Name: Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit. Ta metoda pozwala badać adhezję komórek odpornościowych ludzkich pod przepływem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania CN, IA, MFN i SZ były wspierane przez Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (IZKF) oraz program ELAN Uniwersytetu Erlangen-Norymberga, Else Kröner-Fresenius-Stiftung, Fritz-Bender-Stiftung, Niemiecką Fundację Leśniowskiego-Crohna i Zapalenia Jelita Grubego (DCCV), Grupę Badań Klinicznych CEDER Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (DFG), program tematyczny DFG dotyczący mikrobioty, Emerging Field Initiative oraz Centra Badawcze DFG 643, 796 i 1181.

Badania opisane w poniższych sekcjach zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Etyki Uniwersytetu Friedricha-Alexandra w Erlangen-Norymberdze.
1. Przygotowanie naczyń włosowatych
<ol>
	<li>Podłącz prostokątne kapilary do gumowej rurki, rozciągając rurkę z jednej strony małymi nożyczkami i ostrożnie wkładając kapilar (około 0,5 cm) do rurki. Uszczelnij połączenie między kapilarą a rurką za pomocą plastikowej folii parafinowej.</li>
	<li>Pokryj kapilarę 20 μl adresyny (rekombinowana chimera Fc; 5 μg/ml adresyny, np. MAdCAM-1, w buforze powlekającym (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) lub odpowiednim roztworem kontrolnym izotypu za pomocą pipety p20 (płyn wsiąka w kapilarę). Następnie uszczelnić stronę, która nie jest połączona z rurką, folią parafinową z tworzywa sztucznego i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Użyć kapilary wypełnionej wyłącznie buforem powlekającym lub odpowiednią kontrolą izotypu jako kontrolą ujemną.</li>
	<li>Usunąć folię parafinową z tworzywa sztucznego z końcówki kapilary, opróżnić powłokę, pozwalając płynowi wypłynąć z kapilary na ręczniku papierowym i zatkać kapilary na co najmniej 1 godzinę 20 μl roztworu blokującego (1x PBS z 5% BSA) w temperaturze 37 °C. Uszczelnić otwartą stronę kapilary folią parafinową z tworzywa sztucznego. Nie usuwaj roztworu blokującego przed przystąpieniem do mikroskopii.</li>
</ol>
2. Izolacja, leczenie i przygotowanie komórek do mikroskopii
UWAGA: Te kroki mogą być wykonywane podczas okresów inkubacji niezbędnych do przygotowania kapilary.
<ol>
	<li>Pobrać 18 ml pełnej krwi ludzkiej z antykoagulacją za pomocą aseptycznego zestawu do pobierania krwi z żyły łokciowej osób zgłaszających się na ochotnika (np. pacjentów z IBD i/lub zdrowych osób z grupy kontrolnej) po uzyskaniu świadomej pisemnej zgody zgodnie z przepisami lokalnej komisji etycznej. 
	UWAGA: Ten krok powinien być wykonywany wyłącznie przez przeszkolony i doświadczony personel medyczny zgodnie z przepisami krajowymi i/lub lokalnymi.</li>
	<li>Wlej krew do probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz do objętości 35 ml za pomocą 1x PBS. Następnie mieszaninę krwi i PBS należy podłożyć 10 ml pożywki o gradiencie gęstości.</li>
	<li>Wirowanie w gradiencie gęstości należy przeprowadzić przez 15 minut przy 800 x g i temperaturze 24 °C bez przerwy w celu oddzielenia komórek.</li>
	<li>Zbierz komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), odsysając warstwę białych krwinek bezpośrednio na warstwę pożywki gradientu gęstości (przezroczysta warstwa środkowa). Przenieść PBMC do świeżej probówki o pojemności 50 ml, napełnić do 50 ml 1x PBS i wirować przez 10 minut przy 300 x g i 10 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml 1x PBS, a następnie policzyć liczbę komórek, np. za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera.</li>
	<li>Opcjonalnie: Aby zbadać adhezję granulocytów, wykonaj następującą procedurę. W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.7 lub 2.8.
	<ol>
		<li>Zebrać warstwę granulocytów (najniższą warstwę po odwirowaniu w gradiacji gradientu gęstości, zawierającą również erytrocyty). Zawieś komórki w 40 ml 1x PBS. Następnie dodaj 8 ml 6% dekstranu do 1x PBS, delikatnie wymieszaj i pozwól komórkom osadzać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Erytrocyty opadną na dno probówki, podczas gdy granulocyty pozostaną w zawiesinie.</li>
		<li>Po 30 minutach zebrać sklarowany osad, przenieść do świeżej probówki o pojemności 50 ml i wirować przez 6 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i poddać lizie pozostałe erytrocyty, dodając 5 ml 0,2% NaCl do ddH2O. Inkubować przez 1 minutę.</li>
