Name: Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA do charakterystyki mikrobiomu kleszczowego. Technika ta umożliwia wysoką replikację i rozdzielczość, wspierając badania nad ekologią chorób odkleszczowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty National Science Foundation dla A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

1. Zbieranie kleszczy i sterylizacja powierzchni
<ol>
	<li>Zbieraj kleszcze, przeciągając białą szmatkę o powierzchni 1 m2 po siedlisku związanym z kleszczami, usuwając kleszcze przyczepione do gatunków żywicieli lub hodując kleszcze w lab15,16. Używaj cienkich kleszczy do manipulowania kleszczami i przechowuj je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Umieść kleszcze w poszczególnych probówkach do PCR i usuń zanieczyszczenia powierzchniowe, wirując przez 15 sekund kolejno za pomocą 500 μl nadtlenku wodoru (H2O2), 70% etanolu i ddH2O.</li>
	<li>Umieść kleszcze w nowej probówce do PCR i pozwól im wyschnąć na powietrzu.</li>
	<li>W tej probówce mechanicznie rozbij tkanki kleszcza, miażdżąc kleszcze moździerzem i tłuczkiem (użytym w tym badaniu), używając małych koralików w ubijaku do koralików lub przecinając kleszcza skalpelem.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie DNA
<ol>
	<li>Oczyść DNA z pojedynczych kleszczy, postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA. Eluta do uzyskania końcowej objętości 100 μL. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 1, aby zapoznać się z krokami 2.2-2.8. Alternatywne metody ekstrakcji obejmują ekstrakcję fenolowo-chloroformową17,18, wytrącanie etanolu19, lub ekstrakcja materiałem chelatującym20,21.</li>
	<li>Potwierdź pomyślne oczyszczenie DNA za pomocą fluorometru lub spektrofotometru. Do fluorometrii użyj 10 μl matrycy DNA w dwuniciowym teście DNA o objętości 190 μl. Oczekiwana wydajność wynosi 0,1-1,0 ng/μL22. Do spektrofotometrii należy użyć 1 μl matrycy DNA w ilościowym oznaczaniu kwasu nukleinowego. Oczekiwany stosunek A260/280 wynosi około 1,823.</li>
	<li>Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do amplifikacji, należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Amplifikacja genu 16S rRNA
<ol>
	<li>Ustawić amplikon PCR w reakcji 27,5 μl zawierającej: 5 μl każdego startera w 1 μM; 12,5 μl dostępnej w handlu mieszanki PCR; i 5 μl DNA wyekstrahowanego z pojedynczych kleszczy w stężeniu 5 ng/μl. 
	UWAGA: Użyj następujących starterów do amplifikacji hiperzmiennego regionu V3-V4 genu 16S rRNA13: 
	5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGGGGCWGCAG-3', 
	5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'</li>
	<li>Przenieść probówki do termocyklera zaprogramowanego na: początkową denaturację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 25 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 57 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut; i końcowe zatrzymanie w temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując 4-6 μl / próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma przy 460 pz, aby potwierdzić wzmocnienie. 
	UWAGA: Produkt Amplicon PCR może nie być widoczny na żelu, jeśli stężenie próbki jest zbyt niskie (< 10 ng). Obecność dimerów starterów jest powszechna w próbkach o niskim stężeniu. Jeśli obecne są inne pasma niedocelowe, dostosuj temperaturę wyżarzania lub zmniejsz liczbę cykli.</li>
	<li>Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do oczyszczania, należy przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie amplikonu 16S
<ol>
	<li>Używając nowej probówki do PCR dla każdej próbki, połącz produkt PCR z ddH2O, aby uzyskać łącznie 60 μl. W przypadku próbek o niskich stężeniach DNA należy przeprowadzić amplikonową reakcję PCR w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć odchylenie amplifikacji i połączyć próbki w celu zagęszczenia.</li>
	<li>Doprowadź kulki paramagnetyczne do temperatury pokojowej i dobrze je zwiruj przed użyciem.</li>
	<li>Dodać 48 μl kulek paramagnetycznych do 60 μl próbki i inkubować przez 5 minut. Umieścić probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Usunąć supernatant. 
