Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki
20 sierpnia 2018
Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofizyki, takie jak siła pojedynczego białka w interakcjach białkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do unieruchomienia szerokiej gamy różnych biomolekuł. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ obsługa sondy wspornikowej mikroskopu sił atomowych i sama obsługa mikroskopu sił atomowych może być wyzwaniem.
Na początek załóż rękawice kwasoodporne, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Pod wyciągiem używaj izopropanolu w niestrzępiących się chusteczkach precyzyjnych. Usuń gruboziarnisty kurz i zanieczyszczenia z kilku szkiełek podstawowych.
Przenieś czyste szkiełka do stojącego słoika wypełnionego kwasem solnym rozcieńczonym podwójnie destylowaną wodą. Zamknij słoik odpowiednią pokrywką i umieść go w łaźni ultradźwiękowej na 90 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś sondy wspornikowe AFM z azotku krzemu na czyste szklane szkiełko z końcówką skierowaną do góry.
Przenieść szkiełko do komory nieprzepuszczalnej dla światła UV i naświetlać szkiełko światłem ultrafioletowym od góry przez co najmniej 90 minut. Następnie zastąp kwas solny w słoiku do barwienia podwójnie destylowaną wodą, uważając, aby nie dopuścić do wyschnięcia szklanej powierzchni. Zamknij słoik pokrywką i umieść go z powrotem w łaźni ultradźwiękowej na kolejne 10 minut.
W międzyczasie rozpuść kwas glikolu polietylenowego Ethoxysilan w mieszaninie etanolu i podwójnie destylowanej wody do końcowego stężenia 0,1 miligrama na mililitr. Hermetycznie zamknij ten roztwór, aby zapobiec parowaniu etanolu. Gdy będziesz gotowy, wlej roztwór silanu do dwóch oddzielnych szalek Petriego.
Umieść czyste szkiełka podstawowe na jednej szalce Petriego, a wspornik na drugiej. Za pomocą parafilmu hermetycznie zamknij obie płytki, aby zapobiec parowaniu etanolu. Inkubować nieruchome płytki przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie użyj trzech kolejnych zlewek zawierających czysty etanol, aby umyć zarówno wspornik, jak i szkiełka. Umieść umyty wspornik na czystym szklanym szkiełku. Przenieś funkcjonalizowane szkiełka podstawowe do słoika do barwienia.
Oba utwardzamy w piekarniku w temperaturze 110 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przechowuj próbki ze szkła silanizowanego i kantylanta w eksykatorze próżniowym przez okres do jednego tygodnia. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia losowego unieruchamiania białek, przygotuj roztwór zawierający EDC i NHS w standardowym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami, jak opisano w protokole tekstowym.
Przykryj szkiełka szklane pokryte silanem tym roztworem. Umieść silanizowane sondy wspornikowe w kropli roztworu ECD/NHS. Inkubować oba przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie wypłucz zarówno wspornik, jak i szkiełka w trzech kolejnych zlewkach, aby całkowicie zmyć nadmiar EDC/NHS. Przenieść aktywowane szkiełka podstawowe na szalkę Petriego wyposażoną w mokrą chusteczkę. Dodać kroplę pożądanego roztworu białkowego do obszaru szkiełek aktywowanych EDC/NHS i uszczelnić szalkę Petriego za pomocą parafilmu i inkubować sondy w temperaturze pokojowej.
Dodaj kroplę pożądanego roztworu białkowego do pojemnika wspornikowego wyposażonego w mokrą chusteczkę. Następnie dokładnie umyj sondy wspornikowe PBS. Umieść sondy w kropli w pudełku i zamknij pudełko.
Inkubować sondy w temperaturze pokojowej. Następnie zaznacz obszar kropelki białka na tylnej stronie szkiełek podstawowych. Dokładnie umyć zarówno szkiełka podstawowe, jak i sondy wspornikowe za pomocą trzech kolejnych zlewek wypełnionych PBS.
Umieść umyte sondy w naczyniu zawierającym sól fizjologiczną buforowaną Tris na 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dokładnie umyj szkiełka podstawowe i sondy wspornikowe za pomocą PBS. Przechowuj je na oddzielnych szalkach Petriego pokrytych PBS, aż będą gotowe do użycia.
