Wizualizacja zapadania się stożka wzrostu aksonów i wczesnych efektów β amyloidu w hodowanych neuronach myszy
30 października 2018
Tutaj przedstawiono protokół do badania wczesnych skutków β amyloidu (Aβ) w mózgu. To pokazuje, że Aβ indukuje endocytozę za pośrednictwem klatryny i zapadanie się stożków wzrostu aksonów. Protokół jest przydatny w badaniu wczesnego wpływu Aβ na stożki wzrostu aksonów i może ułatwić zapobieganie chorobie Alzheimera.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad chorobą Alzheimera, zwłaszcza na temat wczesnych zdarzeń związanych z zapadaniem się stożka wzrostu. Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie wizualizacji i analizy stożków wzrostu aksonów bezpośrednio po leczeniu amyloidem beta. Zacznij od użycia mikronożyczek do mielenia świeżo wyizolowanej kory mózgowej od embrionalnych myszy dnia 14 w pożywce do hodowli neuronów bez antybiotyków.
Zebrać tkanki i odwirować tkanki w temperaturze 87G przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny do granulki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i mieszać, stukając co pięć minut.
Po 15 minutach dodaj cztery mililitry pożywki A, aby zneutralizować trypsynę i wymieszaj, stukając. Następnie odwirować tkanki w temperaturze 178 razy G przez trzy minuty. Po usunięciu supernatantu dodać DNAzę i roztwór inhibitora trypsyny sojowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza mieszając co pięć minut, jak poprzednio.
Po upływie czasu inkubacji dodać cztery mililitry pożywki A.Wymieszać i odwirować jak poprzednio. Po usunięciu supernatantu dodać cztery mililitry pożywki A i rozcierać tkanki wypolerowaną pipetą Pasteura, aż nie zaobserwuje się żadnych zanieczyszczeń. Następnie przefiltruj rozdrobnione tkanki za pomocą siatki o wielkości porów 70 mikronów.
Po filtracji policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz gęstość komórek. Pipetować 0,8 razy 10 do czwartej komórki w pożywce A do każdego dołka ośmiodołkowego szkiełka hodowlanego. Następnie inkubuj w wilgotnej atmosferze 10% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po czterech godzinach hodowli zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę B.Czystość neuronów przy użyciu tej metody wynosi około 75%Rozpocznij ten test co najmniej tydzień wcześniej, otwierając świeżą fiolkę z komercyjnie uzyskanym pełnoziarnistym A beta 42 i rozpuszczając zawartość w sterylnej, destylowanej wodzie do stężenia 0,5 milimola. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni w celu wywołania agregacji i toksyczności. Przygotuj porcje zagregowanego A beta 1-42 i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do zużycia.
W czwartym dniu hodowli neuronalnej należy potraktować studzienki 100 mikrolitrami 0,5 mikromolowego zagregowanego A beta 1-42 lub roztworu nośnika w pożywce B przez jedną godzinę, jak wykazano wcześniej. Po upływie godziny usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast utrwalić neurony za pomocą 4% paraformaldehydu zawierającego 4% sacharozy w PBS przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na gorącej płycie. Fiksacja jest najważniejsza, ponieważ utrzymanie kształtu stożków wzrostu ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu.
Po utrwaleniu przemyj neurony trzykrotnie PBS. Następnie, po wyjęciu komory, zamontuj neurony za pomocą wodnego podłoża montażowego. Suszyć podłoże montażowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa do czterech dni.
Uchwyć cały obszar każdej studzienki za pomocą 20-krotnej suchej soczewki obiektywowej w odwróconym mikroskopie. Uchwycenie i przeanalizowanie całego obszaru w każdej studni jest ważne dla uniknięcia subiektywizmu. Sklasyfikuj najdłuższe neuryty każdego neuronu w stadium trzecim lub czwartym jako aksony.
Stożki wzrostu aksonów pozbawione blaszek lub posiadające mniej niż trzy filopodia są uważane za zapadnięte stożki wzrostu. Oligomery beta 1-42, pokazane tutaj przed inkubacją, agregują się po siedmiu dniach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po leczeniu zagregowanym A beta 1-42, barwienie immunologiczne przeciwciałem przeciwko toksycznemu oligomerowi A beta wykazuje dodatnie barwienie na czerwono na neuronach traktowanych A beta 1-42, ale nie neuronach traktowanych nośnikiem.
