Name: Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metody identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników gospodarza ograniczających replikację arbowirusów przy użyciu komórek LD652 i testów luminescencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D.G. był wspierany przez fundusze z University of Texas Southwestern Medical Center's Endowed Scholars Program. Autorzy dziękują Michaelowi Whittowi (The University of Tennessee Health Science Center) i Seanowi Whelanowi (Harvard Medical School) za udostępnienie VSV-DsRed i VSV-LUC. Autorzy dziękują również Gary'emu Lukerowi (University of Michigan Medical School) za miły dar w postaci szczepu VACV-FL-GFP.

1. Hodowla komórek i wirusów General Lymantria dispar (LD652)
<ol>
	<li>Hodowla i posiew komórek LD652
	<ol>
		<li>Aby wyhodować komórki LD652 pochodzące z L. dispar, należy utrzymać monowarstwę komórek w pożywce wzrostowej (tabela materiałów) inkubowanej w temperaturze 27 °C w normalnej atmosferze. Utrzymuj komórki w 10-centymetrowych naczyniach poddanych kulturze tkankowej i przechodź komórki po osiągnięciu 80% zlewności.</li>
		<li>Aby uzyskać płytkę, usuń przylegające komórki LD652 z płytki, wielokrotnie pipetując pożywkę na monowarstwę (komórki te nie wymagają trypsynizacji do usunięcia) i rozcieńczyć próbkę w pożywce wzrostowej do przybliżonej gęstości 1 x 105 komórek/ml. Odpipetować 1 ml rozcieńczonej kultury/dołka z 24-dołkowej płytki. Wysiewać co najmniej trzy kontruplikowane studzienki/rodzaj zasiewu dla każdego punktu czasowego (maksymalnie osiem zabiegów/płytkę).</li>
		<li>Pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat wirusa krowianki
	<ol>
		<li>Aby przygotować zapasy wirusa VACV, amplifikuj wirusa w komórkach HeLa20 lub komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy (komórki BSC-1 lub BSC-40)20,21,22. 
		UWAGA: Szczep VACV Western Reserve (VACV-WR) działa dobrze w opisanych tutaj testach.</li>
		<li>Miareczkować szczep VACV za pomocą testu płytki nazębnej na komórkach BSC-1 lub BSC-4020,22. 
		UWAGA: Wszystkie wskazane wielokrotności infekcji VACV (MOI) opisane tutaj dla zakażeń komórkami LD652 są oparte na mianach uzyskanych z testów płytek BSC-40.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej 
	<ol>
		<li>Aby przygotować zapasy VSV, amplifikuj wirusa w komórkach BHK23.</li>
		<li>Miareczkowanie VSV za pomocą testu płytkiowego na monowarstwach komórek BSC-40 lub BHK13,23. 
		UWAGA: Wszystkie opisane tutaj MOI VSV dla zakażeń komórkami LD652 są oparte na mianach uzyskanych z testów płytek BSC-40.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test ratunkowy VSV oparty na fluorescencji z wykorzystaniem koinfekcji i obrazowania żywych komórek
<ol>
	<li>Wysiew i infekcja komórek LD652 
	<ol>
		<li>Płytka 40 000 komórek LD652 / studzienka w komorze 8-dołkowej.</li>
		<li>Do obrazowania żywych komórek na podstawie fluorescencji należy użyć szczepów VSV kodujących białka fluorescencyjne. Przedstawione tutaj eksperymenty wykorzystują VSV-DsRed17, rekombinowany szczep VSV, który wyraża wolne białko DsRed, które nie jest połączone z żadnym innym białkiem VSV. 
		UWAGA: Zakażenie VSV komórek LD652 nie jest cytopatyczne o 96 hpi, a zatem śmierć komórki nie jest czynnikiem zakłócającym przy ocenie replikacji VSV w tym przedziale czasowym.</li>
		<li>Przygotować VSV-DsRed i VACV-FL-GFP w pożywce bez surowicy (SFM; Tabela materiałów) przy MOI wynoszącym odpowiednio 1 i 25. 
		UWAGA: VACV-FL-GFP to rekombinowany szczep VACV, który wyraża fuzję między LUC i GFP24. Użycie MOI 25 lub więcej dla szczepów VACV zapewnia, że wszystkie komórki LD652 są zainfekowane13. W przypadku korzystania z innego wirusa koinfekującego, MOI będzie musiał zostać określony empirycznie przez użytkownika. Każde leczenie infekcji powinno być skonfigurowane w zduplikowanych studzienkach i obejmować leczenie pozorowane zakażeniem, w którym do komórek dodaje się tylko SFM.</li>
		<li>Inkubować komórki w 0,2 ml inokulum przez 2 godziny w temperaturze 27 °C.</li>
		<li>Umyj komórki 0,5 ml / studzienkę pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Inkubować komórki w 25 μM barwnika żywotności komórek (tabela materiałów) w pożywkach wzrostowych przez 45 minut w temperaturze 27 °C.</li>
		<li>Zassać pożywkę i umyć studzienki 1x 0,5 ml / studzienkę, aby usunąć nadmiar barwnika.</li>
		<li>Utrzymuj komórki w 0,3 ml / studzienkę pożywki wzrostowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechwytywanie obrazu komórki na żywo
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop konfokalny z 30-minutowym wyprzedzeniem i załaduj 8-dołkową miskę komorową. 
