Name: Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę oceny skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu obrazowania in vivo, ultrasonografii wysokiej częstotliwości i HPLC. Technika ta umożliwia precyzyjne monitorowanie akumulacji nanocząstek oraz rozwój płodu u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Natural Sciences Foundation (81771617) i Natural Science Foundation of Guangdong Province (2016A030313178) przyznane X.F.; grant z Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) przyznany X.F; oraz Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R01HD088549 (za treść wyłączną odpowiedzialność ponosi autorów i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy National Institutes of Health) do N.N.

Wszystkie eksperymenty na myszach ściśle przestrzegały protokołów (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) zatwierdzonych przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutów Zaawansowanych Technologii w Shenzhen, Chińskiej Akademii Nauk.
1. Synteza nanocząstek lipidowo-polimerowych siarczanu chondroityny łożyskowej
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj nanocząstki lipidowo-polimerowe załadowane MTX i ICG (odpowiednio MNP i INN) oraz nanocząstki sprzężone z plCSA-BP (plCSA-MNP i plCSA-INN), jak opisano szczegółowo w innym miejscu18.</li>
</ol>
2. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo
<ol>
	<li>Przygotowanie ciężarnych myszy
	<ol>
		<li>Umieść samice myszy CD-1 (8-12 tygodni) z płodnym samcem tego samego szczepu w jednej klatce (samiec: samica = 1:2) po południu i sprawdź korki dopochwowe następnego ranka. Jeśli zaobserwuje się czop dopochwowy, zdefiniuj mysz jako dzień embrionalny 0,5 (E0,5).</li>
		<li>Ciężarne myszy trzyma się samotnie w pomieszczeniu dla zwierząt wolnym od patogenów z cyklem 14 godzin światła/10 godzin ciemności i zapewnia swobodny dostęp do pożywienia i wody do momentu E14,5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dożylne wstrzyknięcie nanocząstek
	<ol>
		<li>Przed zabiegiem należy wysterylizować nanocząstki poprzez filtrację przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Zważyć ciężarną mysz w temperaturze E11,5, aby określić ilość i objętość wstrzykniętych nanocząstek. 
		Uwaga: Objętość wstrzykniętych nanocząstek powinna być mniejsza niż 1% (objętość/waga) masy ciała ciężarnej myszy. Na przykład objętość wstrzykniętych nanocząstek powinna być mniejsza niż 0,25 ml w myszy o wadze 25 g.</li>
		<li>Aby rozszerzyć żyłę ogonową, ogrzewaj ogon przez 5-10 minut za pomocą poduszki grzewczej.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy odessać INPs lub plCSA-INPs do strzykawki insulinowej o masie 28 g.</li>
		<li>Przenieś ciężarną mysz do urządzenia przytrzymującego, które przytrzymuje mysz, umożliwiając jednocześnie dostęp do żyły ogonowej. Oczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Następnie wprowadzić strzykawkę do żyły ogonowej. Powoli wstrzykiwać INP lub plCSA-INPs (ekwiwalent 5 mg/kg ICG) pod równomiernym ciśnieniem przez 5-10 s. 
		Uwaga: Należy przerwać wstrzykiwanie, jeśli na ogonie pojawi się pęcherz, ponieważ oznacza to, że igła nie znajduje się w żyle. Strzykawki nie powinny być współdzielone przez myszy, aby zminimalizować przenoszenie choroby i zanieczyszczenie krzyżowe.</li>
		<li>Zapisać czas wstrzyknięcia. W międzyczasie należy delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie, co zwykle trwa 30-60 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie in vivo 
	<ol>
		<li>30 minut po wstrzyknięciu należy zobrazować ciężarne myszy za pomocą systemu obrazowania fluorescencyjnego in vivo.</li>
		<li>Znieczulenie ciężarnych myszy natężeniem przepływu tlenu 1,0 l/min i izofluranem w stężeniu 2-4% w odpowiedniej komorze jednostki anestezjologicznej i sprawdzenie pełnego znieczulenia poprzez powolne i regularne oddychanie. Następnie przenieś je do komory obrazowania. Umieść znieczulone ciężarne myszy w komorze obrazowania, utrzymując zwierzęta w pozycji leżącej.</li>
		<li>Umieść stożek nosowy nad ustami i nosem, aby umożliwić wdychanie 1-2% izofluranu o natężeniu przepływu tlenu 1,0 l/min w celu utrzymania znieczulenia.</li>
		<li>Wybierz fluorescencję 2D i parametry fotograficzne, aby zobrazować sygnały fluorescencji ICG. Ustaw ekspozycję na auto i długości fal wzbudzenia/emisji na 710/820 nm.</li>
		<li>Pod koniec procedury obrazowania wyłącz dopływ izofluranu, aby zatrzymać znieczulenie, i ostrożnie wróć ciężarne myszy do klatek.</li>
		<li>48 godzin po wstrzyknięciu nanocząstek znieczulić ciężarne myszy izofluoranem, a następnie poświęcić matkę przez zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz płody i łożyska za pomocą kleszczy Graefe, kleszczyków do tkanek Graefe i nożyczek preparacyjnych.</li>
		<li>Umieścić łożyska i płody w komorze obrazowania i wykonać obraz metodą opisaną w kroku 2.3.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena rozwoju embrionalnego przez HFUS
<ol>
	<li>Modele zwierzęce
	<ol>
		<li>Pobrać i przygotować ciężarne myszy zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
