Name: Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Poznaj autometalografię do lokalizacji srebra w tkankach wątroby i nerek waleni. Metoda CHAA umożliwia półilościowe oznaczanie srebra, oferując proste i ekonomiczne narzędzie w badaniach toksykologii środowiskowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tajwańskiej Sieci Tkania Waleni za zbieranie i przechowywanie próbek, w tym Tajwańskiej Społeczności Waleni, Tajpej; Laboratorium Badań Waleni (Prof. Lien-Siang Chou), Instytutowi Ekologii i Biologii Ewolucyjnej, Narodowemu Uniwersytetowi Tajwańskiego, Tajpej; Narodowemu Muzeum Nauk Przyrodniczych (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung; oraz Centrum Biologii Morskiej i Badań nad Waleniami, Narodowemu Uniwersytetowi Cheng-Kung. Dziękujemy również Biuru Leśnictwa, Radzie Rolnictwa, Executive Yuan za ich pozwolenie.

Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, a wykorzystanie próbek tkanek waleni zostało zezwolone przez Radę Rolnictwa Tajwanu (pozwolenie na badania 104-07.1-SB-62).
1. Przygotowanie próbek tkanek do analizy ICP-MS
Uwaga: Tkanki wątroby i nerek pobrano od świeżo martwych i umiarkowanie autolizowanych wyrzuconych na brzeg waleni24, w tym od 6 waleni należących do 4 różnych gatunków: 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp. (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Każdy osobnik posiadał numer polowy służący do indywidualnej identyfikacji. Przygotowanie próbek tkanek do analizy ICP-MS przeprowadzono zgodnie z metodą opracowaną w laboratorium M.H. Chen, a sama analiza ICP-MS została wykonana w tymże laboratorium1,13,25.
<ol>
	<li>Pobrać próbki tkanek wątroby i nerek od wyrzuconych na brzeg waleni do analizy ICP-MS i przechowywać je w temperaturze −20 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Pobrać dopasowane pary tkanek wątroby i nerek od tych samych osobników do analizy AMG (patrz krok 2).</li>
	<li>Odciąć zewnętrzną warstwę próbek tkanek przeznaczonych do analizy ICP-MS za pomocą skalpela ze stali nierdzewnej. Wewnętrzną część próbek pociąć na małe kostki (około 1 cm3) i umieścić w plastikowych woreczkach strunowych. Zazwyczaj każdy woreczek zawiera 10 g tkanek.</li>
	<li>Przechowywać plastikowe woreczki z próbkami tkanek w temperaturze −20 °C do dalszych procedur.</li>
	<li>Umieścić próbki w postaci kostek o wymiarach 1 cm3 w systemie liofilizacji (-50 °C, pompa próżniowa o wydajności co najmniej 98 L/min, 0,02 mBar) na co najmniej 72 h, aż do całkowitego wysuszenia, potwierdzonego osiągnięciem stałej masy.</li>
	<li>Zhomogenizować wysuszone kostki do postaci proszku za pomocą homogenizatora w celu późniejszego trawienia tkanek.</li>
	<li>Odważyć 0,3 g zhomogenizowanych próbek liofilizowanych do butelek z politetrafluoroetylenu (PTFE) o pojemności 30 mL i wymieszać z 10 mL 65% w/w kwasu azotowego.</li>
	<li>Zakręcić butelki PTFE, pozostawiając nakrętki lekko poluzowane. 
	Uwaga: Pozwala to na wydzielenie brązowych oparów w butelkach PTFE i ich cofanie wewnątrz butelki podczas trawienia, aż opary znikną i roztwór stanie się klarowny.</li>
	<li>Podgrzewać trawione próbki na płycie grzejnej w butelkach PTFE, zwiększając temperaturę od 30 °C do 10/120 °C (zależnie od warunków powstawania brązowych oparów) przez 2 do 3 tygodni, aż brązowy gaz w butelkach PTFE stanie się bezbarwny, a ciecz w butelkach przybierze przezroczysty, zielonkawy, bladożółty kolor lub stanie się całkowicie przejrzysta. 
	Uwaga: Proces grzania należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Podgrzewać trawione próbki w temperaturze 120 °C, aby odparować kwas azotowy w butelkach PTFE, aż pozostanie jedynie 0,5-1 mL cieczy. 
	Uwaga: Proces grzania należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, stale monitorując wzrost temperatury, aby upewnić się, że z nakrętek butelek PTFE nie wycieka brązowy gaz.</li>
	<li>Dokręcić nakrętki i schłodzić próbki w temperaturze pokojowej przez około 1 h.</li>
	<li>Umieścić lejki z papierami filtracyjnymi na kolbach miarowych o pojemności 25 mL i przepłukać pozostałą ciecz 1 M HNO3 do uzyskania końcowej objętości 25 mL. 
	Uwaga: Butelkę należy przepłukać co najmniej trzy razy, a nakrętkę dwa razy.</li>
	<li>Zwalidować jakość analityczną analizy ICP-MS, wykorzystując certyfikowane materiały odniesienia, w tym DOLT-2 (wątroba rekina) i DORM-2 (mięśnie rekina).</li>
	<li>Do analizy ICP-MS wykorzystać duplikaty każdej próbki analitycznej oraz triplikaty materiałów odniesienia.</li>
	<li>Obliczyć średnie stężenia Ag dla każdej próbki analitycznej i przedstawić dane jako stężenie w przeliczeniu na masę suchą (μg/g masy suchej).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek tkanek do analizy AMG
<ol>
	<li>Pobrać od osiadłego walenia dopasowane pary tkanek wątroby i nerek do analizy AMG i utrwalić je w 10% neutralnym buforowanym formalinie do czasu użycia. 
	Uwaga: Próbki tkanek należy przechowywać w plastikowych butelkach w 10% neutralnym buforowanym formalinie (NBF, pH 7,0) przez 24 do 48 godzin. Objętość NBF powinna być co najmniej 10 razy większa niż objętość tkanki.</li>
	<li>Przyciąć utrwalone w formalinie tkanki wątroby i nerek za pomocą jednorazowych stalowych ostrzy mikrotomicznych i umieścić przycięte fragmenty tkanek w opisanych kasetkach. 
