Name: Generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj technikę tworzenia homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno. Ta wydajna metoda pozwala analizować odpowiedź roślin na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31772291), Projekt Badawczy dla Interesu Publicznego w Prowincji Zhejiang (2017C32027), Kluczowy Projekt Naukowy Hodowli Roślin w Zhejiang (2016C02051), oraz Narodowy Program Wsparcia Najlepszych Młodych Profesjonalistów (do P.X.).

1. Sterylizacja i kiełkowanie nasion
<ol>
	<li>W celu sterylizacji powierzchniowej nasion tykwy namocz je w zlewce o pojemności 500 mL wypełnionej wodą o temperaturze 58 °C, okresowo mieszając, aż temperatura wody spadnie do 40 °C.</li>
	<li>W międzyczasie umieść 3 kg gleby torfowej w nylonowym worku i w celu jej sterylizacji poddaj autoklawowaniu w temperaturze 120 °C/0,5 MPa przez 20 min.</li>
	<li>Kontynuuj namaczanie nasion tykwy przez kolejne 4 - 5 h bez mieszania.
	<ol>
		<li>Gdy woda osiągnie temperaturę pokojową, przepłucz nasiona 2 - 3 razy wodą destylowaną.</li>
		<li>Odlej nadmiar wody i pozostaw nasiona do wykiełkowania w worku z gazy w temperaturze 28 °C w komorze wzrostowej w ciemności.</li>
		<li>Po wykiełkowaniu wysiej nasiona do plastikowych doniczek (6 cm średnicy) wypełnionych wysterylizowaną glebą torfową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy siewki tykwy rozwiną dwa spłaszczone liście zasiedlone, powtórz kroki 1.1 - 1.3 z nasionami arbuza. 
	UWAGA: Taki harmonogram czasowy zapewnia odpowiednie dopasowanie rozmiarów przykwitka i podkładki dla sukcesu szczepienia.</li>
</ol>
2. Wzrost siewek i szczepienie
<ol>
	<li>Hodować siewki w komorze wzrostowej w cyklu 16 h światła / 8 h ciemności, utrzymując temperaturę 28 °C w dzień (światło) i 22 °C w nocy (ciemność). Podlewać siewki, dodając wodę raz dziennie późnym popołudniem.</li>
	<li>Zastosować metodę szczepienia przez cięcie22 w celu wykonania heteroszczepów, gdy siewki tykwy (podkładka) znajdują się w stadium jednego liścia prawdziwego, a kotyledony arbuza (szczep) wykiełkowały (ale nie są jeszcze spłaszczone).
	<ol>
		<li>Odciąć podkotyledony siewek arbuza na wysokości 2 - 3 cm poniżej kotyledonów oraz wierzchołki siewek tykwy w miejscu bezpośrednio nad liśćmi prawdziwymi.</li>
		<li>Za pomocą wykałaczki wykonać otwór w wierzchołku przyciętych siewek tykwy. Włożyć przycięte siewki arbuza do otworów w siewkach tykwy, aby utworzyć heteroszczepy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu wykonania homoszczepów zastosować metodę analogiczną do przedstawionej w kroku 2.2. 
	UWAGA: Kombinacje homo- i heteroszczepienia powinny być zawsze wykonywane jednocześnie (Rycina 1), co w tym przypadku daje następujące wyniki: arbuz/tykwa (WB, heteroszczep), arbuz/arbuz (WW, homoszczep) oraz tykwa/tykwa (BB, homoszczep).</li>
</ol>
<img alt="Schemat szczepienia arbuza i tykwy; koncepcje łodyg WB, WW, BB z symbolami roślin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja kombinacji szczepień i struktur roślin szczepionych. WB = heteroszczepienie arbuza/tykwy; WW = homoszczepienie arbuza/arbuza; BB = homoszczepienie tykwy/tykwy; WB-S = liście przykwitu arbuza/tykwy, które zostały pobrane do próbek; WB-R = liście podkładki arbuza/tykwy, które zostały pobrane do próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Pielęgnacja po szczepieniu, traktowanie zimnem i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Owiń zaszczepione siewki przezroczystymi workami z polietylenu, aby utrzymać stosunkowo wysoką wilgotność, i utrzymuj je przez 7 d w warunkach środowiskowych z cyklami 16 h światła / 8 h ciemności, zachowując temperaturę 28 °C w dzień (światło) i 22 °C w nocy (ciemność).</li>
	<li>Zdejmij przezroczyste worki z polietylenu w 7. dniu. Pozostaw rośliny do wzrostu na kolejne 7 - 10 dni w tych samych warunkach.</li>
	<li>Podziel zdrowe, jednorodne siewki na dwie grupy: jedną do traktowania zimnem (stresowane) i jedną jako kontrolną (niestresowane). W przypadku grupy kontrolnej pozostaw siewki w tej samej komorze wzrostowej (w 28 °C) na dodatkowe 48 h, natomiast w przypadku grupy poddanej stresowi zimnem przenieś siewki do komory wzrostowej ze stałą temperaturą 6 °C, przy warunkach oświetlenia/ciemności opisanych w kroku 2.1.</li>
