Name: Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji zapadania się stożków wzrostu aksonów po działaniu β-amyloidu w hodowanych neuronach myszy. Protokół umożliwia badanie wczesnych mechanizmów choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty badawcze z JSPS (KAKENHI 18K07389), Japonia, Takeda Science Foundation, Japonia, oraz Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japonia.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Kampusie Sugitani Uniwersytetu Toyama i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych na Kampusie Sugitani Uniwersytetu Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. Test zwinięcia
<ol>
	<li>Powłoka poli-D-lizynowa
	<ol>
		<li>Pokryć 8-dołkowe szkiełka hodowlane 400 μl 5 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Usuń roztwór PDL i umyj studzienki 3 razy wodą destylowaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kultura neuronów24
	<ol>
		<li>Świeżo wyizolowaną korę mózgową od embrionalnych myszy ddY w dniu 14 (E14) za pomocą mikronożyczek w pożywce do hodowli neuronów zawierającej 12% surowicy końskiej, 0,6% glukozy i 2 mM L-glutaminy (pożywka A). Nie dodawać antybiotyków. 
		UWAGA: W tym protokole używana jest mysz ddY. Jest to odmiana niekrewniacza powszechnie stosowana w Japonii. Ten protokół hodowli neuronów może być również stosowany do neuronów korowych szczurów7,25.</li>
		<li>Odwirować tkanki przy sile 87 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Usunąć supernatant. Następnie do granulatu dodaj 2 ml 0,05% trypsyny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37°C. Mieszaj, stukając co 5 minut.</li>
		<li>Dodaj 4 ml pożywki A i wymieszaj, stukając.</li>
		<li>Odwirować tkanki przy sile 178 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Usunąć supernatant i inkubować tkanki z 600 U/ml DNazy I i 0,3 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej rozpuszczonego w PBS przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać stukając co 5 minut.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 4 ml pożywki A i wymieszać, stukając.</li>
		<li>Odwirować tkanki przy sile 178 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Po usunięciu supernatantu dodać 4 ml pożywki A i rozcierać tkanki za pomocą wypolerowanej pipety Pasteura.</li>
		<li>Przefiltruj rozdrobnione tkanki za pomocą siatki o wielkości porów 70 μm. Po filtracji oblicz gęstość komórek za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Wyhodować komórki w 8-dołkowym szkiełku hodowlanym w temperaturze 0,8 x 104 komórki/basenik z pożywką A i utrzymać je w inkubatorze CO2 z nawilżoną atmosferą 10% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po 4 godzinach hodowli należy wymienić pożywkę hodowlaną na taką, która zawiera 2% suplementu do hodowli neuronów, 0,6% glukozy i 2 mM L-glutaminy (pożywka B). 
		UWAGA: Czystość neuronów wynosiła około 75%, jak opisano wcześniej26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwiń test27
	<ol>
		<li>Rozpuścić komercyjnie uzyskany amyloid β1-42 (Aβ1-42) o pełnej długości w wodzie destylowanej o stężeniu 0,5 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Po inkubacji zagregowany roztwór Aβ1-42 należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -30 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Ta inkubacja jest niezbędna do agregacji i toksyczności Aβ27,28,29,30.</li>
		<li>Po 4 dniach hodowli neuronalnej potraktować studzienki 100 μl nowej pożywki B, zawierającej 0,5 μM zagregowanego Aβ1-42 lub roztworu nośnika (woda destylowana) przez 1 h, 
		UWAGA: Efekty Aβ1-42 zostały zwiększone w zależności od dawki z 0,1 do 5 μM i osiągnęły szczyt przy 0,5 μM, jak opisano wcześniej27. Podobne wyniki można zaobserwować po leczeniu Aβ1-42 przez 1 godzinę po 3 dniach hodowli neuronalnej31.</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast utrwalić neurony 4% paraformaldehydem zawierającym 4% sacharozy w PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na gorącej płycie.</li>
		<li>Po utrwaleniu przemyj neurony 3 razy PBS i zamontuj je wodnym podłożem montażowym. Podłoże montażowe suszyć w temperaturze 4 °C przez 2–4 dni.</li>
		<li>Uchwyć cały obszar (7,8 x 9 mm2) każdej studzienki za pomocą 20-krotnej suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie.</li>
		<li>Sklasyfikuj najdłuższe neuryty każdego neuronu w stadium 3 lub 4 jako aksony, zgodnie z wcześniejszym opisem32,33.</li>
		<li>Klasyfikuj stożki wzrostu według następujących kryteriów: 1) stożki wzrostu aksonów pozbawione blaszkowatych lub 2) posiadające mniej niż trzy filopodia są uważane za stożki wzrostu zapadnięte, jak opisano wcześniej17. 
		UWAGA: Zdrowe stożki wzrostu są oceniane jako 0 punktów; Zapadnięte stożki wzrostu są oceniane jako 1 punkt. Średnie wyniki zapadnięcia są obliczane dla każdego zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne β amyloidu
<ol>
	<li>Hoduj neurony korowe myszy przez 3 dni, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	<li>Traktować zagregowanym Aβ1-42 (5 μM) lub podłożem przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Nie usuwając pożywki, dodać równą objętość 4% paraformaldehydu zawierającego 4% sacharozy w PBS do każdej studzienki i utrzymywać kulturę w temperaturze 37 °C na gorącej płycie przez 5 minut.</li>
	<li>Zastąp roztwór 400 μl 4% paraformaldehydu zawierającego 4% sacharozy w PBS i utrzymuj w temperaturze 37 °C na płycie grzejnej przez 1 godzinę. Ten protokół fiksacji został zmodyfikowany w stosunku do poprzedniego raportu34.</li>
	<li>Umyj neurony 3 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Blok z 5% normalną surowicą kozią w PBS.</li>