	Uwaga: Rozmiar każdego fragmentu tkanki powinien wynosić około 2 cm x 1 cm, a grubość każdego fragmentu nie powinna przekraczać 3 mm. Tkanki wątroby i nerek od tego samego osobnika należy umieścić w jednej kasetce.</li>
	<li>Odwodnić przycięte fragmenty tkanek w procesorze tkanek poprzez serię roztworów etanolu o różnym stężeniu (70% przez 1 h, 80% przez 1 h, 95% przez 1 h, 95% przez 2 h, 10% przez 1 h w 2 różnych naczyniach do barwienia oraz 100% przez 2 h), zamienniku ksylenu (przez 1 h i 2 h w różnych naczyniach do barwienia), a następnie zanurzyć odwodnione próbki tkanek w parafinie (przez 1 h i 2 h w różnych naczyniach do barwienia).</li>
	<li>Umieścić odwodnione próbki tkanek na dnie stalowych form histologicznych i zalać je parafiną.</li>
	<li>Schłodzić bloki tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) na blacie chłodzącym, aż parafina stwardnieje. Przyciąć bloki FFPE za pomocą mikrotomu, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta.</li>
	<li>Schłodzić bloki FFPE w temperaturze −20 °C przez 10 min. Wykonać seryjne cięcia bloków FFPE o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Napełnić kąpiel wodną wodą dwukrotnie destylowaną o temperaturze 45 °C. Podnieść taśmy z przekrojami tkanek i ułożyć je na powierzchni ciepłej wody za pomocą pęset i pędzli.</li>
	<li>Rozdzielić taśmy z przekrojami tkanek pęsetą. Umieścić przekrój na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Umieścić szkiełka mikroskopowe w suszarce do szkiełek i pozostawić przekroje do wyschnięcia przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić szkiełka mikroskopowe w koszykach i odparafinizować, zanurzając je w 3 różnych naczyniach do barwienia z czystym zamiennikiem ksylenu (około 20 do 250 mL) przez odpowiednio 8, 5 i 3 min.</li>
	<li>Nawodnić przekroje tkanek w koszykach, zanurzając je w różnych naczyniach do barwienia z roztworami etanolu o różnym stężeniu (dwukrotnie w 10% etanolu, raz w 90% etanolu i raz w 80% etanolu [po 1 min każde]), a następnie opłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej. 
	Uwaga: Roztwory te mają objętość około 20 do 250 mL w różnych naczyniach do barwienia. Dla każdego przemycia wystarczy 30 s.</li>
	<li>Opłukać przekroje tkanek w buforze fosforanowym (PBS) z 0,5% Triton X-10, kilkakrotnie przemyć w PBS, a następnie opłukać w wodzie dwukrotnie destylowanej. 
	Uwaga: Roztwory te mają objętość około 20 do 250 mL w różnych naczyniach do barwienia. Dla każdego przemycia wystarczy 30 s.</li>
	<li>Przygotować w ciemności równe ilości trzech komponentów (inicjatora, moderatora i aktywatora) dostarczonych w zestawie do wzmacniania srebrem i dokładnie je wymieszać. 
	Uwaga: Roztwory moderatora i aktywatora są lepkie, dlatego należy używać pipet z szerokimi końcówkami (lub odciąć końcówki, aby stworzyć szersze otwory). Dla każdego szkiełka zazwyczaj wystarcza 30 μL zmieszanego roztworu (w zależności od wielkości przekroju tkanki). Zatem przy użyciu 10 szkiełek ilość każdego komponentu (inicjatora, moderatora i aktywatora) wynosi 100 μL (całkowita objętość zmieszanego roztworu dla 10 szkiełek to 30 μL).</li>
	<li>Inkubować przekroje tkanek w zmieszanym roztworze przez 15 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Całkowicie pokryć przekroje tkanek na szkiełkach zmieszanym roztworem. Dłuższy czas inkubacji może prowadzić do fałszywie dodatnich sygnałów AMG.</li>
	<li>Przemyć szkiełka wodą dwukrotnie destylowaną i wybarwić hematoksyliną przez 10 s jako barwienie kontrastowe.</li>
	<li>Przemyć szkiełka bieżącą wodą z kranu, wysuszyć i zamontować za pomocą medium montażowego.</li>
	<li>Zbadać szkiełka pod mikroskopem świetlnym.</li>
	<li>Losowo przechwycić dziesięć obrazów histologicznych z każdego przekroju tkanki przy użyciu obiektywu 40X, wykorzystując podłączoną kamerę cyfrową z oprogramowaniem do analizy obrazu.</li>
</ol>
3. Analiza półilościowa obrazów histologicznych w celu wyznaczenia dodatnich wartości AMG
Uwaga: Wartość dodatnia AMG oznacza procent powierzchni z sygnałami dodatnimi dla AMG.
<ol>
	<li>Do analizy obrazów histologicznych należy wykorzystać oprogramowanie do analizy obrazu (ImageJ).</li>
	<li>Otwórz obraz histologiczny, wybierając File | Open.</li>
	<li>Rozdziel wybrany obraz na trzy kanały kolorystyczne (czerwony, niebieski i zielony), wybierając Image | Type | RGB Stack.</li>
	<li>Ilościowo określ sygnały pozytywne dla AMG, korzystając z kanału niebieskiego. Sygnały fałszywie dodatnie w jądrach są zazwyczaj zredukowane w kanale niebieskim, gdy do kontrastowania jąder zastosowano barwienie hematoksyliną (Rycina 2).</li>
	<li>Zmierz procent powierzchni z sygnałami pozytywnymi dla AMG na każdym obrazie histologicznym za pomocą narzędzia progowania (Image | Adjust | Threshold).</li>
	<li>Ręcznie dostosuj wartość odcięcia progu dla każdego obrazu histologicznego (od 90 do 10) w zależności od obecności obszarów fałszywie dodatnich w jądrach i/lub erytrocytach. 
	Uwaga: W ustawieniach domyślnych sygnały pozytywne dla AMG powinny być podświetlone na czerwono.</li>
	<li>Wybierz Analyze | Set Measurements i zaznacz pole Area Fraction, aby określić, że rejestrowana ma być frakcja powierzchni.</li>
