Name: Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej i wizualizacji pułapek NET w interakcjach z komórkami nowotworowymi. Technika ta umożliwia badanie roli neutrofili w immunologii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pani J. Shinoharze i I. Niedzie za pracę techniczną i biurową. Dziękujemy również doktorom Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina i Kazuya Takahashi za współpracę przy pobieraniu próbek na sali operacyjnej. Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid na badania naukowe z Ministerstwa Edukacji, Nauki, Sportu i Kultury Japonii oraz Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (17K10606).

LDN zostały uzyskane od pacjentów włączonych do tego badania i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Medycznego Jichi.
1. Izolacja LDN z płukania jamy brzusznej i wykrywanie NET
<ol>
	<li>Pobieranie próbek
	<ol>
		<li>Wlać 1,000 ml normalnej sterylnej soli fizjologicznej bezpośrednio do jamy brzusznej przed zamknięciem rany u pacjentów, którzy przeszli operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego. 
		UWAGA: Próbki uzyskano od pacjentów, którzy przeszli resekcję żołądka, kolektomię lub przełyk bez uprzedzeń ze względu na wiek lub płeć. Sól fizjologiczną przeniesiono do pojemnika i wlano do całego brzucha w ciągu jednej minuty. Jest to rutynowo wykonywane jako pooperacyjne płukanie otrzewnej bez znaczącego wpływu na pacjentów.</li>
		<li>Intensywnie płukać jamę brzuszną przez co najmniej 1 minutę. 
		UWAGA: Zaleca się, aby podawany płyn był powoli mieszany rękami chirurga, aby próbki były jednolite.</li>
		<li>Odzyskaj 200 ml płynu do płukania za pomocą czterech strzykawek o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Czasami do pobierania płynów używa się gumowego łącznika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj oczyszczanie LDN otrzewnowej za pomocą mAb specyficznego dla granulocytów, CD66b16. 
	UWAGA: Ponieważ warstwa pośrednia po wirowaniu w gradionym spadku gęstości zawiera wiele komórek jednojądrzastych, przeprowadzono pozytywną selekcję polimorficznych neutrofili przy użyciu mAb CD66b.
	<ol>
		<li>Przenieść płyn z płukania otrzewnowej do probówki o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Na tym etapie przepuść płyny przez nylonowy filtr 100 μm, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Odwirować płyn otrzewnowy o sile 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki w 5 ml PBS z 0,02% EDTA.</li>
		<li>Ostrożnie nałożyć 5 ml zawiesiny komórek na 3 ml roztworu gradientu gęstości.</li>
		<li>Wirować przy 1 700 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez żadnych przerw.</li>
		<li>Zebrać ~ 2 - 3 ml roztworu zawierającego warstwy pośrednie (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) za pomocą pipety i wymieszać z 10 ml PBS z 0,02% EDTA.</li>
		<li>Odwirować płyn otrzewnowy o sile 400 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać kolejne 10 ml PBS z 0,02% EDTA i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Rozpuść osad komórkowy (1 x 107) w 60 μl buforu do zestawu do magnetycznej separacji komórek.</li>
		<li>Dodać 20 μl bloku Fc do granulek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 20 μl anty-CD66b sprzężonego z mikrogranulkami i inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć i ponownie zawiesić granulki w 500 μl buforu MACS.</li>
		<li>Zawiesinę komórek nanieść na kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego i zebrać przepływowe komórki zawierające CD66b(-) poprzez przemycie kolumny 15 ml buforu.</li>
		<li>Wyjmij kolumnę z separatora magnetycznego i natychmiast wypłucz magnetycznie oznaczone ogniwa CD66b(+), mocno wciskając tłok do kolumny. 
		UWAGA: Populacja komórek CD66b(+) składa się głównie z neutrofili, jak określono w analizie FACS wskazującej, że >95% frakcji CD66(+) jest dodatnie dla CD11b, CD15 i CD16, ale ujemne dla CD14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie sieci NET
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawiesić wyizolowany LDN (5 x 106) w 1 ml RPMI1640 z 10% FCS.</li>
		<li>Hodować LDN na 6-dołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną (o średnicy 6 cm) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Dodać zielone fluorescencyjne barwienie przeciwbarwiące (nieprzepuszczalny dla błony barwnik do barwienia jądra i chromosomów) o końcowym stężeniu 5 μM.</li>