		<li>Dodać 5 ml 1,4% NaCl do ddH2O i inkubować przez kolejną minutę. Zatrzymać hipotoniczną lizę, dodając 20 ml 1x PBS i wirować przez 6 minut w temperaturze 300 x g i 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml 1x PBS. Następnie policz numery komórek za pomocą komory do liczenia komórek Neubauera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie: Aby zbadać adhezję podzbiorów PBMC, należy oczyścić różne typy lub podzbiory komórek (np. Limfocyty T CD4 + i CD8 + lub limfocyty B CD19 +) za pomocą mikrogranulek zgodnie z protokołem producenta lub przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). W przeciwnym razie przejdź do kroku 2.8.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 10 °C. Wyrzucić supernatant i wybarwić komórki barwnikiem śledzącym komórki (np. CFSE) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Następnie odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić w 1x PBS, określić liczbę komórek i ponownie wirować przez 10 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wybarwione komórki w odpowiedniej ilości buforu adhezyjnego (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) w celu uzyskania zawiesiny 1,5 x 106 komórek/ml. Następnie dodać odpowiednią ilość 100 mM MnCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. 
	UWAGA: Komórki te są teraz gotowe do mikroskopii.</li>
	<li>Opcjonalnie: Traktuj komórki cytokinami, przeciwciałami neutralizującymi lub innymi związkami. W przeciwnym razie przejdź do kroku 3.
	<ol>
		<li>Pominąć krok 2.10 i ponownie zawiesić wybarwione osady komórkowe z kroku 2.9 w pożywce RPMI (z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny) w celu uzyskania stężenia 1,5 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Odpipetować 1 ml tej zawiesiny komórek do tylu dołków na 48-dołkowej płytce, ile jest warunków do analizy. Zawsze należy przygotować jedną studzienkę z nieleczonymi komórkami, które mają być perfundowane przez niepowlekaną kapilarnę jako kontrola ujemna, a drugą studzienkę z nietraktowanymi komórkami, które mają być perfundowane przez kapilarnę pokrytą adresyną jako kontrola pozytywna.</li>
		<li>W przypadku leczenia przeciwciałami antyintegrynowymi należy dodać odpowiednią ilość przeciwciała (np. 10 μg/ml wedolizumabu) do zawiesiny komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. W przypadku leczenia cytokinami należy dodać odpowiednią ilość rekombinowanej cytokiny (np. 10 ng/ml CXCL10) do zawiesiny komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po inkubacji należy pobrać komórki, kilkakrotnie ponownie je zawieszając za pomocą pipety p1000. Przenieść komórki do probówki o pojemności 2 ml, ponownie dobrze spłukać 1 ml 1x PBS i dodać do probówki o pojemności 2 ml. Określ numer komórki. 
		UWAGA: Inkubacja przylegających populacji komórek (np. monocytów) może wymagać dodatkowych środków (np. leczenia trypsyną) w celu oderwania komórek od płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki przez 10 minut przy 300 x g w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości buforu adhezyjnego do uzyskania zawiesiny 1,5 x 106 komórek/ml. Następnie dodać odpowiednią ilość 100 mM MnCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Podczas wstępnego leczenia chemokinami nie należy dodawać MnCl2 do zawiesiny komórek. Komórki te są teraz gotowe do mikroskopii. 
	UWAGA: Minimalna objętość użyta do testu zależy od użytej pompy i przewodów. W tym badaniu, przy użyciu pompy perystaltycznej i rurki określonej w Tabeli Materiałów, wymagana była minimalna objętość 400 μL. W razie potrzeby i zastosowania (w zależności od rodzaju komórek i wydajności) stężenie komórek w zawiesinie można zwiększyć, aby zmierzyć wyższą przyczepność w krótszym czasie.</li>
	<li>Modyfikacja potencjału: Konkurencyjny test dynamicznej adhezji
	<ol>
		<li>Wykonaj wyżej wymienione kroki z różnymi populacjami komórek, które mają być ze sobą porównane (np. limfocyty T regulatorowe i efektorowe wyizolowane przez izolację kulek magnetycznych zgodnie z instrukcjami producenta zgodnie z krokiem 2.7).</li>
		<li>Wybarwić każdą populację innym barwnikiem (np. CFSE i FarRed) zgodnie z opisem w krokach 2.8–2.9, aby móc różnicować populacje komórek podczas mikroskopii.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wybarwione osady komórek w odpowiedniej ilości buforu adhezyjnego (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) w celu uzyskania zawiesiny 1,5 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Wymieszać równe objętości zawiesin komórkowych (np. 500 μl regulatorowych limfocytów T i 500 μl efektorowych limfocytów T), aby uzyskać końcowe stężenie mieszanych komórek 1,5 x 106 komórek/ml. Następnie dodać odpowiednią ilość 100 mM MnCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Takie zawiesiny mogą być następnie wykorzystane do konkurencyjnej analizy procesu adhezji poprzez perfuzję różnych populacji komórek przez tę samą kapilarę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie dynamicznych komórek na żywo