	<li>Wybierz Analyze | Measure. Procentowy obszar pozytywny każdego obrazu histologicznego zostanie wyświetlony w kolumnie %Area w oknie Result.</li>
	<li>Oblicz średnią procentową powierzchnię pozytywną z 10 obrazów histologicznych dla każdego przekroju tkanki i przyjmij ten wynik jako wartość pozytywną dla AMG dla każdego przekroju tkanki.</li>
</ol>
<img alt="Obraz mikroskopowy, podział kanałów kolorów; niebieski PPA 6,32, zielony 8,05, czerwony 6,76; schemat analizy komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Obecność fałszywie dodatnich sygnałów jądrowych w różnych kanałach kolorystycznych (kontrastowe barwienie: hematoksylina). Reprezentatywne fałszywie dodatnie sygnały jądrowe zaznaczono żółtymi strzałkami. PPA = procent dodatnich obszarów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Ustanowienie histologicznego testu przeciwciał dla waleni (CHAA) za pomocą modelu regresji
Uwaga: Poniższa analiza została przeprowadzona w programie Prism 6.01 dla systemu Windows.
<ol>
	<li>Oceń korelację pomiędzy wynikami ICP-MS a wartościami dodatnimi AMG.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie, utwórz nowy plik projektu i wybierz XY oraz Korelacja (Correlation).</li>
	<li>Wprowadź dane, w tym wyniki ICP-MS oraz wartości dodatnie AMG.</li>
	<li>Naciśnij Analiza (Analysis) i wybierz Korelacja (Correlation) w kategorii Analiza XY (XY Analysis), aby przeanalizować siłę powiązania między wynikami ICP-MS a wartościami dodatnimi AMG za pomocą analizy korelacji Pearsona. 
	Uwaga: Wyniki ICP-MS i wartości dodatnie AMG muszą być ze sobą dodatnio skorelowane; w przeciwnym razie nie należy opracowywać kolejnego modelu regresji.</li>
	<li>Statystycznie porównaj modele regresji, w tym regresję liniową, kwadratową, sześcianową oraz regresję liniową przechodzącą przez początek układu współrzędnych, korzystając z oprogramowania statystycznego12,26,27. 
	Uwaga: Jeśli model regresji generuje nierealistyczne stężenie Ag, należy go odrzucić12.</li>
	<li>Wróć do tabeli danych (lewy panel) i wybierz Analiza (Analysis) | Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) (Nonlinear regression (curve fit)) w kategorii Analiza XY (XY Analysis) | OK.</li>
	<li>W oknie Parametry: Regresja nieliniowa (Parameters: Nonlinear regression) wybierz odpowiedni model regresji na stronie Dopasowanie (Fit), a następnie porównaj różne modele regresji na stronie Porównaj (Compare).</li>
	<li>Na stronie Porównaj (Compare) wybierz metody porównawcze, w tym test F dla nadmiarowej sumy kwadratów oraz kryterium informacyjne Akaike (AIC). Na podstawie wyników metod porównawczych zastosuj stosowny model regresji w metodzie CHAA.</li>
	<li>Oszacuj stężenia Ag w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanym stężeniu Ag, korzystając z metody CHAA.</li>
	<li>Oceń dokładność i precyzję metody CHAA dla tkanek wątroby i nerek. Różnica między precyzją a dokładnością została przedstawiona na Rysunku 3.</li>
	<li>Dokładność: Oblicz średnie odchylenie standardowe (SD) z różnic pomiędzy znanymi a oszacowanymi stężeniami Ag.</li>
	<li>Precyzja: Przeprowadź pomiary wielokrotne (co najmniej w trzech powtórzeniach) wartości dodatnich AMG dla seryjnych skrawków z tych samych tkanek FFPE. Oblicz średnie SD pomiarów z tkanek wątroby lub nerek z różnic pomiędzy znanymi a oszacowanymi stężeniami Ag. 
	Uwaga: Metody oceny dokładności i precyzji przedstawiono na Rysunku 4.</li>
</ol>
<img alt="Schemat koncepcyjny precyzji i dokładności; wykresy tarcz ilustrujące dane precyzyjne i nieprecyzyjne oraz dokładne i niedokładne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Różnica między dokładnością a precyzją. Dokładność określa, jak blisko wartości rzeczywistej znajduje się pomiar (t. j. stężenie Ag oznaczone metodą ICP-MS); precyzja oznacza powtarzalność pomiaru (t. j. spójność powtarzalnych pomiarów dodatnich wartości AMG z trzech powtórzeń próbek tkanek). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres stężenia Ag w próbkach tkanek; metoda ICP-MS i CHAA; wzory na dokładność i precyzję." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schemat przedstawiający metody oceny dokładności i precyzji. CHAA = analiz biologicznych Ag u waleni; FFPE = utrwalone formaliną i zatopione w parafinie; ICP-MS = spektrometria mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej; Ai = każda z wartości stężeń Ag wyznaczonych metodą ICP-MS dla każdej dopasowanej pary próbek tkanek; Bi = każda z wartości stężeń Ag oszacowanych metodą CHAA dla każdej dopasowanej pary próbek tkanek; Ci, Di i Ei = każda z wartości stężeń Ag oszacowanych metodą CHAA dla próbek wykonanych w trzech powtórzeniach dla każdej dopasowanej pary próbek tkanek; i = od 1 do n. Surowe dane z testów dokładności i precyzji znajdują się w sekcji wyników reprezentatywnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Oznaczanie stężenia Ag metodą CHAA.
<ol>
	<li>Pobrać tkankę wątroby i nerek od wyrzuconych na brzeg waleni i utrwalić je w 10% neutralnym buforowanym formalinie.</li>
	<li>Przetworzyć utrwalone w formalinie tkanki w sposób rutynowy (patrz krok 2).</li>
	<li>Oszacować stężenia Ag w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanym stężeniu Ag za pomocą CHAA (patrz kroki 3 i 4).</li>
</ol>