Umieścić świeżo oczyszczone szkiełko podstawowe na uchwycie próbki AFM i przykryć je buforem PBS. Następnie zamocuj przygotowaną sondę wspornikową na uchwycie wspornika i umieść ją w głowicy AFM. Ostrożnie zwilż wspornik kroplą buforu PBS.
Powoli przesuwaj wspornik w kierunku powierzchni kalibracyjnej, aż wspornik zostanie całkowicie zanurzony w buforze PBS, ale nadal z dala od powierzchni kalibracyjnej. Użyj mikroskopu optycznego z widokiem z góry lub mikroskopu odwróconego AFM, aby ustawić laser z tyłu wspornika. Umieść plamkę lasera w pobliżu końca wspornika w pobliżu miejsca, w którym znajduje się końcówka i wyreguluj położenie na czterokwadrantowej fotodiodzie detektora AFM tak, aby odbita wiązka laserowa była umieszczona w środku fotodiody.
Następnie otwórz menedżera kalibracji w oprogramowaniu AFM. Aby rozpocząć kalibrację czułości wspornika i stałej sprężystości, ostrożnie zbliż się do powierzchni podłoża i zapisz krzywą odległości siły. Dopasuj linię prostą do najbardziej stromej części krzywej siły cofania, w której końcówka styka się z powierzchnią podłoża, aby określić czułość dźwigni optycznej.
Cofnij wspornik z powierzchni próbki i zarejestruj kilka widm szumu termicznego za pomocą wspornika w odległości co najmniej 100 mikronów od powierzchni i dopasuj oscylator harmoniczny, dostarczony przez oprogramowanie AFM, do widm szumu termicznego w celu określenia stałej sprężystości wspornika. Następnie powoli wycofaj wspornik i wyjmij go z roztworu. Usunąć szklaną powierzchnię używaną do kalibracji wspornika i zastąpić ją powierzchnią próbki zawierającą unieruchomione białka.
Powoli przesuwaj wilgotny wspornik w kierunku powierzchni próbki, aż wspornik zostanie całkowicie pokryty buforem PBS, ale nadal z dala od powierzchni podłoża. Zbliżyć się do powierzchni i zapisać wiele krzywych odległości siły w różnych miejscach na powierzchni próbki z siłą nacisku 250 pikonewtonów, czasem kontaktu wynoszącym jedną sekundę, długością retrakcji wynoszącą dwa mikrometry i prędkością cofania wynoszącą jeden mikrometr na sekundę. W oprogramowaniu do przetwarzania danych wybierz ikonę Otwórz partię Force Scan, aby otworzyć pliki zmierzonej krzywej siły.
Wybierz ikonę Skalibruj ponownie odchylenie V, dostosowując czułość w Spring Constant, aby przeliczyć odchylenie wspornika na siłę wprost proporcjonalną. Następnie wybierz Odejmowanie linii bazowej'ikonę, aby odjąć linię bazową kanału cofania w obszarze krzywej siły daleko od powierzchni, co również ustawia zerowy poziom siły. Wybierz ikonę Wyznaczanie punktu kontaktowego, aby zdefiniować punkt, w którym końcówka styka się z próbką.
Wybierz ikonę Separacja próbki końcówki, aby przekonwertować sygnał wysokości na separację próbki końcówki. Oprócz odjęcia położenia punktu kontaktowego, odejmuje się w ten sposób zginanie wspornika w celu obliczenia odległości między powierzchnią podłoża a końcówką AFM. Wybierz ikonę Dopasuj model łańcucha polimerowego i wybierz model Rozszerzalny łańcuch podobny do robaka, aby przesiać ślady odległości siły pod kątem szczytów siły występujących przy długościach zerwania powyżej 70 nanometrów.
Uporządkuj niespecyficzne interakcje i zastosuj rozszerzalny model łańcucha przypominającego robaka do wybranych szczytów. W tym badaniu białka są kowalencyjnie unieruchomione z losową orientacją za pomocą dostępnych amin pierwszorzędowych. Obraz AFM warstwy silanizowanego polimeru pokazuje tylko małe pofałdowania powierzchni o wysokości od około dwóch do pięciu nanometrów.
