Name: Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych Salmonella i Shigella z wykorzystaniem PCR w czasie rzeczywistym i prowadzonej hodowli. Ta metoda zapewnia wysoką specyficzność i czułość w wykrywaniu patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Naukowo-Technologiczny w Zhuhai, Chiny (numer grantu 20171009E030064), Program Naukowo-Technologiczny Guangdong, Chiny (numer grantu 2015A020211004) oraz Program Naukowo-Technologiczny Generalnego Zarządzania Nadzorem, Inspekcją i Kwarantanną Chińskiej Republiki Ludowej (numer grantu 2016IK302, 2017IK224).

Protokół jest zgodny z wytycznymi ustalonymi przez komisję etyki badań klinicznych w Zhuhai International Travel Healthcare Center. Podczas eksperymentu należy stosować standardową sterylną operację.
1. Skład i przygotowanie podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>Przygotuj bulion odżywczy: Rozpuść 1% peptonu, 0,3% ekstraktu wołowego, 0,5% chlorku sodu, 0,1% glukozy wH2O, dostosuj pH do 7,5 i autoklawuj w 121 °C przez 15 min.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę selenitowo-cystynową: Rozpuść 0,5% peptonu, 0,4% laktozy, 1%Na2HCO3, 0,4% wodoroseleninu sodu, 0,001% L-cystyny w H2O, dostosuj pH do 7,0 i gotuj przez 5 min.</li>
	<li>Przygotuj płytkę z agarem ksylozy, lizyny, deoksycholanu (XLD): Rozpuść 0,3% ekstraktu drożdżowego, 0,5% L-lizyny, 0,375% ksylozy, 0,75% laktozy, 0,75% sacharozy, 0,5% chlorku sodu, 0,008% czerwieni fenolowej, 0,68% tiosiarczanu sodu, 0,08% cytrynianu żelaza amonu, 0,25% deoksycholanu sodu, 1,5% agaru w H2Oi dostosuj pH do 7,4. Następnie gotuj przez 5 minut i wlej do talerzy o średnicy 90 mm.</li>
	<li>Przygotuj chromogenną płytkę agarową Salmonella: Rozpuść 1,5% agaru, 0,7% peptonu i ekstraktu drożdżowego, 1,29% odczynnika selektywnego wH2O. Następnie gotuj przez 5 minut i wlej do talerzy o średnicy 90 mm.</li>
	<li>Przygotuj płytkę agarową z pożywką: Rozpuść 1% peptonu, 0,3% ekstraktu wołowego, 0,5% chlorku sodu, 1,5% agaru w H2Oi dostosuj pH do 7,3. Następnie sterylizuj go w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut i rozlej do płytek o średnicy 90 mm.</li>
	<li>Przygotuj płytkę z agarem MacConkey (MAC): rozpuść 2% peptonu, 1% laktozy, 0,5% chlorku sodu, 0,5% soli żółciowej OX, 0,0025% neutralnej czerwieni, 1,5% agaru, 0,0001% fioletu krystalicznego w H2O i dostosuj pH do 7,2. Następnie sterylizuj go w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut i przelewaj do płytek o średnicy 90 mm.</li>
</ol>
2. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Włóż wacik z odbytu do odbytu pacjenta na głębokość 3-5 cm i obróć go o 360°.</li>
		<li>Umieść wacik z odbytu w sterylnej probówce do pobierania opłat. Zaznacz identyfikator próbki.</li>
		<li>Wyślij próbkę do laboratorium tak szybko, jak to możliwe. 
		UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogacanie wstępne
	<ol>
		<li>Dodaj 3 ml bulionu odżywczego do każdej próbki w probówce.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 36 °C przez 6 godzin w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanie próbek (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Zebrać 100 μl każdej kultury wstępnie wzbogacającej i wymieszać 8-10 próbek z 1 próbki w probówce o pojemności 1,5 ml, jeśli jest więcej niż 10 próbek.</li>
		<li>Oznacz prawidłowo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA
	<ol>
		<li>Odwirować kulturę wstępnego wzbogacania przy 800 x g przez 2 minuty, aby umożliwić duże cząstki ustabilizowanie się, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant przez aspirację.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu do ekstrakcji DNA (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) do osadu. Wirować energicznie przez 1 min.</li>
		<li>Gotować w temperaturze 100 °C przez 5 minut w suchej kąpieli.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 5 min. Zebrać supernatant za pomocą nowej probówki, która posłuży jako matryca do kolejnej analizy PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR w czasie rzeczywistym
	<ol>
		<li>Ustawić mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: dla każdej próbki dodać 12,5 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, 0,4 μM każdego startera, 0,2 μM każdej sondy (sekwencje w tabeli 1)27, 5 μL matrycy, jak przygotowano w kroku 2.4.4, i użyć ddH2O, aby dodać do 25 μL całkowitej objętości.</li>
		<li>Ustaw program cykliczny w następujący sposób: 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 34 s. Zbieraj sygnały fluorescencyjne z kanałów 6-karboksy-fluoresceiny (FAM) i heksachlorofluoresceiny (HEX) na etapie wydłużania (72 °C) automatycznie za pomocą fluorescencyjnego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym na fluorescencyjnym urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z instrukcjami urządzenia.</li>
		<li>Przejdź bezpośrednio do kroku 4 i wystawiaj negatywne raporty, jeśli na kanałach FAM/HEX wystąpią negatywne wyniki, co oznacza, że próbki są ujemne na obecność Salmonella spp./Shigella spp.</li>
		<li>Przejść do kroku 3.1 i/lub 3.2, jeśli wyniki dodatnie występują w kanałach HEX i/lub FAM, co oznacza, że próbka może być dodatnia odpowiednio na obecność Salmonella spp. i/lub Shigella spp. 
		UWAGA: Jeśli w kroku 2.3 przeprowadzono mieszanie próbki, należy przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym na poszczególnych próbkach, które składały się na próbkę dodatnią, aby odsiać prawdziwą próbkę dodatnią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kultura prowadzona
<ol>
	<li>Salmonella spp. Próbka dodatnia w PCR
	<ol>
		<li>Selektywna hodowla w pożywce
		<ol>
			<li>Dodaj 100 μl kultury wstępnie wzbogacającej do 5 ml pożywki selenitowo-cystynowej w probówce. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18–24 godziny w inkubatorze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oddzielanie kultur na talerzu
		<ol>
			<li>Zebrać jedną pętlę kultury za pomocą mikropętli i rozprowadzić na płytce XLD lub chromogennej płytce agarowej Salmonella. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18-24 godziny w inkubatorze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Identyfikacja biochemiczna
		<ol>
			<li>Wybierz podejrzaną kolonię na płytce XLD (różowa kolonia z/bez ciemnego serca; ciemna kolonia; żółta kolonia z/bez ciemnego serca) lub chromogenną płytkę agarową Salmonella (fioletowa lub prunosus kolonia, gładka i okrągła) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
			<li>Poddaj podejrzaną kolonię w celu identyfikacji biochemicznej w automatycznym systemie identyfikacji mikrobiologicznej, zgodnie z instrukcjami urządzenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Charakterystyka serologiczna
		<ol>
			<li>Charakterystyka antygenu O
			<ol>
				<li>Dodać jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu O na czysty szkiełku.</li>
				<li>Zbierz jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i zmiel w sera.</li>
				<li>Przejdź do kroku 3.1.4.1.4, jeśli wygląda jak płynący piasek, co oznacza, że kolonia reaguje na surowice (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). W przeciwnym razie przejdź do kroku 3.1.4.1.5.</li>
				<li>Użyć surowic monowalentnych antygenu O, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.1.1 do 3.1.4.1.3, aż do scharakteryzowania swoistego antygenu O.</li>
				<li>Użyć surowicy więzowej, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.1.1 do 3.1.4.1.3. Zebrać te kolonie reaktywne visurowica do probówki i gotować w temperaturze 100 °C przez 5 minut w suchej kąpieli. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min. Zebrać osad i powtarzać kroki od 3.1.4.1.1 do 3.1.4.1.4 aż do scharakteryzowania specyficznego antygenu O.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Charakterystyka antygenu H
			<ol>
				<li>Dodać jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu H na czyste szkiełko.</li>
				<li>Zbierz jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i zmiel w sera.</li>
				<li>Przejdź do kroku 3.1.4.2.4, jeśli wygląda jak płynący piasek, co oznacza, że kolonia reaguje na surowice.</li>
				<li>Użyj surowic monowalentnych antygenu H, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.2.1 do 3.1.4.2.3, aż do scharakteryzowania swoistego antygenu H. 
