Name: Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj kinetykę wzrostu wykładniczego Saccharomyces cerevisiae w hodowli wsadowej do analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego. Ta metoda umożliwia badanie wpływu substancji na drożdże.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez granty Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant numer 293940) i Fundación TELMEX-TELCEL (grant numer 162005585), oba dla IKOM.

1. Pożywki hodowlane i przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml płynnego podłoża z 2% ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD) (dodać 1 g ekstraktu drożdżowego, 2 g peptonu kazeinowego i 2 g glukozy do 100 ml wody destylowanej). Dozować 3 ml pożywki do 15 ml sterylizowalnych probówek stożkowych. Autoklawować pożywkę przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi. 
	UWAGA: Nośnik można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4–8 °C.</li>
	<li>Zaszczepić stożkową probówkę wypełnioną 3 ml chłodnego, sterylnego 2% bulionu YPD 250 μl komórek S. cerevisiae zakonserwowanych w glicerolu w temperaturze -20 °C. Inkubować przez noc w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 °C z mieszaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Na szalce Petriego (60 x 15 mm2) wypełnionej sterylnym 2% agarem YPD (dodać 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu kazeinowego, 20 g glukozy i 20 g agaru bakteriologicznego do 1000 ml wody destylowanej) z komórkami wyhodowanymi w stożkowej probówce za pomocą sterylnej pętli. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 30 °C do momentu, gdy odizolowane kolonie zaczną rosnąć.</li>
	<li>Przygotować pre-inokulum poprzez zaszczepienie pojedynczej izolowanej kolonii do stożkowej probówki wypełnionej 10 ml chłodnego, sterylnego 2% bulionu YPD i inkubować go przez noc w temperaturze 30 °C z ciągłym mieszaniem przy 200 obr./min.</li>
</ol>
2. Pożywki hodowlane i krzywe wzrostu na mikropłytkach
<ol>
	<li>Przygotuj 10 ml 1% bulionu YPD (dodać 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,1 g glukozy do 10 ml wody destylowanej), 10 ml 2% bulionu YPD (dodać 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,2 g glukozy do 10 ml wody destylowanej) i 10 ml 10% bulionu YPD (dodać 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 1 g glukozy na 10 ml wody destylowanej). Autoklawować te pożywki wzrostowe przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi. 
	UWAGA: Pożywka hodowlana służy do kontroli wzrostu fermentacyjnego.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml 2% bulionu z ekstraktu drożdżowego, peptonu i etanolu (YPE) i 10 ml 2% bulionu z ekstraktu drożdżowego, peptonu i glicerolu (YPG). Dla 2% YPE: dodaj 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,2 ml etanolu do 10 ml wody destylowanej. Dla 2% YPG: dodaj 0,1 g ekstraktu drożdżowego, 0,2 g peptonu i 0,2 ml glicerolu do 10 ml wody destylowanej. Autoklawować te pożywki wzrostowe przez 15 minut w temperaturze 121 °C i 1,5 psi. 
	UWAGA: Glicerol i etanol są niefermentującymi źródłami węgla, które są metabolizowane wyłącznie przez oddychanie mitochondrialne. Z tego powodu są one używane jako kontrola wzrostu układu oddechowego. Na tym etapie można zmienić rodzaj i stężenie źródła węgla w pożywce hodowlanej w celu zbadania wpływu na fenotyp wzrostu przy użyciu bulionu z ekstraktem drożdżowym i peptonem (YP) (10 g ekstraktu drożdżowego i 20 g peptonu kazeinowego w 1000 ml wody destylowanej) jako bazy. Aby przetestować działanie innych składników odżywczych poza węglem, syntetyczne podłoże kompletne (SC) jest suplementowane zgodnie z celem eksperymentu. Bazą dla pożywki SC jest 1,8 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 5 g siarczanu amonu [(NH4)2SO4], 1,4 g fosforanu sodu (NaH2PO4) i 2 g mieszanki drop-out w 1 000 ml wody destylowanej. Uzupełnij pożywkę o źródło węgla i dodatkowe źródło azotu w potrzebnych stężeniach.</li>
	<li>Dodać 145 μl odpowiedniej pożywki hodowlanej do projektu eksperymentalnego do każdego dołka sterylnej mikropłytki (10 x 10-dołkowej) z pokrywką i zaszczepić je 5 μl pre-inokulum. 