Wczesne zjawiska wywołane przez leczenie A beta 1-42 analizowano po czterech dniach w hodowli. Zidentyfikowane aksony zostały potwierdzone jako takie przez dodatnie barwienie immunologiczne dla markera aksonalnego tau-1 pokazanego na czerwono i ujemne barwienie immunologiczne dla markera dendrytycznego, MAP-2, pokazanego na zielono. Po jednej godzinie leczenia podłożem stożki wzrostu rozprzestrzeniły się blaszki i kilka filopodiów.
Zostały one zidentyfikowane jako zdrowe stożki wzrostu. I odwrotnie, jedna godzina leczenia A beta 1-42 doprowadziła do skurczenia się stożków wzrostu, w których nie rozwinęły się lamellipodia ani filopodia. Zostały one zidentyfikowane jako zapadnięte stożki wzrostu.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrwaleniu komórek za pomocą 4% PFA i 4% sacharozy w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby jak najlepiej zastosować ten protokół utrwalania. Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek i transfekcja genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kiedy i w jaki sposób stożki wzrostu aksonów są zapadane i jak zapadnięte stożki wzrostu są odzyskiwane.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół opracowany w celu oceny wczesnego wpływu amyloidu-β (Aβ) na stożki wzrostu aksonów w neuronach. W badaniu wykorzystano korę mózgową embrionów myszy, wykazując, że Aβ indukuje endocytozę zależną od klatryny i prowadzi do zapadnięcia się stożków wzrostu. Badania te są kluczowe dla zrozumienia wczesnych mechanizmów, które mogą przyczyniać się do rozwoju choroby Alzheimera.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wstęp
- Aβ jest zaangażowany w patogenezę choroby Alzheimera, w szczególności w degenerację neuronów.
- Zrozumienie wpływu Aβ na neurony może dostarczyć kluczowych informacji na temat postępu choroby Alzheimera.
- Kolaps stożków wzrostu aksonów jest wczesnym zdarzeniem w procesie uszkodzenia neuronów.
- Niniejsze badanie dostarcza niezbędnej metodologii wizualizacji i analizy tych zmian w odpowiedzi na Aβ.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów, poprzez które Aβ wpływa na stożki wzrostu aksonów.
- Ułatwienie zrozumienia wczesnych zdarzeń patofizjologicznych w chorobie Alzheimera.
- Opracowanie protokołu obserwacji bezpośrednich efektów działania Aβ na strukturę neuronów.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano platformę hodowli komórkowej z neuronami pochodzącymi z kory mózgowej myszy w 14. dniu embrionalnym.
- Po izolacji neurony są traktowane agregowanymi Aβ w celu oceny ich wpływu na stożki wzrostu.
- Kluczowe etapy obejmują przygotowanie i inkubację kultur neuronalnych, a następnie fiksację i immunobarwienie w celu oceny morfologii stożków wzrostu.
- Protokół określa krytyczne czasy inkubacji dla agregacji Aβ oraz harmonogramy traktowania kultur neuronalnych.
- Obserwacje są prowadzone przy użyciu mikroskopii w celu klasyfikacji stożków wzrostu na podstawie ich cech strukturalnych.
Główne wyniki
- Traktowanie Aβ doprowadziło do kolapsu stożków wzrostu, co charakteryzowało się brakiem lamelipodiów i zmniejszoną liczbą filopodiów.
- Neurony kontrolne wykazywały prawidłową morfologię stożka wzrostu, co stanowiło istotny kontrast w stosunku do neuronów traktowanych Aβ.
- Immunobarwienie potwierdziło tożsamość aksonalną oraz toksyczny wpływ Aβ na strukturę neuronalną.
- Otrzymane wyniki potwierdzają hipotezę, że Aβ negatywnie wpływa na rozwój neuronów we wczesnych stadiach.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wartościowy protokół służący do wyjaśnienia wpływu Aβ na stożki wzrostu aksonów.
- Zastosowana metodologia umożliwia badanie mechanizmów odpowiedzi neuronów na traktowanie Aβ.