		UWAGA: Ogniwa LD652 można obrazować w temperaturach pokojowych w zakresie 20–25 °C, ale dla optymalnych warunków temperaturę w pomieszczeniu należy dostosować do 27 °C.</li>
		<li>Ustaw odpowiednie ustawienia wzbudzenia/emisji dla każdego białka markera fluorescencyjnego, które ma być obrazowane, a także ustawienia obrazu kontrastu fazowego.</li>
		<li>Dostosuj intensywność lasera dla każdego kanału. 
		UWAGA: Może to wymagać przeprowadzenia eksperymentu pilotażowego w celu określenia zakresu intensywności sygnału fluorescencyjnego obserwowanego w całym czasie, który ma być wykorzystany w końcowym eksperymencie.</li>
		<li>Korzystając z obiektywu 10X, rejestruj obrazy kontrastu fazowego i fluorescencji każdej studzienki co 1–5 godzin przez cały czas trwania infekcji do pożądanego punktu czasowego (np. 48–72 hpi). 
		UWAGA: Ważne jest, aby uchwycić wiele pól widzenia w każdym dołku, aby dokładnie oszacować wskaźniki infekcji w całej hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obrazu
	<ol>
		<li>Używaj oprogramowania do analizy obrazu do automatycznej analizy obrazu odpowiednich kanałów fluorescencyjnych (np. 405 nm, 488 nm, 568 nm).</li>
		<li>Aby obliczyć odsetek komórek, które są zakażone, podziel całkowitą liczbę komórek fluorescencyjnych wskazujących na zakażenie VSV (np. komórki DsRed-dodatnie dla infekcji VSV-DsRed) przez całkowitą liczbę żywych komórek znakowanych barwnikiem żywotności komórek dla każdego pola widzenia we wszystkich zabiegach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ogólny protokół infekcji wirusowych dla testów ratunkowych VSV opartych na luminescencji w komórkach LD652
<ol>
	<li>Przygotowanie inokulum
	<ol>
		<li>30 minut przed zakażeniem rozmrozić zapasy VSV-LUC16 (rekombinowany szczep VSV, który wykazuje ekspresję wolnego białka lucyferazy świetlika, które nie jest połączone z żadnym innym białkiem VSV). W przypadku testu na ratunek VSV-LUC podczas koinfekcji VACV, należy również rozmrozić wirusa VACV-WR na lodzie. 
		UWAGA: Inne wirusy (oprócz VACV-WR) mogą uratować VSV-LUC podczas koinfekcji, ale będzie to musiało zostać ustalone empirycznie przez każdego użytkownika.</li>
		<li>Przygotować inokulum przez rozcieńczenie VSV-LUC w obecności lub bez VACV-WR do SFM tak, aby MOI wynosił odpowiednio 10 i 25 przy dodawaniu całkowitej objętości inokulum 0,2 ml / studzienkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie komórek
	<ol>
		<li>Ostrożnie odessać dojrzałe pożywki LD652, aby uniknąć naruszenia monowarstwy i zaszczepić 0,2 ml wirusa/studzienkę. Czas ten jest definiowany jako 0 hpi. Dodać sterylną SFM do dodatkowych studzienek, aby służyły jako "pozorowane zakażenie" w ramach leczenia kontroli negatywnej.</li>
		<li>Inkubować komórki w inokulum przez 2 godziny w temperaturze 27 °C.</li>
		<li>Przy 2 hpi usunąć inokulum przez aspirację i zastąpić 1 ml / dołkiem LD652 pożywką wzrostową.</li>
		<li>Pozwól, aby infekcja postępowała 24–72 hpi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test lucyferazy
<ol>
	<li>Przygotowanie lizatów komórkowych
	<ol>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant i dodać 1 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco/studzienkę.</li>
		<li>Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml zeskrobać komórki do DPBS.</li>
		<li>Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki i wirować przy 400 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W międzyczasie przygotować 1x rozcieńczenie 5x buforu reporterowego do lizy (RLB) w sterylnymH2O.</li>
		<li>Po odwirowaniu odessać DPBS bez naruszania osadu komórkowego.</li>
		<li>Ponownie zawiesić każdą pastylkę w 150 μL 1x RLB.</li>
		<li>Zamrażać i rozmrażać próbki 1 raz, stosując 5-minutową inkubację w zamrażarce o temperaturze -80 °C, a następnie szybko rozmrażać w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test lucyferazy
	<ol>
		<li>Rozmrozić lizaty na lodzie.</li>
		<li>Odpipetować 20 μl lizatu do dołka z stałą czarną lub białą 96-dołkową mikropłytką.</li>
		<li>Dodaj 100 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy do każdego dołka.</li>