<ol>
	<li>Włącz mikroskop i wybierz odpowiedni filtr lub laser do wzbudzenia barwnika (barwników) śledzącego komórki (np. laser 488 nm dla CFSE), odpowiedniego obiektywu (np. 40X) oraz trybu akwizycji umożliwiającego obrazowanie poklatkowe.</li>
	<li>Usuń plastikową folię parafinową z końcówki kapilary i połącz kapilarnę z krótkim kawałkiem rurki (około 5 cm długości), rozciągając rurkę z jednej strony małymi nożyczkami i ostrożnie wkładając kapilar (około 0,5 cm) do rurki. Uszczelnij połączenie między kapilarą a rurką za pomocą plastikowej folii parafinowej.</li>
	<li>Zamontuj kapilę na tacce mocującej (np. pokrywie z płytki 6-dołkowej z prostokątnym wycięciem nieco krótszym niż długość kapilary) i umieść stałą kapilarnę na uchwycie tacki mikroskopu, tak aby kapilara była wyostrzona i gotowa do mikroskopii.</li>
	<li>Włóż gumową rurkę do odpowiedniego wycięcia pompy perystaltycznej i umieść koniec nieprzymocowany do kapilary w odpowiedniej probówce zawierającej zawiesinę komórek. Włóż krótką rurkę po drugiej stronie kapilary do probówki o pojemności 15 ml, aby zebrać przepływ.</li>
	<li>Pozwól, aby rurka napełniła się z natężeniem przepływu 500 μl na minutę, aż zawiesina komórek prawie dotrze do kapilary. Następnie pozwól kapilarze napełnić się natężeniem przepływu 100 μl/min. 
	UWAGA: Szybkie napełnienie kapilary zapewnia regularne rozprowadzenie zawiesiny komórkowej wewnątrz kapilary.</li>
	<li>Gdy kapilara zostanie wypełniona zawiesiną komórek, wyreguluj natężenie przepływu na 10 μl/min. 
	UWAGA: Te natężenia przepływu mogą się różnić, gdy używane są kapilary o różnej wielkości lub różne pompy perystaltyczne. W tym badaniu natężenie przepływu wynoszące 10 μl/min zostało zoptymalizowane dla pompy i naczyń włosowatych, aby naśladować przepływ krwi in vivo.</li>
	<li>Rób zdjęcia poklatkowe komórek poruszających się powoli przez kapilarnę wzdłuż wewnętrznej ściany pokrytej adresyną co 2 s, łącznie przez 3 minuty 
	UWAGA: Interwały i łączny czas mogą się różnić w zależności od typu komórki i pytania, na które należy odpowiedzieć.</li>
	<li>Przed wyrzuceniem kapilary należy prześwietlić całą kapilarnę przez okular mikroskopu, aby upewnić się, że przekrój pokazany na filmie jest reprezentatywny. W razie potrzeby wykonaj drugie nagranie.</li>
	<li>Odłącz rurkę od pompy i pozwól, aby pozostały płyn spłynął z powrotem do probówki o pojemności 2 ml, a następnie odłącz kapilar i rurkę od tacki mocującej i kontynuuj z następną kapilarą.</li>
</ol>
4. Ocena i liczenie komórek
<ol>
	<li>Otwórz sekwencję poklatkową za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wyeksportuj pierwsze trzy obrazy ("Początek") i ostatnie trzy obrazy ("Koniec") jako pliki TIFF.</li>
	<li>Otwórz trzy obrazy "Początkowe" w ImageJ, przekonwertuj je na 32-bitowe ('Obraz | Rodzaj | 32 Bity") i scalić zdjęcia ('Obraz | Kolor | Scalanie kanałów"; Przypisz kolory czerwony, zielony i niebieski do różnych zdjęć). Konwertuj obraz kompozytowy na RGB ('Obraz | Type-RGB') i zapisz jako plik TIFF. Powtórz z obrazami "Koniec". 
	Uwaga: W konkurencyjnych dynamicznych testach adhezji z komórkami zabarwionymi różnymi kolorami, najpierw podziel kanały obrazów, aby osobno przeanalizować adhezję różnych populacji komórek.</li>
	<li>Policz białe komórki widoczne w kompozycji "Początek" i "Koniec" i odejmij liczbę białych komórek w "Początku" od białych komórek w "Końcu". 
	Uwaga: Różnica reprezentuje liczbę nowo przylegających komórek w 3-minutowym przedziale czasu. Na obrazie złożonym komórki, które się przesunęły, są widoczne w określonym kolorze, który został przypisany do odpowiedniej klatki, ponieważ są lokalizowane w innym miejscu w poprzedniej i następnej klatce. W przypadku komórek, które przylegają, sygnały czerwony, zielony i niebieski w tym samym miejscu nakładają się na białe.</li>
	<li>Aby lepiej zobrazować wyniki, skompiluj film z sekwencji poklatkowych, np. za pomocą ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Function+and+Migration+-+Two+Sides+of+the+Same+Coin%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin.</a> New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B14%CE%B21+Homing+Pathway+Is+Essential+for+Ileal+Homing+of+Crohn%27s+Disease+Effector+T+Cells+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).</li>
<li>Binder, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+inhibition+of+dynamic+adhesion+of+lymphocytes+from+IBD+patients+to+MAdCAM-1+by+vedolizumab+and+etrolizumab-s%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).</li>
<li>Feagan, B. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23964932">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).</li>
