Name: Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności fosfolipazy C w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej. Technika ta umożliwia badanie związku między aktywnością enzymu a zachowaniem w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rysunek 4B - 4D został zmodyfikowany z Suenami et al.24 za zgodą Biology Open. Autorzy są wdzięczni wydawcy za zgodę. Prace te były wspierane przez Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) dla Shota Suenamiego i Ryo Miyazakiego.

1. Chwytanie pszczół miodnych zbierających
<ol>
	<li>Kup kolonie pszczół miodnych od lokalnego dystrybutora.</li>
	<li>Za pomocą siatki przeciw owadom złap pszczoły zbieraczki, które wracają do ula z workami na pyłek na tylnych nogach. Przenieś pszczoły do standardowej plastikowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zakryj probówkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Umieść rurkę na lodzie, aby znieczulić pszczoły. 
	UWAGA: Noś wyznaczone kurtki do pszczelarstwa, aby uniknąć użądleń pszczół. W zależności od eksperymentu można również zbierać pszczoły karmiące. Aby złapać pszczoły pielęgniarki, obserwuj zachowanie pszczoły na woskowym grzebieniu i łap pszczoły pielęgniarki, które wsadzają głowy w komórki czerwiu, aby nakarmić larwy, za skrzydło lub klatkę piersiową za pomocą pęsety. Następnie umieść pszczoły w plastikowej probówce o pojemności 50 ml, zakryj probówkę i umieść ją na lodzie, jak wspomniano w kroku 1.2.</li>
	<li>Złap losowo 12 zbieraczy. 
	UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się dwie pszczoły na partię, co daje sześć partii. W jednej probówce można złapać wiele pszczół, a liczba pszczół w jednej probówce nie jest ważna, ponieważ pszczoły w każdej partii są później łączone (patrz krok 3.1.1). Utrzymuj rurkę w chłodzie latem, ponieważ wysoka temperatura w rurce szkodzi pszczołom.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu pszczoły miodnej
<ol>
	<li>W laboratorium umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie na co najmniej 30 min6, aby znieczulić pszczoły.</li>
	<li>Aby przygotować etap sekcji, złóż kawałek wosku dentystycznego na pół (uzyskany rozmiar to około 3,5 x 7,5 cm) i wepchnij go do plastikowego naczynia (60 x 15 mm). 
	UWAGA: Złożony wosk mocno trzyma szpilki owadów.</li>
	<li>Pod mikroskopem lornetkowym oddziel głowę pszczoły od jej ciała za pomocą pęsety i przymocuj ją do wosku dentystycznego, wkładając szpilki do owadów u podstawy każdej anteny, aby utrzymać przednią część głowy w pozycji do góry (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Umyj pęsetę przed użyciem przy użyciu etanolu lub wysterylizowanej wody.</li>
	<li>Wlej tyle roztworu soli (0,13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl i 1 mmol/L CaCl 2-2H 2O) na głowę, aby ją przykryć. Ponownie przebij głowę szpilkami, jeśli głowa unosi się w roztworze. W razie potrzeby użyj lodowatego roztworu soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Jednak ten protokół działa bez zimnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Usuń anteny za pomocą pęsety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Wykonaj poziome cięcie w pobliżu podstaw czułków i wzdłużnie na granicy oczu złożonych, używając skalpela. Następnie wykonaj poziome nacięcie na czubku głowy. Usuń naskórek, aby otworzyć okno nad mózgiem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
	UWAGA: W razie potrzeby przed użyciem umyj skalpel etanolem lub wysterylizowaną wodą.</li>
	<li>Usuń siatkówki z oczu i tchawicy na przedniej powierzchni mózgu za pomocą pęsety (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Rozszerz nacięcie na granicy złożonych oczu grzbietowo i brzusznie, używając skalpela (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E). Następnie usuń tkankę łączną między naskórkiem oczu złożonych a siatkówką, wkładając pęsetę bezpośrednio pod naskórek oka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Odrzuć naskórek oczu złożonych. Podnieś pęsetą grzbietowe końcówki siatkówki oczu złożonych i przesuń pęsetę w kierunku brzusznym, aby ostrożnie odkleić siatkówkę (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2G).</li>