		<li>Użyj HFUS do obrazowania ciężarnych myszy w E 6.5 (protokoły 3.2 i 3.3.3). Najpierw potwierdź ciążę, wizualizując zarodki w dniu E6,5, a następnie losowo przydziel ciężarne myszy do trzech grup: grupy MNP, grupy plCSA-MNP i grupy soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Wstrzykiwać PBS, MNP lub plCSA-MNPs (ekwiwalent MTX 1 mg/kg) do żył ogonowych ciężarnych myszy co drugi dzień, zaczynając od E6,5, jak opisano w kroku 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do obrazowania
	<ol>
		<li>24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstek należy zobrazować ciężarne myszy za pomocą systemu obrazowania HFUS.</li>
		<li>Znieczulić ciężarne myszy zgodnie z opisem w kroku 2.3.2. Włącz zintegrowane regulatory temperatury platformy obrazowania i podgrzej platformę do 37-42 °C. Zabezpiecz ciężarne myszy w pozycji leżącej na platformie za pomocą taśmy.</li>
		<li>Umieść stożek nosowy połączony z jednostką anestezjologiczną nad pyskiem. Zastosuj 2% izofluranu o natężeniu przepływu tlenu 1,0 l/min, aby utrzymać stałe znieczulenie.</li>
		<li>Usuń chemicznie włosy z brzucha za pomocą kremu do depilacji. Resztki kremu dokładnie zetrzyj gazą nasączoną wodą, a następnie pokryj brzuch akustycznym żelem sprzęgającym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura obrazowania
	<ol>
		<li>Umieść przetwornik 40 MHz w ramieniu mechanicznym.</li>
		<li>Dostosuj pozycję przetwornika, aby uzyskać podłużne obrazy płodu i łożyska z obszarem zainteresowania znajdującym się w strefie ogniskowej.</li>
		<li>Obrazowanie i analiza w trybie B<br />
		Uwaga: Patrz film 1.
		<ol>
			<li>Kliknij przycisk B-Mode i opuść przetwornik nad brzuchem, aż płód i łożysko pojawią się w polu widzenia. Naciśnij przycisk Scan/Freeze, aby rozpocząć/zatrzymać obrazowanie, naciśnij przycisk Cine store, aby zapisać pętlę cine, a następnie naciśnij przycisk Frame store, aby zapisać obrazy klatek.</li>
			<li>Kliknij przycisk Zmierz, aby przeanalizować długość worka ciążowego (GS), długość zadu korony płodu (CRL), średnicę dwuciemieniową (BPD), obwód brzucha (AC), średnicę łożyska (PD) i grubość łożyska (PT).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obrazowanie i analiza PW-Doppler 
		Uwaga: Patrz film 1.
		<ol>
			<li>Korzystając z tej samej projekcji skanowania, kliknij przycisk PW, umieść pole objętości próbkowania na środku tętnicy pępowinowej i naciśnij Skanuj/Zamroź, aby rozpocząć obrazowanie. Kliknij Sklep Cine, aby pobrać obrazy tętnicy pępowinowej.</li>
			<li>Kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć szczytową prędkość tętnicy pępowinowej (UA).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obrazowanie i analiza w trybie kolorowego Dopplera
		<ol>
			<li>Korzystając z tej samej projekcji skanowania, kliknij przycisk Kolor i dostosuj położenie głowicy, aby uzyskać obrazy serca płodu. Naciśnij przycisk Skanuj/zamroź, aby rozpocząć obrazowanie i Magazyn Kine, aby zebrać obrazy.</li>
			<li>Kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć tętno płodu (HR).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza HPLC
<ol>
	<li>Przygotowanie tkanek
	<ol>
		<li>Ciężarnym myszom należy wstrzyknąć pojedynczą dawkę MNP lub plCSA-MNP (ekwiwalent 1 mg/kg MTX) w późnej ciąży (np. E14.5), jak opisano w kroku 3.1.3.</li>
		<li>Po 24 godzinach znieczulić myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie awertyny w ilości 240 μg/masę ciała (g). Upewnij się, że nie reaguje na uszczypnięcie stopy, aby sprawdzić, czy myszy są w pełni znieczulone.</li>
		<li>Spryskaj klatkę piersiową 75% etanolem. Wykonaj perfuzję serca (przetnij prawe przedsionki i przelej przez lewą komorę) zgodnie z wcześniejszym szczegółowym opisem19,20 z 50 ml lodowatego 0,9% soli fizjologicznej przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane nanocząstki.</li>
		<li>Poddać zaporę eutanazji. Wykonaj cesarskie cięcie w celu pobrania płodów i łożysk za pomocą kleszczy Graefe, nożyczek preparacyjnych i kleszczy tkankowych Graefe, a następnie przechowuj tkanki w temperaturze -80 °C przed analizą.</li>
		<li>Przygotować roztwór homogenizacyjny (10% kwas nadchlorowy) i przechowywać na lodzie. Zebrać około 200 mg tkanki i dodać 500 μl roztworu homogenizacyjnego do każdej próbki. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora na pełnych obrotach przez 30 s i powtórzyć tę procedurę dwukrotnie.</li>
		<li>Odwirować próbki o sile 14 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant (około 300 μl) przez filtr strzykawkowy 0,45 μm i przenieść otrzymaną ciecz do fiolki HPLC. Umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie norm
	<ol>
		<li>Przygotować następujący roztwór do fazy ruchomej: 40 mM dwuzasadowy fosforan potasu (pH 4,5) i acetonitryl (88:12, v/v). Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm i przenieść otrzymaną ciecz do czystej butelki zbiornika HPLC. 
		Uwaga: Dostosuj pH za pomocą 0,1 M kwasu fosforowego. Użyj wibracji ultradźwiękowych przez 15 minut, aby odgazować fazę ruchomą za każdym razem przed użyciem.</li>
		<li>Odważyć 10 mg MTX do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml 1 M wodorotlenku sodu.</li>
		<li>Wiruj z dużą prędkością, aż MTX całkowicie się rozpuści. 
		Uwaga: Jest to surowiec podstawowy i może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
		<li>Aby utworzyć wtórny materiał MTX (500 μg/ml), należy rozcieńczyć 50 μl materiału pierwotnego w 950 μl fazy ruchomej. 