	UWAGA: To stężenie kulek ma na celu usunięcie dimerów startera (< 60 pz). W razie potrzeby dostosuj stężenie ściegów, aby usunąć inne niespecyficzne pasma.</li>
	<li>Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym dodaj 500 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH. Natychmiast po dodaniu EtOH do wszystkich probówek odpipetować płyn. Nie usuwaj koralików. Powtórz dodawanie i usuwanie EtOH jeszcze raz.</li>
	<li>Wysuszyć próbki na powietrzu, aby usunąć nadmiar EtOH, pozostawiając otwarte probówki na stojaku magnetycznym na 5 minut lub do momentu, gdy widoczne będą małe pęknięcia w kulkach.</li>
	<li>Dodać 20 μl buforu TE i inkubować próbki z magnesu, w temperaturze pokojowej, przez 5-10 minut.</li>
	<li>Umieść rurki z powrotem na magnesie. Po oddzieleniu kulek i płynu przenieść supernatant do świeżej probówki, aby uzyskać oczyszczony produkt PCR.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Wizualizuj produkt, aby potwierdzić pomyślne oczyszczanie amplikonu, ładując 4-6 μl / próbkę na 1,5% żelu. Pasmo 460 pz powinno być widoczne i nie powinno być ściemniacza startera.</li>
	<li>Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do indeksowania PCR, należy przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Próbkowanie kodów kreskowych i oczyszczanie
<ol>
	<li>Przypisz unikalne kombinacje starterów do każdej próbki, wybierając startery do przodu lub do tyłu, lub jedno i drugie, z dostępnego na rynku zestawu indeksów bibliotecznych. 
	UWAGA: Jednoznaczne etykietowanie próbek pozwala na różnicowanie po sekwencjonowaniu. Zestawy zazwyczaj zapewniają wystarczającą ilość starterów do sekwencjonowania 96-384 próbek.</li>
	<li>Dołączyć podwójne startery lub indeksy do próbek, wykonując PCR w reakcji 25 μl zawierającej 2,5 μl każdego startera (N7xx i S5xx), 12,5 μl dostępnej w handlu mieszanki głównej PCR, 5 μl ddH2O i 2,5 μl oczyszczonego produktu amplikonowego.</li>
	<li>Przenieść probówki do termocyklera zaprogramowanego na: wstępną denaturację w temperaturze 95 °C przez 3 minuty; 8-14 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 55 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut; i końcowe zatrzymanie w temperaturze 10 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując 4-6 μl / próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma przy 550 pz, aby potwierdzić wzmocnienie. 
	UWAGA: Wykorzystaj wyniki wizualizacji, aby poinformować o warunkach cyklicznych indeksu PCR. Zmniejsz liczbę cykli, aby złagodzić niespecyficzne wiązanie, lub zwiększ liczbę cykli, aby uzyskać widoczne pasma dla każdej próbki.</li>
	<li>Powtórz procedurę czyszczenia wymienioną w kroku 4. Aby uniknąć rozcieńczenia podczas czyszczenia, należy wykonać indeks PCR w dwóch egzemplarzach i połączyć produkt w tym miejscu.</li>
	<li>Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do bibliotecznej kwantyfikacji i normalizacji, należy przechowywać próbki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja i normalizacja biblioteki
<ol>
	<li>Oszacuj stężenie każdego oczyszczonego produktu oznaczonego kodem kreskowym od kroku 5.5 za pomocą fluorometru lub spektrofotometru (patrz krok 2.2). Rozcieńczyć próbki w buforze TE, aby uzyskać stężenie około 1 pM. 
	UWAGA: Kwantyfikacja biblioteki jest niezbędna do osiągnięcia stężenia obciążenia próbki zalecanego dla platformy sekwencjonowania. Kwantyfikacja biblioteki odbywa się za pomocą qPCR, ale oszacowanie stężenia próbki przed qPCR oszczędza odczynniki i czas. Stężenie 1 pM jest zalecane, aby zmaksymalizować dokładność kwantyfikacji biblioteki, ponieważ jest to średnie stężenie wzorców qPCR podanych w zestawie do kwantyfikacji24.</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR w 10 μL reakcji zawierającej 6,0 μL głównej mieszanki qPCR (z zestawu do kwantyfikacji z biblioteki), 2,0 μL ddH2O i 2,0 μL próbki lub wzorca. Uruchom każdą próbkę i wzorzec w trzech egzemplarzach, aby uzyskać większą dokładność i precyzję. Każdą próbkę należy uruchomić na trzech lub więcej poziomach rozcieńczenia (np. 0,1 pm, 1 pm i 10 pm dla szacowanych stężeń początkowych), aby zapewnić dokładną ocenę ilościową. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat dostarczonych podkładów i wzorców będą się różnić w zależności od użytego zestawu do oznaczania ilościowego i są dostępne w karcie technicznej produktu. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z zestawem do oznaczania ilościowego używanym w tym badaniu.</li>
	<li>Przenieść płytkę lub probówki qPCR do przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym zaprogramowanego na: początkową denaturację 95 °C przez 5 minut; 35 cykli po 1) 95 °C przez 30 s i 2) 60 °C przez 45 s; oraz stopień dysocjacji 1) 95 °C przez 15 s, 2) 60 °C przez 30 s i 3) 95 °C przez 15 s.</li>
	<li>Obliczyć średnie stężenie początkowe dla każdej próbki, wykorzystując wartości ilościowe uzyskane na podstawie wyników qPCR i zastosowane poziomy rozcieńczenia próbki. 