	<li>Ostrożnie usuń pozostałe tchawice z przedniej powierzchni mózgu za pomocą pęsety (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Przetnij tkankę łączną między mózgiem i wokół tkanek za pomocą pęsety i wypreparuj mózg z torebki głowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2H).</li>
	<li>Odklej tchawice na tylnej powierzchni mózgu za pomocą pęsety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I).</li>
	<li>Za pomocą skalpela przetnij połączenie między MB a innymi obszarami mózgu obok pionowych płatów, które są częścią MB (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J).</li>
	<li>Umieść wypreparowane MB i pozostałe tkanki mózgowe w probówkach o pojemności 1,5 ml i szybko zamroź je suchym lodem lub ciekłym azotem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2K). Zamrożone chusteczki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się w wyznaczonych rękawicach i wentylacji, aby uniknąć zimnych oparzeń i uduszenia. Z suchym lodem należy również obchodzić się ostrożnie w rękawiczkach. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Sekcja i przechowywanie tkanek mózgowych powinny być wykonywane po jednej pszczole na raz, aby uniknąć degradacji białka.</li>
</ol>
3. Przygotowanie homogenatów mózgu
<ol>
	<li>Dodać 10 μl buforu homogenizacyjnego składającego się z 50 mmol/l HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/l KCl i 1,0 mmol/L CaCl2 do zamrożonej tkanki mózgowej i homogenizować tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml, ręcznie wywierając nacisk plastikowym tłuczkiem. Pogłaszcz tkankę co najmniej 200 razy 
	UWAGA: Czynności opisane w rozdziale 3 należy wykonywać na lodzie. Użyj tłuczka mocującego się bezpośrednio w probówce, aby wystarczająco rozbić tkanki, które łatwo unoszą się w buforze homogenizacyjnym.
	<ol>
		<li>Przenieść homogenizowany roztwór tkankowy do następnej tkanki w partii i homogenizować tkankę w ten sam sposób. 
		UWAGA: Pszczoły miodne w każdej partii są łączone na tym etapie. W tym protokole wykorzystuje się sześć lotów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 30 μl buforu homogenizacyjnego.</li>
	<li>Odwirować homogenizowaną próbkę tkanki przez 10 minut w temperaturze około 900 x g27 i 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i ponownie odwirować przez 20 minut w temperaturze około 9 500 x g27 i 4 °C.</li>
	<li>Umieścić supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Przechowywać homogenat w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 2,5 μl homogenatu w 17,5 μl wysterylizowanej wody (rozcieńczając w ten sposób homogenat ośmiokrotnie) i użyć całego rozcieńczonego homogenatu. 
		UWAGA: Pobieranie próbek homogenatu za pomocą mikropipety musi być wykonywane ostrożnie ze względu na jego wysoką lepkość.</li>
		<li>Wykonać test BCA przy użyciu 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 i 2,0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 20 μl jako wzorce. 
		UWAGA: W razie potrzeby zmień skalę testu BCA w oparciu o objętość homogenatu i próbek wzorcowych. W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Reakcja PLC w homogenatach mózgu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy podłoża fluorogenicznego WH-1526 rozpuszczonego w wysterylizowanej wodzie o stężeniu 50 μmol/l i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Przykryj roztwory zawierające podłoże folią, aby zapobiec blaknięciu.</li>
