywką i umieść go w łaźni ultradźwiękowej na 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś sondy wspornikowe AFM z azotku krzemu na czyste szklane szkiełko z końcówką skierowaną do góry.Przenieść szkiełko do komory nieprzepuszczalnej dla światła UV i naświetlać szkiełko światłem ultrafioletowym od góry przez co najmniej 90 minut. Następnie zastąp kwas solny w słoiku do barwienia podwójnie destylowaną wodą, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia szklanej powierzchni. Zamknij słoik pokrywką i umieść go z powrotem w łaźni ultradźwiękowej na kolejne 10 minut.W międzyczasie rozpuść kwas glikolu polietylenowego Ethoxysilan w mieszaninie etanolu i podwójnie destylowanej wody do końcowego stężenia 0,1 miligrama na mililitr. Hermetycznie zamknij ten roztwór, aby zapobiec parowaniu etanolu. Gdy będziesz gotowy, wlej roztwór silanu do dwóch oddzielnych szalek Petriego.Umieść czyste szkiełka podstawowe na jednej szalce Petriego, a wspornik na drugiej. Za pomocą parafilmu hermetycznie zamknij obie płytki, aby zapobiec parowaniu etanolu. Inkubować nieruchome płytki przez 90 minut w temperaturze pokojowej.Następnie użyj trzech kolejnych zlewek zawierających czysty etanol, aby umyć zarówno wspornik, jak i szkiełka. Umieść umyty wspornik na czystym szklanym szkiełku. Przenieś funkcjonalizowane szkiełka podstawowe do słoika do barwienia.Oba utwardzamy w piekarniku w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przechowuj próbki ze szkła silanizowanego i kantylanta w eksykatorze próżniowym przez okres do jednego tygodnia. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia losowego unieruchamiania białek, przygotuj roztwór zawierający EDC i NHS w standardowym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami, jak opisano w protokole tekstowym.Przykryj szkiełka szklane pokryte silanem tym roztworem. Umieść silanizowane sondy wspornikowe w kropli roztworu ECD/NHS. Inkubować oba przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie wypłucz zarówno wspornik, jak i szkiełka w trzech kolejnych zlewkach, aby całkowicie zmyć nadmiar EDC/NHS. Przenieść aktywowane szkiełka podstawowe na szalkę Petriego wyposażoną w mokrą chusteczkę. Dodać kroplę pożądanego roztworu białkowego do obszaru szkiełek aktywowanych EDC/NHS i uszczelnić szalkę Petriego za pomocą parafilmu i inkubować sondy w temperaturze pokojowej.Dodaj kroplę pożądanego roztworu białkowego do pojemnika wspornikowego wyposażonego w mokrą chusteczkę. Następnie dokładnie umyj sondy wspornikowe PBS. Umieść sondy w kropli w pudełku i zamknij pudełko.Inkubować sondy w temperaturze pokojowej. Następnie zaznacz obszar kropelki białka na tylnej stronie szkiełek podstawowych. Dokładnie umyć zarówno szkiełka podstawowe, jak i sondy wspornikowe za pomocą trzech kolejnych zlewek wypełnionych PBS.Umieść umyte sondy w naczyniu zawierającym sól fizjologiczną buforowaną Tris na 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dokładnie umyj szkiełka podstawowe i sondy wspornikowe za pomocą PBS. Przechowuj je na oddzielnych szalkach Petriego pokrytych PBS, aż będą gotowe do użycia.Umieścić świeżo oczyszczone szkiełko podstawowe na uchwycie próbki AFM i przykryć je buforem PBS. Następnie zamocuj przygotowaną sondę wspornikową na uchwycie wspornika i umieść ją w głowicy AFM. Ostrożnie zwilż wspornik kroplą buforu PBS.Powoli przesuwaj wspornik w kierunku powierzchni kalibracyjnej, aż wspornik zostanie całkowicie zanurzony w buforze PBS, ale nadal z dala od powierzchni kalibracyjnej. Użyj mikroskopu optycznego z widokiem z góry lub mikroskopu odwróconego AFM, aby ustawić laser z tyłu wspornika. Umieść plamkę lasera w pobliżu końca wspornika w pobliżu miejsca, w którym znajduje się końcówka i wyreguluj położenie na czterokwadrantowej fotodiodzie detektora AFM tak, aby odbita wiązka laserowa była umieszczona w środku fotodiody.Następnie otwórz menedżera kalibracji w oprogramowaniu AFM. Aby rozpocząć kalibrację czułości wspornika i stałej sprężystości, ostrożnie zbliż się do powierzchni podłoża i zapisz krzywą odległości siły. Dopasuj linię prostą do najbardziej stromej części krzywej siły cofania, w której końcówka styka się z powierzchnią podłoża, aby określić czułość dźwigni optycznej.Cofnij wspornik z powierzchni próbki i zarejestruj kilka widm szumu termicznego za pomocą wspornika w odległości co najmniej 100 mikronów od powierzchni i dopasuj oscylator harmoniczny, dostarczony przez oprogramowanie AFM, do widm szumu termicznego w celu określenia stałej sprężystości wspornika. Następnie powoli wycofaj wspornik i wyjmij go z roztworu. Usunąć szklaną powierzchnię