Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji ekspresji genów, takie jak to, w jaki sposób białka wiążące RNA gromadzą się na poszczególnych RNA in vivo, a tym samym narzucają potranskrypcyjną regulację genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona klonowania ani manipulacji genetycznych. Można go dostosować do dowolnego organizmu modelowego lub podtypu.

Aby zaprojektować oligonukleotydy, przeanalizuj drugorzędową strukturę mRNA lub jego fragmentu za pomocą narzędzi online. Najpierw wprowadź sekwencję nukleotydów w pustym polu, a następnie w polu Opcje podstawowe wybierz minimalną energię swobodną i unikaj izolowanych par zasad. W polu Opcje wyjściowe wybierz interaktywny wykres struktury drugorzędowej RNA, a na koniec kliknij przycisk Kontynuuj.

Pojawi się nowe okno, które wyświetla drugorzędową strukturę interesującego nas mRNA. Wybierz co najmniej trzy różne sekwencje o długości od 21 do 24 nukleotydów w interesującym mRNA, preferencyjnie w regionach pozbawionych rozległych struktur drugorzędowych i zlokalizowanych w regionach nieulegających translacji 3-prime. Wybierz regiony o stosunku guanidyny do cytozyny bliskim 50% i braku powtórzeń tandemu nukleotydów, aby uniknąć potencjalnego tworzenia się spinek do włosów lub samowyżarzania.

Ręcznie zaprojektuj oligonukleotydy RNA modyfikowane 2-prime-metoksy z ugrupowaniem biotyny w 3-prime, które są w pełni komplementarne z wybranymi regionami w pożądanym docelowym mRNA. Użyj odpowiedniego narzędzia online, aby dostosować temperaturę topnienia hybryd RNA do zakresu od 60 do 65 stopni i mieć dobrą złożoność sekwencji językowej. Użyj narzędzia Basic Local Alignment Search Tool, aby wyszukać potencjalną hybrydyzację krzyżową ASO z innymi mRNA w transkryptomie.

Wybierz Nucleotide BLAST, wstaw sekwencję w puste pole i wybierz interesujący Cię organizm. Pozostaw pozostałe parametry jako domyślne i kliknij BLAST. Transfekcję komórek HEK293 przy 70% konfluencji w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej, mieszając dwa mikrogramy genu reporterowego z 20 mikrolitrami odczynnika do transfekcji i dodając do komórek.

Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin przed pobraniem. W dniu zbioru usunąć pożywkę pipetą serologiczną i szybko dwukrotnie przemyć komórki 10 mililitrami PBS podgrzanego w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj sześć mililitrów PBS do naczynia i umieść na lodzie.

Następnie wystaw komórki na działanie światła UV o prędkości 100 milidżuli na centymetr kwadratowy w sieciowniku UV. Po ekspozycji na promieniowanie UV zeskrob komórki i PBS i przenieś do 15-mililitrowej probówki. Następnie wiruj komórki w temperaturze 250 razy g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Po usunięciu supernatantu za pomocą pipety, ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach wstępnie schłodzonego buforu do lizy, pipetując w górę i w dół pięć lub sześć razy, trzymając probówkę na lodzie. Przenieś lizat za pomocą pipety do pięciomililitrowej probówki umieszczonej na lodzie i poddaj sonicjacji przez trzy rundy składające się z 20-sekundowych serii o amplitudzie 10 mikronów z 30-sekundowymi okresami chłodzenia na lodzie. Po przeniesieniu lizatu do dwumililitrowych probówek odwirować przy 15 000 razy g przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.

Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki. Aby rozpocząć izolację RNA, zrównoważ jeden miligram kulek magnetycznych sprzężonych z oligo(dT) w 500 mikrolitrach buforu do lizy. Wyjmij rurkę z rotatora, umieść ją na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do lizy.

Połącz cztery miligramy ekstraktu białkowego HEK293 z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z oligo(dT)25. Energicznie wymieszać próbki, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 10 sekund, a następnie usuń supernatant.