	<li>Przygotować premiks reakcyjny w wymaganej objętości, aby uzyskać następujący skład w 10 μl mieszaniny reakcyjnej: 50 mmol/l HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L ditiotreitol, 50 mg/L BSA i 12,5 μmol/L WH-15.</li>
	<li>W razie potrzeby rozcieńczyć homogenat buforem homogenizacyjnym.</li>
	<li>Wymieszać premiks reakcyjny i homogenat zawierający 1,3 μg białek w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby uzyskać końcową objętość 10 μl mieszaniny reakcyjnej.
	<ol>
		<li>Przygotować dwa rodzaje mieszanin kontrolnych do analizy statystycznej: umieścić homogenat, ale nie WH-15 w mieszaninie (mieszanina kontrolna 1) i odwrotnie (mieszanina kontrolna 2). 
		UWAGA: Przygotować mieszaniny reakcyjne i mieszaniny kontrolne na lodzie, aby zapobiec degradacji białek i reakcji PLC. Mieszaniny kontrolne 1 i 2 służą do wykrywania fluorescencji odpowiednio z homogenatu i wolnego substratu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłukać probówkę i inkubować ją w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 2 μl 25 mmol/L glikolu etylenowego bis (β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'--tetraoctowego. 
	UWAGA: Odpowiednie ilości białka i czasy reakcji różnią się w zależności od eksperymentu. Tak więc, aby zoptymalizować warunki reakcji, może być konieczne powtórzenie procedur opisanych w krokach 4.1 - 5.3 we wstępnych eksperymentach poprzez zmianę ilości białka i czasu inkubacji, aż fluorescencja wzrośnie liniowo. Dla porównania, gdy stosuje się homogenat pochodzący z innych regionów mózgu, reakcja zwykle przebiega liniowo z 1,3 μg lub mniej białek w ciągu 30 minut, ale liniowość zmniejsza się albo przy co najmniej 2,7 μg białek, albo przy czasie inkubacji wynoszącym 90 minut lub dłużej.</li>
</ol>
5. Wykrywanie fluorescencji wynikającej z aktywności PLC
<ol>
	<li>Odwirować mieszaninę reakcyjną i mieszaniny kontrolne przez 5 minut przy około 310 x g28 i przenieść 10 μl supernatantu do różnych studzienek na 384-dołkowej mikropłytce mającej zastosowanie do wykrywania fluorescencji. 
	UWAGA: Aby zapobiec blaknięciu i zabrudzeniu kurzem, przykryj płytkę folią.</li>
	<li>Przepłukać mikropłytkę za pomocą wirówki do mikropłytki.</li>
	<li>Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i wykryć fluorescencję za pomocą technicznej trójkiplkatu. 
	UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji wynoszą odpowiednio 344 nm i 530 nm. W stosownych przypadkach (w zależności od czytnika mikropłytek) mieszaniny próbek należy mieszać przez 5 s przed każdym wykryciem. Protokół można zatrzymać w tym miejscu.</li>
</ol>
6. Test hamującego działania środków farmakologicznych
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe edelfozyny i neomycyny o odpowiednich stężeniach i przechowywać je do czasu użycia: edelfozyna w stężeniu 5,0 mmol/l i temperaturze -20 °C; neomycyna w stężeniu 550 mmol/l i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotowując premiks reakcyjny zgodnie z opisem w kroku 4.2, dodać inhibitory do premiksu, aby osiągnąć odpowiednie stężenia końcowe: edelfozyna, 1,0 mmol/l; neomycyna, 0,55 mmol/l.</li>
	<li>Dodać homogenat do premiksu reakcyjnego i odpowiednich mieszanin kontrolnych, jak w kroku 4.4.
	<ol>
		<li>Przygotować trzy rodzaje mieszanin kontrolnych: umieścić homogenat i inhibitor, ale nie substrat, w mieszaninie kontrolnej 1; dodać substrat i inhibitor, ale nie homogenat, do mieszaniny kontrolnej 2; i umieścić inhibitor, ale nie homogenat lub substrat, w mieszaninie kontrolnej 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PLC i detekcję fluorescencji zgodnie z opisem w krokach 4.5 - 5.3.</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>W celu wykrycia aktywności PLC przy użyciu mieszanin opisanych w sekcji 4 należy obliczyć fluorescencję uzyskaną z reakcji między PLC a substratem, odejmując fluorescencję emitowaną z homogenatu lub wolnego substratu w następujący sposób: 
	 
