Name: Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj metodę wykrywania zintegrowanego DNA wirusa zapalenia wątroby typu B z wysoką czułością. Protokół umożliwia ilościowe oznaczanie i mapowanie miejsc integracji wirusa z genomem gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca otrzymała finansowanie od Niemieckiego Centrum Badań nad Infekcjami (DZIF), TTU Hepatitis Projects 5.807 i 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) TRR179 (TP 15) oraz Australijskiego Centrum Badań nad HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby.
Jesteśmy wdzięczni profesorowi Williamowi Masonowi za jego wkład w opracowanie oryginalnej metody invPCR i jej zademonstrowanie nam. Chcielibyśmy podziękować doktorom Yi Ni i Florianowi A. Lemppowi za odczynniki (linie komórkowe i inokulum HBV). Dziękujemy Anji Rippert, Franzisce Schlund, Sarah Engelhardt i dr Katrin Schöneweis za pomoc techniczną. Jesteśmy wdzięczni Miriam Kleinig za korektę oraz profesorom Nicholasowi Shackelowi i Ralfowi Bartenschlagerowi za nieustanne wsparcie.

1. Zakażenie komórkowe i ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Utrzymuj hodowane komórki Huh7-NTCP 8,9 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 1x penicylina/streptomycyna i 2 mM L-glutamina. 
	UWAGA: Zostało to wcześniej szczegółowo opisane40.</li>
	<li>Umieść 2 x 105 komórek/ml komórek Huh7-NTCP na 12-dołkowej płytce z 1 ml DMEM.</li>
	<li>W przypadku testowania leczenia komórkami (np. inhibitorów HBV), należy je zastosować do supernatantu hodowli 4 godziny po wysiewie (1 dzień przed zakażeniem HBV). W celu kontroli ujemnej należy zastosować 200 nM Myrcludex B (silny inhibitor wnikania HBV41).</li>
	<li>Użyj oczyszczonego z kolumny heparyny 42 supernatant z HepAD3843 jako inokulum do infekowania komórek przy 1,000 VGE/komórkę w 500 μL pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 1x penicylina/streptomycyna, 2 mM L-glutamina i 2,5% v/v DMSO), zawierający 4% w/v glikolu polietylenowego 8000 [rozpuszczony w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)].</li>
	<li>Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C (przy 5% CO2 i wilgotności 90%).</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 1 ml sterylnego 1x PBS po 16–24 godzinach od zakażenia.</li>
	<li>Pożywkę należy wymieniać co 2 dni po zakażeniu HBV aż do zbiorów.</li>
	<li>W 3. dniu po zakażeniu należy potraktować komórki 5 μM dizoproksylu tenofowiru i 10 μM lamiwudyny, aby ograniczyć wytwarzanie replikacyjnych produktów pośrednich HBV, które są amplifikowane przez invPCR.</li>
	<li>W 5 dniu po zakażeniu trypsynizuj komórki za pomocą 200 μl trypsyny-EDTA i ponownie zawieś je w 2 ml DMEM (uzupełnionym 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej, 1x penicylina/streptomycyna i 2 mM L-glutamina), zawierającej również 5 μM dizoproksylu tenofowiru i 10 μM lamiwudyny.</li>
	<li>Przenieś zawiesiny komórek na 6-dołkową płytkę, aby wywołać jedną rundę mitozy (która, jak doniesiono, indukuje utratę HBV cccDNA44 i innych produktów pośrednich DNA HBV, które są amplifikowalne przez invPCR).</li>
	<li>W 7 dniu po zakażeniu trypsynizuj rozszerzone komórki w 400 μl Trypsyny-EDTA i ponownie zawieś mieszaninę w 1 ml DMEM. Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 1,5 ml, granulować komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant przez aspirację.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przechowuj granulki komórek w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Wyekstrahuj DNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Oszacuj końcowe stężenie DNA za pomocą densytometrii optycznej. 
	UWAGA: Wydajność DNA w objętości elucji 100 μL wynosi na ogół ~250-400 ng / μL.</li>
</ol>
2. Odwrócenie DNA
<ol>
	<li>Podwielokrotność ~1,5–2,5 μg całkowitego ekstraktu DNA z etapu 1 do probówki PCR o pojemności 200 μl. Dodać odpowiednią ilość głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać 40 μl objętości reakcyjnej zawierającej 1x bufor reakcyjny trawienia (np. bufor CutSmart) i 10 U NcoI-HF.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj reakcje i odwiruj w małej wirówce probówkowej. Inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w maszynie do PCR w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu uzyskania optymalnej wydajności trawienia.</li>
	<li>Dezaktywować enzym restrykcyjny przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Przenieść całą reakcję enzymu restrykcyjnego do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 400 μl 1x buforu ligazy DNA T4 i 500 U ligazy DNA T4 i dokładnie wymieszać. Duża objętość reakcji sprzyja wewnątrzcząsteczkowej (w przeciwieństwie do międzycząsteczkowej) ligacji strawionych fragmentów DNA.</li>
	<li>Inkubować reakcję ligacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby zapewnić pełne podwiązanie.</li>
	<li>Dezaktywować ligazę DNA T4 w temperaturze 70 °C przez 20 min.</li>
	<li>Dodaj 10 μl 10% w/v dodecylosiarczanu sodu, aby zapewnić całkowitą inaktywację ligazy T4.</li>
	<li>Wymieszaj probówki przez wirowanie impulsowe i krótko odkręć mieszaninę reakcyjną. Dodać NaCl do końcowego stężenia 100 mM i dekstran (35–45 kDa) do końcowego stężenia 90 μg/ml. Wymieszaj probówki przez wirowanie impulsowe i krótko odkręć mieszaninę reakcyjną.</li>
	<li>Dodać 900 μl 100% etanolu i wymieszać przez odwrócenie. Wytrącić DNA w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wytrącone DNA osadzać przez odwirowanie przy 14 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant przez aspirację pipetą P200. Przemyć osad 500 μl etanolu o stężeniu 70% v/v i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Usunąć etanol przez aspirację za pomocą pipety P200. Suszyć osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Rozpuścić osad w 20 μlH2O. Dodać 20 μl głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać objętość reakcyjną 40 μl zawierającą 1x bufor reakcyjny do trawienia, 5 U BsiHKAI i 5 U SphI-HF. Inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C (optymalna temperatura dla SphI-HF) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną. Inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 65 °C (optymalna temperatura dla BsiHKAI) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną.</li>
	<li>Odwrócony DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do następnego etapu.</li>
</ol>
3. Zagnieżdżony PCR
<ol>
