Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit
20 września 2018
Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu podstawowej immunobiologii i badań nad nieswoistymi zapaleniami jelit dotyczące kaskady adhezyjnej komórek odpornościowych wymaganych do naprowadzania do narządów obwodowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to wygodne i proste podejście do odpowiedzi na pytania funkcjonalne w kontekście adhezji komórek w warunkach przepływu. Chociaż metoda ta została opracowana w celu zbadania mechanizmu działania komórkowych przeciwciał przeciw integrynie w chorobach zapalnych jelit, można ją zmodyfikować w celu analizy podobnych problemów w innych stanach zapalnych.
Zacznij od rozciągnięcia kawałka gumowej rurki z jednej strony małymi nożyczkami, aby umożliwić wprowadzenie prostokątnej kapilary na około 0,5 centymetra do rurki. Następnie uszczelnij połączenie folią parafinową. Pokryj kapilarę 20 mikrolitrami interesującego Cię adresu i uszczelnij stronę niepołączoną z rurką folią parafinową z tworzywa sztucznego na co najmniej jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji usuń plastikową folię parafinową i pozwól, aby płyn wsiąkł z kapilary na ręcznik papierowy, aby opróżnić rurkę. Następnie zatkaj kapilary 20 mikrolitrami roztworu blokującego przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bardzo ważne jest, aby nałożyć blokadę na kapilarnę bezpośrednio po usunięciu powłoki, aby uniknąć wysuszenia naczynia włosowatego, ponieważ może to pogorszyć funkcjonalność kodowanych białek.
Podczas gdy naczynia włosowate są blokowane, dodaj 18 mililitrów antykoagulowanej pełnej krwi ludzkiej z 50-mililitrowej probówki i rozcieńcz krew do całkowitej objętości 35 mililitrów za pomocą PBS. Umieść 10 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości pod roztworem krwi i wyizoluj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej przez wirowanie w gradiacji gęstości. Pod koniec separacji przenieś jednojądrzaste komórki krwi obwodowej z granicy faz pożywki gradientu gęstości do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.
I zwiększ całkowitą objętość w probówce do 50 mililitrów ze świeżym PBS. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego PBS do liczenia i zabarwij komórki odpowiednim barwnikiem śledzącym komórki zgodnie z instrukcjami producenta. Pod koniec inkubacji barwienia zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w proporcji 1,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr całkowitego stężenia pożywki RPMI.
Następnie zasiej jeden mililitr komórek w tylu dołkach 48-dołkowej płytki, ile jest w warunkach. I dodać odpowiednią objętość przeciwciała antyintegrynowego do odpowiednich studzienek na jednogodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj pipety P1000, aby kilkakrotnie zawiesić komórki przed przeniesieniem komórek do pojedynczych dwumililitrowych probówek.
Przepłucz każdą studzienkę jednym mililitrem PBS i zbierz popłuczyny w odpowiednich dwumililitrowych probówkach. Po zliczeniu rozpuść komórki przez odwirowanie i ponownie wsuspensuj komórki w odpowiedniej objętości bufora adhezyjnego, aby uzyskać 1,5 razy dziesięć do szóstych komórek na mililitr zawiesiny. Następnie dodać odpowiednią objętość chlorku manganu do każdej probówki do końcowego stężenia jednego milimolowego.
Gdy komórki są gotowe, włącz mikroskop i wybierz odpowiednie filtry i lasery, obiektyw i tryb akwizycji. Usuń plastikową folię parafinową z końcówki kapilary i użyj nożyczek, aby rozciągnąć pięciocentymetrowy kawałek gumowej rurki, aby umożliwić połączenie kapilary z mniejszą rurką. Uszczelnij połączenie między kapilarą a rurką plastikową folią parafinową.
I zamontuj kapilarnę na tacce mocującej. Umieść tackę na uchwycie tacki mikroskopu tak, aby kapilara była ostra. I włóż gumową rurkę do odpowiedniego wycięcia pompy perystaltycznej.