	<li>Inkubować neurony z mysią antyamyloidem β immunoglobuliną G (IgG) (1:50) i 1% albuminą surowicy bydlęcej w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj neurony 3 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować neurony z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją (1:400) i 1% albuminą surowicy bydlęcej w PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Umyj neurony 3 razy PBS i zamontuj je za pomocą wodnego podłoża montażowego.</li>
	<li>Rejestruj obrazy fluorescencyjne i obrazy jasnego pola z ukośnym oświetleniem, używając 40-krotnej suchej soczewki obiektywowej na odwróconym mikroskopie B.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne aksonów27
<ol>
	<li>Przemyj neurony 3 razy PBS po ustabilizowaniu neuronów w hodowli, jak opisano w kroku 1.3.3.</li>
	<li>Inkubuj neurony z mysim anty-tau-1 IgG (1:500), króliczym białkiem 2 związanym z antymikrotubulami (MAP2) IgG (1:500) w 5% normalnej surowicy koziej i 0,3% t-oktylofenoksypolietoksyetanolem w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj neurony 3 razy za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować neurony z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi (1:400) i 0,3% t-oktylofenoksypolietylenem w PBS w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Umyj neurony 3 razy PBS i zamontuj za pomocą wodnego podłoża mocującego.</li>
	<li>Rejestruj obrazy fluorescencji i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) za pomocą 20× suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie A.</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo komórek27
<ol>
	<li>Pokryj naczynia szklane 500 μl PDL (5 μg/ml), jak opisano w kroku 1.1.1. 
	UWAGA: W tym protokole użyto domowych naczyń szklanych. Dostępne na rynku naczynia szklane mogą być również używane do obrazowania na żywo. Domowe naczynia szklane przygotowywano w następujący sposób: 1) za pomocą ręcznego dziurkacza wykonać otwór o średnicy około 1,4 mm w środku naczynia o średnicy 35 mm oraz 2) przymocować szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 22 mm) z tyłu naczynia za pomocą silikonu.</li>
	<li>Umyć płytki wodą destylowaną, jak opisano w kroku 1.1.2, i wyhodować neurony korowe w szklanym naczyniu w temperaturze 3 x 104 komórki/naczynie z pożywką A, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	<li>Po 4 dniach hodowli komórkowej zastąp pożywkę 2 ml nowej pożywki B i przenieś naczynie do odwróconego mikroskopu A. Utrzymuj kulturę w wilgotnej atmosferze 10% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Eksperyment z endocytozą
<ol>
	<li>Posadź neurony korowe myszy zgodnie z opisem w kroku 1.2.</li>
	<li>Cztery dni później zastąp pożywkę 100 μl nowej pożywki B zawierającej 20 μM sondy z membraną fluorescencyjną na 1 minutę.</li>
	<li>Dodać 1 μl 0,05 mM zagregowanego roztworu Aβ1-42 (końcowe 0,5 μM) lub nośnika (woda destylowana) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 20 minut.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i dwukrotnie umyć studzienki pożywką B, która została wstępnie podgrzana do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Napraw, umyj i zamontuj neurony zgodnie z opisem w krokach 1.3.3 i 1.3.4.</li>
	<li>Rejestruj obrazy fluorescencyjne i DIC za pomocą obiektywu olejowego 63X na odwróconym mikroskopie A.</li>
	<li>Określ ilościowo gęstość obszaru dodatniego sondy membrany fluorescencyjnej w każdym zdrowym stożku wzrostu za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>
6. Transfekcja genów
<ol>
	<li>Przygotuj neurony korowe zgodnie z opisem w kroku 1.2. Po wykonaniu kroków od 1.2.1 do 1.2.10 należy odwirować neurony przy stężeniu 178 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad, dodać 4 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (CMF-HBSS) wolnego od Ca2+ i Mg2+ i wymieszać pipetując.</li>
	<li>Odwirować komórki przy sile 178 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant, dodać 4 ml CMF-HBSS i wymieszać pipetując. Następnie oblicz gęstość komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.2.10.</li>
	<li>Przenieść 5 x 106 komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 1,677 x g przez 1 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant, dodać 100 μl roztworu do transfekcji z suplementem i 3 μg plazmidu DNA kodującego C-koniec EGFP lub EGFP-AP180 i wymieszać pipetując.</li>
	<li>Przenieść powyższy roztwór (krok 6.6) do certyfikowanej kuwety i przetransfekować za pomocą elektroporatora, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Natychmiast po transfekcji dodać 500 μl pożywki A do kuwety i przenieść roztwór do probówki o pojemności 1,5 ml z certyfikowaną pipetą. Następnie oblicz gęstość komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.2.10.</li>
	<li>Hodować komórki na 8-dołkowym szkiełku hodowlanym w temperaturze 0,8 x 104 komórki/basenik, jak opisano w krokach 1.2.11 i 1.2.12.</li>
	<li>Po 4 dniach hodowli komórkowej wykonaj test zapadania się zgodnie z opisem w kroku 1.3.</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Protokół opisany w tym badaniu umożliwił obserwację wczesnych zjawisk w stożkach wzrostu aksonów po leczeniu Aβ1-42. Aβ1-42 indukował endocytozę w aksonalnych stożkach wzrostu w ciągu 20 minut, a zapadnięcie się stożka wzrostu obserwowano w ciągu 1 godziny od zabiegu. W tej endocytozie prawdopodobnie pośredniczyła klatryna. Dzięki zastosowaniu tego protokołu potwierdzono, że hamowanie endocytozy za pośrednictwem klatryny zapobiega zapadaniu się stożka wzrostu wywołanemu przez Aβ1-42 i zwyrodnieniu aksonów w hodowanych ne...