				UWAGA: Czasami może być konieczna indukcja surowicy w celu scharakteryzowania antygenu drugiej fazy H. Jeśli tak, należy wykonać następujące opcjonalne kroki.</li>
				<li>(Opcjonalnie) Dodaj jedną kroplę specyficznej surowicy antygenu H na płytkę agarową z pożywką. Poczekaj, aż wszystkie surowice zostaną wchłonięte.</li>
				<li>(Opcjonalnie) Zebrać jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i rozprowadzić na płytce, na której wchłaniane są specyficzne surowice antygenu H. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18-24 godziny w inkubatorze.</li>
				<li>(Opcjonalnie) Użyć surowic monowalentnych antygenu H, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.2.1 do 3.1.4.2.3, aż do scharakteryzowania antygenu drugiej fazy H.</li>
				<li>Przejdź do kroku 4.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Shigella spp. Próbka dodatnia do PCR
	<ol>
		<li>Oddzielanie kultur na talerzu
		<ol>
			<li>Zebrać jedną pętlę kultury wstępnego wzbogacania za pomocą mikropętli i rozprowadzić na płytce XLD lub płytce MAC. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18–24 godziny w inkubatorze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Identyfikacja biochemiczna
		<ol>
			<li>Zbierz podejrzaną kolonię na płytce XLD (gładka, okrągła, przezroczysta i czerwona kolonia) lub MAC (gładka, okrągła, przezroczysta i bezbarwna kolonia o średnicy 2-3 mm; Shigella sonnei może być większa i zmieniać kolor na jasnoróżowy wraz z wydłużeniem czasu inkubacji) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
			<li>Poddaj podejrzaną kolonię w celu identyfikacji biochemicznej w automatycznym systemie identyfikacji mikrobiologicznej, zgodnie z instrukcjami urządzenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Charakterystyka serologiczna
		<ol>
			<li>Dodać jedną kroplę surowicy wielowartościowej Shigella spp. na czyste szkiełko.</li>
			<li>Zbierz jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i zmiel w sera.</li>
			<li>Przejdź do kroku 3.2.3.4, jeśli wygląda jak płynący piasek, co oznacza, że kolonia reaguje na surowicę.</li>
			<li>Użyć surowic monowalentnych Shigella spp., aby powtarzać kroki od 3.2.3.1 do 3.2.3.3 aż do scharakteryzowania specyficznych surowic Shigella spp.</li>
			<li>Przejdź do kroku 4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Raport
<ol>
	<li>Wystawiaj pozytywne lub negatywne raporty zgodnie z powyższymi wynikami.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+acute+gastrointestinal+illness+in+developed+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries.</a> Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).</li>
<li>Wilking, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+gastrointestinal+illness+in+adults+in+Germany%3A+a+population-based+telephone+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey.</a> Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).</li>
<li>Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costs+of+gastroenteritis+in+the+Netherlands%2C+with+special+attention+for+severe+cases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).</li>
<li>Henson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+costs+of+acute+gastrointestinal+illness+in+British+Columbia%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada.</a> International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).</li>
<li>Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-diarrhea+chronic+intestinal+symptoms+and+irritable+bowel+syndrome+in+North+American+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico.</a> The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).</li>
<li>Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+19+diarrhea-related+pathogens+with+a+quantitative+real-time+PCR+panel+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay.</a> Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).</li>
<li>Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening+algorithm+for+diagnosing+bacterial+gastroenteritis+by+real-time+PCR+in+combination+with+guided+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+molecular+diagnostic+methods+to+identify+causes+of+diarrhoea+in+children%3A+a+reanalysis+of+the+GEMS+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study.</a> Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).</li>
<li>Wang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+shigellosis+by+real-time+PCR+suggests+underestimation+of+shigellosis+prevalence+by+culture-based+methods+in+a+population+of+rural+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China.</a> Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).</li>
<li>Wikswo, M. E., Hall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+acute+gastroenteritis+transmitted+by+person-to-person+contact--United+States%2C+2009-2010%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveillance+Summaries%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010.</a> MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+12+Gastrointestinal+Pathogens+Spectrum+of+Acute+Infectious+Diarrhea+in+a+Sentinel+Hospital%2C+Shenzhen%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1926(2016).</li>
<li>Tariq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+antimicrobial+resistance+and+integron+association+of+multidrug-resistant+clinical+isolates+of+Shigella+species+from+Faisalabad%2C+Pakistan%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).</li>
<li>Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+Genotypic+Eligible+Methods+for+Salmonella+Typhimurium+Source+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2587(2017).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+but+nonculturable+state+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The viable but nonculturable state in bacteria.</a> The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).</li>
