Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.
7 listopada 2018
Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.
Metoda ta zapewnia wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonelli i Shigelli. Główną zaletą tej techniki jest powtarzalność, specyficzność, czułość i wysoka przepustowość. Technika ta łączyła szybką metodę NAAT i hodowlę, w której najpierw zastosowano badania przesiewowe PCR w czasie rzeczywistym, a następnie dodatnie wyniki wysłano do hodowli i identyfikacji bakterii.
Chociaż metoda ta koncentruje się na badaniach przesiewowych Salmonelli i Shigelli, można ją również zastosować do innych patogenów, takich jak Vibrios, Staphylococcus, E.Coli i tak dalej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wybór właściwej kolonii jest trudny ze względu na florę tła w próbkach. Na początek dodaj trzy mililitry bulionu odżywczego do każdej próbki.
Następnie inkubuj próbki w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Następnie odwirować kulturę wstępnego wzbogacania w temperaturze 800 g przez dwie minuty. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie odwirować go przez pięć minut w temperaturze 12 000 g.
Po odrzuceniu supernatantu dodać do osadu 100 mikrolitrów roztworu do ekstrakcji DNA. Następnie wiruj rurkę przez minutę. Następnie podgrzej próbkę w temperaturze 1 000 stopni Celsjusza w suchej kąpieli.
Po powtórzeniu wirowania zebrać supernatant do nowej probówki. Najpierw utwórz mieszaninę reakcyjną i ustaw program cykliczny zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie wykonaj PCR w czasie rzeczywistym na fluorescencyjnej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.
Najpierw dodaj 100 mikrolitrów kultury wstępnego wzbogacania do pięciu mililitrów pożywki krystalicznej selenitu. Następnie inkubuj kulturę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Następnie zbierz jedną pętlę kultury i rozprowadź ją na talerzu.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Po inkubacji wybierz podejrzane kolonie i przenieś je na płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.
Następnie zidentyfikuj podejrzaną kolonię za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikrobiologicznej. Aby rozpocząć charakterystykę antygenu O, dodaj jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu O do czystego szkiełka. Przenieś jedną pętlę kolonii na szkiełko i zmiel ją w sera.
Jeśli bakterie wyglądają jak płynący piasek, powtórz poprzedni zabieg surowicami monowalentnymi antygenu O, aż do scharakteryzowania antygenu. Aby rozpocząć charakterystykę antygenu H, dodaj jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu H do czystego szkiełka. Następnie zbierz jedną pętlę kolonii i uformuj ją w sera.
Stosować surowice monowalentne antygenu H w celu powtarzania leczenia aż do scharakteryzowania specyficznego antygenu H. Aby oddzielić kulturę, zbierz jedną pętlę kultury przed wzbogaceniem i rozprowadź ją na talerzu. Następnie inkubuj miejsce w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin.
Po inkubacji zbierz podejrzanie wyglądającą kolonię na talerzu. Inkubować płytkę w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 17 do 24 godzin. Następnie poddaj kolonię identyfikacji biochemicznej za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikrobiologicznej.
Następnie nałóż jedną kroplę surowicy wielowartościowej Shigella na czyste szkiełko. Następnie użyj mikropętli, aby zebrać część bakterii i zmielić je na surowicę. Wreszcie, jeśli surowice przypominają płynący piasek, użyj surowic monowalentnych gatunku Shigella, aby dokładniej scharakteryzować bakterie.
Korzystając z tego protokołu, próbki kału od pacjentów zostały przebadane pod kątem gatunków Salmonella i Shigella. Korzystając z PCR w czasie rzeczywistym, nastąpiła udana amplifikacja w kanale HEX, co wskazuje, że próbka była pozytywna na obecność gatunku Salmonella. Dalsze badania PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że druga próbka była dodatnia na obecność Salmonelli i została wybrana do kontrolowanej hodowli gatunków Salmonelli.
W hodowli kierowanej gatunków Salmonelli różowe i fioletowe kolonie zostały posiane oddzielnie i poddane identyfikacji biochemicznej. Wyniki wskazały, że kolonie z próbki drugiej to Salmonella paratyphi B. Korzystając z PCR w czasie rzeczywistym, nastąpiła udana amplifikacja w kanale FAM, co wskazuje, że próbka była dodatnia dla gatunku Shigella. Dalsze badania PCR w czasie rzeczywistym wykazały, że próbka 10 była dodatnia na obecność Shigella i została wybrana do hodowli sterowanej.
W hodowli kierowanej gatunków Shigella różowo-czerwone i bezbarwne kolonie posiewano oddzielnie i poddawano identyfikacji biochemicznej. Wyniki wykazały, że próbka 10 zawierała bakterie Shigella sonnei fazy II. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ograniczeniu metody ze względu na zmienność sekwencji.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak hodowla bezpośrednia, w celu uniknięcia fałszywie ujemnych wyników PCR w czasie rzeczywistym. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się wykrywaniem Salmonelli i Shigelli, ponieważ nowy protokół może dwukrotnie zwiększyć odsetek pozytywnych wyników oraz znacznie zmniejszyć obciążenie pracą i TAT. Nie zapominaj, że praca z Salmonellą i Shigellą może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zabrać ze sobą środki ochrony osobistej, środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia platformę wysokoprzepustową do przesiewowego wykrywania Salmonella spp. i Shigella spp. z wykorzystaniem techniki real-time PCR w połączeniu z hodowlą ukierunkowaną. Metoda ta kładzie nacisk na swoistość, czułość oraz efektywność w wykrywaniu patogenów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Wykrywanie patogenów
- Przesiewy wysokoprzepustowe
Wstęp
- Salmonella i Shigella są istotnymi przyczynami biegunki.