<li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).</li>
<li>Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038247">Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study.</a> Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).</li>
<li>Kopylov, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+Safety+of+Vedolizumab+for+Induction+of+Remission+in+Inflammatory+Bowel+Disease-the+Israeli+Real-World+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).</li>
<li>Amiot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Safety+of+Vedolizumab+Induction+Therapy+for+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%3A+The+Official+Clinical+Practice+Journal+of+the+American+Gastroenterological+Association%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis%3A+a+randomised%2C+controlled%2C+phase+2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).</li>
<li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MAdCAM+antibody+%28PF-00547659%29+for+ulcerative+colitis+%28TURANDOT%29%3A+a+phase+2+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).</li>
<li>Miller, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Controlled+Trial+of+Natalizumab+for+Relapsing+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-based+therapeutics%3A+biological+basis%2C+clinical+use+and+new+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).</li>
<li>Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+effects+of+vedolizumab+binding+on+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes.</a> mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B14%CE%B27+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
<li>Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+receptor+occupancy+pharmacodynamic+assays+used+in+the+clinical+development+of+the+monoclonal+antibody+vedolizumab%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).</li>
<li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+the+integrin+beta+7+subunit%3A+identification+of+domains+involved+in+adhesion+to+MAdCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1.</a> Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).</li>
<li>Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Binding+Specificity+and+Selective+Antagonism+of+Vedolizumab%2C+an+Anti-%CE%B14%CE%B27+Integrin+Therapeutic+Antibody+in+Development+for+Inflammatory+Bowel+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).</li>
<li>Parikh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vedolizumab+for+the+treatment+of+active+ulcerative+colitis%3A+a+randomized+controlled+phase+2+dose-ranging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).</li>
<li>Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+Suppress+CCR9-Mediated+Chemotaxis%2C+Calcium+Flux%2C+and+Adhesion+to+MAdCAM-1+in+Human+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells.</a> The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptor+3+promotes+leukocyte+rolling+by+mobilizing+endothelial+P-selectin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+MRP8%2F14+is+a+regulator+of+%CE%B22+integrin-dependent+neutrophil+slow+rolling+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion.</a> Nature Communications. 6, (2015).</li>
<li>Binder, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+Inhibition+of+Dynamic+Adhesion+of+Lymphocytes+From+IBD+Patients+to+MAdCAM-1+by+Vedolizumab+and+Etrolizumab-s%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+Sampling+and+Blood+Flow+Velocity+Distribution+With+Vessel+Diameter+for+Characterizing+the+Human+Bulbar+Conjunctival+Microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature.</a> Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).</li>
<li>House, S. D., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+blood+flow+of+skeletal+muscle+venules+during+local+flow+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation.</a> The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).</li>
<li>Zundler, S., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+T+cell+subsets+in+allergic+and+chronic+inflammatory+bowel+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders.</a> Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).</li>
<li>Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Adhesion+Therapies+in+Inflammatory+Bowel+Disease-Molecular+and+Clinical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Flow+Chamber+Adhesion+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li>
<li>Zundler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+%CE%B1E%CE%B27+integrin+suppresses+accumulation+of+CD8%28%2B%29+and+Th9+lymphocytes+from+patients+with+IBD+in+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).</li>
</ol>