		<li>Natychmiast obserwuj morfologię NET (zewnątrzkomórkowych składników DNA wydalanych z LDN pod mikroskopią fluorescencyjną).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie komórek nowotworowych czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym łącznikującym komórki
<ol>
	<li>Przygotuj ludzkie linie komórek rakowych MKN45, NUGC i OCUM-1.</li>
	<li>Przemyć 1 x 107 komórek PBS + 0,02% EDTA w probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 270 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml roztworu do barwienia barwnika do granulek i delikatnie odpipetować.</li>
	<li>Rozpuścić 4 μl barwnika Red Fluorescent Cell Linker w 1 ml roztworu do barwienia i wymieszać z zawiesiną komórek z kroku 2.2.</li>
	<li>Inkubować granulki przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 4 ml DMEM (10% FBS), aby zatrzymać reakcję barwienia.</li>
	<li>Odwirować 270 x g przez 7 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.6 i 2.7 dwukrotnie.</li>
	<li>Sprawdź za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (wzbudzenie = 551 nm, emisja = 567 nm), czy komórki nowotworowe są zabarwione na czerwono.</li>
</ol>
3. Analiza adhezji komórek nowotworowych do sieci NET
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić wybarwione na czerwono fluorescencyjne komórki nowotworowe (1 x 106) w 1 ml RPMI 1640 uzupełnionym 0,1% BSA.</li>
	<li>Dodaj komórki nowotworowe do hodowli LDN, która wytworzyła NET, jak opisano w kroku 1.3.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, co umożliwia komórkom nowotworowym kontakt z NETs. 
	UWAGA: Długa inkubacja indukuje adhezję komórek nowotworowych do LDN lub do płytek.</li>
	<li>Usuń pożywkę i delikatnie umyj studzienki, dodając 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża (0,1% BSA + RPMI 1640) i obracając naczynie.</li>
	<li>Powtórz procedurę prania opisaną w kroku 3.4 dwukrotnie. 
	UWAGA: Ponieważ siatki słabo przylegają do płytki, mycie należy wykonywać tak delikatnie, jak to możliwe, aby uniknąć wyjęcia samych siatek.</li>
	<li>Dodać zielony barwnik fluorescencyjny do barwienia jądra i chromosomów w końcowym stężeniu 5 μg/ml w celu wizualizacji NETs.</li>
	<li>Obserwuj NET i przyłączone komórki nowotworowe za pomocą odpowiednich filtrów (zielony, wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm; czerwony, wzbudzenie = 551 nm, emisja = 567 nm).</li>
	<li>Scal rysunki, aby pokazać komórki nowotworowe, które są uwięzione przez NETs. 
	UWAGA: W niektórych eksperymentach enzym degradacji DNA dodawano do kultury LDN (końcowe stężenie 100 U/ml) 5 minut przed współinkubacją przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Analiza wideo poklatkowego uwięzionych komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Hodować LDN otrzewnowej w okrągłym naczyniu o średnicy 35 mm pokrytym poli-L-lizyną, jak opisano w kroku 1.3.</li>
	<li>Dodaj zielony barwnik fluorescencyjny do barwienia jądra i chromosomów, aby uwidocznić NET, jak opisano w kroku 1.3.</li>
	<li>Po 1 minucie inkubacji usuń pożywkę i dodaj 2 ml 0,1% BSA + RPMI 1640.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj niebarwione ogniwa 1 x 106 MKN45 zawieszone w 0,1% BSA + RPMI 1640. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń wszelkie nieprzyłączone komórki nowotworowe, delikatnie myjąc zgodnie z opisem w kroku 3.4 i dodaj DMEM z 10% FCS uzupełnionym 100 μg / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny.</li>
	<li>Zamontuj naczynie hodowlane w systemie obserwacji komórek z pełnym widokiem i wybierz odpowiednie pole, w którym komórki nowotworowe są uwięzione przez NET.</li>
	<li>Kontynuuj wspólną hodowlę przez dodatkowe 2 dni i rób ciągłe zdjęcia pola co 6 minut w normalnym świetle i fluorescencji, która wykrywa odpowiednio komórki MKN45 i NET.</li>
	<li>Nakładaj obrazy w każdym punkcie czasowym i twórz filmy poklatkowe za pomocą oprogramowania Image Viewer.</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wcześniejsze badania wykazały, że krążące komórki nowotworowe mogą być uwięzione przez substraty NET in vivo10,11. Wykazano, że komórki raka piersi z przerzutami stymulują neutrofile i indukują tworzenie NET, co pomaga we wzroście komórek nowotworowych w narządzie docelowym17. Ponadto odkryliśmy, że krótkoterminowe hodowle LDN z pooperacyjnego płynu płukanego wytwarzały masywne NET, które mogły skutecznie więzić komórki nowotworow...