	UWAGA: Jeśli celem jest badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na metabolizm energetyczny drożdży, ta substancja/związek powinna zostać dodana na tym etapie. Przydatny powinien być również każdy rodzaj mikropłytki z pokrywką.</li>
	<li>Inkubować płytkę wielodołkową w czytniku mikropłytek w temperaturze 30 °C ze stałym mieszaniem przy 200 obr./min przez 48 godzin. Mierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm co 30 lub 60 min. 
	UWAGA: Jeśli czytnik mikropłytek nie ma opcji inkubacji mikropłytki, może ona być inkubowana w wytrząsarce orbitalnej w tych samych warunkach między każdym pomiarem średnicy zewnętrznej.</li>
</ol>
3. Krzywe wzrostu w wstrząśniętych kolbach stożkowych
<ol>
	<li>Dodać 4,8 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej do kolb stożkowych o pojemności 20 ml i autoklawu. Zaszczepić każdą kolbę 200 μl kultury pre-inokulum przy OD600nm ~ 2 w chłodnym, sterylnym 2% bulionie YPD. Inkubować je w temperaturze 30 °C ze stałym mieszaniem przy 250 obr./min przez 24 h. 
	UWAGA: Jeśli okres inkubacji jest dłuższy niż 24 godziny, dodać 12 ml odpowiedniej pożywki do kolb stożkowych o pojemności 50 ml i przetworzyć autoklaw. Zaszczep je 500 μl pre-inokulum. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę kontrolę wzrostu fermentacyjnego (pożywka YP z 1%, 2% lub 10% glukozy) i kontrolę wzrostu układu oddechowego (pożywka YP z 2% glicerolem lub etanolem).</li>
	<li>Pobrać 100 μl wstrząśniętej kultury kolby stożkowej i rozcieńczyć ją w 900 μl wody destylowanej w kuwecie spektrofotometru o pojemności 1 ml i delikatnie wymieszać pipetując. Mierzyć średnicę zewnętrzną przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru co 2 godziny. Aby uzyskać rzeczywistą wartość OD, pomnóż wynik przez dziesięć.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie danych i obliczanie parametrów kinetycznych
<ol>
	<li>Utwórz nowy plik projektu w oprogramowaniu pakietu statystycznego. W sekcji "Nowa tabela i wykres" wybierz opcję "XY".
	<ol>
		<li>Wybierz opcję: "Zacznij od pustej tabeli danych" w sekcji "Przykładowe dane".</li>
		<li>Wybierz typ wykresu "Punkty i linia łącząca". Pozostaw sekcję "X" niezaznaczoną w segmencie "Podkolumny dla powtórzeń lub wartości błędów", a w sekcji "Y" wybierz opcję: "Wprowadź (10) replikuj wartości w podkolumnach obok siebie i wykreśl średnią i błąd SD". Kliknij przycisk tworzenia. 
		UWAGA: Format tabeli składa się z jednej kolumny X i kilku kolumn Y, z których każda zawiera 10 podkolumn wybranych wcześniej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W kolumnie X należy wpisać czas, w którym wykonano pomiary OD (np. 0, 30, 60, 90 min lub 0, 1, 1,5, 2 h). W kolumnach Y wpisz wartości OD uzyskane z kultur.</li>
	<li>Zidentyfikuj fazę wzrostu wykładniczego przekształcającą dane z kolumny Y w logarytmy. Kliknij przycisk "Analizuj", wybierz analizę "Przekształć", wybierz wartości Y za pomocą Y = Log(Y). Przejdź do "Galerii wyników", wybierz tabelę danych "Przekształć", kliknij przycisk "Analizuj" i wybierz analizę "Regresja liniowa". Wyklucz wartości OD, które nie są zgodne z zachowaniem liniowym. Aby wykluczyć wartości, zaznacz je w tabeli danych i wpisz "Ctrl + E". 