	UWAGA: Na przykład średnie stężenie 2 pM dla próbki rozcieńczonej w stosunku 1:100 000 daje pierwotne stężenie początkowe 200 nM. Jeżeli żaden z poziomów rozcieńczenia dla danej próbki nie mieści się w zakresie krzywych wzorcowych, wyniki oznaczania ilościowego mogą nie być dokładne; w takim przypadku dostosować poziomy rozcieńczenia i ponownie przeprowadzić qPCR.</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą oczyszczoną próbkę oznaczoną kodem kreskowym do 4 nM w buforze TE, w oparciu o średnie stężenia obliczone w kroku 7.5. 
	UWAGA: Na przykład, aby uzyskać średnie stężenie próbki 200 nM, rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:50 w buforze TE, aby uzyskać stężenie 4 nM. Dokładne stężenie próbki będzie się różnić w zależności od zastosowanego systemu sekwencjonowania i zestawu odczynników. Zapoznaj się z instrukcją obsługi systemu sekwencjonowania, aby uzyskać zalecane stężenie.</li>
	<li>Utwórz połączoną bibliotekę, dodając równe objętości (zwykle 5-10 μl) wszystkich indywidualnych bibliotek do jednej probówki. 
	UWAGA: Ponieważ wszystkie próbki powinny mieć stężenie 4 nM, dodanie równych objętości pozwala uzyskać równe stężenie wszystkich próbek w bibliotece zbiorczej.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.2-6.4 na połączonej bibliotece, aby potwierdzić stężenie 4 nM.</li>
	<li>Obliczyć połączone stężenie biblioteki i rozcieńczyć lub odtworzyć ostateczną, zbiorczą bibliotekę za pomocą bufora Tris, jeśli jest to konieczne do osiągnięcia 4 nM.</li>
	<li>Jeżeli nie przystąpi się natychmiast do ładowania próbki, należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C. Sekwencjonowanie należy przeprowadzić wkrótce po oznaczeniu ilościowym, aby zminimalizować straty lub zmiany stężenia DNA podczas przechowywania.</li>
</ol>
7. Denaturacja i rozcieńczanie biblioteki oraz sekwencjonowanie (wykonywane tego samego dnia)
<ol>
	<li>Denaturuj połączoną bibliotekę 4 nM z kroku 6.9 za pomocą NaOH. 
	UWAGA: Te końcowe kroki przygotowania biblioteki różnią się dla każdego systemu sekwencjonowania. Zapoznaj się z podręcznikiem użytkownika systemu sekwencjonowania, aby uzyskać bardziej szczegółowe i zaktualizowane protokoły. Nowi użytkownicy prawdopodobnie będą musieli zostać przeszkoleni w zakresie korzystania z platformy sekwencjonowania lub mogą wysłać swoje biblioteki do podstawowego narzędzia sekwencjonowania.</li>
	<li>Rozcieńczyć zdenaturowaną bibliotekę do żądanego stężenia wsadowego za pomocą buforu znajdującego się w zestawie odczynników do sekwencjonowania (tabela materiałów). 
	UWAGA: Optymalne stężenia obciążenia różnią się w zależności od systemu sekwencjonowania i zwykle wahają się od 1 do 250 pM25.</li>
	<li>Dedenaturować i rozcieńczyć kontrolę sekwencjonowania. 
	UWAGA: Dodanie kontrolki sekwencjonowania koryguje problemy z sekwencjonowaniem wynikające z bibliotek o niskiej różnorodności. Denaturować kontrolę sekwencjonowania za pomocą NaOH i rozcieńczyć do tego samego stężenia co biblioteka.</li>
	<li>Połącz bibliotekę i kontrolę sekwencjonowania. 
