Name: Pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Poznaj metodę pomiaru stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej. Technika ta umożliwia dokładne badanie regulacji kanałów jonowych przez przepływ płynu w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Centrum Badawczego Pioneer (2011-0027921), przez Programy Badań Nauk Podstawowych (2015R1C1A1A02036887 i NRF-2016R1A2B4014795) przez Narodową Fundację Badawczą Korei finansowane przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości oraz przez grant Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Medycznych przez Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Medycznego (KHIDI), finansowane przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (HI15C1540).

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Konkuk.
1. Mostki soli agarozowej między roztworem kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl
UWAGA: Mostki solne Agarose 3M KCl są produkowane zgodnie z wcześniejszym opisem12 z niewielkimi zmianami.
<ol>
	<li>Tworzenie mostów
	<ol>
		<li>Zegnij rurki kapilarne ze szkła ogniowego, aby odpowiednio uformować kształt litery U. Wewnętrzna średnica kapilar powinna być wystarczająco duża, aby zmniejszyć rezystancję szeregową podczas rejestrowania dużych prądów jonowych. Zwykle dopuszczalne są rurki o średnicy wewnętrznej 2-5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu agarozy 3 M KCl
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml 3 M roztworu KCl (dopuszczalne jest również 1 M lub 2 M).</li>
		<li>Waga 3 g agarozy.</li>
		<li>Rozpuścić agarozę w 100 ml KCl (tj. 3% agarozy) na gorącej płycie w temperaturze od 90 do 100 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obciążenie mostów agarozą 3 M KCl
	<ol>
		<li>Aby ułatwić załadunek, zanurz szklane mostki w kształcie litery U w roztworze agarozy-KCl. 
		UWAGA: Łatwo jest wykopać szklane mostki, jeśli roztwór agarozy-KCl znajduje się w płytkim i szerokim pojemniku.</li>
		<li>Przechowuj je przez noc w temperaturze pokojowej (RT), aby agaroza stwardniała i stwardniała.</li>
		<li>Ostrożnie wykop szklane mostki obciążone agarozą KCl z zestawu/utwardzonej soli agarozowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie mostów
	<ol>
		<li>Przygotować wystarczającą ilość (tj. 500 ml) roztworu 3 M KCl w butelce z szeroką szyjką.</li>
		<li>Przygotowane mostki agarozowo-solne przechowuj w butelce w lodówce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zastosowanie siły ścinającej przepływu płynu do komórek w komorze zaciskania łat
UWAGA: Schemat eksperymentalny układu zacisku krosowego jest pokazany w Rysunek 1.
<ol>
	<li>Umieścić pojemnik załadowany roztworem do kąpieli (objętość i wysokość powinny być już zmierzone) nad komorą zacisku krosowego.</li>
	<li>Napełnij komorę zacisku krosowego roztworem do kąpieli, odsysając rurkę.</li>
	<li>Aby zatrzymać przepływ płynu, przypnij rurkę z boku pojemnika, aby zablokować przepływ płynu, a następnie przypnij rurkę po stronie ssącej, aby jednocześnie zatrzymać ssanie. Jest to "stacjonarny" warunek sterowania.</li>
	<li>Aby zastosować siłę ścinającą przepływ płynu, otwórz jednocześnie obie rurki po stronie zbiornika i ssawki.</li>
	<li>Przed lub po przyłożeniu siły ścinającej przepływu płynu do ogniwa zmierz natężenie przepływu w ml/min.</li>
	<li>Oblicz natężenie przepływu, mierząc spadek objętości płynu w danym czasie.</li>
	<li>Na podstawie zmierzonego natężenia przepływu i geometrii (struktury) komory kąpielowej należy oszacować siłę ścinającą wywieraną na komórkę przez przepływ płynu (patrz punkt dyskusji).</li>
	<li>Alternatywnie, aby kontrolować natężenie przepływu (dla kroków 2.3-2.6), użyj pompy perfuzyjnej. W takim przypadku należy uważać, aby zapewnić stały, a nie pulsacyjny przepływ.</li>
</ol>
3. Pomiar zmian potencjału złącza ciekło-metalowego przez przepływ płynu między roztworem kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A)
<ol>
	<li>Stosować elektrodę lub granulat Ag/AgCl, który jest dostępny w gotowych produktach, bez mostka solnego agarozy.</li>
	<li>Przygotować normalną fizjologiczną sól fizjologiczną do komory kąpielowej (np. 143 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,33 mM NaH2PO4, 5 mM HEPES, 0,5 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11 mM D-glukozy; pH dostosowane do 7,4 z NaOH).</li>
	<li>Umieścić pipetę krosową zawierającą 3 M roztwór KCl w komorze, aby zminimalizować przesunięcie potencjału połączenia między pipetą a roztworami do kąpieli.</li>
	<li>Ustawić napięcie-clamp amplifier na prąd clamp tryb ("I = 0" lub "CC").</li>
	<li>Po zniwelowaniu początkowego potencjału przesunięcia zmierz zmiany napięcia wywołane różnymi natężeniami przepływu.</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy zmiany napięcia są potencjałami złącza ciecz/metal, należy ponownie zbadać wpływ przepływu płynu na potencjał złącza za pomocą mostka agarozowo-solnego między roztworem kąpieli a elektrodą Ag/AgCl.</li>
</ol>
4. Eksperymentalne oszacowanie rzeczywistego stężenia Cl- w niezmieszanej warstwie przylegającej do elektrody Ag/AgCl w warunkach statycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B)
<ol>
	<li>Na podstawie wyników kroku 3 narysuj zależności potencjał-natężenie przepływu złącza i oszacuj maksymalną (nasyconą) wartość przesunięcia potencjału złącza przez natężenie przepływu płynu nadziemnego.</li>
	<li>Przygotować roztwory o różnych stężeniach Cl (tj. 50, 99, 147, 195 i 288 mM NaCl).</li>
	<li>Zmieniając stężenie Cl- w płynie do kąpieli, narysuj zależność potencjał-[Cl-]. Należy pamiętać, że szybkość płynu powinna być stała i wystarczająco wysoka (> 30 ml/min), aby zapobiec spadkowi stężenia Cl- do stężenia sąsiedniej elektrody referencyjnej Ag/AgCl.</li>
	<li>Na podstawie dwóch krzywych zależności oszacuj zmiany stężenia Cl- na podstawie zmierzonego przesunięcia potencjału złącza.</li>
</ol>