Złogi β amyloidu (Aβ) znajdują się w mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera (AD) i są uważane za krytyczną przyczynę AD1, które zakłócają sieci neuronowe, prowadząc do zaburzeń pamięci2,3,4. Wykazano, że wielu kandydatów na leki kliniczne skutecznie zapobiega wytwarzaniu β amyloidu (Aβ) lub usuwa złogi Aβ. Jednak żadnemu z nich nie udało się poprawić funkcji pamięci u pacjentów z AD5. Aβ odkłada się w mózgu jeszcze przed wystąpieniem zaburzeń pamięci6; dlatego obniżenie poziomu Aβ w mózgach pacjentów wykazujących zaburzenia pamięci może być nieskuteczne. Odkładanie się Aβ występuje u przedklinicznych pacjentów z AD; Jednak u tych pacjentów rzadko występują zwyrodnienia neuronów i deficyty pamięci<klasa SUP='xref'>6. Istnieje opóźnienie czasowe między odkładaniem się Aβ a zaburzeniami pamięci. Dlatego kluczową strategią zapobiegania chorobie Alzheimera jest blokowanie sygnalizacji toksyczności Aβ we wczesnych stadiach choroby Alzheimera, przed rozwojem deficytów pamięci. Osadzanie Aβ indukuje degenerację aksonów7,8,9,10,11,12,13, co może prowadzić do zakłócenia sieci neuronowych i trwałego upośledzenia funkcji pamięci. W wielu badaniach badano mechanizmy toksyczności Aβ; na przykład wykazano, że zdegenerowane aksony mózgów myszy z AD mają zwiększoną autofagię14. Aktywacja kalcyneuryny została opisana jako możliwy mechanizm zwyrodnienia aksonów wywołanego przez Aβ15; Jednak bezpośredni czynnik wywołujący zwyrodnienie aksonów pozostaje nieznany. 
To badanie skupia się na zapadaniu się zakończeń aksonalnych zwanych stożkami wzrostu. Zapadanie się aksonalnych stożków wzrostu może być spowodowane przez środki odstraszające wzrost aksonów, takie jak semaforyna-3A i efryna-A516,17,18,19,20. W mózgach pacjentów z AD zaobserwowano zapadające się dystroficzne zakończenia aksonów21,22. Dodatkowo, nieprawidłowe funkcjonowanie stożka wzrostu może wywołać zwyrodnienie aksonów23. Nie wiadomo jednak, czy Aβ indukuje zapadanie się stożka wzrostu. Dlatego badanie to przedstawia nowy protokół obserwacji wczesnych skutków Aβ w hodowanych neuronach i zbadania wywołanego przez Aβ zapadania się stożka wzrostu.

