Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące wirusowego zapalenia wątroby typu B, takie jak znalezienie czynników komórkowych lub wirusologicznych, które wpływają na integrację DNA HPV. Technika ta ma wiele zalet. Jest stosunkowo tani i łatwy do przeprowadzenia, analiza wyników jest prosta i bardzo czuła, aż do pojedynczych kopii.

Chociaż metoda ta może być stosowana w celu uzyskania wglądu w integrację HBV, może być również stosowana w przypadku innych wirusów, które integrują się z genomem komórki gospodarza, takich jak HIV, HTLV-1 lub HPV. Aby zainfekować komórki, wysiewaj 200 000 komórek na mililitr na płytce dwunastomodeniowej z 1 mililitrem D-mem. Następnego dnia użyj oczyszczonej kolumny z heparyną su-per-na-din z HEP-AD 38 jako inokulantu do zakażenia komórek w ilości 1 000 VGE na komórkę, w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej.

Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie, następnego dnia, umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem sterylnego jednorazowego PBS. Następnie wymieniaj pożywkę co 2 dni, aż do zbiorów.

W 3 dniu po zakażeniu należy potraktować komórki 5 mikromolowym dizoproksylem tenofowiru i 10 mikromolową lamiwudyną, aby ograniczyć wytwarzanie replikacyjnych produktów pośrednich HBV, które są amplifikowane przez odwrotną reakcję PCR. W 5 dniu, po zakażeniu, trypsynizuj niektóre komórki za pomocą 200 mikrolitrów Trypsyny EDTA i ponownie zawiesić je w 2 mililitrach D-mem zawierającej 5 mikromolowych dizoproksylów tenofowiru i 10 mikromolowych lamiwudyn. Następnie przenieś zawiesiny komórek na płytkę z sześcioma dołkami, aby wywołać jedną rundę mitozy.

W 7 dniu po zakażeniu trypsynizować rozprężone komórki w 400 mikrolitrach Trypsyny EDTA i zawiesić mieszaninę w 1 mililecie D-mem. Następnie przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej tubki. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 razy G przez pięć minut.

I usuń Su-per-na-din przez aspirację. Wyodrębnij DNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, zgodnie z instrukcją producenta. W celu odwrócenia DNA należy przydzielić od 1,5 do 2,5 mikrograma całkowitego ekstraktu DNA do probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów.

Następnie dodaj odpowiednią ilość głównej mieszanki enzymów restrykcyjnych, aby uzyskać 40 mikrolitrów objętości reakcji, zawierającą 1 razy bufor reakcji trawienia i 10 jednostek NCO-1HF. Inkubuj reakcję enzymu restrykcyjnego w maszynie do PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby uzyskać optymalną wydajność trawienia. Następnie dezaktywuj enzym restrykcyjny, inkubując go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Przenieś całą reakcję enzymu restrykcyjnego do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 400 mikrolitrów 1 razy buforu ligazy DNA T4 i 500 jednostek ligazy DNA T4 i dokładnie wymieszaj. Duża objętość reakcji sprzyja wewnątrzcząsteczkowej ligacji strawionych fragmentów DNA.

Inkubować reakcję ligacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby zapewnić pełne podwiązanie. Po 2 godzinach dezaktywuj ligazę DNA T4 w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 10 dodedecylosiarczanu sodu, aby zapewnić całkowitą inaktywację ligazy T4.

Dodaj chlorek sodu do końcowego stężenia 100 milimoli i dekstran do końcowego stężenia 90 mikrogramów na mililitr. Wymieszać przez wirowanie impulsowe i krótko odwirować mieszaninę reakcyjną. Następnie dodaj 900 mikrolitrów 100 etanolu i wymieszaj przez odwrócenie.

Wytrącić DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. I osadzać wytrącone DNA przez odwirowanie w temperaturze 14000 razy G przez 15 minut. Następnie usuń Su-per-na-dine przez aspirację.

Umyj granulat 500 mikrolitrami 70 etanolu. I wirowanie w temperaturze 14000 razy G przez 15 minut. Następnie usuń etanol przez aspirację i wysusz osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Rozpuść osad w 20 mikrolitrach wody i dodaj 20 mikrolitrów głównej mieszanki enzymów ograniczających, aby uzyskać objętość reakcji 40 mikrolitrów, zawierającą 1 razy bufor reakcji trawienia, 5 jednostek BSIHK-1 i 5 jednostek SPH-1HF. Zagnieździć, inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1 godzinę. Krótko odwirować mieszaninę reakcyjną, inkubować reakcję enzymu restrykcyjnego w bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 1 godzinę.