<ol><li>McGillicuddy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+in+the+environment%3A+Sources%2C+detection+and+ecotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology.</a> Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).</li>
<li>Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Processes+and+Impacts%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles in the environment.</a> Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).</li>
<li>Hansen, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoproducts-+what+is+actually+available+to+European+consumers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanoproducts- what is actually available to European consumers?</a> Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).</li>
<li>Vance, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+the+real+world%3A+Redeveloping+the+nanomaterial+consumer+products+inventory%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).</li>
<li>Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+and+analysis+of+nanomaterials+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).</li>
<li>Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+of+silver+nanomaterials+in+the+aquatic+environment%3A+a+review+of+literature+and+gaps+in+nano-toxicological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Science+and+Health.+Part+A%2C+Toxic%2Fhazardous+Substances+%26+Environmental+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research.</a> Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).</li>
<li>Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+transformations+of+silver+nanoparticles%3A+impact+on+stability+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity.</a> Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).</li>
<li>Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+environmental+impact+of+nanosilver%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Predicting the environmental impact of nanosilver.</a> Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity%2C+bioaccumulation%2C+and+biotransformation+of+silver+nanoparticles+in+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms.</a> Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).</li>
<li>Buffet, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+marine+mesocosm+study+on+the+environmental+fate+of+silver+nanoparticles+and+toxicity+effects+on+two+endobenthic+species%3A+the+ragworm+Hediste+diversicolor+and+the+bivalve+mollusc+Scrobicularia+plana%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana.</a> Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).</li>
<li>Chen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+metal+concentrations+in+sediments+and+fish%2C+and+the+determination+of+bioindicators+in+the+subtropical+Chi-ku+Lagoon%2C+S+W+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Pollution+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan.</a> Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).</li>
<li>Li, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+silver+%28Ag%29+deposition+in+tissues+from+stranded+cetaceans+by+autometallography+%28AMG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG).</a> Environmental Pollution. , 534-545 (2018).</li>
<li>Chen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+concentrations+of+four+Taiwanese+toothed+cetaceans+indicating+the+silver+and+cadmium+pollution+in+the+western+Pacific+Ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Pollution+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean.</a> Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).</li>
<li>Li, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotoxicity+of+silver+nanoparticles+%28AgNPs%29+on+the+leukocytes+of+common+bottlenose+dolphins+%28Tursiops+truncatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus).</a> Scientific Reports. , In Press (2018).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sample+preservation+methods+for+clinical+trace+element+analysis+by+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).</li>
<li>Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+sample+preparation+strategies+for+biological+tissues+and+subsequent+trace+element+analysis+using+LA-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).</li>
<li>Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+formalin+fixation+and+tissue+embedding+of+bovine+liver+on+copper%2C+iron%2C+and+zinc+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).</li>
<li>Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Autometallography+in+Studies+of+Nanosilver+Distribution+and+Toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity.</a> International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).</li>
<li>Anderson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+persistence+and+clearance+of+aerosolized+silver+nanoparticles+in+the+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung.</a> Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).</li>
<li>Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+study+of+gender+differences+in+accumulation+of+silver+nanoparticles+in+kidneys+of+Fischer+344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health%2C+Part+A%22%5BJournal%5D)">Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).</li>
<li>Danscher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+autometallography+to+heavy+metal+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Applications of autometallography to heavy metal toxicology.</a> Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).</li>
<li>Deroulers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+huge+pathology+images+with+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Analyzing huge pathology images with open source software.</a> Diagnostic Pathology. 8, 92(2013).</li>
<li>Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+colour+models%3A+an+automated+digital+image+analysis+method+for+quantification+of+histological+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers.</a> BioMedical Engineering Online. 15, 46(2016).</li>
<li>Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeraci%2C+JR+%22Marine+mammals+ashore%3A+a+field+guide+for+strandings%22">Marine mammals ashore: a field guide for strandings</a>. , National Aquarium. Baltimore. 167-230 (2005).</li>
<li>Shih, C. -C., Liu, L. -L., Chen, M. -H., Wang, W. -H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShih%2C+C-C+%22Investigation+of+heavy+metal+bioaccumulation+in+dolphins+from+the+coastal+waters+off+Taiwan%22">Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan</a>. , National Sun Yat-sen University. Kaohsiung. (2001).</li>
<li>Liang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+the+striatal+dopamine+transporter+and+novelty+seeking+and+cognitive+flexibility+in+opioid+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuro-Psychopharmacology+and+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).</li>
<li>Spiess, A. N., Neumeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+R2+as+an+inadequate+measure+for+nonlinear+models+in+pharmacological+and+biochemical+research%3A+a+Monte+Carlo+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach.</a> BMC Pharmacology. 10, 6(2010).</li>
<li>Stoltenberg, M., Danscher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+differentiation+of+autometallographically+traceable+metals+%28Au%2C+Ag%2C+Hg%2C+Bi%2C+Zn%29%3A+protocols+for+chemical+removal+of+separate+autometallographic+metal+clusters+in+Epon+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections.</a> Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).</li>
<li>Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Hg+and+Pb+in+the+palps%2C+the+digestive+gland+and+the+gills+in+Mytilus+galloprovincialis+%28L.%29+using+autometallography+and+X-ray+microanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis.</a> Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).</li>
<li>Loumbourdis, N. S., Danscher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autometallographic+tracing+of+mercury+in+frog+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Autometallographic tracing of mercury in frog liver.</a> Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).</li>
<li>Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autometallographic+tracing+of+mercury+in+pilot+whale+tissues+in+the+Faroe+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Circumpolar+Health%22%5BJournal%5D)">Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands.</a> International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem pracy w artykule jest opracowanie metody adiuwantowej do oceny rozmieszczenia Ag na poziomie podnarządowym oraz oszacowanie stężeń Ag w tkankach waleni. Obecne protokoły obejmują: 1) Oznaczanie stężeń Ag w tkankach waleni za pomocą ICP-MS, 2) Analizę AMG próbek tkanek dopasowanych parami o znanych stężeniach Ag, 3) Ustanowienie modelu regresji (CHAA) do szacowania stężeń Ag za pomocą dodatnich wartości AMG, 4) Ocenę dokładności i precyzji CHAA oraz 5) Oszacowanie stężeń Ag za pomocą CHAA.
<p class="jove_content...

