Name: Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metodę inżynierii tkanki nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich komórek macierzystych na błonie owodniowej. Technika umożliwia przygotowanie implantów do badań terapii regeneracyjnej oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jérôme'owi Larghero i Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paryż, Francja) za ich wkład podczas tworzenia opisanej tutaj metody.
Ta praca była wspierana przez granty z ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Program Bioinżynierii - DBS20140930777] oraz od LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73] do Oliviera Goureau i Christelle Monville. Projekt był wspierany przez NeurATRIS, translacyjną infrastrukturę badawczą (Investissements d'Avenir) dla terapii biologicznych w neuronaukach [ANR-11-INBS-0011] oraz INGESTEM, krajową infrastrukturę (Investissements d'Avenir) inżynieryjną dla pluripotencjalnych i zróżnicowanych komórek macierzystych [ANR-11-INBS-000] dla Christelle Monville. Karim Ben M'Barek był wspierany przez stypendia DIM Stempole i LABEX REVIVE [ANR-10-LABX-73]. I-Stem jest częścią Instytutu Bioterapii Chorób Rzadkich wspieranego przez Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.

Wszystkie materiały użyte w tym protokole zostały użyte zgodnie z przepisami Unii Europejskiej. Ludzka linia komórkowa ES wykorzystana w tym badaniu pochodziła z unikalnego zarodka. Para, która oddała zarodek, była w pełni poinformowana i wyraziła zgodę na anonimowe dawstwo. Z tego zarodka uzyskano kliniczną linię ludzkich komórek ES, które zostały zbankowane, zakwalifikowane i odpowiednio udokumentowane przez Roslin Cells (Wielka Brytania). hAM zostały pobrane w sterylnych warunkach podczas cesarskiego cięcia u matek, które podpisały świadomą zgodę na oddanie łożyska zgodnie z wytycznymi szpitala (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki do hodowli komórek RPE
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę do hodowli komórek RPE, dodaj 4% substytut surowicy (20 ml dla końcowej objętości 500 ml), 1000x rozcieńczony 2-merkaptoetanol (500 μl dla końcowej objętości 500 ml) i 1% roztworu aminokwasów endogennych (MEM) dla minimalnej pożywki egzogennej Eagle's (5 ml, dla końcowej objętości 500 ml) firmy Dulbecco do zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (475 ml dla końcowej objętości 500 ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podłoża transportowego/konserwującego
	<ol>
		<li>W celu przygotowania pożywki transportowej/konserwującej należy dodać 1% penicyliny-streptomycyny (5 ml dla końcowej objętości 500 ml) do pożywki niezależnej od CO2 (495 ml dla końcowej objętości 500 ml) i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowne zawieszenie enzymu termolizyny
	<ol>
		<li>Przygotowanie roztworu podstawowego termolizyny
		<ol>
			<li>Aby przygotować podstawowy roztwór termolizyny, należy rozmrozić proszek termolizyny, który był przechowywany w temperaturze -20 °C, w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Ponieważ aktywność enzymatyczna może być zmienna w zależności od partii, należy obliczyć tę aktywność na podstawie świadectwa analizy dostarczonego z proszkiem termolizyny z partii, która ma być użyta. Podzielić "Obliczono proteazę neutralną pod względem aktywności = ANPC" (wskazaną w certyfikacie analizy) przez 181 (co jest masą cząsteczkową tyrozyny). Uzyskany wynik odpowiada całkowitej aktywności enzymatycznej dostarczonego proszku termolizyny (U/fiolkę).</li>
			<li>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 200 j./ml, dodając objętość wody odpowiadającą całkowitej aktywności enzymatycznej (U/fiolkę) podzieloną przez 200 (j./ml).</li>
			<li>Rozpuść enzym, pipetując wodę, która została dodana w górę iw dół. Wirować roztwór przez 30 sekund i sprawdzić, czy proszek został całkowicie zawieszony. Do całkowitego rozpuszczenia może być konieczne dalsze pipetowanie.</li>
			<li>Podzielić roztwór podstawowy na porcje i przechowywać go w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie roztworu roboczego termolizyny 
		UWAGA: Roztwór termolizyny musi być przygotowany w dniu zabiegu hAM.
