Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące autoterapii oka, takie jak skuteczność specjalnie zaprojektowanej tkanki bioinżynieryjnej in vivo. Dzięki tej technice zapewniamy metodę wytwarzania i konturowania tkanki siatkówki, a także strategię przetwarzania tkanki do implantacji oka w modelu zwierzęcym. Zacznij od umycia od jednego do czterech kawałków ludzkiej błony owodniowej o wymiarach 30 na 30 mm lub hAM.

Zamocuj nylonowe rusztowanie dwa razy po 80 ml PBS na pranie w butelce o pojemności 250 ml na shakerze, z dużą prędkością przez pięć minut. Po drugim myciu dodaj 40 ml działającego roztworu Thermolysin do każdej butelki i potrząsaj butelkami dwa razy przez pięć minut z prędkością 450 obr./min, a następnie przez 30 sekund wirowania. Po drugiej rundzie leczenia Thermolysin, umyj kawałki jeszcze dwa razy 80 ml PBS na pranie, jak pokazano.

Następnie użyj długich sterylnych kleszczy, aby przenieść hAM pojedynczo do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego, zawierającego 10 ml PBS. Następnie umieść jedną membranę nylonem skierowanym w dół w drugim 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym PBS i odłącz dwa z czterech klipsów mocujących membranę do nylonu. Włóż mniejszy pierścień wkładki hodowlanej między nylon a membranę, upewniając się, że membrana całkowicie zakrywa mniejszy pierścień.

Przypnij drugą część wkładki hodowlanej do górnej części membrany tak, aby błona podstawna hAM była skierowana prawą stroną do góry we wkładce hodowlanej i odłącz dwa ostatnie klipsy. Następnie użyj sterylnych nożyczek, aby w razie potrzeby przyciąć błonę poza wkładką hodowlaną. I użyj kleszczy, aby przenieść membranę do jednego dołka z 12-dołkowej płytki, zawierającej PBS do przechowywania w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Przed wysiewem ciepłe fiolki kriogeniczne zawierające od jednego razy 10 do szóstego komórek RPE w 3 ml pożywki RPE w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml na fiolkę. Gdy komórki się rozmrozążą, odpipetuj pipetą, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek w każdej z probówek i policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie niebieskiego tri pane. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w stężeniu siedem razy od 10 do piątych komórek na mililitr w świeżej pożywce RPE.

Następnie odessaj PBS z każdej studzienki przygotowanej 12-dołkowej płytki i dodaj 500 mikrolitrów komórek do środka każdej wkładki hodowlanej i 1 ml pożywki RPE na dno każdej studzienki. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 dni, zmieniając pożywkę dwa razy w tygodniu, aż do końca hodowli. W 30 dniu hodowli ogrzej 8% roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

I napełnij wewnętrzną komorę wibratomu podłożem niezależnym od CO2 o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą skalpela wytnij blok o wymiarach 5 cm na 5 cm z bloku 20% żelatyny przechowywanego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przymocuj górną stronę bloku do wspornika za pomocą odpowiedniego kleju.

I umieść nowe ostrze w wibratomie. Wyreguluj blok, aż znajdzie się na tym samym poziomie co żyletka i napełnij wannę wokół wspornika świeżym, niezależnym od CO2 podłożem o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Tnij blok ze średnią prędkością, aż blok zostanie przycięty równomiernie z gładką powierzchnią prowadzącą i ustaw pozycję na zero.

Następnie odsysaj pożywkę wokół żelatyny, aż żelatyna całkowicie wyschnie. I użyj kleszczy, aby ostrożnie otworzyć wkładkę hodowlaną z nasionami RPE na wierzchu bloku. Za pomocą nożyczek usuń całą membranę na zewnątrz pierścienia wkładki i zassaj całą objętość pozostałego medium.

Dodaj do 1 ml 8% płynnego roztworu żelatyny do membrany, aż zostanie pokryta. I ostrożnie usuń nadmiar żelatyny. Po pięciu do ośmiu minutach dodaj do kąpieli świeżą, niezależną od CO2 pożywkę o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zestalona membrana zostanie pokryta.

A gdy wibratom znajduje się w pozycji 100 mikronów, przetnij odcinek membrany ze średnią prędkością, uważając, aby utrzymać orientację tkanki. Wytnij róg sekcji skalpelem, aby umożliwić identyfikację orientacji sekcji. I za pomocą szpatułki przenieś membranę zatopioną w żelatynie na jedną z sześciodołkowych płytek, wypełnionych podłożem konserwującym o czterech stopniach Celsjusza.

Orientacja plastra może zostać odwrócona z powodu swobodnego ruchu przed ciętym rogiem. Zadbaj więc o to, aby zabezpieczyć pozycję plastra tuż za sekcją. Wielkość implantu można następnie dostosować do wielkości oka biorcy pod mikroskopem chirurgicznym, przed przeszczepem.

Zazwyczaj kilka martwych komórek pozostaje na powierzchni błony po utrwaleniu na wkładce hodowlanej, ale komórki te są eliminowane po zmianie pożywki hodowlanej. Włókna błony podstawnej są widoczne w większym powiększeniu, gdy nie pozostają żadne komórki, co wskazuje, że okres leczenia termolizyną został zoptymalizowany. Nabłonek siatkówki staje się łatwiejszy do zauważenia pod mikroskopem, w miarę dojrzewania, tworząc kompletną monowarstwę przypominającą kostkę brukową po trzech tygodniach.

Po czterech tygodniach nabłonek jest wystarczająco dojrzały, aby był przygotowany do implantacji. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że stan żelatyny zależy od temperatury. Dlatego należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu zalecanych temperatur.

Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkami macierzystymi do zbadania potencjału terapeutycznego tkanki bioinżynieryjnej w zwierzęcym modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki. Chociaż metoda ta może być stosowana do przygotowania tkanki na rusztowaniu, w celu jej późniejszego przeszczepu, może być również stosowana do bardziej złożonych systemów zawierających warstwy fotoreceptorów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z obsługą ludzkich błon owodniowych, które są bardzo cienkie i mają tendencję do łatwego fałdowania.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy utrwalania błony owodniowej u ludzi i zatapiania żelatyny są trudne do nauczenia i wymagają szczególnego podejścia do obchodzenia się z nimi.