	<li>Pobierz próbki liści z przyszczepu i podkładu z zaszczepionych roślin (Rycina 1). Natychmiast zamroź próbki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -70 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe
<ol>
	<li>Przenieś zamrożone próbki do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL w ciekłym azocie.</li>
	<li>Do każdej probówki z tkankami dodaj stalową kulkę (o średnicy 5 mm).</li>
	<li>Zhomogenizuj tkanki do postaci drobnego proszku, używając homogenizatora kulkowego przez 30 s.</li>
	<li>Dla każdej kombinacji szczepienia pobierz równe ilości (0,1 g) zmielonej próbki z dziesięciu siewek i zmieszaj je w probówce wirówkowej o pojemności 10 mL. Dodaj odpowiednią ilość odczynnika chlorku guanidyny (Tabela materiałów) zgodnie z sugestiami producenta w zależności od masy tkanki.
	<ol>
		<li>Usuń zanieczyszczenia genomowym DNA, dodając wolną od RNA DNazę I do 150 U/mL w temperaturze 37 °C przez 1 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz całkowitą ilość RNA za pomocą systemu mikrokapilarnej elektroforezy, aby upewnić się, że wskaźnik integralności RNA (RIN) &gt; 7,0. 
	UWAGA: RIN &gt; 7,0 gwarantuje wysoką integralność próbek RNA.</li>
	<li>Przygotuj biblioteki małego RNA przy użyciu komercyjnego zestawu (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Do rozpoczęcia użyj 1 µg całkowitego RNA na próbkę.
	<ol>
		<li>Rozmroź odczynniki do normalizacji bibliotek oraz adaptery zgodnie z wytycznymi producenta. Liguj małe RNA z adapterami 5′ i 3′, a następnie je eluuj i oczyszczaj. Następnie przeprowadź odwrotną transkrypcję małych RNA z ligado-adapterami 5′ i 3' zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
		<li>Przeprowadź amplifikację PCR zgodnie z protokołem producenta. Oceń jakość i ilość bibliotek cDNA za pomocą systemu mikrokapilarnej elektroforezy.</li>
		<li>Nałóż 1 µL biblioteki RNA na system mikrokapilarnej elektroforezy, aby upewnić się, że RIN &gt; 7,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsekwencjonuj biblioteki małego RNA na urządzeniu do wysokoprzepustowego sekwencjonowania, zgodnie z opisem zamieszczonym w innym źródle23.</li>
</ol>
5. miRNA i przewidywanie genów docelowych
<ol>
	<li>W przypadku każdej kombinacji szczepienia użyj otwartoźródłowego programu UEA sRNA workbench 2.4-plant version24, aby usunąć sekwencje słabej jakości oraz przyciąć sekwencje adaptorów z surowych odczytów. Odrzuć sekwencje krótsze niż 18 nt lub dłuższe niż 32 nt.</li>
	<li>Porównaj wysokiej jakości „oczyszczone” sekwencje z otwartoźródłową bazą danych Rfam 11.0, aby zidentyfikować i usunąć odczyty rRNA, tRNA, snoRNA oraz innych snRNA.</li>
	<li>Wyrównaj pozostałe odczyty do genomów referencyjnych, korzystając z narzędzia do wyrównywania krótkich sekwencji25. Na tym etapie nie dopuszcza się żadnych niedopasowań (mismatches). 
	UWAGA: Do wyrównania odczytów z przyszczepu wykorzystano asemblację genomu arbuza „97103” V126, a do odczytów z podkładki asemblację genomu tykwy „HZ” V127.</li>
	<li>Porównaj pozostałe odczyty ze znanymi dojrzałymi miRNA w otwartoźródłowej bazie miRBase 22.028. Odczyty homologiczne do znanych miRNA klasyfikuje się jako konserwatywne miRNA.</li>
	<li>Porównaj sekwencje, które nie dopasowały się do znanych prekursorów miRNA, z sekwencją genomu. Użyj algorytmu MIREAP29 z ustawieniami domyślnymi w celu wykrycia potencjalnych nowych miRNA.</li>
</ol>
6. Analiza różnicowej ekspresji i ontologii genów
<ol>
	<li>Porównać poziomy ekspresji miRNA na podstawie liczby odczytów. miRNA z wartością P (dokładny test Fishera) &lt; 0,05 i wartością bezwzględną log2 &gt; 2 są uznawane za różnicowo wyrażone.</li>
	<li>Użyć narzędzia do wyboru miejsc docelowych oligosomów antysensownych (TargetFinder)30, aby przewidzieć potencjalne komplementarne mRNA (geny docelowe miRNA) dla różnicowo wyrażonych miRNA przy użyciu parametrów domyślnych.</li>