- Zrozumienie tych wczesnych zmian w stożkach wzrostu może pomóc w opracowaniu strategii zapobiegania i leczenia choroby Alzheimera.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wczesne wykrycie zapadania się stożka wzrostu aksonu indukowanego przez amyloid-β, co jest kluczowym zdarzeniem mechanistycznym poprzedzającym dysfunkcję synaptyczną w chorobie Alzheimera. Dzięki wizualizacji endocytozy zależnej od klatryny oraz degeneracji strukturalnej w czasie rzeczywistym, metoda ta wspomaga walidację celów i redukcję ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków na choroby neurodegeneracyjne. Podejście to zapewnia system istotny z punktu widzenia choroby, pozwalający na ocenę interwencji terapeutycznych mających na celu zablokowanie toksyczności Aβ na dalszych etapach, zanim wystąpi spadek funkcji poznawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę, według której indukowana przez Aβ endocytoza prowadzi do zapadnięcia się stożka wzrostu, umożliwiając walidację mechanistycznego celu terapeutycznego.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje immunobarwienie markerów aksonalnych (tau-1) i dendrytycznych (MAP-2) w celu potwierdzenia tożsamości neuronów oraz specyficzności fenotypu.
- Wartość predykcyjna: Wykazuje, że zahamowanie endocytozy zapobiega toksyczności Aβ, dostarczając odczytu podobnego do biomarkera w zakresie aktywacji szlaku sygnałowego.
Przesiewanie i opracowywanie analiz
- Gotowość analizy: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników morfologicznych (obecność lamellipodiów/filopodiów) do wysokoprzepustowej analizy wpływu związków.
- Powtarzalność: Standaryzowana fiksacja 4% PFA i sacharozą pozwala zachować strukturę stożka wzrostu, minimalizując zmienność w ocenie opartej na obrazowaniu.
- Skalowalność: Metoda jest kompatybilna z wieloodworowymi szkiełkami do hodowli, co umożliwia równoległe testowanie agregatów Aβ oraz potencjalnych inhibitorów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje wczesną toksyczność oligomerów Aβ w pierwotnych neuronach mysich, odzwierciedlając zdarzenia patofizjologiczne poprzedzające zaburzenia pamięci.
- Ciągłość translacyjna: Łączy degenerację aksonalną z zaburzeniami sieci neuronowej, co stanowi uzasadnienie dla wczesnej interwencji w chorobie AD.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Identyfikuje endocytozę jako modyfikowalny punkt uchwycenia (druggable node) przed wystąpieniem neurodegeneracji, co wspomaga wybór celu terapeutycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, dostarczając wglądu w mechanizmy działania po związaniu z celem, lecz przed badaniami fenotypowymi w złożonych modelach chorób.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków sygnalizacyjnych Aβ poprzez bezpośrednią wizualizację dynamiki stożków wzrostu.
- Przesiewanie: Generuje standaryzowane, ilościowe dane morfologiczne odpowiednie do miniaturyzacji i automatyzacji testów.
- Analityka: Opiera się na klasyfikacji stanów stożka wzrostu w oparciu o mikroskopię, co pozwala na obiektywne porównanie różnych warunków traktowania.
- Badania translacyjne: Wspiera ocenę związków hamujących endocytozę lub zapobiegających zapadaniu się cytoszkieletu w korelacji z biomarkerami.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania oligomerów Aβ i innych neurotoksyn w pierwotnych kulturach neuronalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie ekspozycji na Aβ z określonymi zmianami cytoszkieletu w stożkach wzrostu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, zależne od fiksacji przepływy pracy obrazowania, kompatybilne z istniejącą infrastrukturą neurobiologiczną.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez identyfikację związków blokujących wczesne uszkodzenia strukturalne indukowane przez Aβ.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapeutyków ukierunkowanych na mechanizmy presynaptyczne w chorobie Alzheimera z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie pierwotnych hodowli neuronów, immunobarwienia oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od dostępu do mikroskopów odwróconych, komór hejmo-cytometrycznych oraz inkubatorów do hodowli komórkowych (10% CO2, 37°C).
- Wymaga zastosowania ustandaryzowanych protokołów agregacji Aβ (7-dniowa inkubacja w 37°C) w celu zapewnienia spójności toksycznych oligomerów.
- Wiąże się z koniecznością optymalizacji w zależności od poziomu czystości neuronów (~75% w niniejszym protokole) oraz potencjalnej zmienności morfologii stożków wzrostu.
- Ograniczone do analiz końcowych, chyba że zostanie połączone z obrazowaniem żywych komórek, ponieważ fiksacja uniemożliwia śledzenie zmian w czasie.