W tej procedurze należy usunąć potencjalne amplikony z uszczelki wielokrotnego użytku z maty silikonowej za pomocą roztworu do degradacji DNA. Dokładnie spłucz matę wodą bez DNA i wysusz ją na powietrzu w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj jeden milileter 1-krotnej mieszanki PCR zawierającej zewnętrzne startery do przodu i do tyłu w stężeniu 0,5 mikromola.

Dodać 170 mikrolitrów, jeśli 1-krotny roztwór PCR miesza się do dołków A-1 i E-1, w 96-dołkowej płytce PCR. Następnie dodaj 120 mikrolitrów mieszanki 1 razy PCR do studzienek B-1 i H-1. Następnie dodaj 10 mikrolitrów odwróconego DNA do studzienek A-1 i E-1.

Wymieszaj reakcję w każdym dołku, delikatnie pipetując każdą, około 10 razy, używając P-1000 ustawionego na 100 mikrolitrów. Próbki należy rozcieńczyć seryjnie z dołków A-1 do D-1 w stosunku 1:3, przenosząc 60 mikrolitrów na każdym etapie. Mieszaj dołki na każdym etapie, delikatnie pipetując je około 10 razy za pomocą P-1000 ustawionego na 100 mikrolitrów.

Unikać tworzenia się pęcherzyków, powtórzyć procedurę dla studzienki E-1, rozcieńczając do studzienki H-1. Następnie przydzielić 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej, za pomocą pipety wielokanałowej, z dołków A-1, H-1 do studzienek A-2, H2, A-3, H-3 i tak dalej, aż do osiągnięcia studzienek A-12, H-12 płytki 96-dołkowej. Przykryj płytkę PCR suchą matą silikonową i mocno dociśnij.

Następnie umieść płytkę w maszynie do PCR i uruchom wskazany program przed przeniesieniem płytki do temperatury pokojowej. Następnie podgrzej piny 96-pinowego replikatora do czerwoności za pomocą palnika Bunsena, a następnie schładzaj przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej. Napełnij dołki drugiej płytki PCR 10 mikrolitrami 1-krotnej mieszanki PCR, zawierającej bufor gotowy do użycia żelu, a wewnętrzną do przodu i do tyłu przy 0,5 mikromola.

Ostrożnie usuń matę silikonową z płytki PCR płytki 96-dołkowej z pierwszej rundy PCR i unikaj zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami. Użyj schłodzonego replikatora, aby przenieść produkty PCR z płytki 96-dołkowej, z pierwszej rundy PCR, na nowo przydzieloną płytkę 96-dołkową. Przeprowadź zagnieżdżony PCR, używając warunku zgodnie ze wskazaniami.

Aby wyizolować produkty PCR, przeanalizuj je za pomocą elektroforezy żelowej, używając płytki 96-dołkowej, z 1,3 żelem agarozowym. W przypadku 100-mililitrowego żelu agarozowego uruchom przy napięciu 200 woltów przez 10 do 15 minut. Następnie wytnij pasma DNA z żeli agarozowych za pomocą jednorazowych słomek do napojów.

Dla każdego produktu PCR umieść słomkę i korek z żelu agarozowego w tubce o pojemności 1,5 mililitra, przytnij słomkę na wymiar nożyczkami. Następnie wyrzuć zatyczki agarozowe do każdej rurki, ściskając koniec fragmentu słomy. Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do ekstrakcji żelu i 5 mikrolitrów szklanych kulek do ekstrakcji żelu do każdej probówki.

Ekstrahuj produkty PCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji żelu i rozcieńcz DNA z kulek 30 mikrolitrami wody. Prześlij oczyszczone DNA do sekwencjonowania Sangera, z przednim starterem użytym w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR. Przykładowa elektroforeza w żelu agarozowym udanego odwróconego PCR, przed i po izolacji produktu PCR, jest pokazana tutaj.

M oznacza marker DNA na końcu, każdy rząd 12 reprezentuje kontrpróby techniczne w pojedynczym rozcieńczeniu na płytce PCR. W takim przypadku pojedyncze produkty PCR należy uzyskać przez drugie lub trzecie rozcieńczenie każdej próbki w stosunku 1:3. Przy tych rozcieńczeniach około 50% produktów będzie reprezentować prawdziwe połączenia DNA komórek wirusa.

Podczas gdy druga połowa reprezentuje amplifikację produktów pośrednich DNA HBV. Technika ta pozwoliła naukowcom zbadać integrację DNA HPV w wysoce kontrolowanych systemach infekcji in vitro. Aby odpowiedzieć na dalsze pytania, można zastosować dodatkowe metody, takie jak analiza biotemyczna.

Na przykład, jeśli integracja DNA HPV zachodzi w określonych regionach genomu komórkowego. Nie zapominaj, że praca z infekcją wirusem zapalenia wątroby typu B może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przeprowadzać odpowiednie kontrole infekcji, takie jak gabinety bezpieczeństwa biologicznego i wcześniejsze szczepienia.