Umieścić niepodłączony koniec rurki w pierwszej probówce zawierającej zawiesinę komórek. I włóż krótką rurkę po drugiej stronie kapilary do 15-mililitrowej rurki, aby zebrać przepływ. Pozwól rurkom napełnić się z prędkością 500 mikrolitrów na minutę, aż zawiesina komórek prawie dotrze do kapilary.
Następnie pozwól kapilarze napełnić się z prędkością przepływu 100 mikrolitrów na minutę. Gdy kapilara zostanie wypełniona komórkami, dostosuj natężenie przepływu do 10 mikrolitrów na minutę i uchwyć poklatkowe obrazy komórek poruszających się powoli przez kapilarnę wzdłuż wewnętrznej strony ściany pokrytej adresyną co dwie sekundy przez łącznie trzy minuty. Gdy zawiesina komórkowa dotrze do wnętrza kapilary, bardzo ważne jest, aby uniknąć jakichkolwiek przerw w przepływie, ponieważ doprowadzi to do statycznej interakcji adresyny integryny, która może wpływać na pomiar.
Przed wyrzuceniem przepuść całą kapilarnę przez okular mikroskopu, aby upewnić się, że przekrój obserwowany na ekranie jest reprezentatywny. Uwolnij rurkę z pompy i pozwól, aby pozostały płyn spłynął z powrotem do dwumililitrowej rurki. Następnie odłącz kapilarnę i rurkę od tacki mocującej i zobrazuj następną kapilarę, jak właśnie pokazano.
Aby ocenić nagrania poklatkowe, otwórz pierwszą sekwencję w odpowiednim oprogramowaniu analitycznym i wyeksportuj pierwsze i ostatnie trzy obrazy jako pliki TIFF. Otwórz trzy początkowe obrazy w ImageJ i wybierz obraz, typ i 32-bitowy, aby przekonwertować obrazy na 32-bitowe. Następnie wybierz kanały obrazu, koloru i scalania, aby scalić obrazy w jeden obraz i przekonwertować obraz kompozytowy na RGB w celu zapisania jako plik TIFF.
Po przekonwertowaniu trzech ostatnich obrazów w ten sam sposób policz białe komórki widoczne na początku i na końcu obrazu kompozytowego. I odejmij liczbę białych komórek na początkowym obrazie od liczby białych komórek na końcowym obrazie. Perfuzja naczyń włosowatych pokrytych ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, ale nie chimerą Isotype Fc z ludzkimi PBMC prowadzi do wyraźnej adhezji, gdy obecna jest jedna z trzech adresin.
W przeciwieństwie do tego, hamowanie oddziaływań adresyny integrynowej za pomocą przeciwciał neutralizujących zwykle prowadzi do wyraźnego spadku adhezji dynamicznej, która jest nieobecna po dodaniu przeciwciał kontrolnych izotypu. Co więcej, traktowanie ludzkich limfocytów T CD4 specyficznymi chemokinami prowadzi do zwiększonej adhezji do adresin w porównaniu z nieleczonymi komórkami ludzkimi. Podejmując próbę tej procedury, bardzo ważne jest, aby pamiętać, że różne czynniki przyczyniają się do dynamicznej adhezji komórek in vivo, których nie można całkowicie podsumować w tym teście.
Możliwe jest jednak dostosowanie testu do bardzo złożonych pytań. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące zróżnicowanego zachowania adhezyjnego typów komórek testowych, możliwe jest również przeprowadzenie konkurencyjnych testów adhezji z różnymi typami komórek oznaczonych różnymi barwnikami śledzącymi komórki. Po jej opracowaniu, technika ta umożliwiła nam zbadanie wpływu różnych przeciwciał antyintegrynowych stosowanych lub obecnie opracowywanych w leczeniu chorób zapalnych jelit.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do przeprowadzania funkcjonalnego testu in vitro w celu analizy dynamicznej adhezji komórek odpornościowych do ścianek naczyń, która jest kluczowa dla kierowania do jelit. Metoda ta pozwala na analizę wpływu przeciwciał przeciwko integrinom, chemiokin i innych czynników na adhezję komórek ludzkich w warunkach przepływu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Imunobiologia
- Badania nad chorobami zapalnymi jelit
- Mechanizmy adhezji komórkowej
Tło
- Dynamiczna adhezja jest niezbędna dla kierowania komórek odpornościowych.