	Fl (aktywność PLC) = Fl (mieszanina reakcji) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} 
	 
	UWAGA: Fl (aktywność PLC), Fl (mieszanina reakcyjna), Fl (ctrl 1) i Fl (ctrl 2) oznaczają fluorescencję w dobrej wierze pochodzącą z aktywności PLC, fluorescencję wykrytą w mieszaninie reakcyjnej oraz mieszaniny kontrolne 1 i 2.
	<ol>
		<li>Po pomiarze fluorescencji w mieszaninach zgodnie z opisem w krokach 4.1 - 5.3, obliczyć Fl (aktywność PLC) zgodnie z równaniem w kroku 7.1, a następnie średnią Fl (aktywność PLC) trzylecia technicznego dla każdego homogenatu.</li>
		<li>Korzystając ze średniej Fl (aktywność PLC) z trójki technicznej otrzymanej w kroku 7.1.1, należy ponownie obliczyć średnią aktywność Fl (PLC) biologicznych powtórzeń MB i innych obszarów mózgu i porównać wartości między tkankami mózgowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu zbadania aktywności PLC w obecności inhibitorów przy użyciu mieszanin opisanych w sekcji 6 należy obliczyć fluorescencję uzyskaną w wyniku reakcji między homogenatem, substratem i inhibitorem w następujący sposób. 
	 
	Fl (aktywność PLC z inhibitorem) = Fl (mieszanina reakcji) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3) 
	 