		<ol>
			<li>Rozmrozić podstawowe porcje termolizyny w stężeniu 200 U/ml przechowywane w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 200x w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania końcowej aktywności enzymatycznej 1 U/ml. Przygotuj 40 ml do leczenia 1–4 plastrów hAM.</li>
			<li>Przed użyciem przefiltrować roztwór termolizyny przez filtr 0,2 μm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponowne zawieszenie żelatyny
	<ol>
		<li>Przygotowanie 20% roztworu żelatyny i Block 
		UWAGA: 20% roztwór i blok żelatyny można przygotować do 1 tygodnia przed użyciem.
		<ol>
			<li>Podgrzać podłoże niezależne od CO2 do temperatury 42 °C w łaźni wodnej przez 30 min (do 1 h). W probówce o pojemności 50 ml dodaj 10 g żelatyny do 40 ml podgrzanej pożywki niezależnej od CO2 i rozmieszaj roztwór.</li>
			<li>Rozpuścić żelatynę przez 30–60 minut w temperaturze 42 °C. Wirować co 10 minut w celu homogenizacji roztworu.</li>
			<li>Gdy roztwór będzie jednorodny, dodaj 4 ml 20% roztworu żelatyny do czterech 6-centymetrowych szalek hodowlanych. Unikaj bąbelków. Dodać plastikową folię parafinową w celu ochrony naczyń i pozostawić roztwór do zestalenia się w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie 8% roztworu żelatyny 
		UWAGA: 8% roztwór żelatyny można przygotować dzień przed użyciem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
		<ol>
			<li>Podgrzać podłoże niezależne od CO2 do 42 °C przez 30 min (do 1 h). W probówce o pojemności 50 ml dodaj 4 g żelatyny do 46 ml podgrzanej pożywki niezależnej od CO2 i rozprowadź roztwór.</li>
			<li>Rozpuścić żelatynę przez 30–60 minut w temperaturze 42 °C. W celu ochrony probówki należy dodać folię parafinową z tworzywa sztucznego i przechowywać ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, jeśli ma być użyta tego samego dnia, lub przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli ma być użyta później.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie termolizyną ludzkich błon owodniowych
<ol>
	<li>Płukanie błony owodniowej człowieka
	<ol>
		<li>HAM należy dostarczyć w postaci małych kawałków (około 30 mm x 30 mm) zamocowanych w nylonowym rusztowaniu, już w temperaturze 4 °C w PBS lub zamrożonych. W przypadku zamrożenia membrany rozmrażać w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 30 minut.</li>
		<li>Umyj membrany:
		<ol>
			<li>Umieść 1-4 membrany w butelce o pojemności 250 ml zawierającej 80 ml PBS. Użyj tylu butelek, ile potrzeba.</li>
			<li>Potrząsaj każdą butelką w wytrząsarce talerzowej na wysokich obrotach przez 5 minut, a następnie wyrzuć PBS. Dodaj 80 ml PBS i powtórz czynność.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie termolizyną
	<ol>
		<li>Dodać 40 ml roztworu roboczego termolizyny (1 U/ml) na butelkę zawierającą membrany (1-4 membrany na butelkę; do 3 butelek na raz).</li>
		<li>Wstrząsaj butelkami przez 5 minut z prędkością 450 obr./min, a następnie wiruj je przez 30 s. Powtórz 1x.</li>
		<li>Odrzucić roztwór termolizyny i dodać 80 ml PBS.</li>
		<li>Potrząsaj butelkami przez 5 minut przy 450 obr./min. Wyrzuć PBS i dodaj 80 ml PBS. Powtórz 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalenie błon owodniowych człowieka na wkładce hodowlanej
<ol>
	<li>Użyj długich sterylnych kleszczyków (które mogą sięgać dna butelki), aby usunąć hAM jeden po drugim i przenieś każdy hAM do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego 10 ml PBS.</li>