Przechowywać supernatant na lodzie do kolejnych rund rekonwalescencji. Dodaj 500 mikrolitrów buforu myjącego A do kulek i wiruj przez pięć sekund. Zbierz kulki za pomocą magnesu, a następnie umyj je dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu do płukania, B.To wymyć RNA, dodać 30 mikrolitrów 10-milimolowego Tris-HCl i inkubować probówkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty z ciągłym wytrząsaniem przy 1 000 obr./min.

Przenieś probówkę bezpośrednio na stojak magnetyczny i zbierz eluat tak szybko, jak to możliwe po około 10 sekundach, aby zapobiec potencjalnemu ponownemu wiązaniu mRNA z kulkami w niższych temperaturach. Eluaty z powtarzających się rund są następnie łączone i mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wychwycić określone mRNA, dodaj 30 mikrolitrów kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną do jednego mililitra buforu wiążącego i płuczącego zawierającego 0,1 miligrama na mililitr RNA przenoszącego E. coli.

Równoważyć na rotatorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie umyj koraliki trzykrotnie 750 mikrolitrami buforu wiążącego i myjącego. Zagłuszić probówkę, następnie usunąć bufor czarno-biały, a następnie ponownie zawiesić w 30 mikrolitrach buforu i trzymać na lodzie do momentu użycia.

Rozcieńczyć około 35 mikrogramów całkowitego białka z uprzednio poli(A) izolacji w 100 mikrolitrach buforu wiążącego i przemywającego, następnie dodać 200 pikomoli odpowiedniego oligonukleotydu antysensownego i inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby ułatwić wyżarzanie. Wyjmij cały blok grzewczy z urządzenia i umieść go w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby powoli ostygł. Następnie dodać 30 mikrolitrów zrównoważonych kulek magnetycznych sprzężonych streptawidyną do próbki, a następnie inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza ze stałym wstrząsaniem przy 950 obr./min w mikserze.

Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, usuń supernatant i umyj kulki trzykrotnie 750 mikrolitrami wstępnie podgrzanego wiązania i buforu do płukania w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Dodaj 20 mikrolitrów 10-milimolowego Tris-HCl i umieść w temperaturze 90 stopni Celsjusza ze stałym wstrząsaniem przy 950 obr./min przez 10 minut, aby wymyć RNA. Po 10 minutach umieść probówkę w stojaku magnetycznym i natychmiast zbierz eluat.

Jest to żel agarozowy stosowany do wykrywania mRNA za pomocą RT-PCR przy użyciu specyficznych starterów po wychwyceniu za pomocą oligo(dT) i oligonukleotydu antysensownego do mRNA p27 z ekstraktu komórkowego HEK293. Pokazano również kontrolę bez oligonukleotydów antysensownych. Pasy wejściowe pokazują całkowity RNA z usieciowanych komórek.

Ponadto pokazane są również wyniki konkurencji z poli(A). Pokazano tutaj analizę immunoblot białek związanych z mRNA z przeciwciałami wykrywającymi ludzki antygen R, nieznane białko wiążące RNA i beta-aktynę, która jest ujemnym białkiem kontrolnym. Blot pokazuje, że ludzki antygen R został pomyślnie wykryty w izolatach poli(A)RNA po wychwyceniu mRNA p27 z oligonukleotydami antysensownymi.

Ludzki antygen R nie został wykryty w izolatach kontrolnych bez oligonukleotydu antysensownego. Pasy wejściowe pokazują białka w ekstrakcie z usieciowanych komórek, a także wyniki konkurencji z poli(A). Po tej procedurze można przeprowadzić inną metodę, taką jak spektrometria mas, w celu systematycznej analizy całej próbki białka oddziałującego z określonym RNA in vivo.

Co ważne, TRIP jest wszechstronnym podejściem, które można dostosować do wszystkich typów poliadenylowanych RNA w różnych organizmach, aby zrozumieć dynamiczny układ interakcji białek RNA. W związku z tym może być stosowany do badania RNA kontrolowanych rozwojowo lub związanych z chorobą i może ostatecznie prowadzić do nowych celów interwencji terapeutycznej.