	UWAGA: Stosunek kontroli sekwencjonowania do połączonej biblioteki będzie zależał od różnorodności biblioteki i używanego systemu sekwencjonowania, ale zazwyczaj jest to 1:126.</li>
	<li>Załaduj połączoną bibliotekę i mieszaninę kontrolną sekwencjonowania do komórki przepływowej sekwencjonowania.</li>
</ol>
8. Analiza sekwencji amplikonów
<ol>
	<li>Oceń ogólny sukces przebiegu, badając metryki przebiegu w środowisku przetwarzania w chmurze odpowiadające używanemu systemowi sekwencjonowania. 
	UWAGA: Wskaźniki uruchamiania, takie jak liczba odczytów sekwencjonowania, będą się różnić w zależności od użytej platformy sekwencjonowania i zestawu odczynników. Wartości docelowe dla powszechnych systemów sekwencjonowania podano w tabeli 1.</li>
	<li>Pobierz surowe dane sekwencjonowania i żądane oprogramowanie bioinformatyczne typu open source, Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME)27 lub Mothur28. 
	UWAGA: Zarówno QIIME, jak i Mothur są open-source i można je pobrać bezpłatnie. Szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z tych programów można znaleźć w Internecie i są wystarczająco szczegółowe dla początkujących użytkowników. Poniższe kroki stanowią szeroki przegląd procesu bioinformatycznego prowadzonego w QIIME. Znajomość Pythona nie jest konieczna, ale ułatwi implementację następujących skryptów</li>
	<li>Utwórz i zweryfikuj plik mapowania za pomocą skryptu "validate_mapping_file.py" w QIIME. 
	UWAGA: Plik mapowania zawiera wszystkie metadane niezbędne do przeprowadzenia analizy danych, w tym identyfikator próbki, sekwencje starterów amplikonów i opis próbki. Na etapie walidacji sprawdzane jest, czy wszystkie niezbędne dane zostały wprowadzone w odpowiednim formacie.</li>
	<li>Demultipleksuj i filtruj sekwencje za pomocą skryptu "split_libraries.py" (Rysunek 1). 
	UWAGA: Ten skrypt przypisuje odczyty z kodami kreskowymi do próbek na podstawie kombinacji starterów indeksowych i identyfikatorów próbek wprowadzonych w pliku mapowania. Wykonuje również kilka kroków filtrowania jakości w celu kontrolowania błędu sekwencjonowania w oparciu o zdefiniowane przez użytkownika wartości odcięcia dla minimalnego wyniku jakości, długości sekwencji i przycinania końców.</li>
	<li>Przypisz operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) do sekwencji za pomocą skryptu "pick_open_references_otus.py". 
	UWAGA: W tym kroku sekwencje są grupowane względem kolekcji sekwencji referencyjnych na podstawie progu tożsamości (zwykle 97%). Odczyty, które nie są zgodne z kolekcją sekwencji odwołań, są grupowane względem siebie. Dostępne są również opcje kompletacji de novo i OTU z zamkniętym odniesieniem, ale programiści QIIME zalecają pobieranie z otwartymi referencjami.</li>
	<li>Znormalizuj tabelę OTU za pomocą skryptu "alpha_rarefaction.py" lub "normalize_table.py". 
	UWAGA: Ten krok koryguje zmiany w sumach kolumn lub całkowitych odczytach sekwencji na próbkę, które wynikają z nowoczesnych technologii sekwencjonowania. Normalizację można przeprowadzić przy użyciu tradycyjnego rozrzedzenia lub za pomocą alternatywnych metod, takich jak skalowanie sum skumulowanych.</li>
	<li>Wykonaj jednocześnie kilka analiz różnorodności alfa, beta i różnorodności taksonomicznej za pomocą skryptu "core_diversity_analysis.py". 
	UWAGA: Alternatywnie analizy te mogą być uruchamiane oddzielnie za pomocą poszczególnych skryptów (np. "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sekwencjonowanie 16S rRNA nowej generacji stało się standardowym podejściem do identyfikacji drobnoustrojów i umożliwiło zbadanie, w jaki sposób mikrobiomy wektorowe wpływają na przenoszenie patogenów. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje zastosowanie tej metody do badania gromadzenia się społeczności drobnoustrojów u I. pacificus, gatunku wektora boreliozy; Można go jednak łatwo zastosować do badania innych gatunków kleszczy lub gatunków wektorów stawonogów.
Rzeczywiście,...