	<li>W nowym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm, zawierającym 10 ml PBS, umieść jedną z membran nylonem skierowanym w dół. Odłącz dwa z czterech zacisków, które służą do mocowania membrany do nylonu.</li>
	<li>Włóż mniejszy pierścień wkładki hodowlanej między nylon a membranę.</li>
	<li>Upewnij się, że membrana całkowicie zakrywa mniejszy pierścień. Przypnij drugą część wkładu hodowlanego do górnej części membrany. Błona podstawna hAM jest skierowana do góry wewnątrz wkładki hodowlanej. Odłącz dwa ostatnie klipsy.</li>
	<li>W razie potrzeby odciąć sterylnymi nożyczkami nadmiar błony na zewnątrz wkładki hodowlanej. Za pomocą kleszczy przenieść membranę utrwaloną we wkładce hodowlanej na płytkę 12-dołkową, dodać PBS i przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Powtórz te czynności (od kroku 3.2 do 3.5) z pozostałymi membranami.</li>
</ol>
4. Rozmrażanie i wysiewanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na błonach owodniowych
<ol>
	<li>Rozmrażanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki
	<ol>
		<li>Bank komórek RPE zamraża się w ciekłym azocie po 1 milionie komórek na fiolkę kriogeniczną. Rozmrozić tyle fiolek kriogenicznych, ile potrzeba (350 000 komórek jest wysiewanych na błonę).</li>
		<li>Przygotować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 3 ml pożywki RPE na fiolkę kriogeniczną. Po rozmrożeniu fiolki przenieść komórki do każdej probówki. Powtórzyć tę operację dla pozostałych fiolek.</li>
		<li>Homogenizować (kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki w pożywce RPE) i pobrać 10 μl roztworu komórkowego i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl błękitu trypanowego. Umieść 15 μl tego roztworu w komorze liczącej, a następnie policz liczbę żywych komórek (nie zabarwionych na niebiesko) pod mikroskopem z obiektywem 4X. Powtórzyć tę operację dla pozostałych fiolek.</li>
		<li>W międzyczasie odwirować probówki o pojemności 15 ml o sile 110 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 700 000 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do ludzkich błon owodniowych
	<ol>
		<li>Wyjąć z inkubatora 12-dołkową płytkę zawierającą błony.</li>
		<li>Zassać PBS. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 4.1.4 w środku wkładki hodowlanej. Dodać 1 ml pożywki RPE na zewnątrz wkładu hodowlanego (do studzienki). Powtórz tę czynność dla pozostałych membran.</li>
		<li>Umieścić 12-dołkową płytkę zawierającą błony w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Utrzymanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na błonach owodniowych człowieka
<ol>
	<li>Odnawiaj pożywkę 2 razy w tygodniu, zwykle w poniedziałki i piątki, co najmniej do 30 dnia hodowli.</li>
	<li>Odessać pożywkę wewnątrz i na zewnątrz wkładki hodowlanej dla każdej studzienki i odnowić ją świeżą pożywką (1 ml na zewnątrz wkładki hodowlanej i 500 μl wewnątrz). Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Przygotowanie plastra nabłonka barwnikowego siatkówki do przeszczepu
UWAGA: Począwszy od 30 dnia hodowli, tkanka jest gotowa do przeszczepu.
<ol>
	<li>Ogrzewać 8% roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Napełnić wewnętrzną komorę wibratomu zimnym podłożem niezależnym od CO2 (w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Umieść 20% blok żelatyny w wibratomie.