Polimorficzne neutrofile jądrowe w krążącej krwi są zazwyczaj oddzielane od komórek jednojądrzastych za pomocą metody przygotowania gradientu gęstości. Jednak niektóre neutrofile znane jako neutrofile o niskiej gęstości (LDN), z fenotypami CD11b(+), CD15(+), CD16(+) i CD14(-), są jednocześnie oczyszczane z komórkami jednojądrzastymi. Względna liczba LDN znacznie wzrasta w różnych stanach patologicznych, w tym chorobach autoimmunologicznych1,2, sepsa3 i cancer4,5. Wcześniejsze badania wykazały, że LDN są fenotypowo i funkcjonalnie odrębną klasą neutrofili6. Należy zauważyć, że LDN w krążącej krwi jest bardziej skłonny do wytwarzania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) niż neutrofile o normalnej gęstości2,7. NET to struktury przypominające sieć złożone z kwasów nukleinowych, histonów, proteaz oraz białek ziarnistych i cytozolowych, które mogą skutecznie więzić i niszczyć patogeny8.
Ostatnio wykazano, że NET wychwytują nie tylko mikroby, ale także płytki krwi i krążące komórki nowotworowe, które mogą pomóc w tworzeniu skrzepliny9 i przerzuty do nowotworów10,11. Jednak mechanizmy molekularne stojące za oddziaływaniami adhezyjnymi między NET a płytkami krwi lub komórkami nowotworowymi są nadal niejasne. Niedawno test adhezji in vitro ujawnił, że komórki białaczki szpikowej (K56212) i komórki raka płuc (A54913) przyłączają się do NET za pośrednictwem integryn β1 i β3. Autorzy wykorzystali materiał NET wyizolowany z neutrofili i aktywowany przez 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) jako substrat adhezyjny14. Chociaż test ten pozwala na wykrycie rzeczywistych interakcji ze składnikami NET przy braku neutrofili, można się spierać, czy "bezkomórkowy zasób NET" wyizolowany przez szybkie wirowanie zachowuje strukturę molekularną identyczną z NET wytwarzanymi in vivo. Ostatnio odkryliśmy, że płyn z płukania otrzewnej po operacji jamy brzusznej zawierał wiele dojrzałych LDN, które generowały masywne NET i przyczepiały się do komórek nowotworowych, powodując przerzuty do otrzewnej15. W tym badaniu z powodzeniem zbadaliśmy adhezję komórek nowotworowych do nienaruszonych NET bez żadnej fizycznej manipulacji. W tym miejscu przedstawiamy szczegóły techniki wykrywania interakcji adhezyjnych między NET a wolnymi komórkami nowotworowymi.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SZWECJA</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Prosto z handlu; Mikrogranulki CD66b z krwi pełnej</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Blok Fc</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór płuczący MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy MACS BSA</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Separator magnetyczny MACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX zielony roztwór kwasu nukleinowego 5mM w DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego etykietowania błony komórkowej</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640 <tr><td>Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średnio-wysoki poziom glukozy (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór 0,5 mol/l-EDTA (pH 8,0)</td> <td>nacalai tesque, Japonia</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA</td><td>gibco by life technologies, Meksyk</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina liofilizowana w proszku, &ge; 96% (elektroforeza w żelu agarozowym)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Life Technologies Japonia</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plazmocin Prophylactic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Pokryta poli-L-lizyną MICROPLATE 6Well</td><td>IWAKI, Japonia</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>MIKROPŁYTKA POKRYTA poli-L-lizyną 24 dołki</td><td>IWAKI, Japonia</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>stereoskop fluoresceinowy</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japonia</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>System obserwacji komórek z pełnym widokiem</td><td>Nikon, Kanagawa, Japonia</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 ludzka linia komórkowa raka żołądka</td><td>Riken, Tukuba, Japonia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 ludzka linia komórkowa raka</td><td>żołądka Riken, Tukuba Japonia</td><td>Nie</td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>linii komórkowej ludzkiego raka żołądka OCUM-1</td><td>Uniwersytet Miejski w Osace, Japonia</td><td>Nie dotyczy</td><td>Prezent od dr M. Yashiro</td></tr></tbody></table>

pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Aktywowane neutrofile uwalniają zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NET), które mogą wychwytywać i niszczyć mikroby. Ostatnie badania sugerują, że NET są zaangażowane w różne procesy chorobowe, takie jak choroba autoimmunologiczna, zakrzepica i przerzuty nowotworowe. Tutaj pokazujemy szczegółową technikę in vitro do wykrywania aktywności NET podczas uwięzienia wolnych komórek nowotworowych, które rosną po przyłączeniu do NET. Najpierw pobraliśmy neutrofile o niskiej gęstości (LDN) z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej od pacjentów, którzy przeszli laparotomię. Krótkotrwała hodowla LDN spowodowała masowe tworzenie się siatki, którą uwidoczniono za pomocą zielonego fluorescencyjnego barwienia jądrowego i przeciwbarwnika chromosomowego. Po jednoczesnej inkubacji ludzkich linii komórkowych raka żołądka MKN45, OCUM-1 i NUGC-4 z NET, wiele komórek nowotworowych zostało uwięzionych przez NET. Następnie przyłączenie zostało całkowicie zniesione przez degradację NET za pomocą DNazy I. Film poklatkowy ujawnił, że komórki nowotworowe uwięzione przez NET nie umierały, ale zamiast tego rosły energicznie w ciągłej hodowli. Metody te mogą być stosowane do wykrywania oddziaływań adhezyjnych między NET a różnymi typami ogniw i materiałów.

W 2-godzinnej hodowli CD66b(+) LDN pochodzące z płynu z płukania otrzewnej wykazywały struktury nitkowate barwione zielonym barwnikiem fluorescencyjnym dla jąder i chromosomów (Ryc. 1B), podczas gdy komórki mononuklearne CD66b(-) ich nie wykazywały (Ryc. 1C). Jednak po wstępnym potraktowaniu hodowli LDN 100 U/mL DNase I charakterystyczna struktura została zniszczona (Ryc. 1D), co wskazuje, że składał...

Tutaj prezentujemy metodę, w której ludzkie neutrofile o niskiej gęstości (LDN), odzyskane z pooperacyjnego płynu z płukania otrzewnej, wytwarzają ogromne pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NET) i skutecznie zatrzymują wolne komórki nowotworowe, które następnie rosną.