Odrodzenie i rozprzestrzenianie się chorób przenoszonych przez wektory w ostatnich dziesięcioleciach stanowi poważne zagrożenie dla globalnego zdrowia ludzi i dzikich zwierząt. Brakuje skutecznych szczepionek przeciwko większości tych chorób, a wysiłki w zakresie kontroli są utrudnione ze względu na złożoną biologiczną naturę wektorów i interakcji wektor-gospodarz. Zrozumienie roli interakcji mikrobiologicznych w obrębie wektora w przenoszeniu patogenów może pozwolić na opracowanie nowych strategii, które pozwolą obejść te wyzwania. W szczególności interakcje między komensalami mikrobiologicznymi związanymi z wektorami, symbiontami i patogenami, określanymi jako mikrobiom, mogą mieć ważne konsekwencje dla przenoszenia patogenów. Przytłaczające dowody potwierdzają to twierdzenie, z przykładami pokazującymi związek między mikrobiomem wektora a kompetencjami w zakresie chorób takich jak malaria, wirus Zika i borelioza1,2,3. Jednak przełożenie tych odkryć na strategie kontroli choroby wymaga znacznie bardziej szczegółowego zrozumienia struktury, funkcji i pochodzenia mikrobiomów wektorowych. Identyfikacja i charakterystyka zbiorowiska mikroorganizmów wektorowych w różnych warunkach ekologicznych i eksperymentalnych stanowi ważną drogę naprzód w tej dziedzinie.
Procedura identyfikacji mikrobiologicznych mieszkańców wektora patogenu jest tutaj zapewniona poprzez wykorzystanie zachodniego kleszcza czarnonogiego, Ixodes pacificus, gatunku wektora patogenu boreliozy Borrelia burgdorferi. Chociaż kleszcze są siedliskiem większej liczby rodzajów ludzkich patogenów niż jakiekolwiek inne stawonogi, stosunkowo niewiele wiadomo na temat biologii i ekologii mikrobiomów kleszczy 4. Oczywiste jest, że kleszcze są siedliskiem różnorodnej gamy wirusów, bakterii, grzybów i pierwotniaków, w tym komensali, endosymbiontów i przejściowych mieszkańców drobnoustrojów5,4. Wcześniejsze prace wykazały silne różnice w mikrobiomach Ixodes związane z geografią, gatunkiem, płcią, etapem życia i mączką z krwi source6,7,8. Jednak mechanizmy leżące u podstaw tej zmienności pozostają nieznane i wymagają bardziej szczegółowych badań nad pochodzeniem i gromadzeniem się tych zbiorowisk drobnoustrojów. Kleszcze mogą przenosić drobnoustroje poprzez transmisję pionową, kontakt z żywicielami i pobieranie z otoczenia przez przetchlinki, usta i pory odbytu9. Zrozumienie czynników kształtujących początkowe tworzenie i rozwój mikrobiomu kleszczy, w szczególności względnego udziału transmisji pionowej i środowiskowej, jest ważne dla zrozumienia naturalnych wzorców i zmian w różnorodności mikrobiomu kleszczy oraz tego, jak te społeczności oddziałują na siebie podczas przenoszenia patogenów, z możliwymi zastosowaniami w zwalczaniu chorób lub wektorów.
Potężne techniki molekularne, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, obecnie istnieją do identyfikacji społeczności mikrobiologicznych i mogą być wykorzystane do scharakteryzowania mikrobiomów wektorowych w różnych warunkach środowiskowych lub eksperymentalnych. Przed pojawieniem się tych wysokoprzepustowych metod sekwencjonowania identyfikacja drobnoustrojów opierała się głównie na mikroskopii i hodowli. Podczas gdy mikroskopia jest szybką i łatwą techniką, morfologiczne metody identyfikacji drobnoustrojów są z natury subiektywne i zgrubne oraz ograniczone niską czułością i detekcją10. Metody oparte na hodowlach są szeroko stosowane do identyfikacji drobnoustrojów i mogą być wykorzystywane do określania podatności drobnoustrojów na leczenie farmakologiczne 11. Jednak ta metoda ma również niską czułość, ponieważ oszacowano, że mniej niż 2% mikroorganizmów środowiskowych można hodować w warunkach laboratoryjnych12. Metody barwienia histologicznego zostały również wykorzystane do wykrywania i lokalizowania określonych drobnoustrojów w obrębie wektorów, umożliwienia badania rozmieszczenia różnych taksonów w obrębie kleszcza oraz badania hipotez dotyczących interakcji mikrobiologicznych. Jednak do wyboru odpowiednich barwników wymagana jest wcześniejsza wiedza na temat tożsamości drobnoustrojów, co sprawia, że podejście to nie nadaje się do charakterystyki i identyfikacji drobnoustrojów. Ponadto barwienie histologiczne jest bardzo czasochłonnym, pracochłonnym procesem i nie skaluje się dobrze w przypadku dużych rozmiarów próbek. Tradycyjne podejścia molekularne, takie jak sekwencjonowanie Sangera, są podobnie ograniczone pod względem czułości i wykrywania różnych społeczności drobnoustrojów.