<ol><li>Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channels+in+Endothelial+Responses+to+Fluid+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress.</a> Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).</li>
<li>Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-induced+constriction+and+dilation+of+cerebral+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries.</a> Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).</li>
<li>Langille, B. L., O’Donnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+arterial+diameter+produced+by+chronic+decreases+in+blood+flow+are+endothelium-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent.</a> Science. 231, 405-407 (1986).</li>
<li>Pohl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+endothelium+in+the+vasodilator+response+to+increased+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo.</a> Hypertension. 8, 37-44 (1986).</li>
<li>Ranade, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+mechanically+activated+ion+channel%2C+is+required+for+vascular+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).</li>
<li>Hoger, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Mendoza, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV4-mediated+endothelial+Ca2%2B+influx+and+vasodilation+in+response+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).</li>
<li>Brahler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficit+of+SK3+and+IK1+channels+disrupts+the+endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+vasodilator+pathway+and+causes+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension.</a> Circulation. 119, 2323-2332 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+pressure+modulates+L-type+Ca2%2B+channel+via+enhancement+of+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%2B+current+by+convectively+restoring+%5BK%2B%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface.</a> Scientific Report. 6, 39585(2016).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluid+flow+on+voltage-dependent+calcium+channels+in+rat+vascular+myocytes%3A+fluid+flow+as+a+shear+stress+and+a+source+of+artifacts+during+patch-clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).</li>
<li>Barry, P. H., Hope, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroosmosis+in+membranes%3A+effects+of+unstirred+layers+and+transport+numbers.+II.+Experimental%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental.</a> Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+unstirred-layer+transport+number+equations+from+the+Nernst-Planck+flux+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations.</a> Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).</li>
<li>Barry, P. H., Diamond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unstirred+layers+on+membrane+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Effects of unstirred layers on membrane phenomena.</a> Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+remodeling+is+a+critical+mechanotransduction+mechanism+of+the+stretch-induced+L-type+Ca2%2B+channel+activation+in+vascular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).</li>
<li>A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf">https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf</a> (2018).</li>
<li>Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+the+pathogenesis+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis.</a> Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Resnick, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+and+the+vascular+endothelium%3A+for+better+and+for+worse%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse.</a> Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu zademonstrowaliśmy metodę pomiaru rzeczywistego stężenia Cl- w niezmieszanej warstwie przylegającej do elektrody referencyjnej Ag/AgCl poprzez określenie potencjału złącza ciekłego metalu za pomocą otwartej pipety z zaciskiem krosowym wypełnionej wysokim stężeniem KCl. Zmiana stężenia Cl- w warstwie granicznej może spowodować przesunięcie potencjału złącza podczas przełączania z warunków statycznych na warunki przepływu płynu. Proste użycie agarozowego mostka KCl między elektrodą odnie...

Przepływ płynów jest ważną wskazówką środowiskową, która kontroluje wiele procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane przepływem płynów oraz zależna od siły ścinającej płynu przebudowa i rozwój naczyń krwionośnych1,2,3,4,5. Chociaż mechanizmy molekularne biologicznych reakcji na siłę ścinającą przepływ płynu nie są w pełni zrozumiałe, uważa się, że regulacja bramkowania kanału jonowego za pośrednictwem przepływu płynu może krytycznie przyczyniać się do reakcji wywołanych przepływem płynu5,6,7,8. Na przykład, sugeruje się, że aktywacja śródbłonkowego prostownika wewnętrznego Kir2.1 i kanałów K+ aktywowanych przez Ca2+ (KCa2.3, KCNN3) po napływie Ca2+ przez przepływ płynu przyczynia się do rozszerzenia naczyń krwionośnych wywołanego przepływem płynu6,7,8. W związku z tym wiele kanałów jonowych, zwłaszcza kanałów aktywowanych mechanicznie lub hamowanych, zostało przebadanych pod kątem wrażliwości na przepływ płynu/siłę ścinającą za pomocą techniki patch-clamp6,9,10,11. Jednak w zależności od protokołu eksperymentalnego przeprowadzonego podczas rejestracji patch-clamp, wyniki i interpretacja danych dotyczących regulacji przepływu płynów w kanałach jonowych mogą być błędne10,11.
Jednym ze źródeł artefaktów wywołanych przepływem płynu w zapisie patch-clamp jest potencjał połączenia między płynem do kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl11. Powszechnie uważa się, że potencjał połączenia ciecz/metal między płynem do kąpieli a elektrodą Ag/AgCl jest stały, ponieważ stężenie Cl- w płynie do kąpieli jest utrzymywane na stałym poziomie, biorąc pod uwagę, że reakcja chemiczna między roztworem do kąpieli a elektrodą Ag/AgCl wynosi:
Ag + Cl- ↔ AgCl + elektron (e-) (Równanie 1)
Jednak w przypadku, gdy ogólna reakcja elektrochemiczna między roztworem do kąpieli a elektrodą odniesienia Ag/AgCl (Równanie 1) przebiega od lewej do prawej, stężenie Cl- płynu do kąpieli przylegającego do elektrody referencyjnej Ag/AgCl (niezmieszana warstwa graniczna12,13,14,15) może być znacznie niższa niż w roztworze do kąpieli, chyba że zapewniony jest wystarczający transport konwekcyjny. Używanie starej lub nieidealnej elektrody Ag/AgCl z niewystarczającym chlorowaniem Ag może zwiększyć takie ryzyko. Ten artefakt związany z przepływem płynu na elektrodzie referencyjnej można w rzeczywistości wykluczyć, po prostu umieszczając konwencjonalny mostek agarozowo-solny między płynem do kąpieli a elektrodą odniesienia, ponieważ artefakt opiera się na zmianach rzeczywistego stężenia Cl- w sąsiedztwie elektrody Ag/AgCl11. Protokół przedstawiony w tym badaniu opisuje, w jaki sposób zapobiegać zmianom potencjału złącza związanym z przepływem i mierzyć rzeczywiste stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej.