M.F.N. służył jako doradca dla Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda i Boehringer. M.F.N. i S.Z. otrzymały wsparcie badawcze od firm Takeda i Roche.

Powyższy protokół opisuje przydatną technikę badania dynamicznej adhezji ludzkich komórek odpornościowych do ligandów śródbłonka. Poprzez zmienność powlekanych ligandów, perfundowanych typów lub podzbiorów komórek, inkubację z dodatkowymi bodźcami lub różnymi przeciwciałami neutralizującymi, ma prawie nieograniczone potencjalne zastosowania. Dlatego takie dynamiczne testy adhezyjne mogą być przydatne do udzielenia odpowiedzi zarówno na podstawowe pytania badań podstawowych, jak i na pytania translacyjne, które mogą pomóc...

Ruch komórek jest ściśle regulowanym procesem niezbędnym do rozwoju i funkcjonowania organizmów wielokomórkowych, ale jest również zamieszany w patogenezę wielu chorób1. Ostatnio coraz większą uwagę cieszy się procesem naprowadzania komórek odpornościowych z krwiobiegu do tkanek obwodowych, ponieważ przyczynia się on do uzupełniania i ekspansji komórek chorobotwórczych w tkankach objętych stanem zapalnym w chorobach o podłożu immunologicznym2,3. W szczególności wykazano, że homing ma znaczenie translacyjne w chorobach zapalnych jelit (IBD). Terapeutyczne przeciwciało integrynowe anty-α4β7 wedolizumab zakłócające naprowadzanie jelit wykazało skuteczność w dużych badaniach klinicznych4,5 i zostało z powodzeniem zastosowane w rzeczywistej praktyce klinicznej6,7,8. Prawdopodobnie pojawią się kolejne związki9,10. Podobnie, terapeutyczne przeciwciało integryny anty-α4, natalizumab, jest stosowane w leczeniu stwardnienia rozsianego (SM)11.
Jednak nasze funkcjonalne zrozumienie procesu naprowadzania w ogóle, a w szczególności mechanizmu działania takich przeciwciał terapeutycznych, jest nadal ograniczone. Powszechnie wiadomo, że naprowadzanie składa się z kilku etapów, w tym wiązania i zwijania komórek, a następnie adhezji komórek prowadzących do mocnego zatrzymania, po którym następuje migracja śródbłonka trans12,13. Wyżej wymienione przeciwciała neutralizują integryny na powierzchni komórki, zapobiegając interakcji z adresinami na śródbłonku ściany naczynia. Uważa się, że utrudnia to mocne przyleganie komórek14,15. Jednak dopiero zaczynamy rozumieć zróżnicowane znaczenie specyficznych integryn dla naprowadzania komórek różnych podzbiorów komórek. Co więcej, wpływ przeciwciał antyintegrynowych na różne podzbiory komórek i powiązania dawka-odpowiedź jest w dużej mierze nieznany, co prowadzi do wielu otwartych pytań w dziedzinie naprowadzania jelit i terapii przeciwadhezyjnych w IBD.
Dlatego rozpaczliwie potrzebne są wygodne narzędzia do rozwiązywania takich pytań. Wpływ przeciwciał anty-integrynowych na interakcję integryna-adresyna był do tej pory oceniany głównie poprzez ocenę skuteczności wiązania/hamowania wiązania za pomocą cytometrii przepływowej lub poprzez statyczne testy adhezyjne16,17,18,19,20, a więc z pozornym uproszczeniem i odchyleniem od sytuacji fizjologicznej. Niedawno opracowaliśmy dynamiczny test adhezji do badania zależnej od integryny adhezji komórek ludzkich do adresin oraz wpływu przeciwciał anty-integrynowych pod wpływem naprężenia ścinającego2. Zasada działania tej techniki została wcześniej zademonstrowana na mysich komórkach21,22. W tym przypadku został on zaadaptowany i opracowany w celu odpowiedzi na wyżej wymienione pytania translacyjne, otwierając nowe możliwości lepszego zrozumienia mechanizmów terapii przeciwciałami antyintegrynowymi in vivo.