	UWAGA: Ważne jest, aby wykluczyć wartości, które nie są zgodne z fazą wykładniczą, ponieważ równanie wzrostu wykładniczego dobrze pasuje do fazy wykładniczej.</li>
	<li>W galerii "Tabele danych" wybierz tabelę danych "Dane 1". Kliknij przycisk "Analizuj" i wybierz analizę "Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej)" spośród "Analiz XY".</li>
	<li>Wybierz zestawy danych do analizy i kliknij przycisk "OK". W zakładce "Dopasowanie" wybierz sekcję "Równanie wykładnicze" i wybierz "Równanie wzrostu wykładniczego" ( , gdzie X to stężenie komórki, X0 to stężenie komórki w czasie zerowym, μ to określona szybkość wzrostu, a t to czas). Użyj metody dopasowania "Dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów" i pozostaw sekcję interpolacji niezaznaczoną. Kliknij przycisk "OK". 
	UWAGA: Zakładka z wynikami dopasowania nieliniowego znajduje się w "Galerii wyników". Oprogramowanie oblicza czas podwojenia (Dt) i właściwą szybkość wzrostu (μ). Oprogramowanie pokazuje μ jako K w zakładce wyników.</li>
	<li>Otwórz nowy plik projektu i w sekcji "Nowa tabela i wykres" wybierz kolumnę. Wybierz opcję "Zacznij od pustej tabeli danych" i wybierz żądany wykres. Wybierz, aby wykreślić średnią za pomocą SD. Wybierz przycisk "Utwórz".</li>
	<li>Skopiuj wartości μ lub Dt z karty wyników dopasowania nieliniowego, która znajduje się w "Galerii wyników" i wklej je w kolumnie. Na koniec wybierz przycisk "Analizuj" i wybierz żądaną analizę w sekcji "Analizy kolumnowe", aby porównać parametry kinetyczne różnych warunków żywieniowych. 
	UWAGA: Parametry kinetyczne uzyskane z kontroli wzrostu fermentacyjnego (pożywka YP z 1%, 2% lub 10% glukozy) i kontroli wzrostu układu oddechowego (pożywka YP z 2% glicerolem lub etanolem) pomagają ustalić odpowiednio próg oddychania fermentacyjnego i mitochondrialnego. Porównanie parametrów kinetycznych z oznaczonego stanu odżywienia i substancji/związku ze wzrostem oddechowym i fermentacyjnym pomaga określić możliwy wpływ na metabolizm oddechowy lub fermentacyjny.</li>
</ol>

<ol><li>Parrella, E., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+to+study+mitochondrial+dysfunction+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease.</a> Methods. 46 (4), 256-262 (2008).</li>
<li>Rosas Lemus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycolysis-derived+hexose+phosphates+in+the+induction+of+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2018).</li>
<li>Xu, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+effect+or+reverse+Warburg+effect%3F+A+review+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism.</a> Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).</li>
<li>De Deken, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+effect%3A+a+regulatory+system+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Crabtree effect: a regulatory system in yeast.</a> Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).</li>
<li>Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+short-term+Crabtree+effect+and+its+origin%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin.</a> The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).</li>
<li>Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+and+Warburg+effects%3A+Do+metabolite-induced+regulations+participate+in+their+induction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction?</a> Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).</li>
<li>Keating, E., Martel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetabolic+Effects+of+Polyphenols+in+Breast+Cancer+Cells%3A+Focus+on+Glucose+Uptake+and+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism.</a> Frontiers in Nutrition. 5, 25(2018).</li>
