Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod
10 września 2018
Opisujemy system, który wykorzystuje trzy metody do oceny bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania leków ukierunkowanych na łożysko: obrazowanie in vivo do monitorowania akumulacji nanocząstek, ultradźwięki o wysokiej częstotliwości do monitorowania rozwoju łożyska i płodu oraz HPLC do ilościowego określania dostarczania leków do tkanek.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny dotyczące skuteczności i bezpieczeństwa leków załadowanych nanocząstkami dostarczonymi matce i płodowi. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona dokładny biochemiczny pomiar ilości leku dostarczanego do łożyska. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii powikłań ciąży za pośrednictwem łożyska, ponieważ ważne jest, aby zapewnić precyzyjne ukierunkowanie dostarczania leku do łożyska.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ ocena rozwoju embrionalnego za pomocą ultrasonografii o wysokiej częstotliwości wymaga cierpliwości i doświadczenia. W celu dożylnego wstrzyknięcia nanocząstek przenieś ciężarną mysz z 14,5 dnia zarodka z rozszerzonymi termicznie żyłami ogonowymi do ogranicznika i wyczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Następnie włóż końcówkę igły strzykawki insulinowej o rozmiarze 28 do rozszerzonej żyły ogonowej i powoli wciskaj tłok przez pięć do 10 sekund z równomiernym naciskiem, aby dostarczyć nanocząstki do żyły ogonowej.
30 minut po wstrzyknięciu umieść znieczuloną ciężarną mysz w komorze obrazowania systemu obrazowania fluorescencyjnego in vivo w pozycji leżącej. Wybierz fluorescencję 2D i odpowiednie parametry fotograficzne do obrazowania sygnałów fluorescencji zieleni indocyjaninowej i ustaw ekspozycję na auto oraz długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 710 i 820 nanometrów. Następnie wyobraź sobie zwierzę i przywróć ciężarną mysz do klatki.
48 godzin po wstrzyknięciu należy użyć kleszczy Graefe, kleszczyków do tkanek Graefe i nożyczek preparacyjnych, aby pobrać płody i łożyska, a następnie zobrazować pobrane tkanki, jak właśnie pokazano dla całego zwierzęcia. W celu oceny rozwoju embrionalnego za pomocą ultrasonografii o wysokiej częstotliwości, 24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstek, przymocuj znieczuloną ciężarną matkę do wstępnie podgrzanej platformy do obrazowania ultrasonograficznego o temperaturze od 37 do 42 stopni Celsjusza w pozycji leżącej na plecach i umieść 40-megahercowy przetwornik w ramieniu mechanicznym. Następnie dostosuj położenie przetwornika, aby uzyskać podłużne obrazy płodu i łożyska z obszarem zainteresowania w strefie ogniskowej.
W przypadku obrazowania i analizy w trybie B wybierz tryb B i opuść głowicę nad brzuchem, aż płód i łożysko pojawią się w polu widzenia. Kliknij opcję Skanuj/Zamroź, aby zainicjować i zatrzymać obrazowanie, opcję Cine Store (Magazyn kina), aby zapisać pętlę cine i opcję Frame Store (Magazyn klatek), aby zapisać obrazy klatek. Następnie kliknij przycisk Zmierz, aby przeanalizować długość worka ciążowego, długość zadu korony płodu, średnicę dwuciemieniową, obwód brzucha, średnicę łożyska i grubość łożyska.
W przypadku obrazowania i analizy dopplerowskiej fali tętna, przy użyciu tej samej projekcji skanu, najpierw kliknij Kolor, a następnie wybierz Fala tętna i umieść pole objętości próbkowania w środku tętnicy pępowinowej. Kliknij przycisk Skanuj/Zamroź, aby rozpocząć obrazowanie i Cine Store, aby zebrać obrazy tętnicy pępowinowej. Następnie kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć szczytową prędkość tętnicy pępowinowej.
W przypadku obrazowania i analizy w trybie kolorowego Dopplera, przy użyciu tej samej projekcji skanu, kliknij opcję Kolor i dostosuj położenie przetwornika, aby uzyskać obrazy serca płodu, jak pokazano. Następnie kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć tętno płodu w zapisanej pętli obrazu filmowego. W przypadku analizy wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) należy najpierw wstrzyknąć ciężarnej myszy w wieku 14,5 dnia zarodka pojedynczą dawkę nanocząstek, jak pokazano.
Po 24 godzinach przelej serce ciężarnego zwierzęcia 50 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej o sile fizjologicznej 0,9% przez 10 minut, aby usunąć wszelkie niezwiązane nanocząsteczki, a następnie zbierz płody i łożyska do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W dniu analizy dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu homogenizacyjnego do każdej 200-miligramowej próbki tkanki i homogenizować próbki dwa razy z pełną prędkością przez 30 sekund na dysocjację. Po drugiej homogenizacji odwirować próbki i przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrometra do fiolki HPLC.
Umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia i włączyć odgazowywacz HPLC, aby usunąć powietrze z systemu. Następnie włącz przepływ, aby zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą przez 30 minut, aby zmniejszyć szum linii podstawowej, i ustaw temperaturę kolumny na 25 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknij próbkę o objętości 20 mikrolitrów z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę w ciągu 30 minut i kliknij przycisk Uruchom metodę, aby rozpocząć analizę.
Po zakończeniu serii ręcznie zmień fazę ruchomą na acetonitryl klasy HPLC i uruchom acetonitryl na około 15 minut, aby chronić system. Obrazowanie in vivo ujawnia silne zielone sygnały indocyjaniny w tkance macicy 30 minut po wstrzyknięciu nanocząstek związanych z siarczanem chondroityny w łożysku, podczas gdy niezwiązane nanocząstki lokalizują się głównie w obszarach wątroby i śledziony. 48 godzin po wstrzyknięciu obserwuje się sygnał fluorescencyjny w łożysku zwierząt, którym wstrzyknięto nanocząstki związane siarczanem chondroityny, bez wykrywania sygnałów u płodu.
Monitorowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości łożyskowych zwierząt z fluorescencyjnymi cząstkami sprzężonymi z fluorescencją i wstrzykiwanymi nanocząstkami ujawnia znaczny spadek kluczowych punktów orientacyjnych rozwoju płodu i łożyska. Co ciekawe, leczenie nanocząstkami związanymi z metotreksatem również nieznacznie upośledza rozwój płodu i łożyska, co wskazuje, że nanocząstki mogą poprawić dostarczanie metotreksatu do łożyska poprzez zwiększoną przepuszczalność i efekt retencji. Pomiar stężeń metotreksatu za pomocą HPLC wskazuje na czas zatrzymywania wynoszący siedem minut w łożyskach myszy z wstrzyknięciem nanocząstek związanych z metotreksatem.
24 godziny po wstrzyknięciu poziomy metotreksatu w łożysku w grupie, w której wstrzyknięto nanocząstki związane z metotreksatem, są znacznie niższe niż mierzone w grupie łożyskowego siarczanu chondroityny i nanocząstek związanych z metotreksatem, przy czym nie wykryto metotreksatu u płodów tych ostatnich. Metotreksat można nadal wykryć w łożysku 48 godzin po wstrzyknięciu siarczanu chondroityny łożyska i nanocząstek związanych z metotreksatem, co pokazuje, że łożyskowy siarczan chondroityny i nanocząstki związane z metotreksatem nie mogą przenikać przez łożysko, minimalizując w ten sposób potencjalne niekorzystne skutki dla płodu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że łożysko zaczyna się formować około 9 1/2 dnia embrionalnego, dlatego eksperyment z obrazowaniem in vivo lepiej przeprowadzić w 10 dniu embrionalnym lub później.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne i analiza, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji nanocząstek w łożysku. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie medycyny reprodukcyjnej do zbadania możliwości leczenia ukierunkowanego na łożysko w przypadku powikłań ciąży.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia nowatorski system oceny bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania leków ukierunkowanego na łożysko. Wykorzystuje on obrazowanie in vivo, ultradźwięki wysokiej częstotliwości oraz technikę HPLC do monitorowania akumulacji leku oraz oceny rozwoju łożyska i płodu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nanomedycyna
- Systemy dostarczania leków
- Biologia łożyska
Wstęp
- Zrozumienie dostarczania leków do łożyska jest kluczowe dla zdrowia matki i płodu.
- Nanocząstki mogą usprawnić ukierunkowane dostarczanie leków.
- Ultradźwięki o wysokiej częstotliwości pozwalają uzyskać wgląd w rozwój embrionalny.
- Precyzyjne pomiary biochemiczne są niezbędne do oceny skuteczności leku.
Cel badania
- Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania leków do łożyska.
- Zapewnienie precyzyjnego celowania terapii w przypadku powikłań związanych z łożyskiem.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej metody w monitorowaniu w czasie rzeczywistym.
Zastosowane Metody
- Obrazowanie in vivo w celu monitorowania akumulacji nanocząsteczek.
- Wysokoczęstotliwościowe badanie USG w celu oceny rozwoju łożyska i płodu.
- HPLC do ilościowego oznaczenia dostarczania leku do tkanek.
- Dożylne wstrzykiwanie nanocząsteczek u ciężarnych myszy.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia monitorowanie dostarczania leku w czasie rzeczywistym.
- Ultradźwięki o wysokiej częstotliwości pozwalają na skuteczną ocenę rozwoju embrionalnego.
- Osiągnięto dokładne pomiary poziomów leku w łożysku.
- Technika ta rokuje nadzieje w zakresie rozwiązywania powikłań ciążowych.
Wnioski
- System ten zwiększa zrozumienie ukierunkowanego dostarczania leków do łożyska.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych badań w dziedzinie nanomedycyny.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jego zastosowania w warunkach klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dostarczanie leków ukierunkowane na łożysko pozostaje krytyczną, niezaspokojoną potrzebą w leczeniu powikłań ciążowych, gdzie precyzyjne celowanie minimalizuje toksyczność płodową i macierzyńską. Ten wielometodowy system ewaluacji umożliwia ilościową ocenę akumulacji leków w łożysku za pomocą nanocząsteczek, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Dzięki połączeniu obrazowania in vivo, HFUS i HPLC, podejście to zapewnia pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i retencji tkankowo-specyficznej, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac nad terapiami łożyskowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących celowania w łożysko poprzez bezpośrednią wizualizację akumulacji nanocząsteczek in vivo.
- Wartość operacyjna: Zapewnia biochemiczną kwantyfikację dostarczania leku do łożyska za pomocą HPLC, ograniczając poleganie na punktach końcowych zastępczych.
- Wartość prognostyczna: Potwierdza pewność wyboru celu poprzez wykazanie specyficznej retencji nanocząsteczek związanych z metotreksatem w łożysku, bez ich przenikania do płodu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Ustanawia zestandaryzowane protokoły wstrzykiwania nanocząsteczek, pobierania tkanek oraz dopasowania wielomodalnych odczytów w poszczególnych punktach czasowych.
- Wyniki ilościowe: Metoda HPLC dostarcza danych dotyczących czasu retencji i stężenia, umożliwiając analizę zależności dawka-odpowiedź w odniesieniu do akumulacji leku w łożysku.
- Reprodukowalność: HFUS zapewnia spójne parametry rozwojowe (średnicę łożyska, długość płodu od czubka głowy do krzyżca) do porównań między grupami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednie modelowanie powikłań związanych z łożyskiem poprzez ocenę dostarczania leku u ciężarnych myszy w 14,5 dniu embrionalnym.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie celowania nanocząsteczek z efektami funkcjonalnymi za pomocą skorelowanych danych obrazowych, USG i biochemicznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wykazanie braku transportu leku do płodu, co wspiera tworzenie profilu bezpieczeństwa dla dalszego rozwoju.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po ocenę przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne udoskonalanie strategii celowania w łożysko.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy dotyczącej specyficzności wiązania peptydów do siarczanu chondroityny A w łożysku za pomocą spatiotemporalnego śledzenia nanocząstek.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację analizy poprzez zdefiniowane protokoły wstrzykiwania, wypłukiwanie perfuzyjne oraz homogenizację tkanek do analizy HPLC.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty HPLC (czas retencji siedem minut) oraz pochodne z HFUS wskaźniki rozwojowe do ewaluacji multiparametrycznej.
- Badania translacyjne: Łączy akumulację leku w łożysku z wynikami bezpieczeństwa płodu, dostarczając informacji do oceny stosunku korzyści do ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modułową platformę możliwą do adaptacji dla innych formulacji nanocząstek i ładunków terapeutycznych poza metotreksatem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez potwierdzenie specyficzności łożyskowej oraz braku transportu do płodu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływ pracy w obrębie platform obrazowania, ultrasonografii i chromatografii w celu zapewnienia powtarzalności w wielu ośrodkach.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesne zidentyfikowanie nanocząstek nieprzenikających przez łożysko, co pozwala uniknąć ryzyka toksyczności płodowej w późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii celowania w łożysko z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe dane dotyczące rozkładu tkankowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach chirurgicznych u gryzoni, wstrzykiwaniu dożylnym oraz w zarządzaniu znieczuleniem u ciężarnych samic.
- Zależność od dostępu do systemów obrazowania fluorescencyjnego in vivo, przetworników HFUS o częstotliwości 40 MHz oraz systemów HPLC z detekcją fluorescencyjną.
- Niezbędne jest stosowanie zestandaryzowanych protokołów perfuzji i homogenizacji tkanek w celu zminimalizowania zmienności w odzysku leku.
- Należy uwzględnić czas trwania ciąży, ponieważ formowanie łożyska rozpoczyna się około 9,5 dnia embrionalnego, co wpływa na optymalne okna czasowe dla iniekcji.
- Ograniczenie do przedklinicznych modeli gryzoni; ekstrapolacja na łożysko ludzkie wymaga dodatkowej walidacji w systemach ex vivo lub zaawansowanych systemach in vitro.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:11
In Vivo Fluorescence Imaging
2:35
High-Frequency Ultrasound (HFUS) Embryonic Development Evaluation
4:28
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Analysis
6:18
Results: Representative Placenta-Targeted Drug Delivery Analyses
8:12
Conclusion