		Uwaga: Przechowywać na lodzie do czasu użycia i codziennie przygotowywać świeże. Ważne jest, aby wykorzystać fazę ruchomą do przygotowania wzorców, aby uniknąć pików wynikających z mieszania różnych roztworów po wstrzyknięciu próbki.</li>
		<li>Dokonaj dalszych rozcieńczeń, aby stworzyć normy (Tabela 1). Przechowuj wzorce na lodzie i codziennie przygotowuj świeże. Uruchom wzorce szeregowo z próbkami eksperymentalnymi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>numer</td>
			<td>Stężenie końcowe (μg/ml)</td>
			<td>500 μg/ml wzorca, μL</td>
			<td>Faza ruchoma (μl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1</td>
			<td>999</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>1</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>998</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Rozdział 2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>Okręg wyborczy 980</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>950</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>100</td> szt.
			<td>900</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>100</td> szt.
			<td>200</td> szt.
			<td>800</td> szt.
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przygotuj krzywą standardową dla MTX. Końcowe stężenie roztworu wzorcowego MTX wynosi od 0,5 do 100 μg/ml.
<ol start="3">
	<li>Oprzyrządowanie HPLC i parametry pracy 
	Uwaga: Próbki analizowano w systemie HPLC wyposażonym w pompę rozpuszczalnika, detektor spektrofotometryczny UV (313 nm) i kolumnę C18 (250×4,6 mm, wielkość cząstek 5 μm).
	<ol>
		<li>Włącz odgazowywacz HPLC, aby usunąć powietrze z systemu. Włącz przepływ, równoważąc kolumnę z fazą ruchomą przez 30 minut, aby zmniejszyć szum linii podstawowej.</li>
		<li>Ustawić temperaturę kolumny na 25 °C, wstrzyknąć 20 μl próbki o natężeniu przepływu 1 ml/min i kliknąć przycisk Uruchom metodę, aby rozpocząć analizę.</li>
		<li>Po zakończeniu serii ręcznie zmień fazę ruchomą na acetonitryl klasy HPLC. Uruchom przez około 15 minut, aby chronić system. 
		Uwaga: Niewykonanie tego kroku zgodnie z zalecanym czasem pracy może spowodować uszkodzenie kolumny.</li>
		<li>W celu analizy ilościowej należy obliczyć obszary pod standardowymi pikami zainteresowania MTX za pomocą oprogramowania systemowego HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+of+Factor+V+Leiden+and+Prothrombin+Gene+Mutation+and+Placenta-Mediated+Pregnancy+Complications%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis+of+Prospective+Cohort+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies.</a> PLOS Medicine. 7 (6), e1000292(2010).</li>
<li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+thrombophilia+and+pregnancy+complications+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Inherited thrombophilia and pregnancy complications revisited.</a> Obstetrics & Gynecology. 112 (2 Pt 1), 320-324 (2008).</li>
<li>Brenner, B., Aharon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombophilia+and+adverse+pregnancy+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Thrombophilia and adverse pregnancy outcome.</a> Clinics in Perinatology. 34 (4), 527-541 (2007).</li>
<li>Fisk, N. M., McKee, M., Atun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+addressability+of+global+disease+burden+in+maternal+and+perinatal+health+by+investment+in+R%26D%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+%26+International+Health%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute addressability of global disease burden in maternal and perinatal health by investment in R&D.</a> Tropical Medicine & International Health. 16 (6), 662-668 (2011).</li>
<li>Fisk, N. M., Atun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Market+failure+and+the+poverty+of+new+drugs+in+maternal+health%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Market failure and the poverty of new drugs in maternal health.</a> PLOS Medicine. 5 (1), e22(2008).</li>
<li>Kaitu'u-Lino, T. uJ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nanoparticle+delivery+of+doxorubicin+into+placental+tissues+to+treat+ectopic+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted nanoparticle delivery of doxorubicin into placental tissues to treat ectopic pregnancies.</a> Endocrinology. 154 (2), 911-919 (2013).</li>
<li>King, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-homing+peptides+as+tools+for+targeted+delivery+of+payloads+to+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Tumor-homing peptides as tools for targeted delivery of payloads to the placenta.</a> Science Advances. 2 (5), e1600349(2016).</li>
<li>Beards, F., Jones, L. E., Charnock, J., Forbes, K., Harris, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Homing+Peptide-microRNA+Inhibitor+Conjugates+for+Targeted+Enhancement+of+Intrinsic+Placental+Growth+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Placental Homing Peptide-microRNA Inhibitor Conjugates for Targeted Enhancement of Intrinsic Placental Growth Signaling.</a> Theranostics. 7 (11), 2940-2955 (2017).</li>
<li>Cureton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Targeting+of+a+Novel+Vasodilator+to+the+Uterine+Vasculature+to+Treat+Impaired+Uteroplacental+Perfusion+in+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Selective Targeting of a Novel Vasodilator to the Uterine Vasculature to Treat Impaired Uteroplacental Perfusion in Pregnancy.</a> Theranostics. 7 (15), 3715-3731 (2017).</li>