<li>Pfeiffer, T., Morley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+Crabtree+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the Crabtree effect.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17(2014).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Monod, J. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.mi.03.100149.002103">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).</li>
<li>Cui, S., Xu, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022247X07002260">Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation.</a> Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).</li>
<li>Benzekry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+mathematical+models+for+description+and+prediction+of+experimental+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth.</a> Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800(2014).</li>
<li>Ramos-Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+induces+mitochondrial+dysfunction+and+decreases+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+a+glucose-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).</li>
<li>Madrigal-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy-dependent+effects+of+resveratrol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).</li>
<li>Peleg, M., Corradini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+growth+curves%3A+what+the+models+tell+us+and+what+they+cannot%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Minęło dużo czasu od czasu, gdy J. Monod10 wyraził się, że badanie wzrostu kultur bakteryjnych jest podstawową metodą mikrobiologii. Pojawienie się narzędzi molekularnych opóźnia użycie i badanie wzrostu jako techniki. Pomimo złożoności wzrostu, który obejmuje wiele powiązanych ze sobą procesów, mechanizmy leżące u jego podstaw można opisać za pomocą modeli matematycznych11. Jest to solidne podejście, które może być wykorzystane jako narzędzie uzupełniające do wyjaśnienia n...

Wzrost Saccharomyces cerevisiae posłużył jako cenne narzędzie do identyfikacji dziesiątek fizjologicznych i molekularnych mechanizmów. Wzrost mierzy się przede wszystkim trzema metodami: seryjnymi rozcieńczeniami do testów punktowych, liczeniem jednostek tworzących kolonie i krzywymi wzrostu. Techniki te mogą być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z różnymi substratami, warunkami środowiskowymi, mutantami i chemikaliami w celu zbadania określonych reakcji lub fenotypów.
Oddychanie mitochondrialne jest procesem biologicznym, w którym kinetyka wzrostu została z powodzeniem zastosowana do odkrywania nieznanych mechanizmów. W tym przypadku suplementacja pożywek wzrostowych niefermentującymi źródłami węgla, takimi jak glicerol, mleczan lub etanol (które są metabolizowane wyłącznie przez oddychanie mitochondrialne), jako jedyne źródło węgla i energii, pozwala na ocenę wzrostu układu oddechowego, co jest ważne dla wykrycia zaburzeń aktywności fosforylacji oksydacyjnej1. Z drugiej strony, skomplikowane jest wykorzystanie modeli kinetycznych wzrostu jako metody rozszyfrowywania mechanizmów stojących za fermentacją.
Badanie fermentacji i oddychania mitochondrialnego jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych stojących za niektórymi fenotypami, takimi jak efekty Crabtree i Warburga2,3. Efekt Crabtree charakteryzuje się wzrostem strumienia glikolitycznego, zahamowaniem oddychania mitochondrialnego i ustanowieniem fermentacji jako głównej ścieżki wytwarzania ATP w obecności wysokich stężeń węglowodanów fermentujących (>0,8 mM)4,5. Efekt Warburga jest metabolicznie analogiczny do efektu Crabtree, z tą różnicą, że w komórkach ssaków głównym produktem fermentacji jest mleczan6. Rzeczywiście, efekt Warburga jest wykazywany przez różne komórki rakowe, wyzwalając wychwyt i konsumpcję glukozy nawet w obecności tlenu7. W związku z tym badanie molekularnych podstaw przejścia od oddychania do fermentacji w efekcie Crabtree ma zarówno reperkusje biotechnologiczne (dla produkcji etanolu), jak i potencjalne skutki dla badań nad rakiem.