<li>Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+multiplex+real-time+PCR+kit+Amplidiag%28R%29+Bacterial+GE+in+the+detection+of+bacterial+pathogens+from+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).</li>
<li>Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Multiplex+Real-Time+PCR+Assay+for+Detecting+Major+Bacterial+Enteric+Pathogens+in+Fecal+Specimens%3A+Intestinal+Inflammation+and+Bacterial+Load+Are+Correlated+in+Campylobacter+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).</li>
<li>Van Lint, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+real-time+multiplex+PCR+for+the+simultaneous+detection+of+Campylobacter+jejuni%2C+Salmonella+spp.%2C+Shigella+spp.%2FEIEC%2C+and+Yersinia+enterocolitica+in+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Journal+of+Clinical+Microbiology+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples.</a> Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).</li>
<li>Kamkamidze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+Of+The+Etiological+Factors+Causing+Diarrheal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Georgian+Medical+News%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases.</a> Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Application+of+a+Visual+DNA+Microarray+for+the+Detection+of+Food-borne+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens.</a> Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+spp.+by+a+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+method+targeting+bcfD+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene.</a> Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).</li>
<li>Shi, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+simultaneous+detection+of+Salmonella+and+Shigella+using+modified+molecular+beacons+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Liu+Xing+Bing+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR.</a> Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).</li>
<li>Mo, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+96-microwell+plate+DNA+diagnostic+chip+for+detection+of+foodborne+bacteria+and+its+application+in+an+incident+of+food+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).</li>
<li>Wang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-free+and+sensitive+detection+of+diarrhea-causing+pathogens+using+RT-PCR+combined+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis.</a> Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+simultaneous+screening+of+seven+clinically+important+enteric+pathogens+using+a+magnetic+bead+based+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+for+rapid+detection+of+five+important+pathogenic+vibrios%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+health+laboratory+technology%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios.</a> Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).</li>
<li>Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-+and+molecular-based+detection+of+swine-adapted+Salmonella+shed+by+avian+scavengers%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers.</a> Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).</li>
<li>Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verification+and+large+scale+clinical+evaluation+of+a+national+standard+protocol+for+Salmonella.spp.%2FShigella.spp.+screening+using+real-time+PCR+combined+with+guided+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).</li>
<li>Dekker, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinking+water+from+dug+wells+in+rural+ghana--salmonella+contamination%2C+environmental+factors%2C+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).</li>
<li>Gargano, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+from+selected+diseases+that+can+be+transmitted+by+water+-+United+States%2C+2003-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009.</a> Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).</li>
<li>Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+assays+for+the+detection+of+Salmonella+in+seafood%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood.</a> Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).</li>
<li>Herrera-Leon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+comparison+of+traditional+serotyping+with+three+multiplex+PCRs+for+the+identification+of+Salmonella+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes.</a> Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).</li>
<li>Cunningham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-hour+molecular+detection+of+Campylobacter%2C+Salmonella%2C+Yersinia%2C+and+Shigella+species+in+feces+with+accuracy+as+high+as+that+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).</li>
<li>Eriksson, E., Aspan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+techniques+for+salmonella+detection+in+faecal+samples+for+cattle%2C+pig+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry.</a> BMC Veterinary Research. 3, 21(2007).</li>
<li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+performance+characteristics+of+a+direct+PCR+with+stool+samples+in+comparison+to+conventional+techniques+for+diagnosis+of+Shigella+and+enteroinvasive+Escherichia+coli+infection+in+children+with+acute+diarrhoea+in+Calcutta%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ Salmonella spp./Shigella spp. są często związane z zatruciem pokarmowym i przenoszeniem fekalno-oralnym ostrego zapalenia żołądkai jelit 28,29, a rutynowa metoda jest albo pracochłonna, albo czasochłonna7, opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp., wykorzystującą PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.
<p class="...

