Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na niektóre z ważnych pytań w dziedzinie produkcji procesów biologicznych dotyczących aspektów charakterystyki linii komórkowych oraz optymalizacji pośrednich i procesów. Zaletą tej techniki jest to, że zapewnia większą kontrolę w kolbach wstrząsowych i umożliwia automatyzację oraz wykonywanie dużej liczby badań na małą skalę w celu szybkiego generowania danych. Procedurę zademonstrują Sai Rashmika Velugula i Casey Kohnhorst, pracownicy naukowi w moim laboratorium.

Zacznij od zanurzenia bulionu trzy razy 10 do siódmych komórek pokazowych na mililitr zamrażarki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy pozostanie tylko mały skrawek lodu, delikatnie odpipetuj szybko rozmrożoną zawiesinę komórkową kilka razy i przenieś jeden mililitr komórek do sterylnej 125-mililitrowej wentylowanej kolby wstrząsającej zawierającej 29 mililitrów pożywki OptiCHO. Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 8% CO2, potrząsając nią z prędkością 130 obr./min.

Hodowla komórek po 72 godzinach w 100 mililitrach świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza w 125-mililitrowej kolbie przędzalniczej przez kolejne 72 godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 8% CO2 z mieszaniem przy 70 obr./min. Trzeciego dnia subhodowli dodać świeżą, wstępnie ogrzaną pożywkę do kolby przędzarki, aby utrzymać komórki na poziomie co najmniej 90% żywotności przez ostatnie 24 godziny hodowli. Następnego ranka kliknij ikonę pulpitu zdalnego i kliknij połącz.

Po podłączeniu zdalnego pulpitu otwórz oprogramowanie licznika komórek i zainstaluj nowy Reagent Pak. Następnie opróżnij korek Trypan Blue i zalej system. Następnie zminimalizuj połączenie zdalne i otwórz oprogramowanie mikro bioreaktora, używając istniejącego eksperymentu jako szablonu do utworzenia nowego eksperymentu.

Przed rozpoczęciem cyklu należy zdefiniować płytki używane podczas przebiegu w sekcji naśladowczej oprogramowania i umieścić 12 sterylnych naczyń hodowlanych w każdej stacji hodowlanej. Umieść autoklawizowane płytki zaciskowe na wierzchu naczyń i umieść płytki mieszające na wierzchu płytek zaciskowych, upewniając się, że każdy kołek jest bezpiecznie włożony. Następnie zabezpiecz clamp płytki za pomocą dostarczonych śrub i końcówek.

Aby uruchomić system, zeskanuj kod kreskowy dostarczony z każdym naczyniem do hodowli. System zainicjuje się i sprawdzi obecność odpowiednich naczyń. Ustaw regulator temperatury na 37 stopni Celsjusza, a mieszanie na 1 000 obr./min i włącz monitor pH tlenu rozpuszczonego.

Następnie uruchom program ładowania średniego. Po załadowaniu całej pożywki, 35 mikrolitrów EX-CELL Antifoam zostanie dodane z płytki Antifoam do naczyń hodowlanych. Po 30 minutach rozpocznij rejestrację rozpuszczonego tlenu i pH w pożywce hodowlanej, pozwalając rozpuszczonemu tlenowi osiągnąć wartość zadaną 50%Po zrównoważeniu rozpuszczonego tlenu włącz dodawanie zasad w tle, aby osiągnąć nastawę pH 7,1 dla wszystkich naczyń hodowlanych.

Następnego ranka wykonaj wstrzymany krok PH i przenieś całą zawartość kolby wirowej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 250 mililitrów w celu odwirowania. Zawiesić osad w wystarczającej ilości świeżego podłoża, aby końcowa gęstość wynosiła od 10 do 6 komórek CHO na mililitr po dodaniu inokulum do naczyń hodowlanych i dodać zawieszone komórki do odpowiednich studzienek sterylnej płytki 24-dołkowej z pokrywką. Dodaj trzy mililitry inokulum do każdej studzienki i umieść płytkę inokulum na wyznaczonym biurku wewnątrz kaptura.

Następnie pozwól naczyniom hodowlanym zrównoważyć się przez co najmniej godzinę i zainicjuj pięć kroków zliczania komórek EX-CELL w programie. Do codziennej analizy składników odżywczych i metabolitów w drugim dniu należy umieścić płytki z uchwytami probówek z próbkami na wyznaczonych pokładach i załadować otwarte probówki do mikrowirówek do odpowiednich uchwytów. Następnie umieść próbki w tacy analizatora, aby przeprowadzić analizę składników odżywczych.

Aby zakończyć bieg, najpierw wyłącz regulację temperatury, a następnie mieszanie. Zatrzymaj kontrolę pH tlenu rozpuszczonego i dodawanie bazy tła, wszystkie inne elementy sterujące i monitor systemu. Odkręć zacisk i mieszaj płytki, wyjmij naczynia hodowlane i wkręć płytki suszące do stacji hodowlanej.

Następnie wykonaj dwugodzinny cykl suszenia w programie; Kliknięcie przycisku Stop w oprogramowaniu bioreaktora po zakończeniu cyklu suszenia. Aby zebrać komórki, przenieś płyn z hodowli komórkowej z naczyń reaktora do odpowiednich stożkowych probówek do odwirowania i przefiltruj supernatanty przez sterylne filtry PVDH o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie przenieś jeden mililitr każdego sterylnego supernatantu do hodowli komórkowej do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra w celu przechowywania w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do analizy miana.

Aby zmierzyć miana IgG próbek, najpierw włącz system biosensorów wspomagających białko. Po ogrzaniu lampy przez co najmniej jedną godzinę, pozwól próbkom zrównoważyć się do temperatury pokojowej i zanurz jedną końcówkę wspomagającą białko na próbkę w pożywce ze świeżymi komórkami przez co najmniej 30 minut. Następnie ustaw temperaturę płyty na 26 stopni Celsjusza.

Załaduj próbki do systemu i uruchom test przy użyciu domyślnego testu o wysokiej czułości z regeneracją w oprogramowaniu do akwizycji danych. Korzystając ze zintegrowanego licznika komórek, można codziennie uzyskiwać średnią gęstość i żywotność żywotnych komórek we wszystkich warunkach hodowli. Za pomocą analizatora składników odżywczych możemy również uzyskać profile składników odżywczych i produktów ubocznych, wykazując możliwość monitorowania tych atrybutów w systemie mikrobioreaktora.

Co więcej, całkowitą produktywność kultur komórkowych w różnych warunkach hodowli można określić ilościowo za pomocą systemu biosensorów wspomagających białko, jak pokazano. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że protokół działa tylko wtedy, gdy programowanie jest wykonane poprawnie; Zapewnienie terminowego wykonywania kroków protokołu przy minimalnych błędach. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak: chromatografia cieczowa, spektrometria mas i wielokątowe rozpraszanie światła, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące właściwości fizycznych i chemicznych wytwarzanego produktu.