Wzrost S. cerevisiae może być odpowiednim narzędziem do badania efektów Crabtree i Warburga. Pomysł ten opiera się na fakcie, że w fazie wykładniczej drożdży centralnymi szlakami wykorzystywanymi do produkcji ATP są oddychanie mitochondrialne i fermentacja, które są niezbędne do utrzymania wzrostu. Na przykład wzrost S. cerevisiae jest ściśle związany z funkcją szlaków generujących ATP. U S. cerevisiae oddychanie mitochondrialne wytwarza około 18 cząsteczek ATP na cząsteczkę glukozy, podczas gdy fermentacja generuje tylko 2 cząsteczki ATP, stąd oczekuje się, że tempo wzrostu ma ścisłe powiązania ze szlakami metabolicznymi wytwarzającymi ATP8. W związku z tym, gdy fermentacja jest główną drogą do wytwarzania ATP, drożdże kompensują niską produkcję ATP poprzez zwiększenie szybkości wychwytu glukozy. Wręcz przeciwnie, zużycie glukozy przez komórki drożdży, które wykorzystują oddychanie mitochondrialne jako główne źródło ATP, jest niskie. Oznacza to, że ważne jest, aby drożdże wyczuły dostępność węglowodanów przed określeniem, w jaki sposób ATP zostanie wygenerowane. Dlatego dostępność glukozy odgrywa ważną rolę w przełączaniu między fermentacją a oddychaniem mitochondrialnym u S. cerevisiae. W obecności dużych ilości glukozy drożdże preferują fermentację jako centralną drogę do wytwarzania ATP. Co ciekawe, gdy drożdże fermentują, właściwe tempo wzrostu utrzymuje się na maksimum. Z drugiej strony, przy niskim poziomie glukozy, S. cerevisiae wytwarza ATP za pomocą oddychania mitochondrialnego, utrzymując niższe tempo wzrostu. W związku z tym zmiany w stężeniu glukozy i wykorzystanie innych źródeł węgla wywołują zmiany w preferencjach drożdży między wzrostem fermentacyjnym a oddechowym. Biorąc pod uwagę ten fakt za pomocą równania wzrostu wykładniczego, można uzyskać biologiczne znaczenie parametrów kinetycznych, takich jak czas podwojenia (Dt) i właściwa szybkość wzrostu (μ). Na przykład niższe wartości μ stwierdzono, gdy drożdże wykorzystują oddychanie mitochondrialne jako główny szlak. Wręcz przeciwnie, w warunkach sprzyjających fermentacji stwierdzono wyższe wartości μ. Metodologia ta może być stosowana do pomiaru prawdopodobnych mechanizmów działania wszelkich substancji chemicznych wpływających na fermentację i oddychanie mitochondrialne u S. cerevisiae.
Celem tego artykułu jest zaproponowanie metody opartej na kinetyce wzrostu do badania wpływu danej substancji/związku na oddychanie lub fermentację mitochondriów.