	<ol>
		<li>Wyjmij z lodówki 6 cm naczynie hodowlane zawierające blok 20% żelatyny. Za pomocą skalpela wytnij blok o wymiarach 5 cm x 5 cm. Wklej górną stronę bloku do wspornika za pomocą kleju cyjanoakrylowego lub jego odpowiednika.</li>
		<li>Umieść nowe ostrze w wibratomie.</li>
		<li>Dostosuj poziom bloku, aż znajdzie się na tym samym poziomie żyletki.</li>
		<li>Napełnić wannę wokół podpory świeżym podłożem niezależnym od CO2 w temperaturze 4 °C. Przeciąć blok wibratomem z prędkością średnią, aż blok zostanie równomiernie przecięty, co doprowadzi do uzyskania gładkiej powierzchni. Ustaw pozycję 0.</li>
		<li>Odessać pożywkę wokół bloku żelatyny aż do całkowitego wyschnięcia, a następnie pobrać 12-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą tkanki z inkubatora w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie otwórz wkładkę hodowlaną na górze bloku żelatyny. Przeciąć nożyczkami wszystkie części błon, które nie zawierają komórek (poza pierścieniem, w którym komórki nie były hodowane). Zassać całe pozostałe podłoże.</li>
		<li>Dodać 1 ml płynnego 8% roztworu żelatyny o temperaturze 37 °C w celu pokrycia membran. Ostrożnie usuń nadmiar. Odczekaj 5–8 minut, aby żelatyna stężała.</li>
		<li>Dodać świeżą pożywkę niezależną od CO2 (w temperaturze 4 °C) do kąpieli, aż membrana zostanie pokryta.</li>
		<li>Cięcie, z wibratomem w pozycji -100 μm, ze średnią prędkością, zachowując świadomość tego, jak zachowuje się blok. Pod koniec sekcji należy uważać, aby utrzymać orientację tkanki.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wytnij róg, aby określić orientację sekcji.</li>
		<li>Zebrać szpatułką membranę zatopioną w żelatynie i umieścić ją w 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką konserwującą w temperaturze 4 °C, aż do wszczepienia jej do oka biorcy.</li>
		<li>W momencie przeszczepienia należy dostosować wielkość implantu do wielkości oka biorcy pod mikroskopem operacyjnym (1–3 dla szczurów, 10–15mm2 dla naczelnych innych niż ludzie).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17101537">Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts.</a> Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).</li>
<li>Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+a+multifactorial+late-onset+disease%3A+from+genetic+susceptibility+to+disease+mechanisms+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).</li>
<li>Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+pluripotent+stem+cells+to+study+and+treat+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).</li>
<li>Ben M'Barek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+retinal+epithelial+cell+sheets+potentiate+rescue+of+photoreceptor+cell+loss+in+rats+with+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration.</a> Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+Follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li>
<li>Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cell+monolayers+have+higher+resistance+to+oxidative+stress-induced+cell+death+than+nonpolarized+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).</li>
<li>Diniz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Thomas, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+functionality+of+hESC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+cultured+as+a+monolayer+on+polymer+substrates+transplanted+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).</li>
<li>Borooah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+treat+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Making+stem+cells+retinal%3A+Methods+for+deriving+retinal+pigment+epithelium+and+implications+for+patients+with+ocular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Lustremant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+tool+to+model+a+form+of+Leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis.</a> Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+Cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+stem+cells+grown+into+polarized+RPE+monolayers+on+a+polyester+matrix+are+maintained+after+grafting+into+rabbit+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li>
<li>Ilmarinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+polyimide+membrane+as+cell+carrier+for+subretinal+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell+derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium.</a> PloS One. 10 (11), e0143669(2015).</li>
<li>Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descemet%27s+membrane+as+membranous+support+in+RPE%2FIPE+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation.</a> Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).</li>
<li>Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+amniotic+membrane+to+the+subretinal+space+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs.</a> Stem Cells International. 2012, 716968(2012).</li>
<li>Capeans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+as+support+for+human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).</li>
<li>Ohno-Matsui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+amniotic+membrane+on+retinal+pigment+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation.</a> Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).</li>
<li>Paolin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membranes+in+ophthalmology%3A+long+term+data+on+transplantation+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes.</a> Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+therapies+in+combination+with+substrate+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%3A+The+Official+Journal+of+the+Association%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Song, M. J., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+into+the+future%3A+Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+build+two+and+three+dimensional+ocular+tissue+for+cell+therapy+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling.</a> Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).</li>
<li>Ramsden, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+Past%2C+present+and+future%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future).</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced%2C+dry+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
</ol>

Olivier Goureau jest wynalazcą oczekujących patentów związanych z wytwarzaniem komórek siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano metodę hodowli komórek RPE na rusztowaniu biologicznym i jej przygotowania do implantacji w modelach zwierzęcych. Jednym z krytycznych etapów protokołu jest utrzymanie orientacji hAM przez cały czas trwania procedury, aż do jego włączenia do żelatyny. Rzeczywiście, natywny nabłonek błony jest usuwany, a jego błona podstawna zostaje odsłonięta9. Komórki RPE muszą być wysiane na tej błonie podstawnej. Podczas przygotowywania do zatapiania żelatyny ważne jest, aby pracować ze wszystkimi produ...