	UWAGA: W tym przypadku Fl (aktywność PLC z inhibitorem) to fluorescencja w dobrej wierze wynikająca z aktywności PLC w obecności inhibitora. Fl (mieszanina reakcyjna), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) i Fl (ctrl 3) są sygnałami fluorescencyjnymi wykrywanymi odpowiednio w mieszaninie reakcyjnej, mieszaninie kontrolnej 1, mieszaninie kontrolnej 2 i mieszaninie kontrolnej 3.
	<ol>
		<li>Po pomiarze fluorescencji w mieszaninach zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.4 należy obliczyć Fl (aktywność PLC z inhibitorem) zgodnie z równaniem w kroku 7.2. Następnie należy obliczyć średnią Fl (aktywność PLC z inhibitorem) technicznego triplikata dla każdego homogenatu.</li>
		<li>Korzystając z wartości średniej obliczonej w kroku 7.2.1, należy obliczyć średnią Fl (aktywność PLC z inhibitorem) kontrprób biologicznych pochodzących z każdej tkanki mózgowej. Porównaj Fl (aktywność PLC z inhibitorem) i Fl (aktywność PLC) uzyskane w kroku 7.1.2 w każdej tkance mózgowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+ML+%22The+Biology+of+the+Honey+Bee%22">The Biology of the Honey Bee</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+and+non-associative+plasticity+in+Kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3(2008).</li>
<li>Müßig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).</li>
<li>Devaud, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect%3A+mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).</li>
<li>Grünbaum, L., Müller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+specific+olfactory+memory+leads+to+a+long-lasting+activation+of+protein+kinase+C+in+the+antennal+lobe+of+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).</li>
<li>Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrated+expression+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+and+protein+kinase+C+in+the+mushroom+bodies+of+the+brain+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L.</a> The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).</li>
<li>Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+profiling+of+central+nervous+system+regions+in+three+species+of+honey+bee+during+dance+communication+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior.</a> PLoS ONE. 4 (7), e6408(2009).</li>
<li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+the+expression+of+futsch%2C+tau%2C+and+MESK2+homologues+in+the+brain+of+the+European+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 5 (2), e9213(2010).</li>
<li>Kaneko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+middle-type+Kenyon+cells+in+the+honeybee+brain+revealed+by+area-preferential+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis.</a> PLoS ONE. 8 (8), e71732(2013).</li>
<li>Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+is+differentially+localized+in+synaptic+regions+of+kenyon+cells+within+the+mushroom+bodies+of+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain.</a> The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).</li>
<li>Suenami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+differentiation+of+Kenyon+cell+subtypes+using+three+mushroom+body-preferential+genes+during+metamorphosis+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> PLoS ONE. 11 (6), e0157841(2016).</li>
<li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).</li>
<li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide-gated+channels%2C+calmodulin%2C+adenylyl+cyclase%2C+and+calcium%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+are+required+for+late%2C+but+not+early%2C+long-term+memory+formation+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee.</a> Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).</li>
<li>Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+knockdown+affects+both+early+and+late+phases+of+olfactory+long-term+memory+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee.</a> Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).</li>
<li>Miyata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+long-term+synaptic+depression+in+the+rostral+cerebellum+correlated+with+impaired+motor+learning+in+phospholipase+C+%CE%B24+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice.</a> European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).</li>
<li>Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+social+behavior+and+sensorimotor+gating+in+mice+lacking+phospholipase+C%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1.</a> Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).</li>
<li>Quan, W. -X., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0941950012000735">Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice.</a> Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).</li>
<li>Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+promotes+motor+cortex+plasticity+and+motor+skill+learning+via+PLC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124986(2015).</li>
<li>Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+neurons%3A+molecular+mechanisms+and+cellular+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences.</a> Science. 268 (5208), 239-247 (1995).</li>
<li>Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipase+C%CE%B5+in+physiological+phosphoinositide+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks.</a> Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).</li>
<li>Dusaban, S. S., Brown, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLC%CE%B5+mediated+sustained+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biological+Regulation%22%5BJournal%5D)">PLCε mediated sustained signaling pathways.</a> Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).</li>
<li>Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genetic+approaches+to+investigating+calcium%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+function+in+plasticity+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).</li>
<li>Giese, K. P., Mizuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+protein+kinases+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">The roles of protein kinases in learning and memory.</a> Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).</li>
<li>Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+inhibition+of+phospholipase+C+in+the+brain+attenuates+early+memory+formation+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.).</a> Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).</li>
<li>Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+phospholipase+C+encoded+by+the+norpA+gene+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).</li>
<li>Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorogenic%2C+small+molecule+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).</li>
<li>Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+phosphatidylinositol+phosphodiesterase+in+the+head+of+a+Drosophila+visual+mutant%2C+norpA+%28no+receptor+potential+A%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A).</a> The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).</li>
<li>Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLC%CE%B23+mediates+cortactin+interaction+with+WAVE2+in+MCP1-induced+actin+polymerization+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).</li>
<li>Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+downregulation+of+protein+kinase+A+during+olfactory+learning+using+antisense+technique+impairs+long-term+memory+formation+in+the+honeybee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).</li>
<li>Thamm, M., Scheiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKG+in+honey+bees%3A+spatial+expression%2C+Amfor+gene+expression%2C+sucrose+responsiveness%2C+and+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).</li>
<li>Balfanz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+transmembrane+adenylyl+cyclases+from+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).</li>
<li>Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11022047">A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane-associated%2C+fluorogenic+reporter+for+mammalian+phospholipase+C+isozymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biochemiczne badanie aktywności białek jest niezwykle ważne dla zrozumienia sygnalizacji molekularnej w mózgu, ponieważ na aktywność enzymu wpływają różne cząsteczki, takie jak substraty i inhibitory, a zatem mogą zmieniać się wraz z zachowaniem zwierząt (np. uczeniem się i pamięcią). W badaniach pszczół miodnych stwierdzono, że enzymy, takie jak cykliczna kinaza białkowa zależna od AMP A, cykliczna kinaza białkowa zależna od GMP, PKC, fosforylowany CaMKII i cyklaza adenylanowa wykazują r...