Biegunka jest nadal powszechnym problemem zdrowotnym o wysokim wskaźniku występowania na całym świecie1,2. Chociaż śmiertelność jest stosunkowo niska, niektórzy pacjenci wykazują różne objawy przez tygodnie (takie jak luźne i wodniste stolce, pilna potrzeba pójścia do łazienki), co sprawia, że wpływ społeczno-ekonomiczny jest bardzo wysoki3,4. Co gorsza, u niektórych pacjentów może nawet rozwinąć się zespół jelita drażliwego, jeśli nie jest leczony5. Istnieją różne rodzaje bakterii, wirusów i pasożytów, które mogą powodować biegunkę6. Salmonella spp./Shigella spp. są jednymi z najczęstszych bakterii przenoszących ostre zapalenie żołądka i jelit7,8,9,10,11. W związku z tym wiele hrabstw wydało przepisy ustawowe lub wykonawcze dotyczące regularnych badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. wśród osób, które miałyby do czynienia z żywnością i wodą. Na przykład rząd chiński wydał przepisy dotyczące obowiązkowych badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. raz w roku.
Złotym standardem w wykrywaniu Salmonella spp./Shigella spp. jest hodowla bakterii. Poprzez hodowlę bakterii oraz późniejszą identyfikację biochemiczną i charakterystykę serologiczną możemy zidentyfikować gatunki bakterii, co może ułatwić zarządzanie ogniskami choroby i profilowanie przeciwdrobnoustrojowe, aby wspomóc leczenie pacjentów12. Może to również pomóc w ustaleniu źródła infekcji podczas epidemii Salmonella spp./Shigella spp. 13. Metoda ta jest jednak pracochłonna (wymaga ręcznej obsługi) i czasochłonna (zajmuje kilka dni), szczególnie w przypadku testowania dużej liczby próbek7. Co więcej, żywotne, ale niehodowlane (VBNC) Salmonella spp./Shigella spp. mogą występować w niektórych próbkach kału14. Ze względu na te wady, wiele laboratoriów próbowało opracować nowe techniki wykrywania Salmonella spp./Shigella spp.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Wszystkie te metody wykorzystują test amplifikacji kwasu jądrowego (NAAT), wśród których najczęściej występuje reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Jednym z głównych ograniczeń tych metod opartych na NAAT jest to, że martwe bakterie, nawet szczątki bakteryjne zawierające niekompletne genomowe DNA, mogą wykazywać pozytywne wyniki26, co może w znacznym stopniu wpłynąć na dokładną diagnozę choroby. Blanco i wsp. wykazali, że test molekularny jest bardzo wrażliwy, nie tylko na żywotną Salmonellę w hodowlach, ale także na częściowe genomy i martwe lub niezdolne do życia bakterie z przeszłych infekcji lub zanieczyszczeń26. Dlatego należy opracować nową technologię.
Tutaj opisaliśmy nowatorską metodę, która łączy metodę opartą na NAAT i hodowlę. Jak pokazano na Rysunek 1, ta nowa metoda najpierw stosuje badania przesiewowe PCR w czasie rzeczywistym, a następnie pozytywne próbki są wysyłane do hodowli i identyfikacji bakterii.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma 798681</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sigma</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Takara</td><td>9012</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara</td><td>R040Q</td><td></td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td>LandBridge</td><td>CM106</td><td></td></tr><tr><td>Odżywka agarowa</td><td>LandBridge</td><td>CM107</td><td></td></tr><tr><td>Selenit Cystyna podłoże</td><td>LandBridge</td><td>CM225</td><td></td></tr><tr><td>XLD</td><td>LandBridge</td><td>CM219</td><td></td></tr><tr><td>MAC&nbsp;</td><td>LandBridge</td><td>CM908</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella chromogenny agar</td><td>CHROMagar</td><td>SA130</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella surowica diagnostyczna</td><td>Tianrun</td><td>SAL60</td><td></td></tr><tr><td>Shigella</td> wymaz z odbytu <td>Tianrun</td><td>SHI54</td><td></td></tr><tr><td>(probówka zbiorcza plus)</td><td>Huachenyang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>slajd</td><td>Mingsheng</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>mikropętla</td> inkubator <td>Weierkang</td><td>W511</td><td></td></tr><tr><td></td><td>autoklaw Jinghong</td><td>DNP-9082</td><td></td></tr><tr><td>sucha</td> kąpiel <td>AUL</td><td>SS-325</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jinghong</td><td>KB-20</td><td></td></tr><tr><td>zautomatyzowany system identyfikacji mikrobiologicznej</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>VITEK2</td><td>można zastosować inny równoważny system</td></tr><tr><td>, fluorescencyjną maszynę do PCR w czasie rzeczywistym</td>, <td>ThermoFisher</td><td>ABI7500</td><td>inną równoważną maszynę</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku salmonella spp./shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Od czasu do czasu dochodzi do oralnej transmisji fekalno-oralnej, zwłaszcza gdy osoby, które miały do czynienia z jedzeniem i wodą, są zarażone Salmonellą spp./Shigella spp. Złotym standardem w wykrywaniu Salmonella spp./Shigella spp. jest posiew bezpośredni, ale jest to pracochłonne i czasochłonne. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych na obecność Salmonella spp./Shigella spp., wykorzystującą reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną. Istnieją dwa główne etapy: PCR w czasie rzeczywistym i hodowla z przewodnikiem. W przypadku pierwszego etapu (PCR w czasie rzeczywistym) wyjaśniamy każdy etap metody: pobieranie próbki, wstępne wzbogacanie, ekstrakcję DNA i PCR w czasie rzeczywistym. Jeśli wynik PCR w czasie rzeczywistym jest pozytywny, przeprowadza się drugi etap (hodowlę kierowaną): hodowlę selektywną, identyfikację biochemiczną i charakterystykę serologiczną. Ilustrujemy również reprezentatywne wyniki uzyskane na jego podstawie. Opisany tutaj protokół byłby cenną platformą dla szybkich, specyficznych, czułych i wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Protokół został zastosowany do badania przesiewowego w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. w próbkach kału pobranych z odbytu osób mających kontakt z żywnością i wodą.
W etapie real-time PCR, jak pokazano na rysunku 5A, nastąpiła skuteczna amplifikacja w kanale HEX, co oznaczało, że próbka mieszana była dodatnia w kierunku Salmonella spp. Następnie prze...

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Metoda ta zapewnia wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonelli i Shigelli. Główną zaletą tej techniki jest powtarzalność, specyficzność, czułość i wysoka przepustowość. Technika ta łączyła szybką metodę NAAT i hodowlę, w której najpierw zastosowano badania przesiewowe PCR w czasie rzeczywistym, a następnie dodatnie wyniki wysłano do hodowli i identyfikacji bakterii.Chociaż metoda ta koncentruje się na badaniach przesiewowych Salmonelli i Shigelli, można ją również zastosować do innych patogenów, takich jak Vibrios, Staphylococcus, E.Coli i tak dalej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wybór właściwej kolonii jest trudny ze względu na florę tła w próbkach. Na początek dodaj trzy mililitry bulionu odżywczego do każdej próbki.Następnie inkubuj próbki w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Następnie odwirować kulturę wstępnego wzbogacania w temperaturze 800 g przez dwie minuty. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie odwirować go przez pięć minut w temperaturze 12 000 g.Po odrzuceniu supernatantu dodać do osadu 100 mikrolitrów roztworu do ekstrakcji DNA. Następnie wiruj rurkę przez minutę. Następnie podgrzej próbkę w temperaturze 1 000 stopni Celsjusza w suchej kąpieli.Po powtórzeniu wirowania zebrać supernatant do nowej probówki. Najpierw utwórz mieszaninę reakcyjną i ustaw program cykliczny zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie wykonaj PCR w czasie rzeczywistym na fluorescencyjnej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.Najpierw dodaj 100 mikrolitrów kultury wstępnego wzbogacania do pięciu mililitrów pożywki krystalicznej selenitu. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Następnie zbierz jedną pętlę kultury i rozprowadź ją na talerzu.Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Po inkubacji wybierz podejrzane kolonie i przenieś je na płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.Następnie zidentyfikuj podejrzaną kolonię za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikrobiologicznej. Aby rozpocząć charakterystykę antygenu O, dodaj jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu O do czystego szkiełka. Przenieś jedną pętlę kolonii na szkiełko i zmiel ją w sera.Jeśli bakterie wyglądają jak płynący piasek, powtórz poprzedni zabieg surowicami monowalentnymi antygenu O, aż do scharakteryzowania antygenu. Aby rozpocząć charakterystykę antygenu H, dodaj jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu H do czystego szkiełka. Następnie zbierz jedną pętlę kolonii i uformuj ją w sera.Stosować surowice monowalentne antygenu H w celu powtarzania leczenia aż do scharakteryzowania specyficznego antygenu H. Aby oddzielić kulturę, zbierz jedną pętlę kultury przed wzbogaceniem i rozprowadź ją na talerzu. Następnie inkubuj miejsce