<li>Paul, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+human+and+mouse+uterus+using+immunoliposomes+targeted+to+the+oxytocin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-specific+drug+delivery+by+trophoblast-targeted+nanoparticles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice.</a> Theranostics. 8 (10), 2765-2781 (2018).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+placenta-specific+transgene+expression+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging.</a> PloS One. 6 (1), e16348(2011).</li>
<li>Murata, M., Tahara, K., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+surface-modified+liposomes+to+evaluate+their+behavior+after+pulmonary+administration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of surface-modified liposomes to evaluate their behavior after pulmonary administration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 115-119 (2014).</li>
<li>Ito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+whole-body+multimodality+imaging+of+gastric+cancer+peritoneal+metastasis+combining+fluorescence+imaging+with+ICG-labeled+antibody+and+MRI+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">New whole-body multimodality imaging of gastric cancer peritoneal metastasis combining fluorescence imaging with ICG-labeled antibody and MRI in mice.</a> Gastric Cancer. 17 (3), 497-507 (2014).</li>
<li>Mazza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-Indocyanine+Green+Nanoprobes+for+Optical+Labeling+and+Tracking+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+Post-Transplantation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Liposome-Indocyanine Green Nanoprobes for Optical Labeling and Tracking of Human Mesenchymal Stem Cells Post-Transplantation In Vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (21), (2017).</li>
<li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+ultrasound+for+in+vivo+pregnancy+diagnosis+and+staging+of+placental+and+fetal+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice.</a> PloS One. 8 (10), e77205(2013).</li>
<li>Spurney, C. F., Leatherbury, L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound+database+profiling+growth%2C+development%2C+and+cardiovascular+function+in+C57BL%2F6J+mouse+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Echocardiography%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound database profiling growth, development, and cardiovascular function in C57BL/6J mouse fetuses.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 17 (8), 893-900 (2004).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/58209/synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa">Synthesis and characterization of placental chondroitin sulfate A (plCSA) -targeting lipid-polymer nanoparticles.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vivo+Blood-brain+Barrier+Permeability+Assay+in+Mice+Using+Fluorescently+Labeled+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+the+central+nervous+system+of+rats+with+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from the central nervous system of rats with EAE.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 527(2007).</li>
<li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1367593103001091">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+detection+and+staging+of+spontaneous+embryo+resorption+by+ultrasound+biomicroscopy+in+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).</li>
<li>Khankin, E. V., Hacker, M. R., Zelop, C. M., Karumanchi, S. A., Rana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+high-frequency+ultrasonography+to+evaluate+cardiovascular+and+uteroplacental+blood+flow+in+mouse+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Pregnancy+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Intravital high-frequency ultrasonography to evaluate cardiovascular and uteroplacental blood flow in mouse pregnancy.</a> Pregnancy Hypertension. 2 (2), 84-92 (2012).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatric Research. 60 (1), 14-21 (2006).</li>
<li>Pallares, P., Gonzalez-Bulnes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+ultrasonographic+characterization+of+phenotypic+changes+during+embryo+development+in+non-anesthetized+mice+of+different+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive ultrasonographic characterization of phenotypic changes during embryo development in non-anesthetized mice of different genotypes.</a> Theriogenology. 70 (1), 44-52 (2008).</li>
<li>Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+%CE%B23+integrin+by+targeted+ECO%2FsiRNA+nanoparticles+inhibits+EMT+and+metastasis+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+doxorubicin+by+CSA-binding+nanoparticles+for+choriocarcinoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment.</a> Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).</li>
<li>Jenkins, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+%28BLI%29+to+improve+and+refine+traditional+murine+models+of+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).</li>
<li>Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+safety+considerations+of+nanoparticle-mediated+drug+delivery+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy.</a> Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).</li>
</ol>