Europejska pszczoła miodna (Apis mellifera L.) jest owadem eusocjalnym, a samice pszczół wykazują rozmnażanie zależne od kasty i zależny od wieku podział pracy. Na przykład w bezpłodnej kaście pszczół określanej jako "robotnice" młodsze osobniki karmią czerwiu, podczas gdy starsze zbierają nektar i pyłek poza ulem1. Zdolność uczenia się i zapamiętywania jest niezwykle ważna w życiu pszczoły miodnej, ponieważ zbieraczki muszą wielokrotnie przemieszczać się tam i z powrotem między źródłami pożywienia a swoim gniazdem, a następnie komunikować się z lokalizacjami dobrych źródeł pożywienia swoim kolegom z gniazda za pomocą komunikacji tanecznej1. Wcześniejsze badania wykazały, że MB, wyższy ośrodek mózgu u owadów, jest zaangażowany w zdolność uczenia się i zapamiętywania pszczoły miodnej2,3,4. Różnie wyrażone geny i białka zostały zidentyfikowane w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej5,6,7,8,9,10,11, co sugeruje, że są one związane z unikalnymi funkcjami każdego regionu mózgu. Chociaż farmakologiczne hamowanie lub aktywacja białka będącego przedmiotem zainteresowania jest dobrze stosowanym podejściem do ujawnienia funkcji białka w zachowaniu pszczół miodnych12,13,14, nie wiadomo, czy wszystkie leki mają działanie funkcjonalne w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej. Walidacja funkcji takich leków wzmocni wnioski z badań farmakologii behawioralnej.
Tutaj skupiamy się na PLC, jednym z enzymów związanych z poznaniem myszy15,16,17,18. PLC wyzwala sygnalizację wapniową poprzez rozkład 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu (2) na 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3) i diacyloglicerol (DAG)19,20,21. IP3 otwiera receptory IP3 na retikulum endoplazmatycznym (ER), prowadząc do uwolnienia jonów wapnia z ER. Uwolniony wapń aktywuje zarówno kinazę białkową II zależną od wapnia/kalmoduliny (CaMKII) z kalmoduliną i kinazą białkową C (PKC) w obecności DAG. Obie kinazy białkowe biorą udział w uczeniu się i zapamiętywaniu22,23, co jest zgodne z udziałem PLC w tym procesie. Sterowniki PLC są podzielone na podtypy, w tym PLCβ, PLCγ i PLCε, na podstawie ich struktur20. Każdy podtyp PLC jest aktywowany w innym kontekście20, a geny kodujące te podtypy są różnie wyrażane w różnych tkankach. Wcześniej wykazaliśmy, że MB pszczół miodnych wyrażają geny kodujące podtypy PLCβ i PLCε na wyższych poziomach niż pozostałe regiony mózgu24, oraz że dwa inhibitory pan-PLC (edelfozyna i siarczan neomycyny [neomycyna]) zmniejszają aktywność PLC w różnych regionach mózgu i rzeczywiście wpływają na zdolność uczenia się i zapamiętywania pszczoły miodnej24.
Tradycyjnie, aktywność enzymatyczna PLC była mierzona za pomocą radioznakowanego225, co wymaga odpowiedniego szkolenia, sprzętu i obiektów. Niedawno stworzono syntetyczny substrat fluorogeniczny PLC26, co ułatwia ocenę aktywności PLC w standardowym laboratorium. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykrywania aktywności PLC w różnych obszarach mózgu pszczoły miodnej za pomocą substratu fluorogenicznego, a następnie testowania hamującego wpływu edelfozyny i neomycyny na PLC w tych tkankach. Ponieważ protokół wymaga tylko podstawowych manipulacji, może mieć zastosowanie do badań aktywności PLC w innych tkankach lub obszarach mózgu pszczół przydzielonych do różnych zadań społecznych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td>Zestaw odczynników do pomiaru stężenia białka</td></tr><tr><td>Pierce Albumina bydlęca Standardowe ampułki 2 mg / ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23209</td><td>Standardowe próbki używane w teście BCA</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>GC</td><td>13B1X00155000141</td><td>Wosk dentystyczny używany jako etap rozwarstwienia</td></tr><tr><td>Szpilka do owadów</td><td>Shiga</td><td>Nr 0</td><td>Nierdzewna, solidna głowica</td></tr><tr><td>PLCglow</td><td>KXT Bio</td><td>KCH-0001</td><td>Fluorogenne podłoże mikropłytki PLC</td></tr><tr><td>384-dołkowej</td><td>Corning</td><td>4511</td><td>Niskonakładowa płytka z okrągłym dnem w kolorze czarnym</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Gemini EM</td><td>Urządzenia</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>Edelfosine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201021</td><td>inhibitor</td></tr> <tr><td>pan-PLCSiarczan neomycyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3573</td><td>inhibitor pan-PLC</td></tr></tbody></table>