	<li>Użyć analitycznego narzędzia do wzbogacania ontologii genów (GO)31, aby ujawnić wzorce ontologii (GO) genów docelowych miRNA przy progu wartości P wynoszącym 0,05 dla istotności statystycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004243">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://journals.tubitak.gov.tr/havuz/bot-1404-115.pdf">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li>
<li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014116000030">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li>
<li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/43/3/730.full">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li>
<li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/44/7/1978.full">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li>
<li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004115">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li>
<li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11099-012-0002-1">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li>
<li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004462">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li>
<li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+%28N%29+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li>
<li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.actahort.org/books/1086/1086_26.htm">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li>
<li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9759-6">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li>
<li>Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurnbull%2C+CG+%22Plant+Developmental+Biology%22">Plant Developmental Biology</a>. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li>
<li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root%2C+stem%2C+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+%28Solanum+tuberosum+L.%29+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).</li>
<li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li>
<li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li>
<li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li>
<li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13562-015-0334-6">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11738-016-2070-5">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li>
<li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li>
<li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359(2013).</li>
<li>Song, G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/294376070_Development_of_2JC-350_automatic_grafting_machine_with_cut_grafting_method_for_vegetable_seedling">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+%28triticum+aestivum+l.%29+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li>
<li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851(2014).</li>
<li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://sacan.biomed.drexel.edu/cmteditor/program/download?confname=ssdbm2013&pid=k2&file=paper">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li>
<li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+draft+genome+of+watermelon+%28Citrullus+lanatus%29+and+resequencing+of+20+diverse+accessions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gourdbase%3A+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+%28lagenaria+siceraria%29%2C+an+economically+important+cucurbit+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).</li>
<li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).</li>
<li>Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://sourceforge.net/projects/mireap/">http://sourceforge.net/projects/mireap/</a> (2008).</li>
<li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TargetFinder%3A+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li>
<li>Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015).</li>
<li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423815303794">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Małe dane sekwencjonowania RNA są zdeponowane w GenBanku pod numerem dostępu SRP136842.