RPE jest kluczowe dla przetrwania i homeostazy fotoreceptorów, z którymi jest ściśle związany1. Kilka stanów patologicznych zmienia jego funkcjonalność i/lub przeżycie, w tym RP i AMD.
RP to grupa dziedzicznych mutacji monogenowych, które wpływają na funkcje fotoreceptorów lub komórek RPE, lub obu2,3. Szacuje się, że mutacje, które wpływają konkretnie na komórki RPE, stanowią 5% RP2. AMD to kolejny stan, w którym warstwa RPE ulega zmianie, co ostatecznie prowadzi do utraty widzenia centralnego. AMD jest spowodowane złożonymi interakcjami czynników genetycznych i środowiskowych i dotyka osoby starsze4,5,6. Według prognoz, do 2020 roku AMD będzie problemem dla 196 milionów pacjentów na całym świecie7. Na te zaburzenia nie ma skutecznego lekarstwa, a jedną z proponowanych strategii jest przeszczepianie nowych komórek RPE w celu skompensowania martwych/niefunkcjonalnych wcześniej istniejących komórek RPE8.
Sposób formułowania produktu końcowego, który ma być szczepiony, jest niezbędny do zapewnienia najlepszych wyników funkcjonalnych. Komórki RPE wstrzykiwane jako zawiesina komórkowa, mimo że są łatwą i bezpośrednią metodą dostarczania, budzą obawy dotyczące ich przetrwania, integracji i funkcjonalności9,10,11,12,13. Naukowcy opracowują obecnie bardziej złożone preparaty, aby zapewnić zmodyfikowaną tkankę siatkówki9,13,14,15,16. W tym kontekście opracowaliśmy oryginalną metodę generowania in vitro tkanki RPE, która może być wykorzystana do transplantacji9.
Banki komórek RPE pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES) są używane w tym protokole. Jednak alternatywne banki komórek RPE z różnych źródeł komórkowych (ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, pierwotne komórki RPE itp.) i różnicowane inną metodą są również odpowiednie dla tego protokołu. Obejmuje protokoły ukierunkowanego różnicowania przy użyciu cytokin i/lub małych cząsteczek17,18,19,20,21,22.
Aby można było przeszczepić, zmodyfikowana tkanka powinna być przygotowana na rusztowaniu. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano różne rusztowania oparte na polimerze lub na matrycy pochodzenia biologicznego13,23,24. W tym przypadku stosowanym substratem biologicznym jest hAM, ale można zastosować inne substraty, takie jak obnażone błony Brucha. Opisana w niniejszym dokumencie metoda ma tę zaletę, że wykorzystuje rusztowanie biologiczne, które jest bardziej odpowiednie dla rodzimego środowiska RPE.
Ludzkie komórki RPE pochodzące z komórek ES są hodowane przez co najmniej 4 tygodnie, aby mogły być w pełni zorganizowane jako monowarstwa brukowa. Na tym etapie uzyskany nabłonek jest funkcjonalny i spolaryzowany9. Wreszcie, ponieważ tkanka ta łatwo się marszczy, jest ona zatopiona w cienkiej warstwie nośnika hydrożelowego, aby nadać jej większą sztywność i elastyczność oraz chronić ją podczas procedury wstrzykiwania. Produkt ten jest następnie przechowywany w temperaturze 4 °C do czasu szczepienia.