<table><tbody><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Thermo Scientific</td><td>4353</td><td>Do inkubacji inokulum lub stożkowych kultur kolbowych</td></tr><tr><td>Bioscreen&nbsp;</td><td>Krzywe wzrostu</td><td>C MBR</td><td>Do hodowli okresowych na mikropłytkach</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G7021</td><td>Do przygotowania bulionu YPD</td></tr><tr><td>Pepton z kazeiny, trawienie enzymatyczne</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>82303</td><td>Do przygotowania bulionu YPD</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>09182-1KG-F</td><td>Do przygotowania bulionu YPD</td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5306</td><td>Do przygotowania agaru YPD</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S8282</td><td>Do przygotowania bulionu SC</td></tr> <tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A4418</td><td>Do przygotowania bulionu SC</td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów i siarczanu amonu</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Y1251</td><td>Do przygotowania bulionu SC</td></tr><tr><td>Syntetyczne podłoże drożdżowe Drop-Out Sigma</td><td>&nbsp;</td><td>Y1501</td><td>Do przygotowania bulionu SC</td></tr><tr><td>Granulowany siarczan amonu</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-R</td><td>Do średniej suplementacji przykład</td></tr><tr><td>Resweratrol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>R5010</td><td>Dla przykładu średniej suplementacji</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td>Dla średniej suplementacji przykład</td></tr><tr><td>sacharozy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S7903</td><td>Dla średniej suplementacji</td></tr><tr><td>Przykład Absolut ethanol</td><td>Merck</td><td>107017</td><td>Dla średniej suplementacji</td></tr><tr><td>Przykład Glicerol</td><td>J.T. Baker</td><td>2136-01</td><td>Przykład średniej suplementacji</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td>GraphPad Do analizy danych</td></tr><tr><td>Mikropłytki o strukturze plastra miodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502550</td><td>Do kultur mikropłytkowych</td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae (saccharomyces cerevisiae) kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Komórki Saccharomyces cerevisiae w fazie wykładniczej podtrzymują swój wzrost, wytwarzając ATP poprzez fermentację i/lub oddychanie mitochondrialne. Stężenie węgla fermentacyjnego decyduje głównie o tym, jak komórki drożdży wytwarzają ATP; w ten sposób zmienność poziomów węglowodanów fermentujących napędza metabolizm energetyczny S. cerevisiae. W artykule opisano wysokoprzepustową metodę opartą na wykładniczym wzroście drożdży w celu oszacowania wpływu zmian stężenia i charakteru źródła węgla na metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Wzrost S. cerevisiae mierzy się na mikropłytce lub wstrząsanej kolbie stożkowej, określając gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Następnie budowana jest krzywa wzrostu poprzez wykreślenie OD w funkcji czasu, co umożliwia identyfikację i wybór fazy wykładniczej oraz jest wyposażone w równanie wzrostu wykładniczego w celu uzyskania parametrów kinetycznych. Niskie właściwe tempo wzrostu z dłuższymi czasami podwojenia na ogół reprezentują wzrost układu oddechowego. I odwrotnie, wyższe właściwe tempo wzrostu przy krótszym czasie podwojenia wskazuje na wzrost fermentacyjny. Wartości progowe czasu podwojenia i właściwej szybkości wzrostu szacuje się przy użyciu dobrze znanych warunków oddychania lub fermentacji, takich jak niefermentujące źródła węgla lub wyższe stężenia cukrów fermentujących. Jest to uzyskiwane dla każdego konkretnego szczepu. Na koniec obliczone parametry kinetyczne są porównywane z wartościami progowymi w celu ustalenia, czy drożdże wykazują wzrost fermentacyjny i/lub oddechowy. Zaletą tej metody jest jej względna prostota w zrozumieniu wpływu substancji/związku na metabolizm fermentacyjny lub oddechowy. Należy podkreślić, że wzrost jest skomplikowanym i złożonym procesem biologicznym; W związku z tym wstępne dane uzyskane za pomocą tej metody muszą zostać potwierdzone przez ilościowe określenie zużycia tlenu i akumulacji produktów ubocznych fermentacji. W ten sposób technika ta może być stosowana jako wstępne badanie przesiewowe związków/substancji, które mogą zakłócać lub wzmacniać metabolizm fermentacyjny lub oddechowy.

Krzywe wzrostu mogą być wykorzystane do wstępnego rozróżnienia fenotypów oddechowych i fermentacyjnych u drożdży S. cerevisiae. W związku z tym przeprowadzono hodowle okresowe S. cerevisiae (BY4742) z różnymi stężeniami glukozy, o których doniesiono, że indukują wzrost fermentacyjny: 1%, 2% i 10% (w/v)9. Hodowle wykazujące fenotyp fermentacyjny charakteryzują się krótką fazą adaptacyjną oraz fazą wykładniczą o wysokim tempie wzrostu (<strong class...