	<li>Usuń potencjalne amplikony z uszczelki maty silikonowej wielokrotnego użytku za pomocą roztworu do degradacji DNA, dokładnie spłucz matę wodą bez DNA i wysusz ją na powietrzu w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania mieszaniny PCR.</li>
	<li>Przygotować 1 ml 1x mieszanki PCR zawierającej zewnętrzne startery do przodu (5'-TTC, GCT, TCA, CCT, CTG, CAC G-3') i odwrotnie (5'-AAA, GGA, CGT, CCC, GCG, CAG-3') w stężeniu 0,5 μM.</li>
	<li>Dodaj 170 μl 1x mieszanki PCR do dołków A1 i E1 w 96-dołkowej płytce PCR.</li>
	<li>Dodać 120 μl 1x mieszanki PCR do studzienek B1 do H1.</li>
	<li>Dodaj 10 μl odwróconego DNA z etapu 2 do dołków A1 i E1 (2 różne odwrócone próbki można analizować na tej samej płytce PCR). Wymieszać reakcję w każdym dołku, delikatnie pipetując każdy z nich około 10 razy, używając P1000 ustawionego na 100 μl.</li>
	<li>Próbki należy rozcieńczyć seryjnie z dołków A1 do D1 w stosunku 1:3, przenosząc 60 μl na każdym etapie. Mieszać studzienki na każdym etapie, delikatnie pipetując je około 10 razy za pomocą P1000 ustawionego na 100 μl. Unikaj tworzenia się pęcherzyków. Powtórzyć krok 3.6 dla dołka E1, rozcieńczając do dołka H1.</li>
	<li>Podwielokrotność 10 μl mieszaniny reakcyjnej za pomocą pipety wielokanałowej z dołków A1-H1 do studzienek A2-H2, A3-H3 i tak dalej, aż do osiągnięcia studzienek A12-H12 płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę PCR suchą matą silikonową z kroku 3.1, mocno dociskając.</li>
	<li>Umieścić płytkę w maszynie do PCR i uruchomić następujący program: 10 minut w temperaturze 95 °C; 35 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C, 15 s w temperaturze 54 °C i 3 minuty w temperaturze 72 °C; 7 minut w temperaturze 72 °C; następnie należy trzymać płytkę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Podgrzej piny 96-pinowego replikatora do czerwoności za pomocą palnika Bunsena, a następnie schładzaj przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Napełnij studzienki drugiej płytki PCR 10 μl 1x mieszanki PCR (zawierającej bufor gotowy do obciążenia żelem) oraz wewnętrzną do przodu (5'-CGC, ATG, GAG, ACC, ACC, GTG, A-3') i odwrotnie (5'-CAC, AGC, CTA, GCA, GCC, ATG G-3') w temperaturze 0,5 μM.</li>
	<li>Ostrożnie usuń matę silikonową z płytki PCR z płytki 96-dołkowej z pierwszej rundy PCR i unikaj zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami.</li>
	<li>Użyć schłodzonego replikatora, aby przenieść produkty PCR z płytki 96-dołkowej z pierwszej rundy PCR na nowo podzieloną płytkę 96-dołkową. Przeprowadzić zagnieżdżony PCR w takich samych warunkach, jak w kroku 3.8, z wyjątkiem zmiany początkowego etapu denaturacji w temperaturze 95 °C z 10 minut na 2 minuty.</li>
</ol>
4. Izolacja produktu PCR i ekstrakcja żelu
<ol>
	<li>Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu 96-dołkowego z 1,3% w/v żelem agarozowym. W przypadku żelu agarozowego o pojemności 100 ml należy pracować pod napięciem 200 V przez 10–15 minut.</li>
	<li>Usuń prążki DNA z żeli agarozowych za pomocą jednorazowych słomek do napojów. Dla każdego produktu PCR umieść słomkę i żel agarozowy w probówce o pojemności 1,5 ml i przytnij słomkę na wymiar nożyczkami. 
	UWAGA: Wystarczające jest wyizolowanie prążków tylko z tych rozcieńczeń, w których można rozpuścić pojedyncze produkty PCR.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Przechowuj probówki w temperaturze -20°C do późniejszej ekstrakcji.</li>
	<li>Wyrzuć korki agarozowe do każdej rurki, ściskając koniec fragmentu słomy. Do każdej probówki dodać 300 μl żelowego buforu ekstrakcyjnego i 5 μl szlamu z kulkami szklanymi do ekstrakcji żelu.</li>
	<li>Wyekstrahuj produkty PCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji żelu (z wyjątkiem użycia połowy objętości do etapów mycia) i wymyj DNA z kulek za pomocą 30 μl wody.</li>
	<li>Prześlij oczyszczone DNA do sekwencjonowania Sangera (zgodnie z instrukcjami dostawcy) za pomocą startera Forward użytego w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR.</li>
</ol>
5. Analiza sekwencji
<ol>
	<li>Potwierdź połączenia DNA wirusa z komórką, wykonując analizę BLAST nukleotydów (przy użyciu ustawień domyślnych dostosowanych do całej kolekcji nukleotydów). 
	UWAGA: Reprezentatywne wyniki są szczegółowo opisane w Rysunek 3 poniżej.
	<ol>
		<li>Jeśli obserwuje się tylko częściowe wyrównanie sekwencji, należy przyciąć sekwencję 5' DNA HBV przed ponownym uruchomieniem analizy BLAST.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj rygorystyczne kryteria wyboru, aby określić, czy dana sekwencja reprezentuje prawdziwe skrzyżowanie całkowania w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Uwzględnij tylko sekwencje zawierające >20 pz sekwencji komórkowej, aby zapewnić pewne mapowanie do genomu komórkowego.</li>
		<li>Zignoruj wszelkie sekwencje, które zawierają miejsca restrykcyjne któregokolwiek z enzymów użytych w promieniu 10 pz od domniemanego połączenia integracyjnego wirus-komórka, ponieważ prawdopodobnie reprezentują one zdarzenia ligacji in vitro, a nie prawdziwe połączenia integracyjne.</li>
		<li>Zignoruj wszelkie sekwencje z oczywistymi różnymi poziomami fluorescencji pików po obu stronach domniemanego złącza integracyjnego w chromatografach sekwencjonowania, ponieważ są to prawdopodobne artefakty generowane przez zanieczyszczenie krzyżowe podczas reakcji sekwencjonowania lub chromatografii kapilarnej.</li>
		<li>Zdefiniuj unikalne zdarzenia integracyjne jako te, które mają dokładne sekwencje HBV i komórkowe na styku wirus-komórka. 
		UWAGA: Powtarzanie się unikalnych zdarzeń integracji może wynikać z klonalnej ekspansji komórek zawierających te integracje lub zanieczyszczenia krzyżowego podczas PCR (które można przetestować przy użyciu reakcji kontroli ujemnej, szczegółowo opisanych w reprezentatywnych wynikach poniżej). Oczekuje się, że powtarzające się integracje z określonymi sekwencjami komórkowymi będą wyświetlać różne miejsca końcowe HBV dla każdego zdarzenia integracji, ponieważ używane są niehomologiczne ścieżki łączenia końców15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć częstotliwość integracji, mnożąc współczynnik rozcieńczenia odwróconych matryc DNA przez liczbę połączeń wirus-komórka wykrytych w tym rozcieńczeniu, a następnie normalizując do ilości całkowitego DNA wprowadzonego do reakcji inwersji. Ogólnie rzecz biorąc, częstotliwość integracji jest rzędu 1:104 komórek.</li>
</ol>