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli subpopulacji neutrofili w immunologii nowotworów, zwłaszcza na temat mechanicznego udziału zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w przerzutach nowotworu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację oddziaływań adhezyjnych komórek nowotworowych z nienaruszonymi sieciami NET. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii raka.Ponieważ NET pochodzące z określonych podzbiorów neutrofilu mogą sprzyjać przerzutom guza. Procedurę zademonstruje Junko Shoniohara z naszego laboratorium. Aby uzyskać neutrofile, należy najpierw wstrzyknąć jeden litr normalnego sterylnego roztworu soli fizjologicznej bezpośrednio przed zamknięciem rany bezpośrednio do jamy brzusznej pacjenta, który właśnie przeszedł operację jamy brzusznej z powodu nowotworu złośliwego przewodu pokarmowego i intensywnie płukać jamę brzuszną przez co najmniej jedną minutę.Następnie wymieszaj sól fizjologiczną w jamie i odzyskaj 200 mililitrów płynu za pomocą czterech 50-mililitrowych strzykawek. W laboratorium przenieś płyn z płukania otrzewnowej przez nylonowy filtr o grubości 100 mikrometrów do pojedynczych 50-mililitrowych probówek w celu odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w 5 mililitrach PBS uzupełnionych 0,02% EDTA i ostrożnie nałożyć zawiesinę każdej komórki na trzy mililitry roztworu gradientu gęstości.Po separacji w gradiencie gęstości należy pobrać od dwóch do trzech mililitrów warstwy pośredniej z każdej probówki i przemyć próbki płynu otrzewnowego w 10 mililitrach świeżego PBS plus EDTA na probówkę. Zebrać granulki w 10 mililitrach świeżego PBS plus EDTA w celu dodatkowego przepłukania i rozcieńczyć komórki do jednego razy 10 do siódmego ogniwa na 60 mikrolitrów magnetycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie lub MACS, stężenia buforu. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 20 mikrolitrów bloku Fc przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych anty-CD66b.Po 10 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj i ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach buforu MACS i dodaj komórki do kolumny magnetycznej o odpowiedniej wielkości w polu magnetycznym odpowiedniego separatora magnetycznego. Gdy wszystkie ujemne komórki CD66b przejdą przez kolumnę, dodaj 15 mililitrów świeżego buforu MACS do zbiornika kolumny i przenieś kolumnę z separatora magnetycznego do nowej stożkowej rurki. Następnie natychmiast zanurz kolumnę, aby przepłukać magnetycznie oznaczony dodatni CD66b do rury.Po odwirowaniu ponownie zawiesić izolowane neutrofile o niskiej gęstości w ilości pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr pożywki RPMI1640 uzupełnionej stężeniem FBS i zasiewać 1 mililitr neutrofili na studzienkę na sześciodołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną. Po dwóch godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla zabarwić komórki w każdym dołku odpowiednią membraną fluorescencyjną, nieprzepuszczalnym barwnikiem jądrowym i chromosomalnym zgodnie z instrukcjami producenta i natychmiast obserwować morfologię NET za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby ocenić adhezję komórek nowotworowych do NET, ponownie zawiesić komórki nowotworowe żołądka wybarwione kontrastowym barwnikiem fluorescencyjnym w ilości od 10 do szóstej na mililitr RPMI1640 uzupełnione 0,1% stężenie albuminy surowicy bydlęcej i dodać jeden mililitr komórek nowotworowych do każdej studzienki kultur neutrofili o niskiej gęstości.Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza usuń supernatant z każdej studzienki i delikatnie umyj komórki dwa razy 2 mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża RPMI1640 uzupełnionego BSA na pranie. Pięciominutowa inkubacja jest wystarczająco długa, aby wykryć powiązanie specyficzne dla NET. Dodaj podgrzaną pożywkę z boku każdej studzienki, powoli, delikatnie obracaj płytką i usuń supernatant za pomocą aspiratora.NET i przyłączone komórki nowotworowe można następnie obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W celu przeprowadzenia poklatkowej analizy wideo uwięzionych komórek nowotworowych, hodowli i barwienia neutrofili o niskiej gęstości otrzewnowej w 35-milimetrowym naczyniu pokrytym poli-L-lizyną, jak pokazano, a następnie krótkim myciu w dwóch mililitrach 0,1% BSA plus RPMI1640. Zastąp pożywkę jednym razy 10 do szóstym niebarwionymi komórkami nowotworowymi żołądka zawieszonymi w dwóch mililitrach RPMI uzupełnionych BSA przez pięć minut inkubacji w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przepłucz komórki w dwóch mililitrach świeżego RPMI uzupełnionego BSA przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie wiruj w celu usunięcia wszelkich nieprzyłączonych komórek nowotworowych. Następnie zastąp supernatant DMEM uzupełnionym FBS i antybiotykami i zamontuj szalkę w systemie obserwacji komórek z pełnym widokiem w celu analizy poklatkowej pułapki komórek nowotworowych przez NET. Po dwóch godzinach hodowli neutrofile CD66b dodatnie i niskiej gęstości pochodzące z płynu z płukania otrzewnej wykazują struktury strunowe przez barwienie na zielono, fluorescencyjne, jądrowe i chromosomowe, podczas gdy komórki jednojądrzaste CD66b ujemne nie.Jednak gdy kultury neutrofili o niskiej gęstości są wstępnie traktowane 100 jednostkami na mililitr DNAzy I, struktury charakterystyczne są niszczone, co wskazuje, że struktury składają się z zewnątrzkomórkowego DNA wydalonego z neutrofili. Gdy neutrofile o niskiej gęstości są hodowane na niepowlekanych płytkach z tworzywa sztucznego, można zaobserwować wiele klastrów NET unoszących się w pożywce z kilkoma NET przyczepionymi do dna naczynia. Po pięciu minutach inkubacji z fluorescencyjnie znakowaną linią komórkową guza żołądka, wiele komórek nowotworowych przyłącza się do neutrofili w NET, zjawisko, którego nie obserwuje się po wstępnym leczeniu DNAzą I. Podobne wzorce adhezji obserwuje się również w przypadku innych komórek nowotworowych.OKUM-1 oraz NUGC-4. Co ciekawe, podczas gdy NET stopniowo znikają w ciągu kilku godzin od przedłużonej kohodowli komórek nowotworowych, komórki nowotworowe uwięzione przez NET zaczynają się energicznie namnażać po uwolnieniu NET. Podczas tej procedury należy pamiętać, że ze względu na to, że siatki słabo przylegają do talerza, procesy mycia i przenoszenia naczyń powinny być wykonywane w sposób szczególnie ostrożny.Po opracowaniu technika ta toruje drogę naukowcom z różnych dziedzin nauk biomedycznych do zbadania związku przyczynowego NET z różnymi chorobami, takimi jak zakrzepica, zespół układowej odpowiedzi zapalnej i choroby autoimmunologiczne.