Sekwencjonowanie nowej generacji pozwala na szybką identyfikację mikrobów z dużej liczby próbek. Obecność standardowych genów markerowych i referencyjnych baz danych dodatkowo umożliwia lepsze rozwiązanie taksonomiczne, często na poziomie rodzaju lub gatunku. Aby osiągnąć ten cel, często stosuje się małe podjednostkowe rybosomalne RNA, przy czym 16S rRNA jest najczęstsze ze względu na obecność konserwatywnych i zmiennych regionów w genie, co pozwala na tworzenie uniwersalnych starterów z unikalnymi amplikonami dla każdego gatunku bakterii13,14. Niniejszy raport szczegółowo opisuje procedurę identyfikacji taksonów w mikrobiomie kleszcza za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA nowej generacji. W szczególności protokół ten kładzie nacisk na etapy związane z przygotowaniem próbek do sekwencjonowania. Podano bardziej ogólne informacje na temat etapów sekwencjonowania i bioinformatyki, ponieważ obecnie dostępnych jest wiele platform sekwencjonowania i programów analitycznych, z których każda ma obszerną istniejącą dokumentację. Ogólna wykonalność tego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji została wykazana poprzez zastosowanie go do badania gromadzenia się społeczności drobnoustrojów w obrębie kluczowego wektora choroby.

<table><tbody><tr><td>Nazwa przedmiotu</td><td>Katalog firmy materiałowej/sprzętowej</td><td></td><td>#</td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>Qubit 4 Fluorometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>NanoDrop 8000 Spektrofotometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td></td><td>Koraliki 5 AMPure XP</td><td>Agen Court</td><td>A63880&nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>Stojak magnetyczny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>Bufor TE</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>Zestaw indeksów Nextera</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>Zestaw kwantyfikacyjny biblioteki KAPA</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>System MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>10</td><td>Zestaw odczynników MiSeq v3&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td>11</td><td>10 mM Tris-HCl z animacją 0,1% 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16s rrna nowej generacji

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

W ostatnich dziesięcioleciach choroby przenoszone przez wektory pojawiły się ponownie i rozprzestrzeniły w zastraszającym tempie, powodując znaczną zachorowalność i śmiertelność na całym świecie. W przypadku większości tych chorób brakuje skutecznych i powszechnie dostępnych szczepionek, co wymaga opracowania nowych strategii łagodzenia skutków choroby. W tym celu obiecująca metoda kontroli chorób polega na ukierunkowaniu na mikrobiom wektora, czyli społeczność drobnoustrojów zamieszkujących wektor. Mikrobiom wektorowy odgrywa kluczową rolę w dynamice patogenów, a manipulacje mikrobiomem doprowadziły do zmniejszenia liczebności wektorów lub transmisji patogenów w przypadku kilku chorób przenoszonych przez wektory. Jednak przełożenie tych odkryć na zastosowania w zakresie kontroli chorób wymaga dogłębnego zrozumienia ekologii mikroorganizmów wektorowych, historycznie ograniczonej przez niewystarczającą technologię w tej dziedzinie. Pojawienie się metod sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło szybkie, wysoce równoległe sekwencjonowanie różnych społeczności drobnoustrojów. Ukierunkowanie na wysoce konserwatywny gen 16S rRNA ułatwiło charakterystykę drobnoustrojów obecnych w wektorach w różnych warunkach ekologicznych i eksperymentalnych. Technika ta obejmuje amplifikację genu 16S rRNA, kodowanie kreskowe próbki za pomocą PCR, ładowanie próbek do komórki przepływowej w celu sekwencjonowania oraz podejścia bioinformatyczne w celu dopasowania danych sekwencyjnych do informacji filogenetycznej. Dzięki temu podejściu można zazwyczaj osiągnąć identyfikację na poziomie gatunku lub rodzaju dla dużej liczby powtórzeń, omijając w ten sposób wyzwania związane z niską wykrywalnością, rozdzielczością i wydajnością tradycyjnych technik hodowli, mikroskopii lub barwienia histologicznego. W związku z tym metoda ta doskonale nadaje się do charakteryzowania drobnoustrojów wektorowych w różnych warunkach, ale obecnie nie może dostarczyć informacji na temat funkcji drobnoustrojów, lokalizacji w wektorze lub odpowiedzi na leczenie antybiotykami. Ogólnie rzecz biorąc, sekwencjonowanie nowej generacji 16S jest potężną techniką pozwalającą lepiej zrozumieć tożsamość i rolę drobnoustrojów-wektorów w dynamice choroby.