Jednak zaobserwowano, że powierzchnia funkcjonalizowana fibronektyną ma cząsteczki fibronektyny o wysokości około 10 nanometrów. Bliższe przyjrzenie się ujawnia, że można rozpoznać dimeryczną strukturę cząsteczek. Cząsteczki te wydają się być zwarte, o wysokości od czterech do pięciu nanometrów nad powłoką powierzchniową PEG i długości około 120 nanometrów.
Następnie badane są siły oddziaływania RRGA z fibronektyną. Reprezentatywne krzywe separacji próbek końcówek zarejestrowane z prędkością jednego mikrona na sekundę wykazały niską interakcję tła i dobrze ukształtowane zdarzenia interakcji, które są następnie dopasowywane przy użyciu rozszerzalnego modelu łańcucha przypominającego robaka. Wykreślenie wyników tego dopasowania pokazuje, że po pokonaniu niespecyficznych oddziaływań powierzchniowych podczas rozciągania łączników PEG, do 19% krzywych siły ma zdarzenia pęknięcia ze średnią siłą zerwania 52 pikonewtonów dla interakcji fibronektyny RRGA i przy odległości próbki końcówki około 100 nanometrów.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że w zależności od ustawień, takich jak czas kontaktu lub prędkość retrakcji, dane ze spektroskopii siły pojedynczej cząsteczki zawierają wiele informacji i że protokół ten może być tylko pierwszym krokiem w kierunku pełnej analizy danych. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat interakcji pojedynczych cząsteczek, może być również wykorzystana do badania interakcji na poziomie pojedynczej komórki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak spektroskopia sił pojedynczej komórki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, w jaki sposób całe komórki oddziałują z powierzchniami pokrytymi białkiem.
Nie zapominaj, że praca z kwasami i światłem UV może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak rękawice kwasoodporne i komora nieprzepuszczalna dla światła UV.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kowalencyjną immobilizację białek z wykorzystaniem heterobifunkcyjnego silanowego środka sprzęgającego na powierzchniach tlenku krzemu w celu przeprowadzenia spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych. Metoda ta została zilustrowana na przykładzie oddziaływania RrgA, adhezyny końcowej pilusa-1 S. pneumoniae, z fibronektyną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Interakcje białkowe
- Skaningowa mikroskopia sił atomowych
Wprowadzenie
- Metoda ta pozwala odpowiedzieć na fundamentalne pytania z zakresu biofizyki, w szczególności dotyczące oddziaływań białkowych.
- Umożliwia ona unieruchomienie różnych biomolekuł.
- Obsługa mikroskopu sił atomowych może być trudna dla osób początkujących.
- Właściwe środki ostrożności oraz procedury czyszczenia są niezbędne do pomyślnej implementacji metody.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody immobilizacji białek na powierzchniach.
- Ułatwienie badania oddziaływań pojedynczych cząsteczek.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania białek pod wpływem siły.
Zastosowane metody
- Przygotowanie powierzchni tlenku krzemu z wykorzystaniem kwasu solnego i czyszczenia ultradźwiękowego.
- Funkcjonalizacja powierzchni kwasem etoksysilanowym glikolu polietylenowego.
- Aktywacja powierzchni za pomocą EDC/NHS w celu immobilizacji białek.
- Kalibracja wsporników AFM i pomiar krzywych siła-odległość.
Główne wyniki
- Skuteczna immobilizacja białek na powierzchniach silanizowanych.
- Precyzyjny pomiar oddziaływań białkowych przy użyciu AFM.
- Demonstracja wszechstronności metody w odniesieniu do różnych biomolekuł.
Wnioski
- Protokół zapewnia solidne podejście do badania oddziaływań białkowych na poziomie pojedynczych cząsteczek.
- Podkreśla on znaczenie przygotowania i funkcjonalizacji powierzchni w badaniach biofizycznych.