używaną do kalibracji wspornika i zastąpić ją powierzchnią próbki zawierającą unieruchomione białka.Powoli przesuwaj wilgotny wspornik w kierunku powierzchni próbki, aż wspornik zostanie całkowicie pokryty buforem PBS, ale nadal z dala od powierzchni podłoża. Zbliżyć się do powierzchni i zapisać wiele krzywych odległości siły w różnych miejscach na powierzchni próbki z siłą nacisku 250 pikonewtonów, czasem kontaktu wynoszącym jedną sekundę, długością retrakcji wynoszącą dwa mikrometry i prędkością cofania wynoszącą jeden mikrometr na sekundę. W oprogramowaniu do przetwarzania danych wybierz ikonę Otwórz partię Force Scan, aby otworzyć pliki zmierzonej krzywej siły.Wybierz ikonę Skalibruj ponownie odchylenie V, dostosowując czułość w Spring Constant, aby przeliczyć odchylenie wspornika na siłę wprost proporcjonalną. Następnie wybierz Odejmowanie linii bazowej'ikonę, aby odjąć linię bazową kanału cofania w obszarze krzywej siły daleko od powierzchni, co również ustawia zerowy poziom siły. Wybierz ikonę Wyznaczanie punktu kontaktowego, aby zdefiniować punkt, w którym końcówka styka się z próbką.Wybierz ikonę Separacja próbki końcówki, aby przekonwertować sygnał wysokości na separację próbki końcówki. Oprócz odjęcia położenia punktu kontaktowego, odejmuje się w ten sposób zginanie wspornika w celu obliczenia odległości między powierzchnią podłoża a końcówką AFM. Wybierz ikonę Dopasuj model łańcucha polimerowego i wybierz model Rozszerzalny łańcuch podobny do robaka, aby przesiać ślady odległości siły pod kątem szczytów siły występujących przy długościach zerwania powyżej 70 nanometrów.Uporządkuj niespecyficzne interakcje i zastosuj rozszerzalny model łańcucha przypominającego robaka do wybranych szczytów. W tym badaniu białka są kowalencyjnie unieruchomione z losową orientacją za pomocą dostępnych amin pierwszorzędowych. Obraz AFM warstwy silanizowanego polimeru pokazuje tylko małe pofałdowania powierzchni o wysokości od około dwóch do pięciu nanometrów.Jednak zaobserwowano, że powierzchnia funkcjonalizowana fibronektyną ma cząsteczki fibronektyny o wysokości około 10 nanometrów. Bliższe przyjrzenie się ujawnia, że można rozpoznać dimeryczną strukturę cząsteczek. Cząsteczki te wydają się być zwarte, o wysokości od czterech do pięciu nanometrów nad powłoką powierzchniową PEG i długości około 120 nanometrów.Następnie badane są siły oddziaływania RRGA z fibronektyną. Reprezentatywne krzywe separacji próbek końcówek zarejestrowane z prędkością jednego mikrona na sekundę wykazały niską interakcję tła i dobrze ukształtowane zdarzenia interakcji, które są następnie dopasowywane przy użyciu rozszerzalnego modelu łańcucha przypominającego robaka. Wykreślenie wyników tego dopasowania pokazuje, że po pokonaniu niespecyficznych oddziaływań powierzchniowych podczas rozciągania łączników PEG, do 19% krzywych siły ma zdarzenia pęknięcia ze średnią siłą zerwania 52 pikonewtonów dla interakcji fibronektyny RRGA i przy odległości próbki końcówki około 100 nanometrów.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że w zależności od ustawień, takich jak czas kontaktu lub prędkość retrakcji, dane ze spektroskopii siły pojedynczej cząsteczki zawierają wiele informacji i że protokół ten może być tylko pierwszym krokiem w kierunku pełnej analizy danych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat interakcji pojedynczych cząsteczek, może być również wykorzystana do badania interakcji na poziomie pojedynczej komórki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak spektroskopia sił pojedynczej komórki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, w jaki sposób całe komórki oddziałują z powierzchniami pokrytymi białkiem.Nie zapominaj, że praca z kwasami i światłem UV może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice kwasoodporne i komora nieprzepuszczalna dla światła UV.

covalent-immobilization-proteins-for-single-molecule-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji wielokrotnych fosforylacji wewnętrznie nieuporządkowanego białka za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), używając białka Tau jako studium przypadku. Rekombinowany Tau jest izotopowo wzbogacany i modyfikowany in vitro przez kinazę przed pozyskaniem i analizą danych.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego do identyfikacji wielokrotnych fosforylacji białek wewnętrznie nieuporządkowanych

Poznaj metodę kowalencyjnej immobilizacji białek na powierzchniach tlenku krzemu przy użyciu heterobifunkcyjnego czynnika sprzegającego silanowego do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Przeglądaj więcej filmów