<table><tbody><tr><td>48-dołkowa płytka</td><td>Sarstedt</td><td>833,923</td><td></td></tr><tr><td>Bufor adhezyjny: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący: 1x PBS w ddH2O + 5 % BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Applichem</td><td>A1391,0100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary: Prostokątna rurka Boro 0,20 mm x 2,00 mm ID, długość 50 mm</td><td>CM Scientific</td><td>3520-050</td><td></td></tr><tr><td>CCL-2, ludzkie</td><td>narzędzia immunologiczne</td><td>11343384</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Microbeads, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade; Zestaw do proliferacji komórek CFSE</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (Rotixa 50 RS)</td><td>Hettrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor powłokowy: 150 mM NaCl + 1 mM Mikroskop konfokalny HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(TCS SP8)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CXCL-10, ludzkie</td><td>narzędzia immunologiczne</td><td>11343884</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran 500</td><td>Roth</td><td>9219.3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA KE/9 mL Monovette</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcons (50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td></td></tr><tr><td>Fc chimera kontrola izotypu</td><td>R& D Systems</td><td>Natężenia przepływu 110-HG</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (LabV1)</td><td>Baoding Shenchen Precision Pump Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu ludzkiej IgG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31154</td><td></td></tr><tr><td>Międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM-1) Chimera Fc</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny</td><td>LS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kontrola izotypu IgG myszy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-545</td><td></td></tr><tr><td>Adresat naczyniowy błony śluzowej Cząsteczka adhezyjna komórek 1 (MAdCAM-1) Chimera Fc</td><td>R& D Systems</td><td>6056-MC</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Natalizumab</td><td>Biogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Komora licząca</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, ludzki</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-601000</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>L 182-10</td><td>w/o Mg i Ca</td></tr><tr><td>Plastikowa folia parafinowa: Parafilm (PM-996)</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>oczyszczona anty-ludzka CD18</td><td>Biolegend</td><td>302102</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Rurka gumowa: SC0059T 3-stopniowa rurka LMT-55, średnica wewnętrzna 1,02 mm, długość 406,4 mm</td><td>Ismatec</td><td>SC0059</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,025</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych 1 (VCAM-1) Chimera Fc</td><td>Biolegend</td><td>553706</td><td></td></tr><tr><td>Wedolizumab (Entyvio)</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Prowadzenie komórek odpornościowych w jelitach jest ważne dla patogenezy chorób zapalnych jelit (IBD). Zależna od integryny adhezja komórek do adresin jest kluczowym krokiem w tym procesie, a strategie terapeutyczne zakłócające adhezję zostały pomyślnie ustalone. Przeciwciało integrynowe anty-α4β7, wedolizumab, jest stosowane w klinicznym leczeniu choroby Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC), a w ślad za nim prawdopodobnie pojawią się kolejne związki.
Szczegóły procedury adhezji i mechanizmy działania przeciwciał anty-integrynowych są nadal niejasne pod wieloma względami ze względu na ograniczone dostępne techniki badań funkcjonalnych w tej dziedzinie.
Tutaj prezentujemy dynamiczny test adhezji do analizy funkcjonalnej adhezji komórek ludzkich w warunkach przepływu oraz wpływu terapii antyintegrynowych w kontekście IBD. Opiera się na perfuzji pierwotnych komórek ludzkich przez ultracienkie szklane kapilary pokryte adresiną z analizą mikroskopową w czasie rzeczywistym. Test oferuje różnorodne możliwości udoskonaleń i modyfikacji oraz ma potencjał w zakresie odkryć mechanistycznych i zastosowań translacyjnych.

Metoda przedstawiona w niniejszym manuskrypcie ma na celu jak najwierniejsze symulowanie procesu in vivo adhezji ludzkich komórek do ściany śródbłonka, aby funkcjonalnie ocenić adhezję komórkową oraz rolę przeciwciał interferujących. W związku z tym ultracienkie kapilary są pokrywane adresynami i przepływane fluorescencyjnie znakowanymi ludzkimi komórkami docelowymi przy użyciu pompy perfuzyjnej. Dzięki obrazowaniu żywych komórek adhezja ludzkich komórek do adresyn może być obser...

