Zastosowanie autometalografii do lokalizacji i półilościowego oznaczania srebra w tkankach waleni

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu toksykologii środowiskowej dotyczące rozmieszczenia podnarządów i stężenia metali ciężkich w układach biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że AMG jest łatwą w użyciu i niedrogą metodologią, która jest cennym adiuwantem do badania metali ciężkich w tkankach. Używamy tkanek delfinów i wielorybów, aby zademonstrować protokół.

Uważamy jednak, że protokół może być stosowany u różnych gatunków zwierząt. Procedurę z użyciem Wen-Ta Li zademonstruje Shun Theng, klinicysta z naszego instytutu. Zacznij od pobrania dopasowanych parami tkanek wątroby i nerek do analizy AMG od osieroconych waleni i utrwalenia tkanki w 10-krotności objętości 10% neutralnej buforowanej formaliny przez 24 do 48 godzin.

Następnie użyj jednorazowych ostrzy mikrotomów ze stali nierdzewnej, aby przyciąć tkanki wątroby i nerek utrwalone formaliną na odcinki o wymiarach dwa centymetry na jeden centymetr, trzy milimetry i umieść zarówno odcinki wątroby, jak i nerek od tej samej osoby w tych samych oznaczonych kasetach. Odwodnić skrawki w procesorze tkanek poprzez serię stopniowanych zanurzeń w etanolu i ksylenie, a następnie jednogodzinne i dwugodzinne zanurzenia w parafinie. Po dwugodzinnym zanurzeniu w parafinie przenieś tkanki na dno stalowych form histologicznych i zanurz odwodnione próbki tkanek w świeżej stopionej parafinie.

Schłodź utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie bloki tkanek na zimnej płytce, aż parafina zastygnie, i przycinaj każdy blok w mikrotomie, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta. Schłodzić próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 minut i uzyskać pięciomikrometrowe skrawki tkanek na mikrotomie. Za pomocą pęsety i szczoteczki podnieś wstęgi sekcji tkanki w miarę ich pozyskiwania i unieś je na powierzchni podwójnie destylowanej kąpieli wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza, aż będzie można je oddzielić i umieścić na poszczególnych szkiełkach mikroskopowych.

Następnie umieść szkiełka na podgrzewaczu do szkiełek na godzinę w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Następnie umieść szkiełka w stojakach na szkiełka i odparafinowaj skrawki w trzech różnych naczyniach barwiących zawierających od 200 do 250 mililitrów czystego nie-ksylenu na osiem, pięć i trzy minuty inkubacji. Uwodnić odparrafinowaizowane próbki w różnych naczyniach do barwienia z sortowanymi roztworami etanolu, a następnie spłukać w wodzie podwójnie destylowanej.

Opłucz sekcje raz w PBS uzupełnionym 5%Triton X 100, kilka razy w samym PBS i jeden raz w świeżej podwójnie destylowanej wodzie przez 30 sekund na pranie. Po ostatnim praniu oznacz każdą próbkę 300 mikrolitrami roztworu zestawu do wzbogacania mieszanego srebra, nie dłużej niż 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć szkiełka wodą podwójnie destylowaną i przeciwbarwić skrawki w 300 mikrolitrach hematoksyliny na szkiełko przez 10 sekund.

Umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu. Wysusz je i zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego. Następnie uchwyć 10 losowych obrazów histologicznych każdego odcinka tkanki pod obiektywem 40X mikroskopu świetlnego.

Aby przeanalizować dodatnią autometalografię (AMG) próbek, otwórz obrazy w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz obraz, typ i stos RGB, aby podzielić pierwszy obraz na kanały koloru czerwonego, niebieskiego i zielonego. W kanale niebieskim wybierz obraz, regulację i próg, aby zmierzyć procent obszaru z sygnałami AMG-dodatnimi na każdym obrazie, ręcznie dostosowując wartość odcięcia dla progu każdego obrazu na podstawie obecności fałszywie dodatnich obszarów w jądrach lub czerwonych krwinek. Kliknij przycisk Analizuj, ustaw pomiary i sprawdź ułamek powierzchni, aby określić, że ma być rejestrowany ułamek powierzchniowy.

Kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby wyświetlić dodatni obszar procentowy każdej kolumny procentowej powierzchni obrazu histologicznego w oknie wyników. Aby ocenić korelację między wynikami spektroskopii mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie a wartościami dodatnimi AMG, otwórz odpowiednie oprogramowanie do tworzenia wykresów. Utwórz nowy plik projektu i wybierz opcję XY i korelacja.

Wprowadź wyniki spektroskopii mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie i analiz AMG, a następnie wybierz analizę i korelację, aby przeanalizować siłę związku między wynikami analizy za pomocą analizy korelacji Pearsona. W oknie parametrów, regresja nieliniowa wybierz inny model regresji na stronie dopasowania i wybierz metody porównania na stronie porównania. Uwzględnij dodatkową sumę kwadratów testu F i kryterium informacyjne Akaike.

Zgodnie z wynikami metod porównawczych należy wybrać względnie odpowiedni model regresji w histologicznym teście srebra u waleni i użyć testu do oszacowania stężenia srebra w tkankach wątroby i nerek waleni o nieznanych stężeniach srebra. Sygnały AMG-dodatnie obejmują różnej wielkości, brązowe do czarnych ziarnistości w cytoplazmie hepatocytów i komórek Kupffera oraz sporadyczne amorficzne, złocistożółte do brązowych sygnały AMG-dodatnie w świetle i błonie podstawnej niektórych proksymalnych kanalików nerkowych. Istnieje dodatnia korelacja między wynikami spektroskopii mas osocza sprzężonego indukcyjnie a wartościami dodatniego AMG w analizowanych tkankach wątroby i nerek, z preferowaną regresją liniową przez początek, zgodnie z dodatkową sumą kwadratów testu F, a kryterium informacyjnym Akaikego.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że metoda AMG jest metodą adiuwantową i musi być stosowana z innymi specyficznymi metodami, takimi jak ICPMS, do monitorowania rzeczywistego składu metali ciężkich w tkankach.