S.U. jest współwnioskodawcą i współtwórcą patentów chroniących Myrcludex B jako inhibitor przedostawania się wirusa HBV/HDV. T.T. deklaruje, że nie występuje w konflikcie interesów.

Przed wykonaniem protokołu należy zauważyć, że ten test invPCR jest bardzo czułą techniką, zdolną do amplifikacji pojedynczych kopii matrycy DNA. Dlatego ograniczenie zanieczyszczenia produktami PCR ma ogromne znaczenie. Ogólne strategie ograniczania zanieczyszczenia produktem PCR obejmują następujące elementy. (i) Ustanowić fizycznie oddzielone obszary dla różnych etapów metody. Każdy obszar powinien mieć osobne fartuchy laboratoryjne, a rękawiczki należy zmieniać podczas przemieszczania się między tymi obszarami. Poniżej wymieniliśmy te obszary w kolejności od najbardziej do najmniej prawdopodobnego zanieczyszczenia: obszar przygotowania reakcji ekstrakcji i sekwencjonowania produktu PCR (po PCR); Dodawanie szablonu PCR i obszar przenoszenia palonych szpilek (z dobrymi wynikami użyliśmy kapturów PCR z odkażającą lampą UV); Obszar ekstrakcji i inwersji DNA (pre-PCR); oraz obszar "wolny od matryc DNA" używany wyłącznie do przygotowywania roztworów podstawowych i PCR. (ii) Należy pamiętać o przepływie powietrza w laboratorium jako potencjalnym czynniku powodującym zanieczyszczenie krzyżowe. W szczególności najbardziej prawdopodobne jest zanieczyszczenie krzyżowe reakcji PCR podczas etapu przenoszenia palonego szpilki, co doprowadzi do niedokładnego określenia ilościowego częstotliwości integracji. Kaptury PCR mogą być używane do ograniczania tych prądów krzyżowych. Studzienki kontroli ujemnej (np. próbki poddane działaniu Myrcludex B lub bez kontroli matrycowych) w PCR mogą być również wykorzystywane do badania pod kątem zanieczyszczenia krzyżowego. (iii) Ogranicz potencjalne zanieczyszczenia PCR na pipetach i powierzchniach roboczych poprzez regularne przecieranie ich roztworem degradującym DNA.
Określony tutaj protokół ma na celu wykrycie integracji znanego zakaźnego klonu HBV wygenerowanego z linii komórkowej42 HepAD38. Jeśli użyte inokulum ma inną sekwencję DNA HBV (np. z surowicy pacjenta), wówczas genom HBV powinien zostać najpierw zsekwencjonowany w celu potwierdzenia zgodności starterów PCR i projektu inwersji. We wcześniej opublikowanych badaniach19 użyliśmy 3 zestawów starterów, które wiążą konserwatywne sekwencje DNA HBV flankujące oczekiwane miejsce połączeń integracyjnych DNA HBV. Inne sekwencje starterów i protokoły zostały opisane w celu określenia sekwencji genomowej HBV 44,45,46,47,48 i mogą działać z powodzeniem.
Ponadto można stosować różne komórki wrażliwe na HBV (np. pierwotne ludzkie hepatocyty, zróżnicowane komórki HepaRG, HepG2-NTCP); jednak odkryliśmy, że komórki Huh7-NTCP zapewniają największy stosunek sygnału do szumu, biorąc pod uwagę liczbę połączeń DNA wirus-komórka, które są amplifikowane, w porównaniu z pośrednim DNA wirusa, które jest amplifikowane13. W szczególności końcowo zróżnicowane komórki, takie jak pierwotne ludzkie hepatocyty lub zróżnicowany HepaRG, nie przechodzą skutecznie mitozy, co skutkuje wysokim poziomem amplifikowalnych replikacyjnych produktów pośrednich DNA HBV pozostających w komórkach. Odkryliśmy, że ~ 90% amplifikowanych sekwencji reprezentuje rearanżacje DNA HBV (a nie zdarzenia integracji) w komórkach ostatecznie zróżnicowanych, w porównaniu do 70-50% w liniach komórkowych wątrobiaka13. Produkty te są na ogół genomami DNA HBV zawierającymi duże delecje na powierzchni i otwartych ramkach odczytu rdzenia lub mogą reprezentować quasi-gatunki HBV z dodatkowym miejscem NcoI przed miejscem SphI. Amplifikacja tych gatunków HBV (wraz ze schematem ideowym) została szczegółowo opisana wcześniej13.
Ta metoda ma kilka wad. Ze względu na pracochłonny i wielodniowy charakter tego protokołu, invPCR nie nadaje się do wysokoprzepustowych analiz dużej liczby próbek. Ponadto, ponieważ nasza metoda opiera się na ograniczeniu miareczkowania rozcieńczalnego, nie jest wysoce precyzyjna pod względem ilościowym; Chociaż powinien łatwo mierzyć zmiany częstotliwości integracji na poziomie dziennika.
Co więcej, nasz protokół inwersji nadaje się tylko do wykrywania integracji zachodzących między regionami DR2 i DR1 genomu HBV, ponieważ większość integracji HBV zachodzi w tym regionie49. Analiza NGS tkanek pacjentów z HBV wykazała, że duża mniejszość (do ~50%) może występować również poza tym regionem49. Nowe projekty invPCR są teoretycznie w stanie wykryć te inne miejsca integracji, chociaż (według naszej wiedzy) nie zostały one jeszcze przeprowadzone. W związku z tym, ze względu na niezbędne miejsca enzymów restrykcyjnych wymagane za sekwencją połączenia wirus-komórka do reakcji inwersji, invPCR nie wykrywa wszystkich integracji zachodzących w regionach DR2 i DR1 genomu HBV (tj. Oszacowaliśmy, że ~ 10% wszystkich integracji można wykryć za pomocą symulacji in silico 13). Jednak w przypadku zastosowania do zogniskowanej partii próbek z niewielką liczbą różnych zabiegów, invPCR jest jedną z niewielu praktycznych metod wykrywania zintegrowanego DNA HBV w rozdzielczości pojedynczej pary zasad.
W związku z tym przewidujemy, że zastosowania tej metody będą odgrywać kluczową rolę w poszukiwaniu czynników wirusowych (poprzez mutacje inokulum HBV), komórkowych (poprzez nokaut lub nadekspresję określonych genów komórkowych lub poprzez stosowanie różnych leków) i środowiskowych (np . narażenie na stres oksydacyjny), które indukują integrację DNA HBV. Dzięki tej metodzie i nowo opracowanym systemom zakażeń HBV umożliwiamy bezprecedensową kontrolę tych czynników, dzięki czemu można je dobrze wyizolować i lepiej scharakteryzować. Spodziewamy się również, że doprowadzi to do kluczowego zrozumienia komórkowych konsekwencji integracji DNA HBV, w tym tego, w jakim stopniu antygeny wirusowe (np. HBx lub HBsAg50) są wyrażane z formy zintegrowanej, co kontroluje tę ekspresję i czy integracja HBV znacząco zmienia fenotyp komórkowy w kierunku bardziej proonkogennego. Wyniki tych przyszłych badań będą miały głęboki wpływ na strategie terapeutyczne stosowane w leczeniu przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B oraz na podstawową wiedzę na temat samego wirusa.