- Dokładne i szybkie metody detekcji mają kluczowe znaczenie dla zdrowia publicznego.
- Tradycyjne metody mogą być powolne i mniej specyficzne.
- Niniejsze badanie wprowadza nowatorskie podejście łączące techniki NAAT i hodowle mikrobiologiczne.
Cel badania
- Opracowanie metody wysokoprzepustowego przesiewu dla bakterii z rodzajów Salmonella i Shigella.
- Zwiększenie swoistości i czułości wykrywania patogenów.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji metody w celu lepszego wyboru kolonii.
Zastosowane metody
- Przesiewowe badanie próbek za pomocą techniki real-time PCR.
- Próbki dodatnie przekazane do hodowli bakteryjnej i identyfikacji.
- Wykorzystanie pożywki płynnej do przygotowania próbek.
- Ocena wizualna w celu wyboru odpowiednich kolonii spośród flory towarzyszącej.
Główne wyniki
- Metoda wykazała wysoką swoistość i czułość.
- Może ona zostać dostosowana do innych patogenów, takich jak Vibrios i E. coli.
- Wsparcie wizualne poprawiło dokładność wyboru kolonii.
- Potwierdzono możliwość wysokiej przepustowości.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w skriningu Salmonella i Shigella.
- Stanowi ona wiarygodną alternatywę dla tradycyjnych metod detekcji.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone o inne bakterie patogenne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i specyficzna detekcja patogenów jelitowych, takich jak Salmonella i Shigella, ma kluczowe znaczenie dla nadzoru nad zdrowiem publicznym i reagowania na ogniska epidemiczne. Ta wysokoprzepustowa platforma łączy screening metodą real-time PCR z ukierunkowanym hodowaniem w celu zwiększenia czułości i skrócenia czasu uzyskania wyniku w porównaniu z tradycyjnymi metodami hodowlanymi. Podejście to wspiera wczesną walidację celów w badaniach nad chorobami zakaźnymi, umożliwiając niezawodną identyfikację patogenów w złożonych próbkach klinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez potwierdzenie obecności patogenu w przedklinicznych modelach infekcji.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez specyficzną identyfikację serotypów Salmonella i Shigella.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w zakresie minimalizacji ryzyka związanego z celem poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych w procesach wykrywania patogenów.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego badania skuteczności środków przeciwdrobnoustrojowych lub szczepionek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przetwarzanie próbek poprzez wstępne namnażanie, ekstrakcję DNA oraz PCR w czasie rzeczywistym w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Skalowalność: Umożliwia wysokoprzepustowe badanie próbek klinicznych lub środowiskowych przy zmniejszeniu czasu pracy manualnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z fazą przedkliniczną, dostarczając próbek z potwierdzonym obecnością patogenu do badań skuteczności.
- Dostrojenie biomarkerów: Wspiera wykrywanie markerów wirulencji poprzez biochemiczną i serologiczną charakterystykę po hodowli.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez potwierdzenie obecności patogenu przed zainwestowaniem w potencjalne kandydaty terapeutyczne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, wspierając weryfikację hipotez w modelach infekcji i umożliwiając niezawodne wykrywanie patogenów przed rozpoczęciem prac nad identyfikacją związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia wyjaśnienie szlaków poprzez potwierdzenie roli Salmonella lub Shigella jako czynników etiologicznych w modelach chorób.
- Przesiewy: Dostarcza próbek gotowych do analizy z ilościowo określonym obciążeniem patogenem za pomocą wartości Ct w technice real-time PCR w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (wartości Ct, liczba kolonii), które umożliwiają porównanie warunków i wybór trafień (hits).
- Badania translacyjne: Zapewnia wykorzystanie systemów istotnych dla danej choroby poprzez walidację obecności patogenu w modelach przed testowaniem terapeutycznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania metod przesiewowych, którą można zastosować w przypadku wielu patogenów poza Salmonella i Shigella.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez potwierdzenie tożsamości patogenu za pomocą ortogonalnego PCR i potwierdzenia hodowlą.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów wstępnego namnażania, wirowania i ekstrakcji DNA.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie nakładu pracy i skrócenie czasu realizacji, co umożliwia wyższą przepustowość próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka, dostarczając wiarygodne dane dotyczące wykrywania patogenów dla decyzji typu go/no-go.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrobiologii molekularnej oraz projektowania testów real-time PCR.
- Zależne od dostępu do aparatury do real-time PCR z detekcją fluorescencyjną oraz zautomatyzowanych systemów identyfikacji drobnoustrojów.
- Wymaga standaryzacji procedur postępowania z próbkami oraz kryteriów wyboru kolonii pomiędzy zespołami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy rozszerzaniu jej na inne patogeny ze względu na różnice w pożywkach do namnażania i odczynnikach serologicznych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak zmienność sekwencji wpływająca na wiązanie starterów oraz konieczność stosowania środków ochrony osobistej podczas pracy z patogenami grupy ryzyka 2 (Biosafety Level 2).