W tym protokole szczegółowo opisaliśmy wysoce wydajną i powtarzalną metodę wykonywania homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową. Ta metoda, nie wymagająca specjalnego sprzętu, jest bardzo łatwa w obsłudze i zazwyczaj ma bardzo wysoki wskaźnik przeżywalności szczepienia. Metodę można również wykorzystać do wykonania przeszczepów dla innych dyniowatych, takich jak arbuz, ogórek i dynia.
Warto zauważyć, że względna wielkość (wiek) podkładki i zrazu ma kluczowe znaczenie dla uda...

Szczepienie od dawna jest stosowane jako technika rolnicza w celu poprawy produkcji roślinnej i tolerancji na stresy biotyczne i abiotyczne1,2,3. W systemach heteroszczepienia, elitarne podkładki mogą zwiększać pobieranie wody i składników odżywczych przez rośliny, wzmacniać odporność na patogeny glebowe i ograniczać negatywne skutki toksyczności metali4,5, co może nadać szczepieniom zwiększoną wigor wzrostu i zwiększoną tolerancję na stresy środowiskowe. W wielu przypadkach heteroszczepienie może również wpływać na jakość owoców w roślinach ogrodniczych, prowadząc do poprawy smaku owoców i zwiększenia zawartości związków związanych ze zdrowiem6,7. Stwierdzono, że transfer fitohormonów, RNA, peptydów i białek między podkładką a zrazem na duże odległości jest podstawowym mechanizmem modulującym przeprogramowanie wzrostu i rozwoju roślin zrazowych8,9,10. Szczepienie jest szeroko stosowane w badaniach nad sygnalizacją i transportem na duże odległości w odniesieniu do adaptacji do środowiska11. Eksperymenty ze szczepieniami są szczególnie skuteczne w jednoznacznym wykrywaniu przenoszonych cząsteczek w tkance odbiorczej lub soku naczyniowym oraz aktywacji lub tłumieniu celów molekularnych z powodu transmisji sygnału12.
Niekodujące RNA, duża klasa RNA, które pełnią ważne funkcje regulacyjne w komórkach, zostały uznane za odgrywające rolę w ułatwianiu adaptacji roślin do stresu abiotycznego13. miRNA to endogenne małe niekodujące RNA o długości około 20 - 24 nt. Badania wykazały regulacyjną rolę miRNA w różnych aspektach aktywności roślin, takich jak wzrost pędów, Tworzenie korzeni bocznych14,15,16, pobieranie składników odżywczych, metabolizm siarczanów i homeostaza17, oraz reakcje na stres biotyczny i abiotyczny18. Ostatnio ekspresja miRNA i ich docelowych genów była związana z tolerancją stresu solnego u heteroszczepionych sadzonek ogórków19. W przeszczepach międzyodmianowych winogron stwierdzono, że reakcje ekspresji miRNA na stres związany z suszą są zależne od genotypu20.
Szybki rozwój i malejące koszty technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości stworzyły doskonałą okazję do zbadania regulacji miRNA w roślinach agronomicznych. Arbuz (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), ważna roślina dyniowata uprawiana na całym świecie, jest podatna na niskie temperatury. Tykwa butelkowa (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) jest bardziej odporną na zmiany klimatu dyniowatą, powszechnie używaną przez rolników do szczepienia arbuzem. Głównym celem obecnego badania jest ustalenie standardowej, wydajnej i wygodnej metody wykonywania heteroprzeszczepów między arbuzami (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) i tykwa butelkowa (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Protokół ten zawiera również szczegółowy schemat eksperymentalny i procedury analityczne do badania regulacji ekspresji miRNA po szczepieniu, co jest przydatne do ujawnienia mechanizmów leżących u podstaw zalet heteroszczepienia.
Materiały roślinne użyte w tym badaniu obejmują odmianę arbuza i tykwę butelkową. Odmiana arbuza jest odmianą handlową o wysokim plonie, ale podatną na niskie temperatury. Tykwa butelkowa jest popularną podkładką do szczepienia arbuzem, ogórkiem i tykwą butelkową, ze względu na doskonałą tolerancję na niskie temperatury21.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DNaza bez RNA I</td><td>Takara</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Zestaw do przygotowania małych próbek RNA</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA wersja 2.4-roślinna&nbsp; (oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr> <tr><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ Rfam 11.0 database&nbsp;( Strona internetowa)</td><td>NA</td><td>NA http://rfam.janelia.org</td><td></td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;( Strona internetowa)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://www.mirbase.org/</td></tr> <tr><td>MIREAP(oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA https://sourceforge.net/projects/mireap/</td><td></td></tr> <tr><td>TargetFinder&nbsp;( oprogramowanie)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikrorna reagujących na zimno

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

MikroRNA (miRNA) to endogenne małe niekodujące RNA o wielkości około 20 - 24 nt, znane z odgrywania ważnych ról w rozwoju i adaptacji roślin. Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że ekspresja niektórych miRNA ulega zmianie podczas szczepienia, co jest praktyką rolniczą powszechnie stosowaną przez rolników w celu poprawy tolerancji upraw na stresy biotyczne i abiotyczne. Tykwa butelkowa jest z natury rośliną odporną na zmiany klimatu w porównaniu z wieloma innymi głównymi dyniowatymi, w tym arbuzem, co czyni ją jedną z najczęściej używanych podkładek dla tych ostatnich. Niedawny postęp w technologiach sekwencjonowania o wysokiej przepustowości zapewnił ogromne możliwości zbadania miRNA reagujących na zimno i ich wkładu w korzyści płynące z heteroprzeszczepów; Warunkiem wstępnym do osiągnięcia tego celu są jednak odpowiednie procedury eksperymentalne. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wydajnego generowania homo- i heteroprzeszczepów między wrażliwym na zimno arbuzem a tykwą butelkową odporną na zimno, a także metody pobierania próbek, generowania i analizy danych. Przedstawione metody są również przydatne w innych systemach szczepienia roślin, do badania regulacji miRNA w różnych stresach środowiskowych, takich jak upały, susza i zasolenie.