Nanocząsteczki srebra (AgNPs) są szeroko stosowane w produktach komercyjnych, w tym w tekstyliach, kosmetykach i artykułach pielęgnacyjnych, ze względu na ich silne działanie przeciwdrobnoustrojowe1,2. W związku z tym produkcja AgNPs oraz liczba produktów zawierających AgNPs zwiększają się w czasie3,4. Jednakże AgNPs mogą przedostawać się do środowiska i gromadzić się w oceanach5,6. Stały się one głównym źródłem zanieczyszczenia srebrem, a świadomość publiczna na temat toksyczności środowiskowej Ag rośnie.
Status AgNPs oraz Ag w środowisku morskim jest złożony i nieustannie się zmienia. Poprzednie badania wskazały, że AgNPs mogą pozostawać w formie cząstek, agregować, rozpuszczać się, reagować z różnymi gatunkami chemicznymi lub być regenerowane z jonów Ag+7,8. W osadach morskich znaleziono kilka rodzajów związków Ag, takich jak AgCl, które mogą być pochłaniane przez organizmy bentosowe i wnikać do łańcucha pokarmowego9,10. Zgodnie z poprzednim badaniem przeprowadzonym w obszarze laguny Chi-ku wzdłuż południowo-zachodniego wybrzeża Tajwanu, stężenia Ag w osadach morskich są niezwykle niskie i zbliżone do obfitości skorupowej, a stężenia w tkance wątroby ryb zazwyczaj znajdują się poniżej granicy wykrywalności (&lt; 0,025 μg/g masa mokra/masa mokra)1. Jednakże badania przeprowadzone w różnych krajach wykazały stosunkowo wysokie stężenia Ag w wątrbach waleni12,13. Stężenie Ag w wątrbach waleni jest zależne od wieku, co sugeruje, że źródłem Ag w ich organizmach są najprawdopodobniej ich ofiary12. Wyniki te dodatkowo sugerują biomagnifikację Ag u zwierząt na wyższych poziomach troficznych. Walenie, jako drapieżniki szczytowe w oceanach, mogły doznać negatywnych skutków zdrowotnych spowodowanych przez Ag/związki Ag12,13,14. Co najważniejsze, podobnie jak walenie, ludzie są ssakami, a negatywne skutki zdrowotne wywołane przez Ag/związki Ag u waleni mogą wystąpić również u ludzi. Innymi słowy, walenie mogłyby pełnić rolę zwierząt wskaźnikowych dla zdrowia środowiska morskiego i ludzi. Dlatego też efekty zdrowotne, dystrybucja tkankowa i stężenie Ag u waleni budzą duże zainteresowanie.
Choć stężenia związków Ag/Ag w tkankach waleni można zmierzyć za pomocą spektrometrii mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS), zastosowanie ICP-MS jest ograniczone przez wysokie koszty kapitałowe (instrumentu i konserwacji) oraz wymagania dotyczące przechowywania i przygotowania tkanek12,15. Ponadto w przypadku wszystkich dochodzeń dotyczących wyrzuconych na brzeg waleni zazwyczaj trudno jest zebrać kompleksowe próbki tkanek ze względu na trudności logistyczne, brak personelu oraz niedobór odpowiednich zasobów12. Zamrożone próbki tkanek do analizy ICP-MS nie są łatwe do przechowywania z powodu ograniczonej przestrzeni w chłodniach, a próbki te mogą zostać utracone w wyniku awarii sprzętu chłodniczego12. Wspomniane przeszkody utrudniają badanie poziomu zanieczyszczeń w tkankach waleni metodą ICP-MS z wykorzystaniem zamrożonych próbek tkanek. W przeciwieństwie do nich, próbki tkanek utrwalone w formalinie są stosunkowo łatwe do pobrania podczas nekropsji martwych waleni wyrzuconych na brzeg. W związku z tym konieczne jest opracowanie łatwej w użyciu i niedrogiej metody wykrywania i pomiaru metali ciężkich w tkankach waleni z wykorzystaniem próbek utrwalonych w formalinie.
Chociaż rozkłady w obrębie narządów oraz stężenia metali alkalicznych i alkalicznych ziem mogą ulec zmianie podczas procesu utrwalania w formalinie i zatapiania w parafinie (FFPE), odnotowano jedynie niewielkie efekty w przypadku metali przejściowych, takich jak Ag16. W związku z tym tkanka FFPE jest uważana za idealny materiał do lokalizacji i pomiaru metali16,17. Autometalografia (AMG), proces histochemiczny, pozwala na uwidocznienie metali ciężkich w postaci sygnałów AMG-dodatnich o różnej wielkości i barwie od złocistożółtej do czarnej w przekrojach tkanek FFPE, a te wzmocnione sygnały metali ciężkich można wizualizować pod mikroskopem świetlnym18,19,20,21. Zatem metoda AMG dostarcza informacji o rozkładzie metali ciężkich w obrębie narządów. Może ona dostarczyć istotnych dodatkowych informacji do badania szlaków metabolicznych metali ciężkich w systemach biologicznych, ponieważ ICP-MS pozwala na pomiar stężenia metali ciężkich jedynie na poziomie całego narządu18. Ponadto oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu, takie jak ImageJ, jest stosowane do ilościowej analizy histologicznych przekrojów tkanek2,23. Złocistożółte do czarnych sygnały AMG-dodatnie o różnej wielkości w przekrojach tkanek FFPE mogą zostać poddane kwantyfikacji i wykorzystane do szacowania stężeń metali ciężkich. Chociaż absolutne stężenie Ag nie może być bezpośrednio wyznaczone metodą AMG z analizą ilościową obrazu, można je oszacować za pomocą modelu regresji opartego na danych uzyskanych z ilościowej analizy obrazu oraz ICP-MS, co nazwano histologicznym oznaczeniem Ag u waleni (CHAA). Biorąc pod uwagę trudności w pomiarze stężeń Ag za pomocą analizy ICP-MS u większości wyrzuconych na brzeg waleni, CHAA jest wartościową metodą pomocniczą do szacowania stężeń Ag w tkankach waleni, których nie można oznaczyć metodą ICP-MS ze względu na brak zamrożonych próbek tkanek. Niniejsza publikacja opisuje protokół techniki histochemicznej (metody AMG) służącej do lokalizacji Ag na poziomie podorganowym oraz procedurę o nazwie CHAA do szacowania stężeń Ag w tkankach wątroby i nerek waleni.