neutrophil-extracellular-traps-generated-low-density-neutrophils

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania neutrofili o niskiej gęstości (LDN) z płynu z płukania otrzewnowej u pooperacyjnego pacjenta. Uzyskane w ten sposób LDN mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach w celu zrozumienia ich roli we wzroście i progresji guza.

Izolacja neutrofili o niskiej gęstości otrzewnej: technika uzyskiwania neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Ten film pokazuje fluorescencyjne barwienie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), zewnątrzkomórkowych składników DNA wydalanych przez neutrofile. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji adhezyjnej między komórkami nowotworowymi a sieciami NET.

Mikroskopia fluorescencyjna zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych lub NET: technika obserwacji interakcji adhezyjnej między komórkami nowotworowymi a NET

W tym filmie analizujemy zachowanie komórek nowotworowych uwięzionych w zewnątrzkomórkowych pułapkach neutrofili (NET) po adhezji poprzez wspólną hodowlę neutrofili o niskiej gęstości i komórek raka żołądka. Analiza wideo poklatkowego pomaga monitorować różne zdarzenia komórkowe i badać rolę NET w stanach patologicznych.

Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna neutrofilowych pułapek zewnątrzkomórkowych lub NET: technika analizy interakcji postadhezyjnej między komórkami rakowymi a NET

Ten film demonstruje technikę in vitro do generowania i izolowania neutrofili w pułapkach zewnątrzkomórkowych (NET). Neutrofile są izolowane z krwi obwodowej i stymulowane octanem mirystynianu forbolu (PMA) w celu wytworzenia NET. Podczas inkubacji neutrofile przechodzą proces śmierci komórki (NETosis) w celu uwolnienia NET zawierających zdekondensowaną chromatynę zmieszaną z ziarnistymi białkami cytoplazmatycznymi.

Technika in vitro do generowania ludzkich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofilów

W tym filmie demonstrujemy test wykorzystujący mikroskopię fluorescencyjną do wykrywania adhezji komórek rakowych do pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). W studzienkach testowych obserwuje się znaczny wzrost liczby znakowanych fluorescencyjnie komórek rakowych przylegających do NET, podczas gdy studzienki potraktowane DNazą wykazują zmniejszoną adhezję komórek rakowych do NET.

Test adhezji in vitro w celu wykrycia przylegania komórek rakowych do zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Opisano szereg metod, w tym izolację lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) z ludzkiego osocza, różnicowanie komórek HL-60 w komórki podobne do neutrofili, przygotowanie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w obecności LDL oraz stymulację ludzkich komórek śródbłonka aorty mieszaniną NET i LDL.

Stymulacja komórek śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w obecności lipoprotein o niskiej gęstości

Poznaj metodę izolacji neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej i wizualizacji pułapek NET w interakcjach z komórkami nowotworowymi. Technika ta umożliwia badanie roli neutrofili w immunologii nowotworowej.

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili generowane przez neutrofile o niskiej gęstości uzyskane z płynu do płukania otrzewnej pośredniczą we wzroście i przyczepianiu komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów