7 stycznia 2019
Mechanowrażliwe kanały jonowe są często badane pod kątem wrażliwości na przepływ płynu/siłę ścinającą z zapisem patch-clamp. Jednakże, w zależności od protokołu eksperymentalnego, wynik dotyczący regulacji przepływu płynów w kanałach jonowych może być błędny. W tym miejscu przedstawiamy metody zapobiegania i korygowania takich błędów wraz z podstawami teoretycznymi.
Niniejszy artykuł może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w sferze elektrofizjologicznej, takie jak przepływ płynów w samych regulacjach kanałów jonowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona oszacować rzeczywiste stężenie jonów w niezmieszanej warstwie granicznej powierzchni membrany w celu interpretacji danych związanych z regulacją przepływu płynu w kanałach jonowych. Aby rozpocząć tę procedurę, zegnij rurkę kapilarną z wypalanego szkła, aby uformować kształt litery U.
Wewnętrzna średnica kapilary powinna być wystarczająco duża, aby zmniejszyć rezystancję szeregową podczas rejestrowania dużych prądów jonowych. Następnie rozpuść trzy gramy agarozy w 100 mililitrach trójmolowego chlorku potasu i umieść go na gorącej płycie w temperaturze od 90 do 100 stopni Celsjusza. Następnie obciążyć most agarozą chlorku potasu, zanurzając szklany mostek w roztworze.
Przechowuj go przez noc w temperaturze pokojowej, aby agaroza stwardniała i stwardniała. Następnego dnia ostrożnie wykop szklany most obciążony chlorkiem potasu agarozy ze stwardniałej soli agarozy. Przechowuj most w butelce z trójtrzonowym chlorkiem potasu z szeroką szyjką w lodówce.
W tej procedurze umieść pojemnik wypełniony roztworem do kąpieli nad komorą zacisku krosowego. Następnie napełnij komorę zacisku krosowego roztworem do kąpieli, odsysając rurkę. Aby zatrzymać przepływ płynu, zapnij rurkę z boku pojemnika, aby zablokować przepływ płynu.
Następnie przypnij rurkę po stronie ssącej, aby jednocześnie zatrzymać ssanie. Jest to stan sterowania stacjonarnego. Aby zastosować siłę ścinającą przepływ płynu, otwórz jednocześnie obie rurki po stronie zbiornika i ssawki.
Przed lub po przyłożeniu siły ścinającej przepływu płynu do ogniwa oblicz natężenie przepływu w mililitrach na minutę, mierząc spadek objętości płynu w danym czasie. Aby zmierzyć zmiany potencjału połączenia ciekłego metalu, należy przygotować normalny roztwór soli fizjologicznej do komory kąpielowej i porównać je pod kątem braku i obecności mostka agarowo-chlorkowo-potasowego. Następnie umieść w komorze pipetę z plastrem zawierającą trójmolowy roztwór chlorku potasu, aby zminimalizować przesunięcie potencjału połączenia między pipetą a roztworami do kąpieli.
Następnie ustaw wzmacniacz cęgowy napięcia na bieżący tryb cęgów. Po zniwelowaniu początkowego potencjału przesunięcia zmierz zmiany napięcia wywołane zmianą natężeń przepływu. Aby sprawdzić, czy zmiany napięcia są potencjałami złączowymi ciekłego metalu, należy ponownie zbadać wpływ przepływu płynu na potencjał złącza, używając mostka soli agarozowej między roztworem kąpieli a elektrodą odniesienia.
Na podstawie wyników zmian potencjału złącza ciekłego metalu należy narysować zależności natężenia przepływu potencjału funkcji i oszacować wartość nasycenia przesunięcia potencjału złącza przez natężenie przepływu płynu nadziemnego. Następnie zmień stężenie chlorków w płynie do kąpieli i narysuj zależność stężenia chlorku potencjału złącza. Należy zauważyć, że szybkość przepływu płynu powinna być stała i wystarczająco wysoka, aby zapobiec spadkowi stężenia chlorków w stosunku do sąsiedniej elektrody referencyjnej srebro-chlorek srebra.
Na podstawie dwóch krzywych zależności oszacuj zmiany stężenia chlorków na podstawie zmierzonego przesunięcia potencjału złącza. Prądy VDCC-L zarejestrowano w enzymatycznie rozproszonych miocytach tętniczych krezki szczura, z zapisem perforowanym nystatyną patch-clamp. Dzięki mostkowi agarozowo-chlorkowo-potasowemu można zminimalizować potencjał połączenia między elektrodą odniesienia a roztworami do kąpieli, a przepływ płynu niezależnie zwiększył napięcie prądu VDCC-L.
Jednakże, gdy elektroda referencyjna srebro-chlorek srebra była bezpośrednio podłączona do płynu do kąpieli, bez mostka agarozowo-chlorkowo-potasowego, zależność IV w obecności przepływu płynu przesunęła się w prawo, w porównaniu z prądami VDCC-L w stanie statycznym. Wywołany przepływem płynu wzrost prądów Kerra 2.1, który zarejestrowano w szczurzych komórkach białaczki zasadochłonnej z mostkiem agarozowym, można wytłumaczyć efektem warstwy niezmieszanej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nadmierną elektrofizjologią.
Służy więc do regulacji przepływu płynu w prądach kanałów jonowych. Jeśli chodzi o zjawiska elektrochemiczne, w niewymieszanej warstwie granicznej na powierzchni błony komórkowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
W niniejszym artykule omówiono znaczenie dokładnego pomiaru przepływu płynów oraz jego wpływ na mechanosensytywne kanały jonowe. Przedstawiono metody zapobiegania i korygowania błędów w protokołach eksperymentalnych.
Dokładny pomiar stężenia jonów w nieruchomej warstwie przyściennej jest kluczowy dla wiarygodnej interpretacji wpływu przepływu płynu na bramkowanie kanałów jonowych. Metoda ta eliminuje artefakty eksperymentalne w badaniach elektrofizjologicznych, poprawiając jakość danych służących walidacji celów w badaniach nad mechanosensytywnymi kanałami jonowymi. Poprzez korekcję przesunięć potencjału złącza, zwiększa ona pewność predykcyjną w przedklinicznych modelach odpowiedzi na naprężenia ścinające płynu.
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez optymalizację wiodących związków, aż po ocenę przedkliniczną, w szczególności w odniesieniu do kanałów jonowych regulowanych bodźcami mechanicznymi.