Tutaj prezentujemy protokół do oszacowania metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego poprzez dopasowanie wykładniczego wzrostu Saccharomyces cerevisiae do równania wzrostu wykładniczego. Obliczanie parametrów kinetycznych pozwala na badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na fermentację lub oddychanie mitochondrialne.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biotechnologii i biomedycyny, takie jak to, jakie są molekularne podstawy efektów Warburga i Crabtree. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustowe badanie wpływu niektórych substancji na metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Zacznij od zaszczepienia 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej trzy mililitry chłodnej, sterylnej 2% dekstrozy peptonowej z ekstraktem drożdżowym lub bulionu YPD, z 250 mikrolitrami komórek drożdży S.cerevisiae zakonserwowanych w glicerolu w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza.Inkubuj drożdże przez noc w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min, aby następnego ranka rozpylić je na 60-mililitrowej, wypełnionej agarem 2% YPD. Hoduj naczynie w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż zaobserwuje się izolowane kolonie.Następnie zaszczepić pojedynczą izolowaną kolonię w nowej stożkowej probówce zawierającej 10 mililitrów chłodnego, sterylnego bulionu 2% YPD do hodowli przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. W przypadku ustawienia krzywej wzrostu mikropłytki, dodać 145 mikrolitrów odpowiedniej eksperymentalnej pożywki hodowlanej do każdej studzienki sterylnej mikropłytki o wymiarach 10 na 10 dołków z pokrywką i zaszczepić każdą studzienkę pięcioma mikrolitrami kultury przez noc. Następnie inkubować płytkę wielodołkową w czytniku mikropłytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem przy 200 obr./min przez 48 godzin, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach co 30 lub 60 minut.W przypadku układu krzywej wzrostu wstrząśniętej kolby stożkowej, należy zaszczepić 20-mililitrowe kolby stożkowe zawierające 4,8 mililitra odpowiedniej sterylnej pożywki hodowlanej 200 mikrolitrami kultury pre-inokulum o gęstości optycznej 600 nanometrów wynoszącej dwa do inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 250 obr./min. Mieszanie z prędkością 250 obrotów na minutę ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia odpowiedniego wzrostu w niskich stężeniach źródeł węgla, które wywierają wpływ na wzrost układu oddechowego, ponieważ zaobserwowaliśmy zmniejszony wzrost drożdży w warunkach oddechowych przy niższych prędkościach mieszania. Aby umożliwić pomiar gęstości optycznej przy 600 nanometrach co dwie godziny przez 24 godziny, rozcieńczyć 100 mikrolitrów kultury wstrząśniętej kolby stożkowej w 900 mikrolitrach wody destylowanej w jednomililitrowej kuwecie spektrofotometru i delikatnie wymieszać pipetą.W celu przetworzenia danych, w odpowiednim oprogramowaniu pakietu statystycznego, utwórz nowy plik projektu, otwórz nowe menu tabeli i wykresu i wybierz XY. W menu przykładowych danych wybierz pozycję rozpocznij od pustej tabeli danych oraz wykresu punktów i linii łączącej. Pozostaw sekcję X niezaznaczoną w podkolumnach dla replikacji lub wartości błędów. W sekcji Y wybierz opcję, aby wprowadzić 10 replikowanych wartości w podkolumnach obok siebie i wykreślić średnią i błąd SD. Następnie kliknij przycisk Utwórz.W kolumnie Y należy wpisać czas, w którym uzyskano pomiary OD, a w kolumnie Y wartości OD uzyskane z kultur. Aby zidentyfikować fazę wzrostu wykładniczego przekształcającą dane kolumny Y w logarytmy, kliknij przycisk analizuj i wybierz analizę przekształcenia. Użyj opcji Y równa się logarytmowi Y, aby wybrać wartości Y i otworzyć galerię wyników.Wybierz tabelę danych przekształcenia, kliknij przycisk Analizuj, a następnie wybierz analizę regresji liniowej, wykluczając