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu podstawowej immunobiologii i badań nad nieswoistymi zapaleniami jelit dotyczące kaskady adhezyjnej komórek odpornościowych wymaganych do naprowadzania do narządów obwodowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to wygodne i proste podejście do odpowiedzi na pytania funkcjonalne w kontekście adhezji komórek w warunkach przepływu. Chociaż metoda ta została opracowana w celu zbadania mechanizmu działania komórkowych przeciwciał przeciw integrynie w chorobach zapalnych jelit, można ją zmodyfikować w celu analizy podobnych problemów w innych stanach zapalnych.Zacznij od rozciągnięcia kawałka gumowej rurki z jednej strony małymi nożyczkami, aby umożliwić wprowadzenie prostokątnej kapilary na około 0,5 centymetra do rurki. Następnie uszczelnij połączenie folią parafinową. Pokryj kapilarę 20 mikrolitrami interesującego Cię adresu i uszczelnij stronę niepołączoną z rurką folią parafinową z tworzywa sztucznego na co najmniej jedną godzinę inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji usuń plastikową folię parafinową i pozwól, aby płyn wsiąkł z kapilary na ręcznik papierowy, aby opróżnić rurkę. Następnie zatkaj kapilary 20 mikrolitrami roztworu blokującego przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bardzo ważne jest, aby nałożyć blokadę na kapilarnę bezpośrednio po usunięciu powłoki, aby uniknąć wysuszenia naczynia włosowatego, ponieważ może to pogorszyć funkcjonalność kodowanych białek.Podczas gdy naczynia włosowate są blokowane, dodaj 18 mililitrów antykoagulowanej pełnej krwi ludzkiej z 50-mililitrowej probówki i rozcieńcz krew do całkowitej objętości 35 mililitrów za pomocą PBS. Umieść 10 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości pod roztworem krwi i wyizoluj jednojądrzaste komórki krwi obwodowej przez wirowanie w gradiacji gęstości. Pod koniec separacji przenieś jednojądrzaste komórki krwi obwodowej z granicy faz pożywki gradientu gęstości do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów.I zwiększ całkowitą objętość w probówce do 50 mililitrów ze świeżym PBS. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego PBS do liczenia i zabarwij komórki odpowiednim barwnikiem śledzącym komórki zgodnie z instrukcjami producenta. Pod koniec inkubacji barwienia zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w proporcji 1,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr całkowitego stężenia pożywki RPMI.Następnie zasiej jeden mililitr komórek w tylu dołkach 48-dołkowej płytki, ile jest w warunkach. I dodać odpowiednią objętość przeciwciała antyintegrynowego do odpowiednich studzienek na jednogodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj pipety P1000, aby kilkakrotnie zawiesić komórki przed przeniesieniem komórek do pojedynczych dwumililitrowych probówek.Przepłucz każdą studzienkę jednym mililitrem PBS i zbierz popłuczyny w odpowiednich dwumililitrowych probówkach. Po zliczeniu rozpuść komórki przez odwirowanie i ponownie wsuspensuj komórki w odpowiedniej objętości bufora adhezyjnego, aby uzyskać 1,5 razy dziesięć do szóstych komórek na mililitr zawiesiny. Następnie dodać odpowiednią objętość chlorku manganu do każdej probówki do końcowego stężenia jednego milimolowego.Gdy komórki są gotowe, włącz mikroskop i wybierz odpowiednie filtry i lasery, obiektyw i tryb akwizycji. Usuń plastikową folię parafinową z końcówki kapilary i użyj nożyczek, aby rozciągnąć pięciocentymetrowy kawałek gumowej rurki, aby umożliwić połączenie kapilary z mniejszą rurką. Uszczelnij połączenie między kapilarą a rurką plastikową folią parafinową.I zamontuj kapilarnę na tacce mocującej. Umieść tackę na uchwycie tacki mikroskopu tak, aby kapilara była ostra. I włóż gumową rurkę do odpowiedniego wycięcia pompy perystaltycznej.Umieścić niepodłączony koniec rurki w pierwszej probówce zawierającej zawiesinę komórek. I włóż krótką rurkę po drugiej stronie kapilary do 15-mililitrowej rurki, aby zebrać przepływ. Pozwól rurkom napełnić się z prędkością 500 mikrolitrów na minutę, aż zawiesina komórek prawie dotrze do kapilary.Następnie pozwól kapilarze napełnić się z prędkością przepływu 100 mikrolitrów na minutę. Gdy kapilara zostanie wypełniona komórkami, dostosuj natężenie przepływu do 10 mikrolitrów na minutę i uchwyć poklatkowe obrazy komórek poruszających się powoli przez kapilarnę wzdłuż wewnętrznej strony ściany pokrytej adresyną co dwie sekundy przez łącznie trzy minuty. Gdy zawiesina komórkowa dotrze do wnętrza kapilary, bardzo ważne jest, aby uniknąć jakichkolwiek przerw w przepływie, ponieważ doprowadzi to do statycznej interakcji adresyny integryny, która może wpływać na pomiar.Przed wyrzuceniem przepuść całą kapilarnę przez okular mikroskopu, aby upewnić się, że przekrój obserwowany na ekranie jest reprezentatywny. Uwolnij rurkę z pompy i pozwól, aby pozostały płyn spłynął z powrotem do dwumililitrowej rurki. Następnie odłącz kapilarnę i rurkę od tacki mocującej i zobrazuj następną kapilarę, jak właśnie pokazano.Aby ocenić nagrania poklatkowe, otwórz pierwszą sekwencję w odpowiednim oprogramowaniu analitycznym i wyeksportuj pierwsze i ostatnie trzy obrazy jako pliki TIFF. Otwórz trzy początkowe obrazy w ImageJ i wybierz obraz, typ i 32-bitowy, aby przekonwertować obrazy na 32-bitowe. Następnie wybierz kanały obrazu, koloru i scalania, aby scalić obrazy w jeden obraz i przekonwertować obraz kompozytowy na RGB w celu zapisania jako plik TIFF.Po przekonwertowaniu trzech ostatnich obrazów w ten sam sposób policz białe komórki widoczne na początku i na końcu obrazu kompozytowego. I odejmij liczbę białych komórek na początkowym obrazie od liczby białych komórek na końcowym obrazie. Perfuzja naczyń włosowatych pokrytych ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, ale nie chimerą Isotype Fc z ludzkimi PBMC prowadzi do wyraźnej adhezji, gdy obecna jest jedna z trzech adresin.W przeciwieństwie do tego, hamowanie oddziaływań adresyny integrynowej za pomocą przeciwciał neutralizujących zwykle prowadzi do wyraźnego spadku adhezji dynamicznej, która jest nieobecna po dodaniu przeciwciał kontrolnych izotypu. Co więcej, traktowanie ludzkich limfocytów T CD4 specyficznymi chemokinami prowadzi do zwiększonej adhezji do adresin w porównaniu z nieleczonymi komórkami ludzkimi. Podejmując próbę tej procedury, bardzo ważne jest, aby pamiętać, że różne czynniki przyczyniają się do dynamicznej adhezji komórek in vivo, których nie można całkowicie podsumować w tym teście.Możliwe jest jednak dostosowanie testu do bardzo złożonych pytań. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące zróżnicowanego zachowania adhezyjnego typów komórek testowych, możliwe jest również przeprowadzenie konkurencyjnych testów adhezji z różnymi typami komórek oznaczonych różnymi barwnikami śledzącymi komórki. Po jej opracowaniu, technika ta umożliwiła nam zbadanie wpływu różnych przeciwciał antyintegrynowych stosowanych lub obecnie opracowywanych w leczeniu chorób zapalnych jelit.