HBV to dwuniciowy wirus DNA, który może powodować przewlekłą infekcję przez całe życie, prowadzącą do marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC)1,2,3. Chociaż istnieje wiele mechanizmów molekularnych napędzających trwałość HBV4 (np. wysoka stabilność epigenetycznej matrycy transkrypcyjnej wirusa, unikanie nadzoru immunologicznego i niski obrót hepatocytów w wątrobie) i związane z tym ryzyko inicjacji HCC5,6 (np. przewlekłe zapalenie i aktywacja komórkowych szlaków stresu), integracja DNA HBV z genomem komórki gospodarza (opisany mechanizm dla obu tych zjawisk) została słabo zbadana. Głównym powodem jest brak odpowiednich systemów zakażenia in vitro HBV, które umożliwiają niezawodne wykrywanie zdarzeń integracyjnych. W tym miejscu opisujemy niedawno opracowany protokół zarówno do generowania in vitro, jak i wykrywania integracji DNA HBV, który można wykorzystać do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów molekularnych i ich konsekwencji.
Replikacja HBV i tworzenie integracji DNA HBV zostały wcześniej szczegółowo przeanalizowane7. Krótko mówiąc, HBV wnika do hepatocytów za pomocą peptydu kotransportującego taurocholan sodu (NTCP) jako głównego receptora komórkowego infekcji8,9. Nukleokapsydy HBV zawierające genom kolistego DNA rozluźnionego przez HBV (rcDNA) wchodzą do jądra, gdzie rcDNA jest przekształcane w episomalny kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA (cccDNA). Jądrowe cccDNA działa jako matryca transkrypcyjna dla wirusowych mRNA i pregenomicznego RNA (pgRNA)10. Polimeraza HBV i pgRNA są następnie pakowane w nowo utworzone nukleokapsydy (złożone z dimerów białka rdzeniowego HBV). pgRNA HBV jest transkrybowane wstecznie w nukleokapsydzie, w wyniku czego powstaje genom rcDNA lub genom dwuniciowego liniowego DNA (dslDNA)11,12. Te dojrzałe nukleokapsydy zawierające genomy DNA HBV są ostatecznie otoczone i eksportowane jako wiriony.
Zakażenie hepatocytów przez otoczkowe cząstki zawierające cząsteczki dslDNA może spowodować integrację wirusa z genomem komórki gospodarza13, prowadząc do niekompetentnych form replikacji DNA HBV7,14,15. Integracja DNA HBV zachodzi w miejscu pęknięcia chromosomalnego dwuniciowego DNA15. Coraz więcej dowodów sugeruje, że każde zdarzenie integracji zachodzi w zasadniczo losowej pozycji w genomie komórki gospodarza16,17. Ponadto integracja DNA HBV zachodzi dość rzadko, w tempie 1 na 104 komórek13,18,19,20. Ważne pytania dotyczące integracji DNA HBV pozostają bez odpowiedzi, szczególnie w odniesieniu do dokładnych szlaków molekularnych, zależności od czynników wirusowych i gospodarza, antygenów wirusowych wyrażanych z form zintegrowanych i ich możliwego udziału w trwałości wirusa7. Stworzyliśmy model in vitro, aby rzucić światło na niektóre z tych pytań.
Rzadkość zdarzeń integracji DNA HBV (zarówno w odniesieniu do szybkości integracji na komórkę, jak i liczby kopii każdej unikalnej integracji) w modelach infekcji HBV in vitro sprawia, że są one trudne do wykrycia. Mitoza komórkowa jest ograniczona w naszym systemie in vitro, ponieważ dzielące się komórki nie wspierają skutecznej infekcji. Tak więc, w przeciwieństwie do tkanek wątroby pacjenta, w których występuje znaczna klonalna ekspansja hepatocytów18,19,20, bardzo niewiele (1 do 2) kopii każdej integracji jest obecnych w danej puli komórek zakażonych in vitro. Odkryliśmy również, że integracja zachodzi głównie podczas początkowej infekcji hepatocytów (a nie w sposób ciągły w hepatocytach przewlekle zakażonych)13. W związku z tym integracji DNA HBV nie można zwiększyć poprzez zwykłą hodowlę komórek przez dłuższy czas.
Ogólnie, metody wcześniej używane do wykrywania zintegrowanego DNA HBV, w tym hybrydyzacja Southern blot21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27, ligacja za pośrednictwem kasety PCR28 i sekwencjonowanie całego genomu29,30,31,32,33, nie mają wystarczającej czułości do wykrywania pojedynczych kopii integracji. Wraz z innymi badaczami użyliśmy odwróconego zagnieżdżonego PCR (invPCR) do wykrycia integracji DNA hepadnawirusa w wątrobach zakażonych kaczek, świstaków i ludzi13,14,18,19,34,35,36. Inni wprowadzili modyfikacje proceduralne do techniki invPCR, które mogą zmienić generowanie sygnałów fałszywie dodatnich i ograniczyć zdolność do kwantyfikacji37. Jeśli test jest przeprowadzany zgodnie z opisem w niniejszym protokole, invPCR stanowi specyficzny i czuły test, który identyfikuje i określa ilościowo (w bezwzględnej liczbie kopii) wielokrotne integracje DNA HBV. Połączenie DNA komórki HBV jest sekwencjonowane z rozdzielczością pojedynczej pary zasad, co pozwala na bioinformatyczne badania sekwencji DNA wirusa i gospodarza w miejscach integracji13.
Wcześniej opisaliśmy38 wyniki z invPCR na DNA zakażonej HBV tkanki ekstrahowanej z wielu różnych źródeł, w tym tkanek wątroby zamrożonych w zatrzasku, skrawków wątroby zatopionych w parafinie oraz bardzo małych próbek tkanek wyizolowanych za pomocą laserowej mikrodysekcji19. Protokół ten przedstawia zaktualizowaną wersję testu invPCR z wykorzystaniem DNA wyekstrahowanego z tkanek pochodzących z hodowli komórkowych po zakażeniu in vitro, w którym generowana jest niska liczba kopii integracji (1–2 kopie na integrację). Integracje DNA HBV powstałe in vitro przypominają te znajdujące się w tkankach pacjenta pod względem ich rozmieszczenia w genomie komórkowym i połączenia w sekwencji wirusa, która jest zintegrowana13,16, co sugeruje porównywalną ścieżkę do zakażonej wątroby.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Inaktywacja termiczna przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina, 10 000 U/ml; Streptomycyna 10 mg / ml, 100 i razy;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna, 0,5 mg/ml; EDTA, 0,22 mg / ml, 1 i razy;</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td>Zapas przy 40% w/v w 1xPBS, autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>DMSO do spektroskopii</td><td>Merck</td><td>102950</td><td></td></tr><tr><td>Tenofovir disoproxil</td><td>Sigma-Aldrich CDS021622</td><td></td><td>Rozpuścić w DMSO</td></tr><tr><td>Lamiwudyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1295</td><td>Rozpuścić w</td></tr><tr><td>DMSO Zestaw tkanek NucleoSpin</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.250</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>433209</tr><tr><td>Dekstran (35-45 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1662-10G</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>BsiHKAI</td><td>NEB</td><td>R0570L</td><td></td></tr><tr><td>SphI-HF</td><td>NEB</td><td>R3182L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Amplitaq Gold Taq</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331816</td><td>Użyj po raz pierwszy nest PCR</td></tr><tr><td>Silikonowe maty uszczelniające do 96-dołkowych płytek PCR</td><td>Biorad</td><td>2239442</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR Roztwór do degradacji DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6509 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>96-pinowy replikator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Flexi PCR</td><td>Promega</td><td>M8295</td><td>Stosować do drugiego gniazda PCR, użyć zielonego bufora do łatwego ładowania żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Biozym LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie zintegrowanego wirusowego dna o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu b

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest powszechnym patogenem przenoszonym przez krew, powodującym raka wątroby i marskość wątroby wynikającą z przewlekłej infekcji. Wirus na ogół replikuje się przez pośredni episomalny DNA; zaobserwowano jednak integrację fragmentów DNA HBV z genomem gospodarza, mimo że ta forma nie jest konieczna do replikacji wirusa. Dokładny cel, czas i mechanizm(y), za pomocą których zachodzi integracja DNA HBV, nie jest jeszcze jasna, ale ostatnie dane pokazują, że następuje ona bardzo wcześnie po zakażeniu. W tym miejscu szczegółowo opisano wytwarzanie in vitro i wykrywanie integracji DNA HBV. Nasz protokół specyficznie amplifikuje pojedyncze kopie integracji DNA wirusa i komórki i umożliwia zarówno bezwzględną kwantyfikację, jak i rozdzielczość pojedynczej pary zasad sekwencji połączeniowej. Technika ta została zastosowana do różnych typów komórek podatnych na HBV (w tym pierwotnych ludzkich hepatocytów), do różnych mutantów HBV oraz w połączeniu z różnymi ekspozycjami na leki. Przewidujemy, że ta technika stanie się kluczowym testem do określenia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tego klinicznie istotnego zjawiska.