wykrywanie aktywności fosfolipazy c w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Pszczoła miodna jest modelowym organizmem do oceny złożonych zachowań i wyższych funkcji mózgu, takich jak nauka, pamięć i podział pracy. Ciało grzyba (MB) jest wyższym ośrodkiem mózgu, który ma być neuronalnym substratem złożonych zachowań pszczół miodnych. Chociaż wcześniejsze badania zidentyfikowały geny i białka, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w MB i innych regionach mózgu, aktywność białek w każdym regionie nie jest jeszcze w pełni poznana. Aby ujawnić funkcje tych białek w mózgu, analiza farmakologiczna jest wykonalnym podejściem, ale najpierw konieczne jest potwierdzenie, że manipulacje farmakologiczne rzeczywiście zmieniają aktywność białek w tych obszarach mózgu.
Wcześniej zidentyfikowaliśmy wyższą ekspresję genów kodujących fosfolipazę C (PLC) w MBs niż w innych regionach mózgu i farmakologicznie oceniliśmy udział PLC w zachowaniu pszczół miodnych. W tym badaniu przetestowaliśmy biochemicznie dwa środki farmakologiczne i potwierdziliśmy, że zmniejszają one aktywność PLC w MB i innych obszarach mózgu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób wykrywać aktywność PLC w homogenacie mózgu pszczoły miodnej. W tym systemie testowym homogenaty pochodzące z różnych regionów mózgu reagują z syntetycznym substratem fluorogennym, a fluorescencja wynikająca z aktywności PLC jest określana ilościowo i porównywana między regionami mózgu. Opisujemy również naszą ocenę hamującego wpływu niektórych leków na aktywność PLC przy użyciu tego samego systemu. Chociaż na ten system prawdopodobnie wpływają inne endogenne związki fluorescencyjne i/lub absorbancja składników testu i tkanek, pomiar aktywności PLC przy użyciu tego systemu jest bezpieczniejszy i łatwiejszy niż przy użyciu tradycyjnego testu, który wymaga substratów znakowanych radioaktywnie. Prosta procedura i manipulacje pozwalają nam zbadać aktywność PLC w mózgach i innych tkankach pszczół miodnych zaangażowanych w różne zadania społeczne.

Stężenia białek w homogenatach mózgu: 
Przygotowaliśmy homogenaty z wykorzystaniem pszczół zbieraczek. Obliczone stężenia białek w oryginalnych homogenatach przedstawiono na Rysunku 3. Przybliżone stężenia białek w oryginalnym homogenacie wynosiły odpowiednio: 1,5 mg/mL w ciałkach grzybkowatych (MBs) oraz 2,3 mg/mL w pozostałych obszarach mózgu. Wykorzystano dwie pszczoły na partię i przeanalizowano sześć partii.
<p class="jove_content...