w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.Po inkubacji zbierz podejrzanie wyglądającą kolonię na talerzu. Inkubować płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 17 do 24 godzin. Następnie poddaj kolonię identyfikacji biochemicznej za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikrobiologicznej.Następnie nałóż jedną kroplę surowicy wielowartościowej Shigella na czyste szkiełko. Następnie użyj mikropętli, aby zebrać część bakterii i zmielić je na surowicę. Wreszcie, jeśli surowice przypominają płynący piasek, użyj surowic monowalentnych gatunku Shigella, aby dokładniej scharakteryzować bakterie.Korzystając z tego protokołu, próbki kału od pacjentów zostały przebadane pod kątem gatunków Salmonella i Shigella. Korzystając z PCR w czasie rzeczywistym, nastąpiła udana amplifikacja w kanale HEX, co wskazuje, że próbka była pozytywna na obecność gatunku Salmonella. Dalsze badania PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że druga próbka była dodatnia na obecność Salmonelli i została wybrana do kontrolowanej hodowli gatunków Salmonelli.W hodowli kierowanej gatunków Salmonelli różowe i fioletowe kolonie zostały posiane oddzielnie i poddane identyfikacji biochemicznej. Wyniki wskazały, że kolonie z próbki drugiej to Salmonella paratyphi B. Korzystając z PCR w czasie rzeczywistym, nastąpiła udana amplifikacja w kanale FAM, co wskazuje, że próbka była dodatnia dla gatunku Shigella. Dalsze badania PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że próbka 10 była dodatnia na obecność Shigella i została wybrana do hodowli sterowanej.W hodowli kierowanej gatunków Shigella różowo-czerwone i bezbarwne kolonie posiewano oddzielnie i poddawano identyfikacji biochemicznej. Wyniki wykazały, że próbka 10 zawierała bakterie Shigella sonnei fazy II. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ograniczeniu metody ze względu na zmienność sekwencji.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak hodowla bezpośrednia, w celu uniknięcia fałszywie ujemnych wyników PCR w czasie rzeczywistym. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się wykrywaniem Salmonelli i Shigelli, ponieważ nowy protokół może dwukrotnie zwiększyć odsetek pozytywnych wyników oraz znacznie zmniejszyć obciążenie pracą i TAT. Nie zapominaj, że praca z Salmonellą i Shigellą może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zabrać ze sobą środki ochrony osobistej, środki ochrony osobistej.

a-high-throughput-platform-for-screening-salmonella-sppshigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Źródło: Yang, Z. i inni. Platforma o wysokiej przepustowości do badania Salmonella spp./Shigella spp. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje selektywne wzbogacanie i identyfikację Salmonelli przy użyciu ksylozy deoksycholatu (XLD) oraz chromogenicznego agaru. Bulion seleninowy wspiera wzrost Salmonelli , natomiast agar XLD odsłania kolonie o centrum czarnego poprzez produkcję siarkowodoru. Chromogeniczny agar potwierdza tożsamość poprzez tworzenie pigmentów podporządkowanych enzymami,...

Selektywne wzbogacanie i identyfikacja Salmonella spp. z użyciem ksylozy, deoksycholatu lizyny i chromogenicznego agaru

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru aktywności Shigellacidal przeciwciał w surowicy. Surowicę miesza się z bakteriami i egzogennym dopełniaczem, inkubuje, a mieszaninę reakcyjną posiewa się na płytkach agarowych. Żywe bakterie tworzą kolonie, które są zliczane za pomocą automatycznego enumeratora kolonii i wykorzystywane do określenia miana bakteriobójczego.

Wysokoprzepustowy test bakteriobójczy specyficzny dla Shigella

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP) to test izotermicznej amplifikacji kwasów nukleinowych (iNAAT), który wzbudził szerokie zainteresowanie w dziedzinie wykrywania patogenów. W tym miejscu przedstawiamy zatwierdzony przez wiele laboratoriów protokół Salmonella LAMP jako szybką, niezawodną i solidną metodę badań przesiewowych Salmonelli w żywności zwierzęcej i potwierdzania przypuszczalnej obecności Salmonelli w izolacji hodowli.

Amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli do badań przesiewowych Salmonelli w karmie zwierzęcej i potwierdzania salmonelli z izolacji hodowli

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych Salmonella i Shigella z wykorzystaniem PCR w czasie rzeczywistym i prowadzonej hodowli. Ta metoda zapewnia wysoką specyficzność i czułość w wykrywaniu patogenów.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Przeglądaj więcej filmów