Schematyczna reprezentacja techniki invPCR przedstawiona jest na Ryc. 1. Przykład elektroforezy w żelu agarozowym dla udanej reakcji invPCR przed i po izolacji produktu PCR pokazano na Ryc. 2. Ryc. 3 przedstawia wyniki analizy BLAST z kroku 5.1 w przypadku (i) amplifikacji miejsca złączenia DNA wirusa z komórką oraz (ii) amplifikacji pośrednika replikacyjnego DNA HBV.
Oczekiwane wyniki dla kontroli pozytywnych: komórki Huh7-NTCP zainfekowane zapasami HBV oczyszczonymi za pomocą heparyny, zgodnie z powyższym opisem (Rycina 1), mogą służyć jako kontrola pozytywna. W tym przypadku pojedyncze produkty PCR powinny zostać uzyskane przy drugim lub trzecim rozcieńczeniu 1:3 każdej próbki (co odpowiada ~104 ekwiwalentom komórek na rozcieńczenie, Rycina 2). Przy tych rozcieńczeniach około 50% produktów będzie reprezentować rzeczywiste połączenia DNA wirus-komórka, natomiast druga połowa będzie reprezentować amplifikację produktów pośrednich DNA HBV (Rycina 3).
W poprzednich badaniach13 stwierdziliśmy niewielką liczbę przypadków powtarzających się złączy wirus-komórka, co sugeruje brak preferencyjnych miejsc w genomie komórkowym dla integracji HBV DNA. Odnotowaliśmy również, że &gt;80% złączy wirus-komórka występuje pomiędzy nukleotydami 1732 a 1832 (zgodnie z numeracją nukleotydową HBV genotypu D, GenBank Accession #U95551.1), gdzie ten ostatni stanowi prawy koniec formy HBV dslDNA. Sekwencje rzeczywistych złączy wirus-komórka, zidentyfikowane za pomocą naszej metody w eksperymentach in vitro, są publicznie dostępne w bazie GenBank (numery akcesyjne od MH057851 do MH058006).
Oczekiwane wyniki dla kontroli negatywnych: Jako kontrole negatywne mogą służyć niezinfekowane komórki Huh7-NTCP lub zinokulowane komórki Huh7-NTCP poddane wstępnej inkubacji z Myrcludex B. Analiza InvPCR DNA wyekstrahowanego z tych komórek nie powinna przynieść żadnych produktów PCR. Przetwarzanie próbek kontroli negatywnej na tej samej płytce PCR co próbki pozytywne pozwala na sprawdzenie obecności zanieczyszczeń krzyżowych podczas procesu nested-PCR. Najbardziej rygorystycznym testem na zanieczyszczenia krzyżowe jest umieszczenie próbki kontroli negatywnej w studzienkach A-D oraz próbki pozytywnej w studzienkach E-H na płytce 96-dołkowej. W takim przypadku najbardziej skoncentrowane rozcieńczenie próbki pozytywnej znajduje się w rzędzie bezpośrednio sąsiadującym z najmniej skoncentrowanym rozcieńczeniem próbki negatywnej. Jeśli w próbkach kontroli negatywnej zostaną zaobserwowane produkty amplifikacji, należy zastosować środki sugerowane w dyskusji w celu zminimalizowania zdarzeń związanych z zanieczyszczeniem krzyżowym.
<img alt="Schemat linearyzacji i trawienia DNA enzymami NcoI i BsiHKAI oraz ligazą T4." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procesu invPCR służącego do wykrywania integracji HBV DNA. Po infekcji HBV tylko mniejszość komórek Huh7-NTCP zawiera HBV dslDNA (czerwony) zintegrowany z genomem komórki gospodarza (czerwony), co przedstawiono w górnej sekcji. Następnie z komórek ekstrahuje się całkowite DNA (krok 1), odwraca jego orientację (krok 2) i przeprowadza amplifikację za pomocą nested PCR (krok 3). Przedstawiono względne położenia miejsc cięcia enzymów restrykcyjnych (NcoI i BsiHKAI) w wyciętym fragmencie złącza DNA wirusa i komórki. Rycina została zaadaptowana z poprzedniej publikacji13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej, proces izolacji prążków DNA, porównanie serii rozcieńczeń, analiza eksperymentalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Elektroforeza w żelu agarozowym i następująca po niej ekstrakcja z żelu udanej reakcji invPCR. „M” oznacza marker wielkości DNA. Każdy rząd 12 studni reprezentuje powtórzenia techniczne dla pojedynczego rozcieńczenia na płytce PCR. Na jednej płytce PCR/żelu agarozowym można przeprowadzić analizę dwóch inwertowanych próbek DNA. Produkty PCR dla każdego rozcieńczenia powinny miareczkować się w stosunku ok. 1:3. Wyekstrahowanie produktów z dwóch najmniej stężonych rozcieńczeń, w których można łatwo wyizolować pojedyncze prążki, jest zazwyczaj wystarczające, ponieważ stopień integracji DNA HBV jest określany przez miareczkowanie punktu końcowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat dopasowania sekwencji; złącze wirus-komórka i produkt wirus-wirus; wyniki bioinformatyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza BLAST sekwencji produktów invPCR. Dzięki uzyskaniu długich fragmentów sekwencji w metodzie sekwencjonowania Sangera, źródło sekwencji DNA jest zazwyczaj jednoznaczne. Na górnym panelu, w różnych obszarach pliku sekwencji FASTA wygenerowanego z sekwencjonowania Sangera, obserwuje się silne dopasowanie do genomów HBV i komórkowych, co sugeruje obecność rzeczywistego złącza DNA wirus-komórka. Na dolnym panelu sekwencja dopasowuje się jedynie do fragmentów genomu HBV, co sugeruje produkt powstały w wyniku amplifikacji przeorganizowanego genomu HBV DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy tutaj generowanie in vitro DNA HBV za pomocą systemu infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i bardzo czułe wykrywanie jego (1-2 kopii) integracji za pomocą odwrotnego zagnieżdżonego PCR.