<table><tbody><tr><td>Sterylna szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>TechGen International</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>System usuwania odpadów płynnych do aspiracji</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2 kontrolowany +37&nbsp; &deg; Inkubator komórek C</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; &mikro; Pipeta L: P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; Pipeta mL: P1000</td><td>Gilson</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &deg; C lodówka</td><td>Liebherr</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze (x2)</td><td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Grant subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Wirówka</td><td></td> Sartorius CP225D <td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka pozioma na biegunach</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>plastikowa folia parafinowa</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0,200 &mikro; m Filtr strzykawkowy jednorazowego użytku</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka bez igły 50 ml</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>Butelki 250 ml</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylne probówki Falcon</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne probówki Falcon</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>wkładka hodowlana</td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm dysze do hodowli komórkowych: B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Castorama</td><td>3178040670105</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysine</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td><td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>CO2-independent</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>ludzka błona owodniowa</td><td>Bank tkanek Szpital St Louis (Paryż, Francja)</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Kilka patologicznych stanów oka wpływa na funkcjonalność i/lub przetrwanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Należą do nich niektóre formy barwnikowego zwyrodnienia siatkówki (RP) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Terapia komórkowa jest jedną z najbardziej obiecujących strategii terapeutycznych zaproponowanych w celu wyleczenia tych chorób, z już obiecującymi wstępnymi wynikami u ludzi. Jednak sposób przygotowania przeszczepu ma znaczący wpływ na jego wyniki funkcjonalne in vivo. Rzeczywiście, komórki RPE przeszczepione jako zawiesina komórkowa są mniej funkcjonalne niż te same komórki przeszczepione jako tkanka siatkówki. W niniejszym artykule opisano prostą i powtarzalną metodę inżynierii tkanki RPE i jej przygotowania do implantacji in vivo. Komórki RPE pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych są wysiewane na podłożu biologicznym, ludzkiej błonie owodniowej (hAM). W porównaniu ze sztucznymi rusztowaniami, to podparcie ma tę zaletę, że ma błonę podstawną, która znajduje się blisko błony Brucha, do której przyczepione są endogenne komórki RPE. Jednak jego manipulacja nie jest łatwa, dlatego opracowaliśmy kilka strategii jego prawidłowej hodowli i przygotowania do szczepienia in vivo.

hAMy zawierają warstwę nabłonkową, którą należy usunąć przed wysianiem komórek RPE. Enzymatyczną obróbkę błony przeprowadza się przy użyciu termolizyny podczas wytrząsania. Aby nie utracić polarności błony (nabłonek znajduje się po jednej stronie), jest ona mocowana na podłożce, której skład może się różnić w zależności od dostawcy (Rycina 1A). Na tym etapie należy sprawdzić przyleganie błony do podłożki i w razie potrzeby dodać klipsy. Podczas mocowania w in...

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące autoterapii oka, takie jak skuteczność specjalnie zaprojektowanej tkanki bioinżynieryjnej in vivo. Dzięki tej technice zapewniamy metodę wytwarzania i konturowania tkanki siatkówki, a także strategię przetwarzania tkanki do implantacji oka w modelu zwierzęcym. Zacznij od umycia od jednego do czterech kawałków ludzkiej błony owodniowej o wymiarach 30 na 30 mm lub hAM.Zamocuj nylonowe rusztowanie dwa razy po 80 ml PBS na pranie w butelce o pojemności 250 ml na shakerze, z dużą prędkością przez pięć minut. Po drugim myciu dodaj 40 ml działającego roztworu Thermolysin do każdej butelki i potrząsaj butelkami dwa razy przez pięć minut z prędkością 450 obr./min, a następnie przez 30 sekund wirowania. Po drugiej rundzie leczenia Thermolysin, umyj kawałki jeszcze dwa razy 80 ml PBS na pranie, jak pokazano.Następnie użyj długich sterylnych kleszczy, aby przenieść hAM pojedynczo do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego, zawierającego 10 ml PBS. Następnie umieść jedną membranę nylonem skierowanym w dół w drugim 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym PBS i odłącz dwa z czterech klipsów mocujących membranę do nylonu. Włóż mniejszy pierścień wkładki hodowlanej między nylon a membranę, upewniając się, że membrana całkowicie zakrywa mniejszy pierścień.Przypnij drugą część wkładki hodowlanej do górnej części membrany