dynamic-adhesion-assay-for-functional-analysis-anti-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Modele eksperymentalne nieswoistych zapaleń jelit pozwoliły nam zbadać złożone odpowiedzi odpornościowe wrodzone i nabyte związane z patogenezą. Wykorzystując ocenę histologiczną, ilościowe oznaczenie cytokin prozapalnych oraz aktywność mieloperoksydazy, można rozpocząć ocenę tych odpowiedzi obserwowanych w nieswoistych zapaleniach jelit.

Badanie stanu zapalnego jelit w modelu IBD indukowanym przez DSS

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Obecne metody leczenia chorób zapalnych jelit (IBD) mają na celu złagodzenie objawów choroby, ale mogą powodować poważne skutki uboczne. W związku z tym badane są alternatywne strategie w modelach zapalenia jelita grubego u zwierząt. W tym miejscu wyjaśniamy, w jaki sposób analizowany jest korzystny wpływ suplementów diety na kliniczne objawy IBD w takim modelu zapalenia jelita grubego.

Analiza korzystnego wpływu suplementów diety na funkcje bariery nabłonkowej jelit podczas eksperymentalnego zapalenia jelita grubego

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Szczegółowy protokół obrazowania pojedynczych migrujących płytek krwi za pomocą funkcjonalizowanych RGD uwięzi awidyna-biotyna o regulowanej gęstości jest dostarczony, ujawniając, że płytki krwi generują wystarczającą siłę, aby zerwać wiązanie awidyna-biotyna.

Test in vitro do badania migracji płytek krwi przy użyciu funkcjonalizowanych RGD tetherów awidyna-biotyna

Protokół ten pokazuje, jak model myszy zawierający domenę homologii 2 zawierający domenę 5'-inozytol fosfatazy (SHIP) niedoborowy dla zapalenia i włóknienia kości typu Leśniowskiego-Crohna (CD) podobnego do choroby Leśniowskiej (CD) może być wykorzystywany do testowania nowych terapii dla CD.

Ocena interwencji terapeutycznych w modelu mysim niedoborowym SHIP zapalenia i włóknienia choroby Leśniowskiego-Crowna podobnego do choroby Leśniowskiego-CRUNA

Poznaj dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit. Ta metoda pozwala badać adhezję komórek odpornościowych ludzkich pod przepływem.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Przeglądaj więcej filmów