<img alt="Porównanie wzrostu roślin w temperaturze pokojowej i 6°C; wyniki eksperymentalnej obróbki zimnem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Fenotypy różnych szczepów w temperaturze pokojowej i w warunkach stresu zimna. (a) Ten panel przedstawia siewki homoszczepione i heteroszczepione w temperaturze pokojowej jako kontrolę. (b) Ten panel prze...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół efektywnego wykonywania homo- i heterograftów między tykwą arbuza a tykwy butelkowej, oprócz metod pobierania próbek, generowania i analizy danych, do badania mikroRNA reagujących na zimno.

Generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące odpowiedzi miRNA na zdolność do stresu w przeszczepach roślin, takie jak to, w jaki sposób miRNA jest regulowane pod wpływem stresu zimna w przeszczepach tykwy z butelki arbuza. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to wysoce wydajna i powtarzalna metoda wykonywania homo i heteroprzeszczepów. Nie wymaga specjalnego sprzętu, jest bardzo łatwy do wykonania i zazwyczaj skutkuje bardzo wysoką przeżywalnością szczepienia.Dzięki tej metodzie może zapewnić wgląd w odpowiedź miRNA na stres zimna w systemie przeszczepu tykwy w butelce arbuza. Może być również stosowany do innych współczesnych organizmów w celu ujawnienia mechanizmów lokalnego i długodystansowego transportu miRNA. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy szczepienia są trudne do nauczenia.Ten krok wymagał zaawansowanych umiejętności i jest kluczem do przetrwania szczepionych roślin. Na początek namocz nasiona tykwy butelkowej w 500-mililitrowej zlewce z wodą o temperaturze 58 stopni Celsjusza. Od czasu do czasu mieszaj nasiona, aż temperatura wody spadnie do 40 stopni Celsjusza.Gdy woda ostygnie, włóż trzy kilogramy ziemi torfowej do nylonowej torby i autoklawuj ją. Gdy woda osiągnie temperaturę pokojową, opłucz nasiona dwa do trzech razy w wodzie destylowanej i spuść nadmiar wody. Pozwól nasionom wykiełkować w woreczku z gazy w temperaturze 28 stopni Celsjusza w ciemnej komorze wzrostu.Po wykiełkowaniu wysiewaj nasiona do plastikowych doniczek wypełnionych wysterylizowaną ziemią torfową. Kiedy sadzonki tykwy butelkowej rozwiną dwa spłaszczone liścienie, powtórz ten proces z pestkami arbuza. Wyhoduj tykwę butelkową i sadzonki arbuza w komorze wzrostowej.Dodawaj wodę do sadzonek raz dziennie po południu. Następnie pokrój hipokotyle sadzonek arbuza dwa do trzech centymetrów poniżej liścieni. Odetnij górną część sadzonek tykwy butelkowej z boku, bezpośrednio nad liścieniami.Następnie za pomocą wykałaczki zrób otwór w górnej części przyciętych sadzonek tykwy butelkowej. Włóż przycięte sadzonki arbuza do otworu, aby wykonać heteroprzeszczepy. Następnie przygotuj homografty przy użyciu wcześniej opisanej metody.Najpierw zawiń szczepione sadzonki w przezroczyste worki polietylenowe, aby utrzymać stosunkowo wysoką wilgotność. Następnie trzymaj owinięte sadzonki w komorze wzrostowej przez siedem dni. Po siódmym dniu wyjmij worki i pozwól roślinom rosnąć w tych samych warunkach przez siedem do 10 dni.Podziel sadzonki na dwie grupy, jedną do leczenia zimnem i jedną do kontroli. Przywróć sadzonki kontrolne do tych samych warunków środowiskowych. Umieść sadzonki poddane działaniu zimna w komorze wzrostowej ustawionej na sześć stopni Celsjusza w tych samych jasnych, ciemnych warunkach, co grupa kontrolna.Po 48 godzinach pozostaw próbki zrazu i podkładek z przeszczepów. Próbki należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza. Przenieść zamrożoną próbkę do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej w ciekłym azocie.Dodaj kulkę ze stali nierdzewnej do każdej probówki z próbką i homogenizuj tkanki na drobny proszek. Dla każdej kombinacji