Po umieszczeniu agarozowego mostka KCl między płynem do kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl, należy wziąć pod uwagę jeszcze jeden kluczowy czynnik: tak jak referencyjna elektroda Ag/AgCl działa jak elektroda Cl-, kanały jonowe również mogą funkcjonować jak elektroda selektywna jonowo. Sytuacja niewymieszanej warstwy granicznej między płynem kąpielowym a elektrodą odniesienia Ag/AgCl powstaje podczas przepływu jonów między roztworami zewnątrzkomórkowymi i wewnątrzkomórkowymi przez błonowe kanały jonowe. Oznacza to, że należy zachować ostrożność przy interpretacji regulacji kanałów jonowych przez przepływ płynu. Jak omówiono w naszym poprzednim badaniu11, ruch jonów przez roztwór, w którym występuje gradient elektrochemiczny, może zachodzić poprzez trzy odrębne mechanizmy: dyfuzję, migrację i konwekcję, gdzie dyfuzja to ruch wywołany gradientem stężenia, migracja to ruch napędzany gradientem elektrycznym, a konwekcja to ruch przez przepływ płynu. Spośród tych trzech mechanizmów transportu, tryb konwekcji najbardziej przyczynia się do ruchu jonów11 (> 1000 razy większy niż dyfuzja lub migracja przy zwykłych ustawieniach patch-clamp). Stanowi to teoretyczną podstawę do wyjaśnienia, dlaczego potencjał połączenia między płynem do kąpieli a elektrodą referencyjną Ag/AgCl może występować w różnych warunkach statycznych i przepływu płynu11.
Zgodnie z hipotezą zaproponowaną powyżej, pewne efekty ułatwiające przepływ płynu na prąd kanału jonowego można wywnioskować z konwekcyjnego przywrócenia rzeczywistych stężeń jonów przylegających do wlotu kanału na powierzchni membrany (niezmieszana warstwa graniczna)10. W tym przypadku wpływ przepływu płynu na prądy kanałów jonowych wynikał po prostu ze zdarzeń elektrochemicznych, a nie z regulacji bramkowania kanałów jonowych. Podobny pomysł został wcześniej zasugerowany przez Barry'ego i współpracowników12,13,14,15 w oparciu o rygorystyczne rozważania teoretyczne i dowody eksperymentalne, znane również jako efekt warstwy niezmieszanej lub liczby transportowej. Jeśli niektóre kanały jonowe mają wystarczającą przewodność jednokanałową i wystarczająco długi czas otwarcia, aby zapewnić wystarczające szybkości transportu przez kanały (szybsze tempo transportu w membranie niż na niezmieszanej powierzchni membrany), może wystąpić efekt warstwy granicznej. W ten sposób transport zależny od konwekcji może przyczynić się do ewentualnego wywołania przepływu płynu ułatwień prądu jonowego10,12,13,14,15.
W tym badaniu podkreślamy znaczenie użycia mostka solnego z agaru lub agarozy podczas badania regulacji prądów jonowych wywołanej przepływem płynu. Udostępniamy również metodę pomiaru rzeczywistych stężeń jonów w niezmieszanej warstwie granicznej przylegającej do elektrody referencyjnej Ag/AgCl i membranowych kanałów jonowych. Co więcej, teoretyczna interpretacja modulacji prądów kanałów jonowych indukowanej przepływem płynu (tj. hipoteza konwekcji lub efekt liczby transportu warstwy niezmieszanej) może dostarczyć cennych informacji dla projektowania i interpretacji badań nad regulacją siły ścinającej kanałów jonowych. Zgodnie z efektem liczby transportu warstwy granicznej bez mieszania, przewidujemy, że prądy kanałów jonowych przez wszystkie typy kanałów jonowych błony mogą być ułatwione przez przepływ płynu, niezależnie od ich biologicznej wrażliwości na siłę ścinającą przepływ płynu, ale tylko wtedy, gdy kanały jonowe mają wystarczającą przewodność jednokanałową i długi czas otwarcia. Wyższe gęstości prądu kanału jonowego mogą zwiększać efekt niezmieszanej warstwy granicznej na powierzchni błony komórkowej.