Łącznie 42 kleszcze z trzech oddzielnych sprzęgieł jaj oraz dwóch okresów ekspozycji środowiskowej (0 i 2 tygodnie w glebie) poddano obróbce w celu sekwencjonowania mikrobiomu. Każda grupa badawcza, uznana za pojedyncze sprzęgło i czas ekspozycji, zawierała 6-8 powtórzeń próbek kleszczy. Przetworzone ekstrakty z kleszczy wprowadzono do sekwenconera nowej generacji, co pozwoliło uzyskać 12 885 713 odczytów typu paired-end przechodzących przez filtr. W tym przebiegu uwzględniono 3 kontrole ...

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ekologii chorób przenoszonych przez wektory, takie jak: jaką rolę odgrywa mikrobiom wektorowy w dynamice patogenów oraz jak powstają i różnią się mikrobiomy wektorowe? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że pozwala ona na wysoką replikację oraz wysoką rozdzielczość i identyfikację, co pozwala użytkownikowi dokładnie scharakteryzować mikrobiom wektorowy w różnych warunkach ekologicznych i środowiskowych. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ etapy konfiguracji sekwencjonowania mikrobiomu są trudne do nauczenia, a dostępnych jest wiele różnych produktów i technik, ale niewiele dostępnych zasobów do nauki tych kroków.Rozpocznij tę procedurę od pobrania znaczników, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby usunąć zanieczyszczenia powierzchniowe z kleszczy, dodaj 500 mikrolitrów nadtlenku wodoru i wiruj przez 15 sekund. Powtórz to pranie z 70% etanolem, a następnie podwójnie destylowaną wodą.Umieść kleszcze w nowej probówce do PCR i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. W tej tubie mechanicznie rozbij tkanki kleszczy, miażdżąc je śmiertelnikiem i tłuczkiem. Oczyść DNA z pojedynczych kleszczy, postępując zgodnie z instrukcjami dołączonymi do dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA.Eluować do końcowej objętości 100 mikrolitrów. Stworzenie kontroli ujemnej na etapie ekstrakcji ma kluczowe znaczenie dla późniejszego odróżnienia podejrzanych zanieczyszczeń od prawdziwych mikroorganizmów wektorowych. Stosowanie sterylnej techniki na etapie ekstrakcji i późniejszych etapach PCR jest również konieczne, aby zminimalizować wpływ zanieczyszczeń powszechnych w sekwencjonowaniu 16S.Ustaw amplikon PCR w reakcji o pojemności 27,5 mikrolitra, zawierającej pięć mikrolitrów każdego startera w jednym mikromolowym i 12,5 mikrolitra dostępnej w handlu mieszanki PCR. Uwzględnij również pięć mikrolitrów DNA wyekstrahowanego z pojedynczych kleszczy w stężeniu pięciu nanogramów na mikrolitr. Przenieś probówki do termocyklera i uruchom program wymieniony w protokole tekstowym.Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując od czterech do sześciu mikrolitrów na próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma na 460 parach podstaw, aby potwierdzić wzmocnienie. Używając nowej probówki do PCR dla każdej próbki, połącz produkt PCR z wodą podwójnie destylowaną, aby uzyskać łącznie 60 mikrolitrów.W przypadku próbek o niskich stężeniach DNA należy przeprowadzić amplikonową reakcję PCR w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć odchylenie amplifikacji i połączyć próbki w celu zagęszczenia. Doprowadź kulki paramagnetyczne do temperatury pokojowej i dobrze je zwiruj przed użyciem. Dodaj 48 mikrolitrów kulek paramagnetycznych do 60 mikrolitrów próbki i inkubuj przez pięć minut.Umieść probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie usunąć supernatant. Za pomocą probówek na stojaku magnetycznym dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu.Natychmiast po dodaniu etanolu do wszystkich probówek odpipetować płyn, nie usuwać kulek. Powtórz dodawanie i usuwanie etanolu jeszcze raz. Wysuszyć próbki na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu, pozostawiając otwarte probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut lub do momentu, gdy w kulkach pojawią się małe pęknięcia.Teraz dodaj 20 mikrolitrów buforu TE i inkubuj próbki z magnesu w temperaturze pokojowej. Po pięciu do 10 minutach umieść