<img alt="Proces analizy tkanek waleni; model regresji; stężenie Ag; wyniki ICP-MS; oprogramowanie ImageJ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający opracowanie i zastosowanie histologicznego testu Ag dla waleni (CHAA) w celu szacowania stężeń Ag. CHAA = test histologiczny przeciwciał dla waleni, FFPE = utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie, ICP-MS = spektrometria mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>HQ Srebrny zestaw wzmacniający</td><td>Nanosondy</td><td>#2012</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Parafina</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>4026</td><td></td></tr><tr><td>Non-Xylene</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>4328</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica pokryta silanem</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>511614</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (25 x 50 mm)</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>24501</td><td></td></tr><tr><td>Malinol</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>20092</td><td></td></tr><tr><td>GM Barwienie hematoksyliną</td><td>Muto Pure Chemical Co., Ltd</td><td>3008-1</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralny buforowany roztwór formaliny</td><td>Chin I Pao Co., Ltd</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Tip (1000 &mu; L)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN Klasyczny P1000</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td>F123602</tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>GeneDireX, Inc.</td><td>PC115-0500</td><td></td></tr><tr><td>Wątroba kolenia</td><td>Narodowa Rada ds. Badań Naukowych Kanady</td><td>DOLT-2</td><td></td></tr><tr><td>Mięsień kolenia</td><td>Krajowa Rada ds. Badań Naukowych Kanady</td><td>DORM-2</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>PE-SCIEX ELAN 6100 DRC</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 6-litrowy system liofilizacji</td><td>Labconco</td><td>7752030</td><td>Do liofilizacji</td></tr><tr><td>MARKA&reg; Kolba miarowa SILBERBRAND</td><td>Merck</td><td>Z326283</td><td></td></tr><tr><td>30 ml fiolka standardowa, płaskie wnętrze z zamknięciem 33 mm</td><td>Savillex Corporation</td><td>200-030-12</td><td>Do diagestii</td></tr><tr><td>Kwas azotowy, superpur&reg;, 65.0%</td><td>Merck</td><td>1.00441</td><td>Do diagestii</td></tr><tr><td>Gorąca płyta/mieszadła</td><td>Corning&reg;</td><td>PC-220</td><td>Do diagestii</td></tr><tr><td>Mieszalnik laboratoryjny o wysokim ścinaniu</td><td>Silverson</td><td>SL2T</td><td>Do homogenizacji</td></tr><tr><td>Sterylny słoik na próbki polipropylenowe (250 ml)</td> <td>Thermo Scientific&trade;</td><td>6186L05</td><td>Do homogenizacji</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Nikon Corporation</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Nikon Corporation</td><td>ECLIPSE Ni-U</td><td></td></tr><tr><td>Shandon&trade; Fizyna i handel; 325 ręczny mikrotom</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>A78100001H</tr><tr><td>Akumulator Cut&reg; SRM i handel; 200 mikrotom obrotowy</td><td>Sakura</td><td>1429</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu S35</td><td>FEATHER&reg;</td><td>207500000</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia szkiełek i pokrywa</td><td>Laboratoria Badań Mózgu</td><td>#3215</td><td></td></tr><tr><td>Stalowy stojak do barwienia</td><td>Laboratoria Badań Mózgu</td><td>#3003</td><td></td></tr><tr><td>Centrum zatapiania Shandon</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>S-EC</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytadela & reg; przetwórca tkanek</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>69800003</tr><tr><td>Podgrzewacz do slajdów</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>26005</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Shandon Capshaw</td><td>3964</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Merck</td><td>1541-070</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6.01 dla systemu Windows</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> GraphPad <td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stal nierdzewna forma do zatapiania tkanek</td><td>Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd</td><td>RD-TBM003</td><td>Do emeddingu parafiny</td></tr></tbody></table>

zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

Nanocząsteczki srebra (AgNPs) są szeroko stosowane w produktach komercyjnych, w tym w tekstyliach, kosmetykach i artykułach ochrony zdrowia, ze względu na ich silne działanie przeciwbakteryjne. Mogą one również być uwalniane do środowiska i gromadzić się w oceanie. W związku z tym AgNPs są głównym źródłem zanieczyszczenia AgNP, a świadomość społeczna na temat toksyczności Ag dla środowiska rośnie. Wcześniejsze badania wykazały bioakumulację (u producentów) i powiększenie (u konsumentów/drapieżników) Ag., jako szczytowe drapieżniki oceanu, mogły być pod negatywnym wpływem związków Ag/Ag. Chociaż stężenia związków Ag/Ag w tkankach waleni można mierzyć za pomocą spektroskopii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS), zastosowanie ICP-MS jest ograniczone ze względu na wysoki koszt kapitałowy i wymóg przechowywania/przygotowania tkanek. Dlatego metoda autometalografii (AMG) z obrazową analizą ilościową przy użyciu tkanki utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE) może być metodą adiuwantową do lokalizacji dystrybucji Ag na poziomie podnarządowym i oszacowania stężenia Ag w tkankach waleni. Sygnały dodatnie AMG to głównie brązowe do czarnych granulki o różnych rozmiarach w cytoplazmie bliższego nabłonka kanalików nerkowych, hepatocytów i komórek Kupffera. Czasami w świetle i błonie podstawnej niektórych bliższych kanalików nerkowych obserwuje się amorficzne złotożółte do brązowych sygnały dodatnie AMG. Test do szacowania stężenia Ag nosi nazwę Cetacean Histological Ag Assay (CHAA), który jest modelem regresji ustalonym na podstawie danych z obrazowej analizy ilościowej metody AMG i ICP-MS. Wykorzystanie AMG z CHAA do lokalizacji i półkwantyfikacji metali ciężkich stanowi wygodną metodologię dla badań czasoprzestrzennych i międzygatunkowych.

Reprezentatywne obrazy sygnałów dodatnich AMG w tkankach wątroby i nerek waleni przedstawiono na Rysunku 5. Sygnały dodatnie AMG obejmują brązowe lub czarne ziarnistości o różnej wielkości w cytoplazmie nabłonka cewien proximalnych nerek, hepatocytów i komórek Kupffera. Sporadycznie w świetle i błonie podstawnej niektórych cewek proximalnych nerek odnotowano amorficzne, złotożółte lub brązowe sygnały dodatnie AMG. Występuje dodatnia korelacja między wynikami ...

Przedstawiono protokół lokalizacji Ag w tkankach wątroby i nerek waleni za pomocą autometalografii. Ponadto opracowano nowy test, nazwany histologicznym testem Ag waleni (CHAA) w celu oszacowania stężeń Ag w tych tkankach.

Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu toksykologii środowiskowej dotyczące rozmieszczenia podnarządów i stężenia metali ciężkich w układach biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że AMG jest łatwą w użyciu i niedrogą metodologią, która jest cennym adiuwantem do badania metali ciężkich w tkankach. Używamy tkanek delfinów i wielorybów, aby zademonstrować protokół.Uważamy jednak, że protokół może być stosowany u różnych gatunków zwierząt. Procedurę z użyciem Wen-Ta Li zademonstruje Shun Theng, klinicysta z naszego instytutu. Zacznij od pobrania dopasowanych parami tkanek wątroby i nerek do analizy AMG od osieroconych waleni i utrwalenia tkanki w 10-krotności objętości 10% neutralnej buforowanej formaliny przez 24 do 48 godzin.Następnie użyj jednorazowych ostrzy mikrotomów ze stali nierdzewnej, aby przyciąć tkanki wątroby i nerek utrwalone formaliną na odcinki o wymiarach dwa centymetry na jeden centymetr, trzy milimetry i umieść zarówno odcinki wątroby, jak i nerek od tej samej osoby w tych samych oznaczonych kasetach. Odwodnić skrawki w procesorze tkanek poprzez serię stopniowanych zanurzeń w etanolu i ksylenie, a następnie jednogodzinne i dwugodzinne zanurzenia w parafinie. Po dwugodzinnym zanurzeniu w parafinie przenieś tkanki na dno stalowych form histologicznych i zanurz odwodnione próbki tkanek w świeżej stopionej parafinie.Schłodź utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie bloki tkanek na zimnej płytce, aż parafina zastygnie, i przycinaj każdy blok w mikrotomie, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta. Schłodzić próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut i uzyskać pięciomikrometrowe skrawki tkanek na mikrotomie. Za pomocą pęsety i szczoteczki podnieś wstęgi sekcji tkanki w miarę ich pozyskiwania i unieś je na powierzchni podwójnie destylowanej kąpieli wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza, aż będzie można je oddzielić i umieścić na poszczególnych szkiełkach mikroskopowych.Następnie umieść szkiełka na podgrzewaczu do szkiełek na godzinę w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie umieść szkiełka w stojakach na szkiełka i odparafinowaj skrawki w trzech różnych naczyniach barwiących zawierających od 200 do 250 mililitrów czystego nie-ksylenu na osiem, pięć i trzy minuty inkubacji. Uwodnić odparrafinowaizowane próbki w różnych naczyniach do barwienia z sortowanymi roztworami etanolu, a następnie spłukać w wodzie podwójnie destylowanej.Opłucz sekcje raz w PBS uzupełnionym 5%Triton X 100, kilka razy w samym PBS i jeden raz w świeżej podwójnie destylowanej wodzie przez 30 sekund na pranie. Po ostatnim praniu oznacz każdą próbkę 300 mikrolitrami roztworu zestawu do wzbogacania mieszanego srebra, nie dłużej niż 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka wodą podwójnie destylowaną i przeciwbarwić skrawki w 300 mikrolitrach hematoksyliny na szkiełko przez 10 sekund.Umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu. Wysusz je i zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego. Następnie uchwyć 10 losowych obrazów histologicznych każdego odcinka tkanki pod obiektywem 40X mikroskopu świetlnego.Aby przeanalizować dodatnią autometalografię (AMG) próbek, otwórz obrazy w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz obraz, typ i stos RGB, aby podzielić pierwszy obraz na kanały koloru czerwonego, niebieskiego i zielonego. W kanale niebieskim wybierz obraz, regulację i próg, aby zmierzyć procent obszaru z sygnałami AMG-dodatnimi na każdym obrazie, ręcznie dostosowując wartość odcięcia dla progu każdego obrazu na podstawie obecności fałszywie dodatnich obszarów w jądrach lub czerwonych krwinek. Kliknij przycisk Analizuj, ustaw pomiary i sprawdź ułamek powierzchni, aby określić, że ma być rejestrowany ułamek powierzchniowy.Kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby wyświetlić dodatni obszar procentowy każdej kolumny procentowej powierzchni obrazu histologicznego w oknie wyników. Aby ocenić korelację między wynikami spektroskopii mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie a wartościami dodatnimi AMG, otwórz odpowiednie oprogramowanie do tworzenia wykresów. Utwórz nowy plik projektu i wybierz opcję XY i korelacja.Wprowadź wyniki spektroskopii mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie i analiz AMG, a następnie wybierz analizę i korelację, aby przeanalizować siłę związku między wynikami analizy za pomocą analizy korelacji Pearsona. W oknie parametrów, regresja nieliniowa wybierz inny model regresji na stronie dopasowania i wybierz metody porównania na stronie porównania. Uwzględnij dodatkową sumę kwadratów testu F i kryterium informacyjne Akaike.Zgodnie z wynikami metod porównawczych należy wybrać względnie odpowiedni model regresji w histologicznym teście srebra u waleni i użyć testu do oszacowania stężenia srebra w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanych stężeniach srebra. Sygnały AMG-dodatnie obejmują różnej wielkości, brązowe do czarnych ziarnistości w cytoplazmie hepatocytów i komórek Kupffera oraz sporadyczne amorficzne, złocistożółte do brązowych sygnały AMG-dodatnie w świetle i błonie podstawnej niektórych proksymalnych kanalików nerkowych. Istnieje dodatnia korelacja między wynikami spektroskopii mas osocza sprzężonego indukcyjnie a wartościami dodatniego AMG w analizowanych tkankach wątroby i nerek, z preferowaną regresją liniową przez początek, zgodnie z dodatkową sumą kwadratów testu F, a kryterium informacyjnym Akaikego.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że metoda AMG jest metodą adiuwantową i musi być stosowana z innymi specyficznymi metodami, takimi jak ICPMS, do monitorowania rzeczywistego składu metali ciężkich w tkankach.

use-autometallography-to-localize-semi-quantify-silver-cetacean

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Hare, D. J., et.al.  Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje zastosowanie spektrometrii mas plazmy sprzężonej indukcyjnie z ablacją laserową (LA-ICP-MS) do wizualizacji i ilościowego określenia rozkładu metali w tkance mózgowej myszy. Protokół obejmuje ablację laserową w celu wytworzenia aerozolu cząstek próbki, jonizację cząstek w plazmie wysokotemperaturowej...

Spektrometria mas plazmy sprzężonej z ablacją laserową do wizualizacji metali w tkance mózgowej myszy

Ten artykuł przedstawia metody używane do badania przestrzennie skorelowanych właściwości chemicznych, strukturalnych i mechanicznych wielowarstwowej skali szpatułki Atractosteus (A. szpatułka) za pomocą nanowgłębienia, spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i rentgenowskiej tomografii komputerowej (X-ray CT). Wyniki eksperymentów wykorzystano do zbadania zasad projektowania ochronnych materiałów biologicznych.

Charakterystyka wielowarstwowych łusek ryb (szpatułka Atractosteus) za pomocą nanoindentacji, rentgenowskiej tomografii komputerowej, FTIR i SEM

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

Stadia embrionalne są najbardziej podatne na ksenobiotyki. Chociaż toksyczność chemiczna zależy od zasolenia, nie istnieje żadna metoda badania zależności toksyczności dla organizmów wodnych od zasolenia. W tym miejscu opisujemy nową i wysokoprzepustową metodę określania zależności toksyczności zasolenia dla zarodków wodnych.

Test toksyczności nanokoloidów srebra zależny od zasolenia przy użyciu jaj Medaka

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Wymagana jest szczególna ostrożność przy użyciu "czystych technik" do prawidłowego pobierania i przetwarzania próbek wody do badań metali śladowych w środowisku wodnym. Przedstawiono protokół pobierania próbek, przetwarzania i procedur analitycznych w celu uzyskania wiarygodnych danych i wyników z monitoringu środowiskowego o wysokiej czułości dla szczegółowych badań metali śladowych.

Czyste pobieranie próbek i analiza wód rzecznych i ujść rzek do badań metali śladowych

Ilościowe mapowanie metali w tkance za pomocą ablacji laserowej - plazma sprzężona indukcyjnie - spektrometria mas (LA-ICP-MS) to czuła technika analityczna, która może dostarczyć nowego wglądu w to, jak metale uczestniczą w normalnych funkcjach i procesach chorobowych. W tym miejscu opisujemy protokół ilościowego obrazowania metali w cienkich odcinkach tkanki neurologicznej myszy.

Obrazowanie metali w tkance mózgowej metodą ablacji laserowej - Plazma sprzężona indukcyjnie - Spektrometria mas (LA-ICP-MS)

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Plankton i zawieszone cząstki odgrywają główną rolę w cyklach biogeochemicznych w oceanie. W tym przypadku zapewniamy ultraczystą, bezstresową metodę zbierania różnych rozmiarów cząstek i planktonu na morzu, która jest w stanie poradzić sobie z dużymi ilościami wody morskiej.

Ultra-czyste, wielowarstwowe urządzenie do zbierania frakcjonowanego planktonu morskiego i zawieszonych cząstek

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Protokół ten opisuje ustandaryzowany sposób zbierania próbek DNA środowiskowego waleni (eDNA) z jednostek obserwatorów wielorybów. Priorytetem jest wykonalność dla badaczy i wykwalifikowanych naukowców-obywateli, natomiast warunki środowiskowe, czas filtracji, mętność oraz logistyka pokładowa wyznaczają praktyczne ograniczenia zastosowania.

Pobieranie próbek DNA środowiskowych z jednostek obserwatorskich wielorybów w celu monitorowania waleni

Poznaj autometalografię do lokalizacji srebra w tkankach wątroby i nerek waleni. Metoda CHAA umożliwia półilościowe oznaczanie srebra, oferując proste i ekonomiczne narzędzie w badaniach toksykologii środowiskowej.

Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

Przeglądaj więcej filmów