tak, aby błona podstawna hAM była skierowana prawą stroną do góry we wkładce hodowlanej i odłącz dwa ostatnie klipsy. Następnie użyj sterylnych nożyczek, aby w razie potrzeby przyciąć błonę poza wkładką hodowlaną. I użyj kleszczy, aby przenieść membranę do jednego dołka z 12-dołkowej płytki, zawierającej PBS do przechowywania w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Przed wysiewem ciepłe fiolki kriogeniczne zawierające od jednego razy 10 do szóstego komórek RPE w 3 ml pożywki RPE w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml na fiolkę. Gdy komórki się rozmrozążą, odpipetuj pipetą, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek w każdej z probówek i policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie niebieskiego tri pane. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w stężeniu siedem razy od 10 do piątych komórek na mililitr w świeżej pożywce RPE.Następnie odessaj PBS z każdej studzienki przygotowanej 12-dołkowej płytki i dodaj 500 mikrolitrów komórek do środka każdej wkładki hodowlanej i 1 ml pożywki RPE na dno każdej studzienki. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 30 dni, zmieniając pożywkę dwa razy w tygodniu, aż do końca hodowli. W 30 dniu hodowli ogrzej 8% roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.I napełnij wewnętrzną komorę wibratomu podłożem niezależnym od CO2 o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą skalpela wytnij blok o wymiarach 5 cm na 5 cm z bloku 20% żelatyny przechowywanego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przymocuj górną stronę bloku do wspornika za pomocą odpowiedniego kleju.I umieść nowe ostrze w wibratomie. Wyreguluj blok, aż znajdzie się na tym samym poziomie co żyletka i napełnij wannę wokół wspornika świeżym, niezależnym od CO2 podłożem o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Tnij blok ze średnią prędkością, aż blok zostanie przycięty równomiernie z gładką powierzchnią prowadzącą i ustaw pozycję na zero.Następnie odsysaj pożywkę wokół żelatyny, aż żelatyna całkowicie wyschnie. I użyj kleszczy, aby ostrożnie otworzyć wkładkę hodowlaną z nasionami RPE na wierzchu bloku. Za pomocą nożyczek usuń całą membranę na zewnątrz pierścienia wkładki i zassaj całą objętość pozostałego medium.Dodaj do 1 ml 8% płynnego roztworu żelatyny do membrany, aż zostanie pokryta. I ostrożnie usuń nadmiar żelatyny. Po pięciu do ośmiu minutach dodaj do kąpieli świeżą, niezależną od CO2 pożywkę o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż zestalona membrana zostanie pokryta.A gdy wibratom znajduje się w pozycji 100 mikronów, przetnij odcinek membrany ze średnią prędkością, uważając, aby utrzymać orientację tkanki. Wytnij róg sekcji skalpelem, aby umożliwić identyfikację orientacji sekcji. I za pomocą szpatułki przenieś membranę zatopioną w żelatynie na jedną z sześciodołkowych płytek, wypełnionych podłożem konserwującym o czterech stopniach Celsjusza.Orientacja plastra może zostać odwrócona z powodu swobodnego ruchu przed ciętym rogiem. Zadbaj więc o to, aby zabezpieczyć pozycję plastra tuż za sekcją. Wielkość implantu można następnie dostosować do wielkości oka biorcy pod mikroskopem chirurgicznym, przed przeszczepem.Zazwyczaj kilka martwych komórek pozostaje na powierzchni błony po utrwaleniu na wkładce hodowlanej, ale komórki te są eliminowane po zmianie pożywki hodowlanej. Włókna błony podstawnej są widoczne w większym powiększeniu, gdy nie pozostają żadne komórki, co wskazuje, że okres leczenia termolizyną został zoptymalizowany. Nabłonek siatkówki staje się łatwiejszy do zauważenia pod mikroskopem, w miarę dojrzewania, tworząc kompletną monowarstwę przypominającą kostkę brukową po trzech tygodniach.Po czterech tygodniach nabłonek jest wystarczająco dojrzały, aby był przygotowany do implantacji. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że stan żelatyny zależy od temperatury. Dlatego należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu zalecanych temperatur.Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkami macierzystymi do zbadania potencjału terapeutycznego tkanki bioinżynieryjnej w zwierzęcym modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki. Chociaż metoda ta może być stosowana do przygotowania tkanki na rusztowaniu, w celu jej późniejszego przeszczepu, może być również stosowana do bardziej złożonych systemów zawierających warstwy fotoreceptorów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z obsługą ludzkich błon owodniowych, które są bardzo cienkie i mają tendencję do łatwego fałdowania.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy utrwalania błony owodniowej u ludzi i zatapiania żelatyny są trudne do nauczenia i wymagają szczególnego podejścia do obchodzenia się z nimi.

engineering-transplantation-suitable-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Poznaj metodę inżynierii tkanki nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich komórek macierzystych na błonie owodniowej. Technika umożliwia przygotowanie implantów do badań terapii regeneracyjnej oka.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów