Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli subpopulacji neutrofili w immunologii nowotworów, zwłaszcza na temat mechanicznego udziału zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w przerzutach nowotworu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację oddziaływań adhezyjnych komórek nowotworowych z nienaruszonymi sieciami NET. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii raka.

Ponieważ NET pochodzące z określonych podzbiorów neutrofilu mogą sprzyjać przerzutom guza. Procedurę zademonstruje Junko Shoniohara z naszego laboratorium. Aby uzyskać neutrofile, należy najpierw wstrzyknąć jeden litr normalnego sterylnego roztworu soli fizjologicznej bezpośrednio przed zamknięciem rany bezpośrednio do jamy brzusznej pacjenta, który właśnie przeszedł operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego i intensywnie płukać jamę brzuszną przez co najmniej jedną minutę.

Następnie wymieszaj sól fizjologiczną w jamie i odzyskaj 200 mililitrów płynu za pomocą czterech 50-mililitrowych strzykawek. W laboratorium przenieś płyn z płukania otrzewnowej przez nylonowy filtr o grubości 100 mikrometrów do pojedynczych 50-mililitrowych probówek w celu odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w 5 mililitrach PBS uzupełnionych 0,02% EDTA i ostrożnie nałożyć zawiesinę każdej komórki na trzy mililitry roztworu gradientu gęstości.

Po separacji w gradiencie gęstości należy pobrać od dwóch do trzech mililitrów warstwy pośredniej z każdej probówki i przemyć próbki płynu otrzewnowego w 10 mililitrach świeżego PBS plus EDTA na probówkę. Zebrać granulki w 10 mililitrach świeżego PBS plus EDTA w celu dodatkowego przepłukania i rozcieńczyć komórki do jednego razy 10 do siódmego ogniwa na 60 mikrolitrów magnetycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie lub MACS, stężenia buforu. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 20 mikrolitrów bloku Fc przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych anty-CD66b.

Po 10 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach buforu MACS i dodaj komórki do kolumny magnetycznej o odpowiedniej wielkości w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego. Gdy wszystkie ujemne komórki CD66b przejdą przez kolumnę, dodaj 15 mililitrów świeżego buforu MACS do zbiornika kolumny i przenieś kolumnę z separatora magnetycznego do nowej stożkowej rurki. Następnie natychmiast zanurz kolumnę, aby przepłukać magnetycznie oznaczony dodatni CD66b do rury.

Po odwirowaniu ponownie zawiesić izolowane neutrofile o niskiej gęstości w ilości pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr pożywki RPMI1640 uzupełnionej stężeniem FBS i zasiewać 1 mililitr neutrofili na studzienkę na sześciodołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną. Po dwóch godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla zabarwić komórki w każdym dołku odpowiednią membraną fluorescencyjną, nieprzepuszczalnym barwnikiem jądrowym i chromosomalnym zgodnie z instrukcjami producenta i natychmiast obserwować morfologię NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby ocenić adhezję komórek nowotworowych do NET, ponownie zawiesić komórki nowotworowe żołądka wybarwione kontrastowym barwnikiem fluorescencyjnym w ilości od 10 do szóstej na mililitr RPMI1640 uzupełnione 0,1% stężenie albuminy surowicy bydlęcej i dodać jeden mililitr komórek nowotworowych do każdej studzienki kultur neutrofili o niskiej gęstości.

Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza usuń supernatant z każdej studzienki i delikatnie umyj komórki dwa razy 2 mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża RPMI1640 uzupełnionego BSA na pranie. Pięciominutowa inkubacja jest wystarczająco długa, aby wykryć powiązanie specyficzne dla NET. Dodaj podgrzaną pożywkę z boku każdej studzienki, powoli, delikatnie obracaj płytką i usuń supernatant za pomocą aspiratora.

NET i przyłączone komórki nowotworowe można następnie obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu przeprowadzenia poklatkowej analizy wideo uwięzionych komórek nowotworowych, hodowli i barwienia neutrofili o niskiej gęstości otrzewnowej w 35-milimetrowym naczyniu pokrytym poli-L-lizyną, jak pokazano, a następnie krótkim myciu w dwóch mililitrach 0,1% BSA plus RPMI1640. Zastąp pożywkę jednym razy 10 do szóstym niebarwionymi komórkami nowotworowymi żołądka zawieszonymi w dwóch mililitrach RPMI uzupełnionych BSA przez pięć minut inkubacji w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji przepłucz komórki w dwóch mililitrach świeżego RPMI uzupełnionego BSA przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie wiruj w celu usunięcia wszelkich nieprzyłączonych komórek nowotworowych. Następnie zastąp supernatant DMEM uzupełnionym FBS i antybiotykami i zamontuj szalkę w systemie obserwacji komórek z pełnym widokiem w celu analizy poklatkowej pułapki komórek nowotworowych przez NET. Po dwóch godzinach hodowli neutrofile CD66b dodatnie i niskiej gęstości pochodzące z płynu z płukania otrzewnej wykazują struktury strunowe przez barwienie na zielono, fluorescencyjne, jądrowe i chromosomowe, podczas gdy komórki jednojądrzaste CD66b ujemne nie.

Jednak gdy kultury neutrofili o niskiej gęstości są wstępnie traktowane 100 jednostkami na mililitr DNAzy I, struktury charakterystyczne są niszczone, co wskazuje, że struktury składają się z zewnątrzkomórkowego DNA wydalonego z neutrofili. Gdy neutrofile o niskiej gęstości są hodowane na niepowlekanych płytkach z tworzywa sztucznego, można zaobserwować wiele klastrów NET unoszących się w pożywce z kilkoma NET przyczepionymi do dna naczynia. Po pięciu minutach inkubacji z fluorescencyjnie znakowaną linią komórkową guza żołądka, wiele komórek nowotworowych przyłącza się do neutrofili w NET, zjawisko, którego nie obserwuje się po wstępnym leczeniu DNAzą I. Podobne wzorce adhezji obserwuje się również w przypadku innych komórek nowotworowych.

OKUM-1 oraz NUGC-4. Co ciekawe, podczas gdy NET stopniowo znikają w ciągu kilku godzin od przedłużonej kohodowli komórek nowotworowych, komórki nowotworowe uwięzione przez NET zaczynają się energicznie namnażać po uwolnieniu NET. Podczas tej procedury należy pamiętać, że ze względu na to, że siatki słabo przylegają do talerza, procesy mycia i przenoszenia naczyń powinny być wykonywane w sposób szczególnie ostrożny.

Po opracowaniu technika ta toruje drogę naukowcom z różnych dziedzin nauk biomedycznych do zbadania związku przyczynowego NET z różnymi chorobami, takimi jak zakrzepica, zespół układowej odpowiedzi zapalnej i choroby autoimmunologiczne.