rurki z powrotem na magnesie. Po oddzieleniu kulek i cieczy przenieść supernatanty do świeżej probówki, aby uzyskać oczyszczony produkt PCR.Przypisz unikalne kombinacje starterów do każdej próbki, wybierając startery do przodu lub do tyłu lub oba te elementy z dostępnego na rynku zestawu indeksów bibliotecznych. Aby dołączyć podwójne startery lub indeksy do próbek, należy przygotować reakcję PCR zawierającą 2,5 mikrolitra każdego startera, 12,5 mikrolitra dostępnego w handlu PCR Master Mix, pięć mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i 2,5 mikrolitra oczyszczonego produktu amplikonowego. Przenieś probówki do termocyklera zaprogramowanego zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Po zakończeniu PCR zwizualizuj produkt PCR, ładując od czterech do sześciu mikrolitrów na próbkę na 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj pasma na 550 parach zasad, aby potwierdzić amplifikacja przed wykonaniem procedury czyszczenia, jak poprzednio. Aby przeprowadzić dokładne oznaczanie ilościowe każdego oczyszczonego produktu oznaczonego kodem kreskowym, należy przeprowadzić qPCR na każdej próbce i wzorcu w trzech powtórzeniach, a następnie uruchomić każdą próbkę na trzech lub więcej poziomach rozcieńczenia.Przygotować 10 mikrolitrowych reakcji qPCR zawierających sześć mikrolitrów qPCR Master Mix, dwa mikrolitry podwójnie destylowanej wody i dwa mikrolitry próbki lub wzorca. Przenieś płytkę qPCR do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym zaprogramowanego zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wykonaj przebieg. Po kwantyfikacji utwórz połączoną bibliotekę, dodając równe objętości wszystkich poszczególnych bibliotek do jednej probówki.Po rozcieńczeniu i denaturacji połączonej biblioteki i kontroli sekwencjonowania, załadować połączoną mieszaninę do komory przepływowej sekwencjonowania. Dokładnie wyczyść komorę przepływową przed załadowaniem, aby uzyskać optymalną optykę. Następnie załaduj komórkę przepływową do sekwencera i wykonaj analizę sekwencji amplikonów.Krzywe rozrzedzenia dla normalizacji liczby sekwencji są pokazane tutaj. Krzywe te wskazują, że rozrzedzenie do 2000 sekwencji na próbkę powinno wystarczyć do uchwycenia pełnej różnorodności obserwowanych operacyjnych jednostek taksonomicznych. Po rozrzedzeniu i filtrowaniu jakości odczytywana sekwencja jest wykonywana w wyniku zróżnicowania alfa i beta.Pokazano tutaj automatycznie generowany wykres analizy współrzędnych zasady przedstawiający, jak skład mikrobiomu kleszcza różni się w zależności od leczenia. Co więcej, wizualizacja drobnoustrojów obecnych w każdej próbce, pokazana tutaj na poziomie ich gromady, jest tworzona automatycznie dla wszystkich próbek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu sterylnej techniki, aby zminimalizować efekt zanieczyszczenia mikrobiologicznego, który może mieć krytyczny wpływ na interpretację danych sekwencji.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak barwienie histologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: gdzie znajdują się obserwowane drobnoustroje w wektorze? Po jej opracowaniu metoda ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się ekologią molekularną do zbadania roli interakcji mikrobiologicznych w obrębie wektora i zbadania, w jaki sposób mogą one wpływać na przenoszenie patogenów.

tick-microbiome-characterization-next-generation-16s-rrna-amplicon

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Przedstawiono półautomatyczny przepływ pracy dla ukierunkowanego sekwencjonowania 16S rRNA z mleka matki i innych typów próbek o niskiej biomasie.

Metoda celowanego sekwencjonowania 16S próbek mleka kobiecego

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Poznaj metodę sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA do charakterystyki mikrobiomu kleszczowego. Technika ta umożliwia wysoką replikację i rozdzielczość, wspierając badania nad ekologią chorób odkleszczowych.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów