Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii chorób przenoszonych przez wektory, takie jak: jaką rolę odgrywa mikrobiom wektorowy w dynamice patogenów oraz jak powstają i różnią się mikrobiomy wektorowe? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że pozwala ona na wysoką replikację oraz wysoką rozdzielczość i identyfikację, co pozwala użytkownikowi dokładnie scharakteryzować mikrobiom wektorowy w różnych warunkach ekologicznych i środowiskowych. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ etapy konfiguracji sekwencjonowania mikrobiomu są trudne do nauczenia, a dostępnych jest wiele różnych produktów i technik, ale niewiele dostępnych zasobów do nauki tych kroków.

Rozpocznij tę procedurę od pobrania znaczników, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe z kleszczy, dodaj 500 mikrolitrów nadtlenku wodoru i wiruj przez 15 sekund. Powtórz to pranie z 70% etanolem, a następnie podwójnie destylowaną wodą.

Umieść kleszcze w nowej probówce do PCR i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. W tej tubie mechanicznie rozbij tkanki kleszczy, miażdżąc je śmiertelnikiem i tłuczkiem. Oczyść DNA z pojedynczych kleszczy, postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA.

Eluować do końcowej objętości 100 mikrolitrów. Stworzenie kontroli ujemnej na etapie ekstrakcji ma kluczowe znaczenie dla późniejszego odróżnienia podejrzanych zanieczyszczeń od prawdziwych mikroorganizmów wektorowych. Stosowanie sterylnej techniki na etapie ekstrakcji i późniejszych etapach PCR jest również konieczne, aby zminimalizować wpływ zanieczyszczeń powszechnych w sekwencjonowaniu 16S.

Ustaw amplikon PCR w reakcji o pojemności 27,5 mikrolitra, zawierającej pięć mikrolitrów każdego startera w jednym mikromolowym i 12,5 mikrolitra dostępnej w handlu mieszanki PCR. Uwzględnij również pięć mikrolitrów DNA wyekstrahowanego z pojedynczych kleszczy w stężeniu pięciu nanogramów na mikrolitr. Przenieś probówki do termocyklera i uruchom program wymieniony w protokole tekstowym.

Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując od czterech do sześciu mikrolitrów na próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma na 460 parach podstaw, aby potwierdzić wzmocnienie. Używając nowej probówki do PCR dla każdej próbki, połącz produkt PCR z wodą podwójnie destylowaną, aby uzyskać łącznie 60 mikrolitrów.

W przypadku próbek o niskich stężeniach DNA należy przeprowadzić amplikonową reakcję PCR w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć odchylenie amplifikacji i połączyć próbki w celu zagęszczenia. Doprowadź kulki paramagnetyczne do temperatury pokojowej i dobrze je zwiruj przed użyciem. Dodaj 48 mikrolitrów kulek paramagnetycznych do 60 mikrolitrów próbki i inkubuj przez pięć minut.

Umieść probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie usunąć supernatant. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu.

Natychmiast po dodaniu etanolu do wszystkich probówek odpipetować płyn, nie usuwać kulek. Powtórz dodawanie i usuwanie etanolu jeszcze raz. Wysuszyć próbki na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu, pozostawiając otwarte probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut lub do momentu, gdy w kulkach pojawią się małe pęknięcia.

Teraz dodaj 20 mikrolitrów buforu TE i inkubuj próbki z magnesu w temperaturze pokojowej. Po pięciu do 10 minutach umieść rurki z powrotem na magnesie. Po oddzieleniu kulek i cieczy przenieść supernatanty do świeżej probówki, aby uzyskać oczyszczony produkt PCR.

Przypisz unikalne kombinacje starterów do każdej próbki, wybierając startery do przodu lub do tyłu lub oba te elementy z dostępnego na rynku zestawu indeksów bibliotecznych. Aby dołączyć podwójne startery lub indeksy do próbek, należy przygotować reakcję PCR zawierającą 2,5 mikrolitra każdego startera, 12,5 mikrolitra dostępnego w handlu PCR Master Mix, pięć mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i 2,5 mikrolitra oczyszczonego produktu amplikonowego. Przenieś probówki do termocyklera zaprogramowanego zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując od czterech do sześciu mikrolitrów na próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma na 550 parach zasad, aby potwierdzić amplifikacja przed wykonaniem procedury czyszczenia, jak poprzednio. Aby przeprowadzić dokładne oznaczanie ilościowe każdego oczyszczonego produktu oznaczonego kodem kreskowym, należy przeprowadzić qPCR na każdej próbce i wzorcu w trzech powtórzeniach, a następnie uruchomić każdą próbkę na trzech lub więcej poziomach rozcieńczenia.

Przygotować 10 mikrolitrowych reakcji qPCR zawierających sześć mikrolitrów qPCR Master Mix, dwa mikrolitry podwójnie destylowanej wody i dwa mikrolitry próbki lub wzorca. Przenieś płytkę qPCR do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym zaprogramowanego zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wykonaj przebieg. Po kwantyfikacji utwórz połączoną bibliotekę, dodając równe objętości wszystkich poszczególnych bibliotek do jednej probówki.

Po rozcieńczeniu i denaturacji połączonej biblioteki i kontroli sekwencjonowania, załadować połączoną mieszaninę do komory przepływowej sekwencjonowania. Dokładnie wyczyść komorę przepływową przed załadowaniem, aby uzyskać optymalną optykę. Następnie załaduj komórkę przepływową do sekwencera i wykonaj analizę sekwencji amplikonów.

Krzywe rozrzedzenia dla normalizacji liczby sekwencji są pokazane tutaj. Krzywe te wskazują, że rozrzedzenie do 2000 sekwencji na próbkę powinno wystarczyć do uchwycenia pełnej różnorodności obserwowanych operacyjnych jednostek taksonomicznych. Po rozrzedzeniu i filtrowaniu jakości odczytywana sekwencja jest wykonywana w wyniku zróżnicowania alfa i beta.

Pokazano tutaj automatycznie generowany wykres analizy współrzędnych zasady przedstawiający, jak skład mikrobiomu kleszcza różni się w zależności od leczenia. Co więcej, wizualizacja drobnoustrojów obecnych w każdej próbce, pokazana tutaj na poziomie ich gromady, jest tworzona automatycznie dla wszystkich próbek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu sterylnej techniki, aby zminimalizować efekt zanieczyszczenia mikrobiologicznego, który może mieć krytyczny wpływ na interpretację danych sekwencji.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak barwienie histologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: gdzie znajdują się obserwowane drobnoustroje w wektorze? Po jej opracowaniu metoda ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się ekologią molekularną do zbadania roli interakcji mikrobiologicznych w obrębie wektora i zbadania, w jaki sposób mogą one wpływać na przenoszenie patogenów.