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, czy i w jaki sposób działania PLC w różnych regionach mózgu są zaangażowane w funkcjonowanie mózgu pszczoły miodnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że naukowcy mogą łatwo przeprowadzić eksperyment przy użyciu standardowych urządzeń laboratoryjnych, ponieważ protokół ten wymaga tylko podstawowych manipulacji. Na początek umieść 50 ml probówkę zawierającą pszczoły miodne na lodzie na 30 minut, aby znieczulić pszczoły. Następnie przygotuj etap preparacji, składając kawałek wosku dentystycznego na pół i umieszczając go w plastikowym naczyniu. Pod mikroskopem lornetkowym użyj pęsety, aby oddzielić głowę pszczoły od jej ciała. Następnie przymocuj głowę do wosku dentystycznego i włóż szpilki przeciw owadom u podstawy każdej anteny, aby utrzymać wnętrze głowy w pozycji do góry. Następnie wlej tyle roztworu soli na głowę, aby ją przykryć. Za pomocą pęsety wyjmij antenę. Następnie za pomocą skalpela wykonaj poziome cięcie w pobliżu podstaw anteny i podłużne cięcie na granicy oczu złożonych. Wykonaj poziome nacięcie na czubku głowy i usuń naskórek, aby otworzyć okno nad mózgiem. Następnie za pomocą pęsety usuń oko retin z kosteczki słuchowej i tchawicę z wewnętrznej powierzchni mózgu. Następnie włóż pęsetę bezpośrednio pod naskórek oka, aby usunąć tkankę łączną między naskórkiem oczu złożonych a okiem. Następnie usuń naskórek i oko retin oczu złożonych. Następnie za pomocą pęsety ostrożnie usuń pozostałą tchawicę z wewnętrznej powierzchni mózgu. Następnie przetnij tkankę łączną między mózgiem i wokół tkanek i wypreparuj mózg z torebki głowy. Za pomocą pęsety oderwij tchawicę od tylnej powierzchni mózgu. Następnie użyj skalpela, aby przeciąć połączenie między ciałami grzybów lub MB a innymi obszarami mózgu obok pionowych płatów. Umieść wypreparowane MB i wszelkie pozostałe tkanki mózgowe w probówkach o pojemności 1,5 ml i szybko zamroź je suchym lodem. Najpierw dodaj 10 ml buforu homogenizacyjnego do zamrożonej tkanki mózgowej. Użyj plastikowej peseli, aby ręcznie homogenizować tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml. Następnie przenieś homogenizowany roztwór tkankowy do następnej tkanki w partii i powtórz proces homogenizacji. Następnie dodaj 30

detection-phospholipase-c-activity-brain-homogenate-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy test pozwalający ustalić obecność fosfolipazy w surowym ekstrakcie z jadu Anthopleura dowii - morskiego ukwiału. Test wykorzystuje technikę dyfuzji żelu agarozowego, w której enzym fosfolipaza dyfunduje i rozkłada fosfolipidy zawarte w pożywce stałej w sposób promienisty.

Test aktywności fosfolipazy: Test dyfuzji żelu w celu określenia aktywności fosfolipazy w surowym ekstrakcie jadu z Anthopleura dowii

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

Prezentowany tutaj jest protokół użycia systemu CRISPR-Cas9 do zmniejszenia produkcji białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej w celu zbadania swoistości przeciwciał.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania surowego ekstraktu z jadu z ukwiału morskiego i wykrywania jego aktywności hemolitycznej i fosfolipazy.

Identyfikacja aktywności hemolitycznej i fosfolipazy w surowych ekstraktach z ukwiałów morskich za pomocą prostych testów biologicznych

Metody immunohistochemiczne są przydatne w badaniach nad pszczołami miodnymi do wykrywania i oceny poziomu apoptozy i nekrozy w jelicie środkowym i gruczołach podgardłowych dorosłych pszczół.

Podstawy histologii i wykrywanie śmierci komórki w tkance pszczoły miodnej

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Poznaj metodę pomiaru aktywności fosfolipazy C w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej. Technika ta umożliwia badanie związku między aktywnością enzymu a zachowaniem w neurobiologii.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Przeglądaj więcej filmów