szczepień należy pobrać równe ilości zmielonej próbki z 10 sadzonek i wymieszać je w 10-mililitrowej probówce wirówkowej. Dodać odpowiednią ilość odczynnika chlorowodorku guanidu.Następnie dodaj DNazę wolną od RNA od jednej do 150 jednostek na mililitr w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie określ całkowitą ilość RNA w systemie elektroforezy mikrokapilarnej. Następnie rozmrozić odczynniki normalizujące bibliotekę i adaptery.Następnie podwiązaj małe RNazy za pomocą pięciu adapterów prime i trzech prime, a następnie eluuj je i oczyść. Odwrotna transkrypcja pięciu pierwszych i trzech pierwszych ligowanych małych RNaz zgodnie z wytycznymi producenta. Następnie wykonaj amplifikację PCR zgodnie z protokołem producenta.Następnie użyj systemu elektroforezy mikrokamilowej, aby upewnić się, że liczba integralności RNA jest większa niż siedem. Załaduj jeden mikrolitr biblioteki RNA do systemu elektroforezy mikrokapilarnej, aby upewnić się, że liczba integralności RNA jest większa niż siedem. Na koniec zsekwencjonuj małe biblioteki RNA na przyrządzie do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.Korzystając z tego protokołu, uzyskano 98% wskaźnik przeżywalności dla szczepienia oraz fenotypy dla temperatury pokojowej i warunków stresu zimna. sRNA 24 nukleotydów stanowiły największą klasę sRNA we wszystkich kombinacjach szczepień, niezależnie od obróbki termicznej. Po 48 godzinach leczenia na zimno odpowiednio 30 i 268 mikroRNA zostało regulowanych w górę i w dół.W liściach zrazu w heteroprzeszczepach, odwrotnie, w liściach podkładki, 31 i 12 mikroRNA było regulowanych odpowiednio w górę i w dół. W homograftach arbuza i arbuza 64 i 83 mikroRNA były regulowane odpowiednio w górę i w dół. To pokazało, że heteroprzeszczep spowodował głębokie przeprogramowanie ekspresji mikroRNA.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o względnym rozmiarze i wieku łodygi potomnej, a zraz ma kluczowe znaczenie dla udanego przeszczepu. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie lncRNA, profilowanie proteomiczne w celu zbadania regulacji lncRNA i białka oraz systemu kodującego w systemie szczepienia. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie tolerancji abiotycznej roślin w celu zbadania mechanizmu przewagi szczepienia roślin w Cucurbitaceae i nie tylko.Nie zapominaj, że praca z chlorowodorkiem guanidyny może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować odpowiednie środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.

generating-homo-heterografts-between-watermelon-bottle-gourd-for

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.

Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Tym celem tego protokołu jest produkcja chimerycznych aksolotli z haploidalnymi kończynami przednimi pochodzącymi z tkanki dawcy zmutowanej, Cas9, przy użyciu technik przeszczepu tkanek embrionalnych.

Pokolenie chimerycznych aksolotli ze zmutowanymi haploidalnymi kończynami poprzez szczepienie embrionalne

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Badanie to opracowało sposób tworzenia i utrzymania stabilnych linii mutantów dla ślimaka jabłkowego słodkowodnego, Pomacea canaliculata. Protokoły obejmują zbieranie zygot, mikrowstrzyknięcie ich komponentami systemu CRISPR/Cas9 w celu wywołania edycji genomu, hodowlę zarodków ex ovo oraz genotypizację po kontrolowanych krzyżowaniach.

Złota jabłka ślimaka Pomacea canaliculata: od zygot do stabilnych linii mutantów

Poznaj technikę tworzenia homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno. Ta wydajna metoda pozwala analizować odpowiedź roślin na stres.

Generowanie homo- i heteroprzeszczepów między arbuzem a tykwą butelkową w celu badania mikroRNA reagujących na zimno

Przeglądaj więcej filmów