<table><tbody><tr><td>ddY myszy</td><td>SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ośmiodołkowy szkiełko hodowlane</td><td>Falcon</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>poli D lizyna</td><td>Wako</td><td>168-19041</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana, pożywka neurobazalna</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>surowica domowa</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>0,05% trypsyna</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>DP</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor trypsyny sojowej</td><td>Gibco</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Filtr z 70 &mikro; m rozmiar oczek, sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkubator</td><td>Astec</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid &beta; 1-42</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9810</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza&nbsp;</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Wodne medium montażowe, Aqua-Poly</td><td>/Mount polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony A</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer Z1&nbsp;</td><td>Połączony z AxioCam MRm, jednostką grzewczą XL S, modułem CO2 S1 i modułem TempModule S1</td></tr><tr><td>Obiektyw Plan-Apochromat 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw Plan-Apochromat 63x</td><td>Carl Zeiss</td><td>440762-9904</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw, CFI Plan Apo Lambda 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-MAP2 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>anty-tau-1 IgG</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td></td></tr><tr><td>anty-amyloid i przeciwciało beta</td><td>IBL</td><td>10379</td><td>klon 11A1</td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>Wako</td><td>143-06561</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Wako</td><td>010-25783</td><td></td></tr><tr><td>t-oktylofenoksypolietylen</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>kozia anty-mysia IgG skoniugowana z AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td></td></tr><tr><td>kozia anty-królicza IgG skoniugowana z AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>płyta grzejna</td><td>NISSIN</td><td>NHP-M30N</td><td></td></tr><tr>szkło<td>osłonowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 35 mm</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy RTV</td><td>Shin-Etsu</td><td>KE42T</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz ręczny</td><td>Roper Whitney</td><td>No. XX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjna sonda membranowa, FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+- i Mg2+ bez Zbilansowany roztwór soli Hanksa</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór transfekcyjny, roztwór Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator, Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony B</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania, ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-β (Aβ) powoduje zaburzenia pamięci w chorobie Alzheimera (AD). Chociaż wykazano, że terapie obniżają poziom Aβ w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, nie poprawiają one funkcji pamięci. Ponieważ Aβ agreguje się w mózgu przed pojawieniem się zaburzeń pamięci, celowanie w Aβ może być nieskuteczne w leczeniu pacjentów z AD, którzy już wykazują deficyty pamięci. W związku z tym dalsza sygnalizacja spowodowana osadzaniem się Aβ powinna zostać zablokowana przed rozwojem AD. Aβ indukuje zwyrodnienie aksonów, prowadząc do zakłócenia sieci neuronalnych i upośledzenia pamięci. Chociaż istnieje wiele badań nad mechanizmami toksyczności Aβ, źródło toksyczności Aβ pozostaje nieznane. Aby pomóc w identyfikacji źródła, proponujemy nowatorski protokół, który wykorzystuje mikroskopię, transfekcję genów i obrazowanie żywych komórek do zbadania wczesnych zmian spowodowanych przez Aβ w aksonalnych stożkach wzrostu hodowanych neuronów. Protokół ten ujawnił, że Aβ indukował endocytozę za pośrednictwem klatryny w aksonalnych stożkach wzrostu, po której następowało zapadnięcie się stożka wzrostu, wykazując, że hamowanie endocytozy zapobiega toksyczności Aβ. Protokół ten będzie przydatny w badaniu wczesnych skutków Aβ i może prowadzić do skuteczniejszego i bardziej zapobiegawczego leczenia AD.