X.F. i B.Z. są wynalazcami we wniosku patentowym PCT/CN2017/108646 złożonym przez SIAT, który obejmuje metodę dostarczania leków specyficzną dla łożyska i jej zastosowanie. Wszyscy pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

W tym manuskrypcie przedstawiamy trzymetodowy system określania, czy nanocząstki kierowane przez plCSA-BP są skutecznym narzędziem do ukierunkowania dostarczania leków do łożyska. Zastosowanie obrazowania in vivo do monitorowania fluorescencyjnego sygnału ICG w podczerwieni potwierdziło swoistość plCSA-BP w kierunku łożyskowym. Korzystając z HFUS i HPLC, wykazaliśmy, że nanocząstki sprzężone z plCSA-BP mogą skutecznie dostarczać MTX tylko do komórek łożyska, a nie do płodu.
W eksperym...

Powikłania ciążowe za pośrednictwem łożyska, w tym stan przedrzucawkowy, utrata ciąży, odklejenie łożyska i mały wiek ciążowy (SGA), są powszechne i prowadzą do znacznej zachorowalności i śmiertelności płodu i matki1,2,3, a bardzo niewiele leków okazało się skutecznych w leczeniu zaburzeń ciąży4,5. Opracowanie strategii bardziej selektywnego i bezpieczniejszego dostarczania leków ukierunkowanych na łożysko w czasie ciąży pozostaje wyzwaniem w nowoczesnej terapii lekowej.
W ostatnich latach kilka raportów skupiało się na celowym dostarczaniu leków do tkanek maciczno-łożyskowych poprzez powlekanie nanocząsteczek peptydami lub przeciwciałami jako narzędziami ukierunkowanymi na łożysko. Należą do nich: przeciwciało przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR)6, peptydy naprowadzające nowotwór (CGKRK i iRGD)7, peptydy ukierunkowane na łożysko8, peptydy ukierunkowane na układ krążenia łożyskowego9 oraz przeciwciała przeciwko receptorowi oksytocyny10.
Tutaj pokazujemy, że syntetyczny peptyd wiążący siarczan chondroityny łożyska (plCSA-BP) może być używany do celowego dostarczania nanocząsteczek i ich ładunków leków do łożyska11. Nanocząstki kierowane przez plCSA-BP są komplementarne z opisanymi metodami celowania maciczno-łożyskowego, ponieważ są ukierunkowane na trofoblast łożyskowy.
Jako metoda nieinwazyjna, obrazowanie in vivo zostało użyte do monitorowania ekspresji genów specyficznych dla łożyska u myszy12, a zieleń indocyjaninowa (ICG) była szeroko stosowana do śledzenia nanocząstek za pomocą systemów obrazowania fluorescencyjnego13,14,15. W związku z tym wstrzyknęliśmy dożylnie nanocząstki sprzężone z plCSA-BP załadowane ICG (plCSA-INN), aby uwidocznić rozkład plCSA-INP u ciężarnych myszy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Następnie wstrzyknęliśmy dożylnie plCSA-NPs obciążone metotreksatem (MTX) ciężarnym myszom. Ultrasonografia o wysokiej częstotliwości (HFUS), inne nieinwazyjne narzędzie do obrazowania w czasie rzeczywistym16,17 została wykorzystana do monitorowania rozwoju płodu i łożyska u myszy. Na koniec zastosowaliśmy wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) do ilościowego określenia rozkładu MTX w łożyskach i płodach.
W tym protokole szczegółowo opisujemy trzymetodowy system używany do oceny skuteczności dostarczania leków ukierunkowanych na łożysko przez nanonośniki kierowane przez plCSA-BP.

<table><tbody><tr><td>Myszy CD-1</td><td>Beijing Vital River</td><td>201</td><td>Samica (8-12 tygodni)</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>328421</td><td>do wstrzykiwań dożylnych</td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10009218</td><td>do syntezy nanocząstek</td></tr><tr><td>Lecytyna sojowa</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>do syntezy nanocząstek</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>do syntezy nanocząstek</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>do syntezy nanocząstek</td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>do syntezy nanocząstek</td></tr><tr><td>Metotreksat (MTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900324</td><td>do syntezy nanocząstek</td></tr><tr><td>Zieleń indocyjaninowa (ICG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1340009</td><td>do in vivo obrazowanie</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)Hyklon</td><td></td> <td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>Instrument widmowy IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Żel transmisyjny do ultradźwięków</td><td>Guanggong</td><td>ZC4252418</td><td>do obrazowania ultrasonograficznego</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Lunan Pharmaceutical</td><td>I0040</td><td>do utrzymania znieczulenia Krem</td></tr> do <tr><td>depilacji</td><td>Nair</td><td>TMG001</td><td>do usuwania futra</td></tr><tr><td>Przetwornik 40 MHz</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td>do obrazowania ultrasonograficznego</td></tr><tr><td>System obrazowania ultrasonograficznego o wysokiej częstotliwości</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo2100</td><td>do obrazowania ultrasonograficznego</td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>do znieczulenia</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Mindray</td><td>SK-500III</td><td>do perfuzji serca</td></tr><tr><td>0,9% roztwór soli</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td>do perfuzji serca</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki polipropylenowe</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C zamrażarka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88600V</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td>do wytrącania białek</td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>SCIENTZ</td><td>SCIENTZ-48</td><td>do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,45 &mu; m)</td> <td>Milipore</td><td>SLHV033RS01</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10019763</td><td>do rozpuszczania</td></tr><tr><td>MTX Fiolki HPLC</td><td>Wody</td><td>670650620</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sinopharm</td><td>Chemical 20032117</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>JKchemical</td><td>932537</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>C18 kolumna</td><td>Wody</td><td>186003966</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>System HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>do HPLC</td></tr></tbody></table>

kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Obecnie nie istnieją skuteczne metody leczenia powikłań ciążowych związanych z łożyskiem, a opracowanie strategii ukierunkowanego dostarczania leków do łożyska przy jednoczesnym zminimalizowaniu skutków ubocznych u płodu i matki pozostaje wyzwaniem. Celowane nośniki nanocząstek stwarzają nowe możliwości leczenia chorób łożyska. Niedawno wykazaliśmy, że syntetyczny peptyd wiążący siarczan chondroityny A łożyskowy (plCSA-BP) może być używany do kierowania nanocząstkami w celu dostarczania leków do łożyska. W niniejszym protokole szczegółowo opisano system oceny skuteczności dostarczania leku do łożyska przez plCSA-BP, który wykorzystuje trzy odrębne metody stosowane w połączeniu: obrazowanie in vivo, ultradźwięki wysokiej częstotliwości (HFUS) i wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Korzystając z obrazowania in vivo, nanocząstki sterowane pod kierunkiem plCSA-BP zwizualizowano w łożyskach żywych zwierząt, podczas gdy HFUS i HPLC wykazały, że nanocząstki sprzężone z plCSA-BP skutecznie i specyficznie dostarczają metotreksat do łożyska. W związku z tym połączenie tych metod może być wykorzystane jako skuteczne narzędzie do ukierunkowanego dostarczania leków do łożyska i opracowywania nowych strategii leczenia kilku powikłań ciąży.

W niniejszym manuskrypcie nanocząsteczki sprzężone z plCSA-BP, załadowane MTX (plCSA-MNPs) lub ICG (plCSA-INPs), wstrzyknięto dożylnie ciężarnym myszom. Obrazowanie in vivo wykazało silne sygnały ICG w obszarze macicy 30 min po wstrzyknięciu plCSA-INP. Nanocząsteczki INP zlokalizowały się głównie w obszarze wątroby i śledziony (Rycina 1A). Po 48 h od wstrzyknięcia plCSA-INP ciężarne myszy zostały uśpione, co ujawniło sygnały ICG wyłącznie w łożysku, ...

Opisujemy system, który wykorzystuje trzy metody do oceny bezpieczeństwa i skuteczności dostarczania leków ukierunkowanych na łożysko: obrazowanie in vivo do monitorowania akumulacji nanocząstek, ultradźwięki o wysokiej częstotliwości do monitorowania rozwoju łożyska i płodu oraz HPLC do ilościowego określania dostarczania leków do tkanek.

Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny dotyczące skuteczności i bezpieczeństwa leków załadowanych nanocząstkami dostarczonymi matce i płodowi. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona dokładny biochemiczny pomiar ilości leku dostarczanego do łożyska. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii powikłań ciąży za pośrednictwem łożyska, ponieważ ważne jest, aby zapewnić precyzyjne ukierunkowanie dostarczania leku do łożyska.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ ocena rozwoju embrionalnego za pomocą ultrasonografii o wysokiej częstotliwości wymaga cierpliwości i doświadczenia. W celu dożylnego wstrzyknięcia nanocząstek przenieś ciężarną mysz z 14,5 dnia zarodka z rozszerzonymi termicznie żyłami ogonowymi do ogranicznika i wyczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Następnie włóż końcówkę igły strzykawki insulinowej o rozmiarze 28 do rozszerzonej żyły ogonowej i powoli wciskaj tłok przez pięć do 10 sekund z równomiernym naciskiem, aby dostarczyć nanocząstki do żyły ogonowej.30 minut po wstrzyknięciu umieść znieczuloną ciężarną mysz w komorze obrazowania systemu obrazowania fluorescencyjnego in vivo w pozycji leżącej. Wybierz fluorescencję 2D i odpowiednie parametry fotograficzne do obrazowania sygnałów fluorescencji zieleni indocyjaninowej i ustaw ekspozycję na auto oraz długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 710 i 820 nanometrów. Następnie wyobraź sobie zwierzę i przywróć ciężarną mysz do klatki.48 godzin po wstrzyknięciu należy użyć kleszczy Graefe, kleszczyków do tkanek Graefe i nożyczek preparacyjnych, aby pobrać płody i łożyska, a następnie zobrazować pobrane tkanki, jak właśnie pokazano dla całego zwierzęcia. W celu oceny rozwoju embrionalnego za pomocą ultrasonografii o wysokiej częstotliwości, 24 godziny po wstrzyknięciu nanocząstek, przymocuj znieczuloną ciężarną matkę do wstępnie podgrzanej platformy do obrazowania ultrasonograficznego o temperaturze od 37 do 42 stopni Celsjusza w pozycji leżącej na plecach i umieść 40-megahercowy przetwornik w ramieniu mechanicznym. Następnie dostosuj położenie przetwornika, aby uzyskać podłużne obrazy płodu i łożyska z obszarem zainteresowania w strefie ogniskowej.W przypadku obrazowania i analizy w trybie B wybierz tryb B i opuść głowicę nad brzuchem, aż płód i łożysko pojawią się w polu widzenia. Kliknij opcję Skanuj/Zamroź, aby zainicjować i zatrzymać obrazowanie, opcję Cine Store (Magazyn kina), aby zapisać pętlę cine i opcję Frame Store (Magazyn klatek), aby zapisać obrazy klatek. Następnie kliknij przycisk Zmierz, aby przeanalizować długość worka ciążowego, długość zadu korony płodu, średnicę dwuciemieniową, obwód brzucha, średnicę łożyska i grubość łożyska.W przypadku obrazowania i analizy dopplerowskiej fali tętna, przy użyciu tej samej projekcji skanu, najpierw kliknij Kolor, a następnie wybierz Fala tętna i umieść pole objętości próbkowania w środku tętnicy pępowinowej. Kliknij przycisk Skanuj/Zamroź, aby rozpocząć obrazowanie i Cine Store, aby zebrać obrazy tętnicy pępowinowej. Następnie kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć szczytową prędkość tętnicy pępowinowej.W przypadku obrazowania i analizy w trybie kolorowego Dopplera, przy użyciu tej samej projekcji skanu, kliknij opcję Kolor i dostosuj położenie przetwornika, aby uzyskać obrazy serca płodu, jak pokazano. Następnie kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć tętno płodu w zapisanej pętli obrazu filmowego. W przypadku analizy wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) należy najpierw wstrzyknąć ciężarnej myszy w wieku 14,5 dnia zarodka pojedynczą dawkę nanocząstek, jak pokazano.Po 24 godzinach przelej serce ciężarnego zwierzęcia 50 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej o sile fizjologicznej 0,9% przez 10 minut, aby usunąć wszelkie niezwiązane nanocząsteczki, a następnie zbierz płody i łożyska do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W dniu analizy dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu homogenizacyjnego do każdej 200-miligramowej próbki tkanki i homogenizować próbki dwa razy z pełną prędkością przez 30 sekund na dysocjację. Po drugiej homogenizacji odwirować próbki i przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,45 mikrometra do fiolki HPLC.Umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia i włączyć odgazowywacz HPLC, aby usunąć powietrze z systemu. Następnie włącz przepływ, aby zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą przez 30 minut, aby zmniejszyć szum linii podstawowej, i ustaw temperaturę kolumny na 25 stopni Celsjusza. Następnie wstrzyknij próbkę o objętości 20 mikrolitrów z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę w ciągu 30 minut i kliknij przycisk Uruchom metodę, aby rozpocząć analizę.Po zakończeniu serii ręcznie zmień fazę ruchomą na acetonitryl klasy HPLC i uruchom acetonitryl na około 15 minut, aby chronić system. Obrazowanie in vivo ujawnia silne zielone sygnały indocyjaniny w tkance macicy 30 minut po wstrzyknięciu nanocząstek związanych z siarczanem chondroityny w łożysku, podczas gdy niezwiązane nanocząstki lokalizują się głównie w obszarach wątroby i śledziony. 48 godzin po wstrzyknięciu obserwuje się sygnał fluorescencyjny w łożysku zwierząt, którym wstrzyknięto nanocząstki związane siarczanem chondroityny, bez wykrywania sygnałów u płodu.Monitorowanie ultrasonograficzne o wysokiej częstotliwości łożyskowych zwierząt z fluorescencyjnymi cząstkami sprzężonymi z fluorescencją i wstrzykiwanymi nanocząstkami ujawnia znaczny spadek kluczowych punktów orientacyjnych rozwoju płodu i łożyska. Co ciekawe, leczenie nanocząstkami związanymi z metotreksatem również nieznacznie upośledza rozwój płodu i łożyska, co wskazuje, że nanocząstki mogą poprawić dostarczanie metotreksatu do łożyska poprzez zwiększoną przepuszczalność i efekt retencji. Pomiar stężeń metotreksatu za pomocą HPLC wskazuje na czas zatrzymywania wynoszący siedem minut w łożyskach myszy z wstrzyknięciem nanocząstek związanych z metotreksatem.24 godziny po wstrzyknięciu poziomy metotreksatu w łożysku w grupie, w której wstrzyknięto nanocząstki związane z metotreksatem, są znacznie niższe niż mierzone w grupie łożyskowego siarczanu chondroityny i nanocząstek związanych z metotreksatem, przy czym nie wykryto metotreksatu u płodów tych ostatnich. Metotreksat można nadal wykryć w łożysku 48 godzin po wstrzyknięciu siarczanu chondroityny łożyska i nanocząstek związanych z metotreksatem, co pokazuje, że łożyskowy siarczan chondroityny i nanocząstki związane z metotreksatem nie mogą przenikać przez łożysko, minimalizując w ten sposób potencjalne niekorzystne skutki dla płodu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że łożysko zaczyna się formować około 9 1/2 dnia embrionalnego, dlatego eksperyment z obrazowaniem in vivo lepiej przeprowadzić w 10 dniu embrionalnym lub później.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne i analiza, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji nanocząstek w łożysku. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie medycyny reprodukcyjnej do zbadania możliwości leczenia ukierunkowanego na łożysko w przypadku powikłań ciąży.