- Metoda ta może zostać dostosowana do szerokiego zakresu zastosowań w biofizyce i biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kowalencyjna immobilizacja białek umożliwia precyzyjną charakterystykę biofizyczną oddziaływań między celem a ligandem, wspierając wczesną walidację celu poprzez ilościowe określenie siły i specyficzności wiązania. Metoda ta zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach oddziaływań białko-białko, zapewniając pewność prognostyczną dla rozwoju dalszych testów oraz kampanii identyfikacji związków wiodących. Możliwość dostosowania protokołu do orientacji specyficznej dla danego miejsca zwiększa powtarzalność w procesach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pomiar sił zerwania (np. 52 pN dla RrgA-fibronektyny) w celu zbadania mocy hipotez terapeutycznych i istotności szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią kwantyfikację zdarzeń oddziaływania pojedynczych cząsteczek w kontrolowanych warunkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację wysokowiarygodnych celów w oparciu o mierzalne progi biofizyczne (np. częstotliwość oddziaływań do 20%).
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty oparte na sile, odpowiednie do standaryzacji testów i potwierdzania trafień w kaskadach przesiewania fenotypowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia jednorodną funkcjonalizację powierzchni (np. rozkład fibronektyny), co gwarantuje powtarzalną prezentację ligandów w ramach kampanii przesiewowych.
- Skalowalność: Kompatybilność z różnymi biomolekułami poprzez sprzęganie EDC/NHS lub specyficzne sprzęganie tiolowe, co umożliwia ponowne wykorzystanie w wielu klasach celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez charakteryzację oddziaływań w układach istotnych dla przebiegu choroby (np. wiązanie adhezyny pneumokokowej z macierzą gospodarza).
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Wyjaśnia mechanikę wiązania (np. długość zerwania >70 nm według modelu łańcucha przypominającego robaka), co pozwala na optymalizację wiodących kandydatów i zmniejszenie ryzyka niepowodzenia badań.
- Dostosowanie do biomarkerów: Wspiera identyfikację sygnatur oddziaływań, które można przenieść do modeli walidacyjnych na poziomie komórkowym lub tkankowym.
Integracja potoków i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od oceny zaangażowania celu po optymalizację związku wiodącego — zapewniając biofizyczną redukcję ryzyka przed podjęciem inwestycji w testy komórkowe.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących kompleksów cel-ligand poprzez bezpośredni pomiar siły, co pozwala na wyjaśnienie mechanizmów wiązania i specyficzności.
- Przesiewanie: Dostarczanie ilościowych wyników siły rozrywania, umożliwiających porównanie wpływu związków lub wariantów na siłę oddziaływania z celem.
- Analityka: Generowanie widm sił dopasowanych do modeli polimerowych (np. rozciągliwego łańcucha typu worm-like chain) w celu obiektywnego profilowania oddziaływań i zapewnienia spójności serii.
- Badania translacyjne: Łączenie danych z poziomu pojedynczej cząsteczki z kontekstami wielokomórkowymi dzięki kompatybilności z późniejszą spektroskopią sił w pojedynczych komórkach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie ustandaryzowanego protokołu przygotowania powierzchni, który można zastosować do wielu celów, co redukuje nakłady pracy na ponowne opracowywanie metod w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośredni, ilościowy pomiar sił i częstotliwości oddziaływań.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu dzięki kontrolowanej immobilizacji kowalencyjnej i pasywacji powierzchni (np. zastosowaniu łączników PEG minimalizujących niespecyficzne wiązanie).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie biofizycznych progów korelujących z istotnością funkcjonalną.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o dane dotyczące stabilności i specyficzności oddziaływań z wczesnej fazy odkrywania.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi AFM, chemii powierzchni oraz pracy z białkami, aby zapewnić właściwą immobilizację i wysoką jakość danych.
- Metoda zależy od dostępu do systemów AFM z możliwością spektroskopii sił oraz kontrolowanego środowiska ciekłego (np. PBS, bufory Tris).
- Konieczna jest standaryzacja etapów silanizacji, aktywacji i inkubacji pomiędzy zespołami w celu zachowania spójności powierzchni.
- Adaptacja do różnych izoform białek lub mutantów może wymagać optymalizacji chemii sprzęgania (np. orientacja aminowa w przeciwieństwie do tiolowej).
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną heterogeniczność powierzchni oraz konieczność starannego odejmowania linii bazowej w celu odróżnienia specyficznych zdarzeń zerwania od niespecyficznych.