W niniejszym protokole Aβ1-42 inkubowano w temperaturze 37 °C przez 7 dni przed użyciem, ponieważ inkubacja Aβ1-42 była niezbędna do wytworzenia form toksycznych27,28,30,35. Po tej inkubacji zaobserwowano formy zagregowane Aβ (Rycina 1A). Wykazano, że analogiczna inkubacja Aβ1-42 prowadzi do powstania formy włóknistej Aβ<sup class="...

Tutaj przedstawiono protokół do badania wczesnych skutków β amyloidu (Aβ) w mózgu. To pokazuje, że Aβ indukuje endocytozę za pośrednictwem klatryny i zapadanie się stożków wzrostu aksonów. Protokół jest przydatny w badaniu wczesnego wpływu Aβ na stożki wzrostu aksonów i może ułatwić zapobieganie chorobie Alzheimera.

Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad chorobą Alzheimera, zwłaszcza na temat wczesnych zdarzeń związanych z zapadaniem się stożka wzrostu. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie wizualizacji i analizy stożków wzrostu aksonów bezpośrednio po leczeniu amyloidem beta. Zacznij od użycia mikronożyczek do mielenia świeżo wyizolowanej kory mózgowej od embrionalnych myszy dnia 14 w pożywce do hodowli neuronów bez antybiotyków.Zebrać tkanki i odwirować tkanki w temperaturze 87G przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny do granulki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i mieszać, stukając co pięć minut.Po 15 minutach dodaj cztery mililitry pożywki A, aby zneutralizować trypsynę i wymieszaj, stukając. Następnie odwirować tkanki w temperaturze 178 razy G przez trzy minuty. Po usunięciu supernatantu dodać DNAzę i roztwór inhibitora trypsyny sojowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza mieszając co pięć minut, jak poprzednio.Po upływie czasu inkubacji dodać cztery mililitry pożywki A.Wymieszać i odwirować jak poprzednio. Po usunięciu supernatantu dodać cztery mililitry pożywki A i rozcierać tkanki wypolerowaną pipetą Pasteura, aż nie zaobserwuje się żadnych zanieczyszczeń. Następnie przefiltruj rozdrobnione tkanki za pomocą siatki o wielkości porów 70 mikronów.Po filtracji policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz gęstość komórek. Pipetować 0,8 razy 10 do czwartej komórki w pożywce A do każdego dołka ośmiodołkowego szkiełka hodowlanego. Następnie inkubuj w wilgotnej atmosferze 10% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po czterech godzinach hodowli zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę B.Czystość neuronów przy użyciu tej metody wynosi około 75%Rozpocznij ten test co najmniej tydzień wcześniej, otwierając świeżą fiolkę z komercyjnie uzyskanym pełnoziarnistym A beta 42 i rozpuszczając zawartość w sterylnej, destylowanej wodzie do stężenia 0,5 milimola. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni w celu wywołania agregacji i toksyczności. Przygotuj porcje zagregowanego A beta 1-42 i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do zużycia.W czwartym dniu hodowli neuronalnej należy potraktować studzienki 100 mikrolitrami 0,5 mikromolowego zagregowanego A beta 1-42 lub roztworu nośnika w pożywce B przez jedną godzinę, jak wykazano wcześniej. Po upływie godziny usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast utrwalić neurony za pomocą 4% paraformaldehydu zawierającego 4% sacharozy w PBS przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na gorącej płycie. Fiksacja jest najważniejsza, ponieważ utrzymanie kształtu stożków wzrostu ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu.Po utrwaleniu przemyj neurony trzykrotnie PBS. Następnie, po wyjęciu komory, zamontuj neurony za pomocą wodnego podłoża montażowego. Suszyć podłoże montażowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa do czterech dni.Uchwyć cały obszar każdej studzienki za pomocą 20-krotnej suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie. Uchwycenie i przeanalizowanie całego obszaru w każdej studni jest ważne dla uniknięcia subiektywizmu. Sklasyfikuj najdłuższe neuryty każdego neuronu w stadium trzecim lub czwartym jako aksony.Stożki wzrostu aksonów pozbawione blaszek lub posiadające mniej niż trzy filopodia są uważane za zapadnięte stożki wzrostu. Oligomery beta 1-42, pokazane tutaj przed inkubacją, agregują się po siedmiu dniach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po leczeniu zagregowanym A beta 1-42, barwienie immunologiczne przeciwciałem przeciwko toksycznemu oligomerowi A beta wykazuje dodatnie barwienie na czerwono na neuronach traktowanych A beta 1-42, ale nie neuronach traktowanych nośnikiem.Wczesne zjawiska wywołane przez leczenie A beta 1-42 analizowano po czterech dniach w hodowli. Zidentyfikowane aksony zostały potwierdzone jako takie przez dodatnie barwienie immunologiczne dla markera aksonalnego tau-1 pokazanego na czerwono i ujemne barwienie immunologiczne dla markera dendrytycznego, MAP-2, pokazanego na zielono. Po jednej godzinie leczenia podłożem stożki wzrostu rozprzestrzeniły się blaszki i kilka filopodiów.Zostały one zidentyfikowane jako zdrowe stożki wzrostu. I odwrotnie, jedna godzina leczenia A beta 1-42 doprowadziła do skurczenia się stożków wzrostu, w których nie rozwinęły się lamellipodia ani filopodia. Zostały one zidentyfikowane jako zapadnięte stożki wzrostu.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrwaleniu komórek za pomocą 4% PFA i 4% sacharozy w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby jak najlepiej zastosować ten protokół utrwalania. Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek i transfekcja genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kiedy i w jaki sposób stożki wzrostu aksonów są zapadane i jak zapadnięte stożki wzrostu są odzyskiwane.