wartości gęstości optycznej, które nie są zgodne z trendem liniowym, wybierając wartości w tabeli i naciskając Control i E.In galerii tabel danych, zaznacz jedną tabelę danych i kliknij przycisk Analizuj. Wybierz analizę dopasowania krzywej regresji nieliniowej i zestawy danych do analizy, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie zastosuj dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do danych, pozostawiając sekcję interpolacji niezaznaczoną, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie otwórz nowy plik projektu i w menu nowej tabeli i wykresu wybierz opcję kolumny, zacznij od pustej tabeli danych i żądanego wykresu. Ustaw wykres tak, aby wykreślił średnią z odchyleniem standardowym, a następnie kliknij przycisk Utwórz.Skopiuj wartości czasu średniej lub różnicowego z tabeli wyników dopasowania nieliniowego w galerii wyników i wklej dane do kolumny. Na koniec kliknij przycisk analizuj i wybierz interesującą Cię analizę w menu analiz kolumnowych, aby porównać parametry kinetyczne różnych warunków żywieniowych. Wartości progu kinetycznego wzrostu różnią się w zależności od siły i muszą być oceniane zgodnie z warunkami, które wykorzystujemy w analizie.Kultury wykazujące fenotyp fermentacyjny mają fazę małego opóźnienia i fazę wykładniczą o wysokim tempie wzrostu. Kultury, które uzyskują energię głównie przez fosforylację oksydacyjną, wykazują dłuższą fazę opóźnienia z powolnym tempem wzrostu w fazie wykładniczej. Obliczanie właściwej szybkości wzrostu i czasu podwojenia krzywych wzrostu za pomocą równania wzrostu wykładniczego pozwala na ustawienie progów dla wartości wzrostu oddechowego i fermentacyjnego.Na przykład w tych reprezentatywnych eksperymentach wpływ różnych stężeń resweratrolu na komórki S.cerevisiae BY4742 ujawnia modyfikację stanu energetycznego komórki w odpowiedzi na różne stężenia glukozy. W tym przypadku suplementacja 10% glukozą pokazuje, że niższe stężenia amonu sprzyjają metabolizmowi fermentacyjnemu, o czym świadczy wydłużona faza wzrostu wykładniczego w tych kulturach, podczas gdy wyższe stężenie indukuje metabolizm respirofermentacyjny, o czym świadczy wydłużona faza opóźnienia i wolniejsze tempo wzrostu w fazie wykładniczej. Wreszcie, można zaobserwować znaczne różnice w wartościach czasu podwojenia fermentacji między tymi dwoma różnymi szczepami drożdży uprawianymi w tych samych warunkach, co podkreśla konieczność walidacji progu czasu podwojenia dla każdego analizowanego szczepu.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że protokół ten służy wyłącznie do odsiewania fenotypu. Specyficzny wpływ na oddychanie i fermentację musi być potwierdzony odpowiednio za pomocą testów zużycia tlenu lub akumulacji produktów ubocznych fermentacji.

saccharomyces-cerevisiae-exponential-growth-kinetics-batch-culture-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Poziom w stanie stacjonarnym określonych mRNA jest określany przez szybkość syntezy i rozpadu mRNA. Tempo degradacji mRNA w całym genomie lub tempo rozpadu określonych mRNA można zmierzyć, określając okresy półtrwania mRNA. Protokół ten koncentruje się na pomiarze szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae.

Pomiar szybkości rozpadu mRNA u Saccharomyces cerevisiae przy użyciu szczepów rpb1-1

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Oddychanie mitochondrialne w całych komórkach drożdży jest cennym wskaźnikiem bioenergetyki komórki. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia tego fenotypu mający zastosowanie do różnych gatunków drożdży.

Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Poznaj kinetykę wzrostu wykładniczego Saccharomyces cerevisiae w hodowli wsadowej do analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego. Ta metoda umożliwia badanie wpływu substancji na drożdże.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego

Przeglądaj więcej filmów