Mikronakłucie przestrzeni Bowmana u myszy ułatwione przez mikroskopię 2-fotonową

Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fizjologii pojedynczych nefronów, w tym szybkości filtracji kłębuszkowej białek i metabolitów ogólnoustrojowych oraz ich wkładu w fizjologię kanalików. Główną zaletą tej techniki mikronakłuwania jest to, że umożliwia ona dostęp do przestrzeni Bowmana i nefronu korowego u wszystkich myszy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona prawidłowo wykonanych kroków przygotowawczych.

Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u nóg, nałóż maść na oczy i użyj taśmy, aby unieruchomić kończyny dorosłej myszy o wadze od 20 do 25 gramów. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć wszystkie włosy po lewej stronie zwierzęcia i użyj śledziony, aby zlokalizować lewą nerkę przez skórę po grzbietowej i ogonowej stronie śledziony. Wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie w skórze, a następnie mniejsze nacięcie w otrzewnej, wystarczająco duże, aby można było przepchnąć nerkę.

Wyciśnij nerkę z delikatnym naciskiem i umieść wokół tkanki polisiloksanową formę stabilizującą nerki. Wyrównaj nerkę z przekładką tak, aby bocznaprawie powierzchnia nerki wystawała poza stabilizator na około jeden milimetr i przymocuj nerkę do formy za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Przyklej płytę głowicy do formy stabilizatora i zamontuj płytę czołową do prętów montażowych na płycie podstawy.

Następnie napełnij studzienkę w podłożu polisiloksanowym jednoprocentowym roztworem agarozy i przytrzymaj 10-milimetrowy szkiełko nakrywkowe na wierzchu formy, aż agaroza będzie twarda. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe do płyty głowicy za pomocą kleju i utwórz pierścień wokół szkiełka nakrywkowego z cementem dentystycznym. Następnie wstrzyknąć od 100 do 150 mikrolitrów FITC-Dekstranu retroorbitalnie i szybko przesunąć mysz i płytkę utrwalającą do stolika mikroskopu dwufotonowego.

Po ręcznym ustawieniu ostrości na powierzchni nerki przełącz się na tryb dwufotonowy bez skanowania i zbadaj okno obrazowania, aby zlokalizować docelowe kłębuszki nerkowe, które znajduje się większe niż 30 mikrometrów poniżej szkiełka nakrywkowego i mniej niż 400 mikrometrów od bocznej torebki nerkowej. Zapisać odległość poprzeczną i pionową do docelowego kłębuszka nerkowego. Następnie zapisz współrzędne etapu x, y i z dla kłębuszków nerkowych.

I na koniec podnieś ogniskową obiektywu o około jeden milimetr w głąb słupa wody, nie zmieniając współrzędnych stopnia x i y. Wbij końcówkę pipety do słupa wody i włącz wzbudzenie DAPI. Przesunąć pipetę w wymiarach x i y do punktu maksymalnej fluorescencji końcówki.

To będzie centrum celu. Zmień ustawienie cytowania x na czerwone białko fluorescencyjne i zwizualizuj pipetę za pomocą okularu, aby umożliwić precyzyjne wyśrodkowanie w widoku oka. Przełącz się z powrotem na dwufotonowy, aby znaleźć pipetę w widoku dwufotonowym na żywo i umieść końcówkę dokładnie na środku obrazu, jest to pozycja rejestracji.

Następnie zapisz obraz pipety i zarejestruj stopień oraz współrzędne sterownika mikropipety. Wyjmij pipetę ze słupa wody w osi x, nie przesuwając osi y i z, a następnie przesuń pipetę z do docelowej współrzędnej z kłębuszków nerkowych i krawędzi nerki. Zanotuj stopień x i oblicz pipetę x na krawędzi nerki, korzystając z odsunięcia od etapu rejestracji x.

Zwiększ stopień x, aby przesunąć stolik w kierunku pipety, aż krawędź nerki znajdzie się daleko po lewej stronie ekranu, pozostając widoczną. Szybko przesuń pipetę na odległość około 100 mikrometrów od krawędzi nerki, którą właśnie obliczyła pipeta X. Zwiększ wzmocnienie czerwieni i zacznij powoli przesuwać końcówkę pipety do krawędzi nerki w ramach obrazowania dwufotonowego na żywo, jednocześnie monitorując histogram czerwonych pikseli.

Powoli kieruj pipetę w osi x do docelowej pipety x kłębuszków nerkowych, obserwując stolik x. Po dotarciu do kłębuszków nerkowych udokumentuj pozycję za pomocą stosu z. Trzymając pipetę na miejscu, ustaw mikropompkę tak, aby wstrzykiwała 100 nanolitrów perfluorodekaliny w ciągu dwóch minut.

Zapewnienie drożności pipety i zmniejszenie zakłóceń spowodowanych zatkaniem pipety podczas jej wprowadzenia. Po czterech do sześciu minutach filtracji ustaw mikropompę tak, aby zasysała do 300 nanolitrów z szybkością do 50 nanolitrów na minutę. Ten piękny, przypowierzchniowy kłębuszek nerkowy wykazuje korzystne obrazowanie ze względu na położenie powierzchni kłębuszków nerkowych na głębokości 20 mikrometrów poniżej torebki nerkowej.

Kłębuszek nerkowy znajduje się jednak zbyt blisko powierzchni, aby można było wykonać mikroiniekcję, ponieważ pipeta uderzyłaby w szkiełko nakrywkowe. Te kłębuszki nerkowe są optymalnie ustawione z bocznymi krawędziami 250 mikrometrów w prawo i wydają się mniej ostre ze względu na załamanie spowodowane ich głębokością 70 mikrometrów od kapsułki. Oba czynniki, które sprawiają, że kłębuszki nerkowe są dostępne.

Na tym typowym obrazie wejścia do nerki, projekcja średniej intensywności ze stosu z z-stackiem z widokami ortogonalnymi ujawnia końcówkę pipety w przestrzeni Bowmana, zwróć uwagę na artefakt widmowy czerwonej końcówki pipety z niezwykle jasnej fluorescencji kropek kwantowych ułożonych na stożkowej części końcówki. W tym przypadku renderowanie objętości ze stosu z osi Z, uzyskane po umieszczeniu pipety w przestrzeni Bowmana, pokazuje końcówkę pipety w przestrzeni przylegającej do kępki kapilarnej. Jeśli zostanie użyta pipeta ze zbyt dużym otworem, torebka nerkowa może pęknąć, powodując krwawienie podtorebkowe i przedostanie się krwi do światła pipety.

Za pomocą tej metody zidentyfikowano 17 białek, głównie o niskiej masie cząsteczkowej, spośród co najmniej dwóch unikalnych peptydów na białko. W połączeniu z tą metodą, inne metody, takie jak spektroskopia, pomiary elektrod wrażliwych na jony i wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych, mogą być wykorzystane do odpowiedzi na pytania dotyczące roli substancji rozpuszczonych w świetle w fizjologii kanalików i kłębuszków nerkowych.