visualizing-axonal-growth-cone-collapse-early-amyloid-effects

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje generowanie modelu uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z indukcją uszkodzenia neuronów za pomocą NMDA, agonisty receptora neuroprzekaźnika pobudzającego i glicyny, koagonisty. NMDA i glicyna wiążą się ze specyficznymi receptorami neuronalnymi, powodując ich nadmierną stymulację i powodując masowy wewnątrzkomórkowy napływ wapnia, co prowadzi do uszkodzenia i śmierci komórek neuronalnych.

Modelowanie uszkodzenia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Ten film pokazuje ocenę in vitro zapadania się stożka wzrostu neuronów przez agregaty amyloid-β (Aβ). Traktowanie neuronów agregatami Aβ powoduje destabilizację cytoszkieletu, prowadzącą do zapadnięcia się stożków wzrostu na końcach aksonów. Leczone komórki porównuje się z komórkami kontrolnymi w celu oceny stopnia zapadania się stożka wzrostu.

Ocena in vitro zagregowanego β amyloidu na zapadanie się stożka wzrostu neuronów

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania i hodowli pierwotnych mysich neuronów ziarnistych (CGN) od 6-7 dniowych szczeniąt, efektywną transdukcję CGN dla badań nad utratą i zyskiem funkcji, oraz modelowanie ekscytotoksyczności neuronów indukowanej przez NMDA, śmierci komórek indukowanej niskim poziomem potasu, uszkodzeń DNA i stresu oksydacyjnego przy użyciu tego samego modelu hodowli.

Modelowanie śmierci i zwyrodnienia neuronów w pierwotnych neuronach ziarnistych móżdżku myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Korzystając z transgenicznych myszy fluorescencyjnych, opisano szczegółowe protokoły do oceny in vivo transportu aksonalnego endosomów sygnałowych i mitochondriów w obrębie aksonów motorycznych i czuciowych nienaruszonego nerwu kulszowego u żywych zwierząt.

Rozszerzenie zestawu narzędzi do obrazowania in vivo transportu aksonalnego

Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.

Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego powiązanej z mitochondriami (MAM) w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę wizualizacji zapadania się stożków wzrostu aksonów po działaniu β-amyloidu w hodowanych neuronach myszy. Protokół umożliwia badanie wczesnych mechanizmów choroby Alzheimera.

Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy

Przeglądaj więcej filmów