<table><tbody><tr><td>RC-11 otwarta komora kąpielowa</td><td>Warner instruments, USA</td><td>W4 64-0307</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl granulat elektrody</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>EP1</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-aldrich, Stany Zjednoczone</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz cęgowy</td><td>napięcia HEKA, Niemcy</td><td>EPC8</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz cęgowy</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa cieczy</td><td>KNF Flodos, Szwajcaria</td><td>FEM08</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Przepływ płynów jest ważnym bodźcem środowiskowym, który kontroluje wiele procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak rozszerzenie naczyń krwionośnych wywołane przepływem płynów. Chociaż mechanizmy molekularne biologicznych reakcji na przepływ płynu/siłę ścinającą nie są w pełni poznane, regulacja bramkowania kanałów jonowych za pośrednictwem przepływu płynów może się do tego krytycznie przyczynić. W związku z tym badano wrażliwość kanałów jonowych na przepływ/siłę ścinającą płynu przy użyciu techniki patch-clamp. Jednak w zależności od protokołu eksperymentalnego wyniki i interpretacja danych mogą być błędne. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne i teoretyczne dowody na błędy związane z przepływem płynów oraz przedstawiamy metody szacowania, zapobiegania i korygowania tych błędów. Zmiany potencjału połączeniowego między elektrodą referencyjną Ag/AgCl a płynem do kąpieli mierzono za pomocą otwartej pipety wypełnionej 3 M KCl. Przepływ płynu mógł następnie przesunąć potencjał złącza ciecz/metal do około 7 mV. I odwrotnie, mierząc przesunięcie napięcia wywołane przepływem płynu, oszacowaliśmy stężenie jonów w niezmieszanej warstwie granicznej. W warunkach statycznych rzeczywiste stężenia jonów przylegające do elektrody referencyjnej Ag/AgCl lub wlotu kanału jonowego na powierzchni błony komórkowej mogą osiągnąć nawet około 30% stężenia w warunkach przepływu. Umieszczenie mostka agarozowego 3 M KCl między płynem kąpielowym a elektrodą odniesienia mogło zapobiec temu problemowi przesunięcia potencjału złączowego. Jednak efekt niezmieszanej warstwy przylegającej do powierzchni błony komórkowej nie mógł być utrwalony w ten sposób. W tym miejscu przedstawiamy metodę pomiaru rzeczywistych stężeń jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej, podkreślając znaczenie stosowania mostka soli agarozowej podczas badania regulacji prądów jonowych wywołanej przepływem płynu. Dlatego to nowatorskie podejście, które uwzględnia rzeczywiste stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej, może dostarczyć użytecznych informacji na temat projektu eksperymentalnego i interpretacji danych związanych z regulacją naprężeń ścinających płynu w kanałach jonowych.

Ca2+ kanały typu L zależne od napięcia w konfiguracji whole-cell2+ kanał (VDCC)LPrądy rejestrowano w enzymatycznie rozproszonych miocytach tętnic krezkowych szczura, zgodnie z wcześniejszym opisem11Miocyty tętnicze poddano dializie przy użyciu roztworu do pipety bogatego w Cs w konfiguracji z nystatyną (perforowanej), stosując roztwór kąpielowy pozbawiony kationów dwuwartościowych, aby ułatwić przepływ prądu przez VDCC.L<sup class="...

Mechanowrażliwe kanały jonowe są często badane pod kątem wrażliwości na przepływ płynu/siłę ścinającą z zapisem patch-clamp. Jednakże, w zależności od protokołu eksperymentalnego, wynik dotyczący regulacji przepływu płynów w kanałach jonowych może być błędny. W tym miejscu przedstawiamy metody zapobiegania i korygowania takich błędów wraz z podstawami teoretycznymi.

Pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Niniejszy artykuł może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w sferze elektrofizjologicznej, takie jak przepływ płynów w samych regulacjach kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona oszacować rzeczywiste stężenie jonów w niezmieszanej warstwie granicznej powierzchni membrany w celu interpretacji danych związanych z regulacją przepływu płynu w kanałach jonowych. Aby rozpocząć tę procedurę, zegnij rurkę kapilarną z wypalanego szkła, aby uformować kształt litery U.Wewnętrzna średnica kapilary powinna być wystarczająco duża, aby zmniejszyć rezystancję szeregową podczas rejestrowania dużych prądów jonowych. Następnie rozpuść trzy gramy agarozy w 100 mililitrach trójmolowego chlorku potasu i umieść go na gorącej płycie w temperaturze od 90 do 100 stopni Celsjusza. Następnie obciążyć most agarozą chlorku potasu, zanurzając szklany mostek w roztworze.Przechowuj go przez noc w temperaturze pokojowej, aby agaroza stwardniała i stwardniała. Następnego dnia ostrożnie wykop szklany most obciążony chlorkiem potasu agarozy ze stwardniałej soli agarozy. Przechowuj most w butelce z trójtrzonowym chlorkiem potasu z szeroką szyjką w lodówce.W tej procedurze umieść pojemnik wypełniony roztworem do kąpieli nad komorą zacisku krosowego. Następnie napełnij komorę zacisku krosowego roztworem do kąpieli, odsysając rurkę. Aby zatrzymać przepływ płynu, zapnij rurkę z boku pojemnika, aby zablokować przepływ płynu.Następnie przypnij rurkę po stronie ssącej, aby jednocześnie zatrzymać ssanie. Jest to stan sterowania stacjonarnego. Aby zastosować siłę ścinającą przepływ płynu, otwórz jednocześnie obie rurki po stronie zbiornika i ssawki.Przed lub po przyłożeniu siły ścinającej przepływu płynu do ogniwa oblicz natężenie przepływu w mililitrach na minutę, mierząc spadek objętości płynu w danym czasie. Aby zmierzyć zmiany potencjału połączenia ciekłego metalu, należy przygotować normalny roztwór soli fizjologicznej do komory kąpielowej i porównać je pod kątem braku i obecności mostka agarowo-chlorkowo-potasowego. Następnie umieść w komorze pipetę z plastrem zawierającą trójmolowy roztwór chlorku potasu, aby zminimalizować przesunięcie potencjału połączenia między pipetą a roztworami do kąpieli.Następnie ustaw wzmacniacz cęgowy napięcia na bieżący tryb cęgów. Po zniwelowaniu początkowego potencjału przesunięcia zmierz zmiany napięcia wywołane zmianą natężeń przepływu. Aby sprawdzić, czy zmiany napięcia są potencjałami złączowymi ciekłego metalu, należy ponownie zbadać wpływ przepływu płynu na potencjał złącza, używając mostka soli agarozowej między roztworem kąpieli a elektrodą odniesienia.Na podstawie wyników zmian potencjału złącza ciekłego metalu należy narysować zależności natężenia przepływu potencjału funkcji i oszacować wartość nasycenia przesunięcia potencjału złącza przez natężenie przepływu płynu nadziemnego. Następnie zmień stężenie chlorków w płynie do kąpieli i narysuj zależność stężenia chlorku potencjału złącza. Należy zauważyć, że szybkość przepływu płynu powinna być stała i wystarczająco wysoka, aby zapobiec spadkowi stężenia chlorków w stosunku do sąsiedniej elektrody referencyjnej srebro-chlorek srebra.Na podstawie dwóch krzywych zależności oszacuj zmiany stężenia chlorków na podstawie zmierzonego przesunięcia potencjału złącza. Prądy VDCC-L zarejestrowano w enzymatycznie rozproszonych miocytach tętniczych krezki szczura, z zapisem perforowanym nystatyną patch-clamp. Dzięki mostkowi agarozowo-chlorkowo-potasowemu można zminimalizować potencjał połączenia między elektrodą odniesienia a roztworami do kąpieli, a przepływ płynu niezależnie zwiększył napięcie prądu VDCC-L.Jednakże, gdy elektroda referencyjna srebro-chlorek srebra była bezpośrednio podłączona do płynu do kąpieli, bez mostka agarozowo-chlorkowo-potasowego, zależność IV w obecności przepływu płynu przesunęła się w prawo, w porównaniu z prądami VDCC-L w stanie statycznym. Wywołany przepływem płynu wzrost prądów Kerra 2.1, który zarejestrowano w szczurzych komórkach białaczki zasadochłonnej z mostkiem agarozowym, można wytłumaczyć efektem warstwy niezmieszanej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nadmierną elektrofizjologią.Służy więc do regulacji przepływu płynu w prądach kanałów jonowych. Jeśli chodzi o zjawiska elektrochemiczne, w niewymieszanej warstwie granicznej na powierzchni błony komórkowej.

measurement-ion-concentration-unstirred-boundary-layer-with-open

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.

Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę bezpośredniego pomiaru aktywności kanałów jonowych na wewnątrzkomórkowych pęcherzykach za pomocą ręcznego endolizosomalnego systemu patch-clamp. Ilustrujemy metodę polegającą na powiększaniu endolizosomów i ręcznym izolowaniu tych pęcherzyków. Takie podejście gwarantuje, że badacze mogą dokładnie odtworzyć i zastosować procedurę.

Techniki patch-clamp do analizy pojedynczych pęcherzyków endolizosomalnych

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

Poznaj metodę pomiaru stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej. Technika ta umożliwia dokładne badanie regulacji kanałów jonowych przez przepływ płynu w komórkach.

Pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar stężenia jonów w niezmieszanej warstwie granicznej za pomocą otwartej pipety krosowej: implikacje w kontroli kanałów jonowych przez przepływ płynu

Przeglądaj więcej filmów