- Ta metoda odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie immunobiologii.
- Może być dostosowana do różnych ustawień chorób zapalnych.
- Zrozumienie kaskady adhezji jest kluczowe dla strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Zbadanie wpływu przeciwciał przeciwko integrinom na adhezję komórek.
- Dostarczenie prostego podejścia do analizy funkcjonalnej.
- Ułatwienie badań nad zachowaniem komórek odpornościowych w warunkach przepływu.
Zastosowanie metod
- Rozciąganie gumowej tętniczki do włożenia kapilary.
- Powlekanie kapilar adresinami.
- Inkubacja w 37 stopniach Celsjusza.
- Uszczelnianie połączeń folią parafinową.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie analizuje dynamikę adhezji komórek.
- Zapewnia wgląd w rolę chemiokin i przeciwciał.
- Wyniki mogą wpłynąć na podejście terapeutyczne w chorobach zapalnych.
Wnioski
- Ta technika jest cennym narzędziem do badań w dziedzinie immunobiologii.
- Może być zmodyfikowana dla różnych stanów zapalnych.
- Zrozumienie mechanizmów adhezji może prowadzić do lepszych metod leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Functional analysis of immune cell adhesion under flow conditions is critical for evaluating anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease. This dynamic adhesion assay provides a physiologically relevant system to assess target engagement and mechanism of action for integrin inhibitors. It supports early-stage de-risking by enabling quantitative comparison of therapeutic candidates before in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of integrin-dependent adhesion mechanisms under shear stress to validate target relevance in IBD pathogenesis.
- Operational Value: Provides a reproducible readout for functional screening of anti-integrin antibodies like vedolizumab and emerging candidates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking antibody treatment to reduced adhesion under defined flow conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative adhesion metrics by comparing cell counts before and after perfusion through addressin-coated capillaries.
- Operational Value: Uses standardized perfusion parameters (10 µL/min flow rate, 3-minute capture) to ensure reproducible dynamic adhesion measurements.
- Assay Readiness: Compatible with multiplexing via competitive adhesion assays using differentially labeled cell types to compare therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human immune cell homing dynamics using primary PBMCs and physiologically relevant addressins (ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1).
- Translational Continuity: Bridges in vitro target modulation with ex vivo functional outcomes predictive of tissue-specific immune cell recruitment.
- Preclinical Utility: Enables dose-response analysis of neutralizing antibodies to inform lead optimization and biomarker strategy.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional adhesion data that informs go/no-go decisions for anti-adhesion candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of integrin blockade effects on cell adhesion under flow, clarifying mechanism of action for therapeutic antibodies.
- Screening: Delivers quantitative, perfusion-based adhesion outputs that enable comparison across antibody candidates and chemokine-modulated conditions.
- Analytics: Employs time-lapse imaging and cell counting to generate subtractive adhesion scores (ending minus starting cell count) as a functional endpoint.
- Translational Research: Uses human PBMCs and disease-relevant addressins to enhance predictive confidence for IBD-specific immune cell trafficking.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other inflammatory disease models and cell types, supporting platform reuse across immunology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in anti-integrin antibody function by providing direct, real-time visualization of adhesion inhibition.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, perfusion, and imaging steps to improve reproducibility across laboratories and projects.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by validating functional target engagement before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of adhesion-modulating therapeutics based on quantitative, mechanism-linked functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, perfusion microscopy, and time-lapse image analysis for accurate adhesion quantification.
- Depends on specialized instrumentation including microscopes with flow chambers, peristaltic pumps, and environmental control at 37°C.
- Necessitates standardization of addressin coating, blocking, and perfusion protocols to minimize variability in adhesion readouts.
- Must account for physiological complexity limitations; the assay simplifies in vivo adhesion cascades and may not capture all contributing factors.
- Adaptation to alternative cell types or addressins requires re-optimization of cell concentration, flow rates, and incubation times.