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wirusowego zapalenia wątroby typu B, takie jak znalezienie czynników komórkowych lub wirusologicznych, które wpływają na integrację DNA HPV. Technika ta ma wiele zalet. Jest stosunkowo tani i łatwy do przeprowadzenia, analiza wyników jest prosta i bardzo czuła, aż do pojedynczych kopii.Chociaż metoda ta może być stosowana w celu uzyskania wglądu w integrację HBV, może być również stosowana w przypadku innych wirusów, które integrują się z genomem komórki gospodarza, takich jak HIV, HTLV-1 lub HPV. Aby zainfekować komórki, wysiewaj 200 000 komórek na mililitr na płytce dwunastomodeniowej z 1 mililitrem D-mem. Następnego dnia użyj oczyszczonej kolumny z heparyną su-per-na-din z HEP-AD 38 jako inokulantu do zakażenia komórek w ilości 1 000 VGE na komórkę, w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej.Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, następnego dnia, umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem sterylnego jednorazowego PBS. Następnie wymieniaj pożywkę co 2 dni, aż do zbiorów.W 3 dniu po zakażeniu należy potraktować komórki 5 mikromolowym dizoproksylem tenofowiru i 10 mikromolową lamiwudyną, aby ograniczyć wytwarzanie replikacyjnych produktów pośrednich HBV, które są amplifikowane przez odwrotną reakcję PCR. W 5 dniu, po zakażeniu, trypsynizuj niektóre komórki za pomocą 200 mikrolitrów Trypsyny EDTA i ponownie zawiesić je w 2 mililitrach D-mem zawierającej 5 mikromolowych dizoproksylów tenofowiru i 10 mikromolowych lamiwudyn. Następnie przenieś zawiesiny komórek na płytkę z sześcioma dołkami, aby wywołać jedną rundę mitozy.W 7 dniu po zakażeniu trypsynizować rozprężone komórki w 400 mikrolitrach Trypsyny EDTA i zawiesić mieszaninę w 1 mililecie D-mem. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej tubki. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 razy G przez pięć minut.I usuń Su-per-na-din przez aspirację. Wyodrębnij DNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcją producenta. W celu odwrócenia DNA należy przydzielić od 1,5 do 2,5 mikrograma całkowitego ekstraktu DNA do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów.Następnie dodaj odpowiednią ilość głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać 40 mikrolitrów objętości reakcji, zawierającą 1 razy bufor reakcji trawienia i 10 jednostek NCO-1HF. Inkubuj reakcję enzymu restrykcyjnego w maszynie do PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby uzyskać optymalną wydajność trawienia. Następnie dezaktywuj enzym restrykcyjny, inkubując go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut.Przenieś całą reakcję enzymu restrykcyjnego do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 400 mikrolitrów 1 razy buforu ligazy DNA T4 i 500 jednostek ligazy DNA T4 i dokładnie wymieszaj. Duża objętość reakcji sprzyja wewnątrzcząsteczkowej ligacji strawionych fragmentów DNA.Inkubować reakcję ligacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby zapewnić pełne podwiązanie. Po 2 godzinach dezaktywuj ligazę DNA T4 w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 10 dodedecylosiarczanu sodu, aby zapewnić całkowitą inaktywację ligazy T4.Dodaj chlorek sodu do końcowego stężenia 100 milimoli i dekstran do końcowego stężenia 90 mikrogramów na mililitr. Wymieszać przez wirowanie impulsowe i krótko odwirować mieszaninę reakcyjną. Następnie dodaj 900 mikrolitrów 100 etanolu i wymieszaj przez odwrócenie.Wytrącić DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. I osadzać wytrącone DNA przez odwirowanie w temperaturze 14000 razy G przez 15 minut. Następnie usuń Su-per-na-dine przez aspirację.Umyj granulat 500 mikrolitrami 70 etanolu. I wirowanie w temperaturze 14000 razy G przez 15 minut. Następnie usuń etanol przez aspirację i wysusz osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Rozpuść osad w 20 mikrolitrach wody i dodaj 20 mikrolitrów głównej mieszanki enzymów ograniczających, aby uzyskać objętość reakcji 40 mikrolitrów, zawierającą 1 razy bufor reakcji trawienia, 5 jednostek BSIHK-1 i 5 jednostek SPH-1HF. Zagnieździć, inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę. Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną, inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 1 godzinę.W tej procedurze należy usunąć potencjalne amplikony z uszczelki wielokrotnego użytku z maty silikonowej za pomocą roztworu do degradacji DNA. Dokładnie spłucz matę wodą bez DNA i wysusz ją na powietrzu w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj jeden milileter 1-krotnej mieszanki PCR zawierającej zewnętrzne startery do przodu i do tyłu w stężeniu 0,5 mikromola.Dodać 170 mikrolitrów, jeśli 1-krotny roztwór PCR miesza się do dołków A-1 i E-1, w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj 120 mikrolitrów mieszanki 1 razy PCR do studzienek B-1 i H-1. Następnie dodaj 10 mikrolitrów odwróconego DNA do studzienek A-1 i E-1.Wymieszaj reakcję w każdym dołku, delikatnie pipetując każdą, około 10 razy, używając P-1000 ustawionego na 100 mikrolitrów. Próbki należy rozcieńczyć seryjnie z dołków A-1 do D-1 w stosunku 1:3, przenosząc 60 mikrolitrów na każdym etapie. Mieszaj dołki na każdym etapie, delikatnie pipetując je około 10 razy za pomocą P-1000 ustawionego na 100 mikrolitrów.Unikać tworzenia się pęcherzyków, powtórzyć procedurę dla studzienki E-1, rozcieńczając do studzienki H-1. Następnie przydzielić 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej, za pomocą pipety wielokanałowej, z dołków A-1, H-1 do studzienek A-2, H2, A-3, H-3 i tak dalej, aż do osiągnięcia studzienek A-12, H-12 płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę PCR suchą matą silikonową i mocno dociśnij.Następnie umieść płytkę w maszynie do PCR i uruchom wskazany program przed przeniesieniem płytki do temperatury pokojowej. Następnie podgrzej piny 96-pinowego replikatora do czerwoności za pomocą palnika Bunsena, a następnie schładzaj przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij dołki drugiej płytki PCR 10 mikrolitrami 1-krotnej mieszanki PCR, zawierającej bufor gotowy do użycia żelu, a wewnętrzną do przodu i do tyłu przy 0,5 mikromola.Ostrożnie usuń matę silikonową z płytki PCR płytki 96-dołkowej z pierwszej rundy PCR i unikaj zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami. Użyj schłodzonego replikatora, aby przenieść produkty PCR z płytki 96-dołkowej, z pierwszej rundy PCR, na nowo przydzieloną płytkę 96-dołkową. Przeprowadź zagnieżdżony PCR, używając warunku zgodnie ze wskazaniami.Aby wyizolować produkty PCR, przeanalizuj je za pomocą elektroforezy żelowej, używając płytki 96-dołkowej, z 1,3 żelem agarozowym. W przypadku 100-mililitrowego żelu agarozowego uruchom przy napięciu 200 woltów przez 10 do 15 minut. Następnie wytnij pasma DNA z żeli agarozowych za pomocą jednorazowych słomek do napojów.Dla każdego produktu PCR umieść słomkę i korek z żelu agarozowego w tubce o pojemności 1,5 mililitra, przytnij słomkę na wymiar nożyczkami. Następnie wyrzuć zatyczki agarozowe do każdej rurki, ściskając koniec fragmentu słomy. Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do ekstrakcji żelu i 5 mikrolitrów szklanych kulek do ekstrakcji żelu do każdej probówki.Ekstrahuj produkty PCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji żelu i rozcieńcz DNA z kulek 30 mikrolitrami wody. Prześlij oczyszczone DNA do sekwencjonowania Sangera, z przednim starterem użytym w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR. Przykładowa elektroforeza w żelu agarozowym udanego odwróconego PCR, przed i po izolacji produktu PCR, jest pokazana tutaj.M oznacza marker DNA na końcu, każdy rząd 12 reprezentuje kontrpróby techniczne w pojedynczym rozcieńczeniu na płytce PCR. W takim przypadku pojedyncze produkty PCR należy uzyskać przez drugie lub trzecie rozcieńczenie każdej próbki w stosunku 1:3. Przy tych rozcieńczeniach około 50% produktów będzie reprezentować prawdziwe połączenia DNA komórek wirusa.Podczas gdy druga połowa reprezentuje amplifikację produktów pośrednich DNA HBV. Technika ta pozwoliła naukowcom zbadać integrację DNA HPV w wysoce kontrolowanych systemach infekcji in vitro. Aby odpowiedzieć na dalsze pytania, można zastosować dodatkowe metody, takie jak analiza biotemyczna.Na przykład, jeśli integracja DNA HPV zachodzi w określonych regionach genomu komórkowego. Nie zapominaj, że praca z infekcją wirusem zapalenia wątroby typu B może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przeprowadzać odpowiednie kontrole infekcji, takie jak gabinety bezpieczeństwa biologicznego i wcześniejsze szczepienia.

detection-low-copy-number-integrated-viral-dna-formed-vitro-hepatitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Ten film demonstruje technikę in vitro do wykrywania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) za pomocą rekombinowanego systemu reporterowego HBV. Po zakażeniu komórek gospodarza rekombinowany genom wirusa wykazuje ekspresję enzymu reporterowego lucyferazy, który wytwarza bioluminescencję po utlenieniu substratu - pomagając wykryć infekcję wirusową.

System reporterowy rekombinowanego wirusa in vitro do wykrywania infekcji wirusowych

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest głównym ludzkim patogenem, który powoduje choroby wątroby, w tym marskość wątroby i raka. System hodowli komórek zakaźnych HCV jest niezbędny do zrozumienia molekularnego mechanizmu replikacji HCV i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół badania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Wykrywanie i kwantyfikacja DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w czasie rzeczywistym oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) jest czułą i dokładną metodą diagnozowania i monitorowania zakażenia HBV. W tym miejscu przedstawiamy protokół detekcji DNA HBV i pomiaru wiremii w próbce.

Wykrywanie i kwantyfikacja DNA wirusa zapalenia wątroby typu B w czasie rzeczywistym w oparciu o reakcję łańcuchową polimerazy

Nie ma standardowego testu neutralizacji wirusa dostępnego dla wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV), niecytopatycznego wirusa RNA z dodatnią polaryzacją. Tutaj opisano test neutralizacji oparty na redukcji fluorescencji (FRNT) – oparty na ilościowym zważeniu białka kapsydu wirusa z oznaczeniem fluorescencyjnym do oceny skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.

Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

Poznaj metodę wykrywania zintegrowanego DNA wirusa zapalenia wątroby typu B z wysoką czułością. Protokół umożliwia ilościowe oznaczanie i mapowanie miejsc integracji wirusa z genomem gospodarza.

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

Przeglądaj więcej filmów