comprehensive-evaluation-effectiveness-safety-placenta-targeted-drug

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zespół transfuzji bliźniak-bliźniak oraz sekwencja anemii i policytemii u bliźniąt to dwa potencjalnie dewastujące problemy w medycynie perinatalnej. Obie te zaburzenia występują wyłącznie u bliźniąt monochorialnych i wynikają z niezrównoważonego przepływu krwi przez naczyniowe anastomozy łożyskowe. Przedstawiamy prosty protokół służący do dokładnej oceny obecności anastomoz naczyniowych za pomocą wstrzykiwania barwnika do naczyń łożyska po urodzeniu.

Dokładna i prosta ocena anastomoz naczyniowych w łożysku jednojajuszowym z wykorzystaniem barwnika

Model podwójnej recyrkulacji ludzkiego łożyska ex vivo może być wykorzystany do zbadania transferu ksenobiotyków i nanocząsteczek przez ludzkie łożysko. W tym protokole wideo opisujemy sprzęt i techniki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia perfuzji łożyska.

Oznaczanie szybkości transportu ksenobiotyków i nanomateriałów przez łożysko przy użyciu modelu perfuzji łożyska człowieka ex vivo

Przedstawiamy szczegółową metodę badania fizjologii łożyska u człowieka in vivo w terminie. Metoda łączy pobieranie próbek krwi z naczyń przychodzących i odpływowych po stronie matczynej i płodowej łożyska z pomiarami ultrasonograficznymi objętości przepływu krwi i pobieraniem próbek tkanki łożyska.

Podejście do pobierania próbek z 4 naczyń w integracyjnych badaniach fizjologii łożyska człowieka in vivo

To badanie przedstawia protokół odwracalnego oczyszczania tkanek, barwienia immunologicznego, renderowania 3D i analizy sieci naczyniowych w próbkach ludzkich kosmków łożyskowych rzędu 1 - 2 mm3.

Trójwymiarowe renderowanie i analiza znakowanych immunologicznie, oczyszczonych ludzkich sieci naczyniowych kosmków łożyskowych

Tutaj prezentujemy protokół syntezy łożyskowych nanocząstek lipidowo-polimerowych skojarzonych z peptydem wiążącym siarczan chondroityny A (plCSA-BP) za pomocą jednoetapowej techniki sonikacji i biokoniugatu. Cząstki te stanowią nowatorskie narzędzie do ukierunkowanego dostarczania leków do większości ludzkich nowotworów i trofoblastów łożyska w leczeniu nowotworów i zaburzeń łożyska.

Synteza i charakterystyka nanocząstek lipidowo-polimerowych siarczanu chondroityny A (plCSA) ukierunkowanych na łożysko

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania i oceny cytotoksycznej funkcji komórek NK z łożysk za pomocą testu kolorymetrycznego na płytce. Szczurzy model niedokrwienia łożyska o obniżonym ciśnieniu perfuzji macicy został wybrany, aby zademonstrować izolację za pośrednictwem przeciwciał i ocenę cytotoksycznej funkcji komórek NK .

Test cytotoksyczności na płytce do oceny funkcji cytolitycznej komórek NK u szczurów łożyskowych

Tutaj przedstawiono protokół perfuzji naczyniowej ex vivo matczyno-płodowej, który umożliwia podanie artykułu testowego do układu naczyniowego matki i ocenę transferu przez łożysko cząsteczek ksenobiotycznych lub środków farmakologicznych oprócz zmian w fizjologii łożyska.

Perfuzja ex vivo łożyska gryzonia

Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.

Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR

Przedstawiono protokół do oceny, czy małe EV (sEVs) wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelując jeden aspekt stanu przedrzucawkowego) naruszają barierę krew-mózg u dorosłych samic myszy niebędących w ciąży.

Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Poznaj metodę oceny skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu obrazowania in vivo, ultrasonografii wysokiej częstotliwości i HPLC. Technika ta umożliwia precyzyjne monitorowanie akumulacji nanocząstek oraz rozwój płodu u myszy.

Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod (Wideo) | JoVE Journal

Kompleksowa ocena skuteczności i bezpieczeństwa podawania leków ukierunkowanych na łożysko przy użyciu trzech uzupełniających się metod

Przeglądaj więcej filmów