		<li>Natychmiast zmierz natężenie światła za pomocą luminometru (odpowiednie ustawienia dla konkretnych luminometrów będą musiały zostać określone empirycznie przez użytkownika).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza testu lucyferazy 
	<ol>
		<li>Normalizuj sygnały LU dla każdego zabiegu do odczytów LU uzyskanych z zabiegów kontrolnych (wyniki reprezentatywne). Po przeprowadzeniu co najmniej trzech niezależnych eksperymentów, średnia LU uzyskana z każdej grupy poddawanej działaniu substancji/grupy kontrolnej może być analizowana za pomocą odpowiednich testów statystycznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Immunoblot
<ol>
	<li>Stosować lizaty ekstrahowane do testów LUC dla SDS-PAGE i późniejszego immunoblottingu, używając odpowiednich odczynników i oprzyrządowania.</li>
</ol>
6. Miano VSV z hodowli komórkowych LD652
<ol>
	<li>Płytka LD652 ogniwa zgodnie z krokiem 1.1.</li>
	<li>Wirus infekuje komórki zgodnie z krokiem 3.</li>
	<li>W żądanych punktach czasowych zebrać supernatanty do sterylnych probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Osadzać komórki przy użyciu 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatanty do nowych probówek.</li>
	<li>Przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C lub przystąpić do miareczkowania za pomocą testu płytkiowego na komórkach BSC-40. 
	UWAGA: W przypadku miareczkowania VSV z kultur komórkowych LD652, które zawierały VACV, zaleca się dodanie 100 μg/ml arabinozydu cytozyny (AraC) do pożywki hodowlanej BSC-40 w ciągu 2 hpi, aby zapobiec tworzeniu się płytek resztkowych cząstek VACV na monowarstwach BSC-4013. AraC jest wirusowym inhibitorem polimerazy DNA, który blokuje replikację DNA VACV25, ale nie wpływa na replikację VSV.</li>
</ol>
7. Warianty testów ratunkowych VSV opartych na luminescencji w komórkach LD652: eksperymenty z transfekcją RNAi i plazmidu
<ol>
	<li>Przygotowanie dsRNA do knockdownu transkryptów wirusa lub gospodarza za pośrednictwem RNAi
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery specyficzne dla genu z ogonem na końcu 5' z sekwencją promotora T7 (TAATACGACTCACTATAGGG), aby celować w wirusa koinfekującego (np. VACV) lub interesujące nas transkrypty mRNA L. dispar. Te startery powinny wytwarzać produkt PCR o stężeniu 400–600 pz, aby zapewnić skuteczne knockdown za pośrednictwem RNAi. Patrz Gammon et al.13 dla sekwencji starterów używanych poniżej do eliminacji transkryptów VACV lub L. dysparują transkrypty za pośrednictwem RNAi za pośrednictwem dsRNA w komórkach LD652. 
		UWAGA: Transkrypty mRNA L. dispar można zidentyfikować na podstawie opublikowanych baz <danych transkryptomu >L. dispar class="xref">26,27,28.</li>
		<li>Wygenerowanie matrycy DNA za pomocą RT-PCR (synteza cDNA: 1 cykl w temperaturze 50 °C przez 30 min; PCR: 40 cykli po 94 °C przez 15 s, 50 °C przez 30 s i 68 °C przez 45 s każdy).</li>
		<li>Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.</li>
		<li>Używając oczyszczonego produktu PCR jako matrycy, transkrybuj i oczyszczaj dsRNA in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji i oczyszczania in vitro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja dsRNA lub plazmidowego DNA do komórek LD652
	<ol>
		<li>Wysiewaj 1 x 105 komórek/dołek z 24-dołkowej płytki i pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Dla każdej studzienki, która ma być transfekowana, rozcieńczyć 4 μl odczynnika do transfekcji w 100 μl SFM. Inkubować do 15 minut w temperaturze pokojowej. Można to przeskalować, aby uzyskać miks wzorcowy dla wszystkich transfekcji, które mają być wykonane.</li>
		<li>Rozcieńczyć do 1 μg dsRNA lub całkowitego plazmidowego DNA 100 μl SFM dla każdej studzienki, która ma być transfekowana. Inkubować do 15 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Wcześniej odkryliśmy, że transfekcja 1 μg komórek dsRNA/105 LD652 jest wystarczająca do >80% knockdown transkryptów wirusa lub gospodarza13, ale dawki dsRNA potrzebne do zmodyfikowanych układów/warunków eksperymentalnych będą musiały zostać określone empirycznie.</li>
		<li>Połączyć odczynnik do transfekcji i rozcieńczenia dsRNA/plazmidowego DNA w stosunku 1:1 (np. 100 μl rozcieńczonego dsRNA miesza się ze 100 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W międzyczasie umyj studzienki 1 ml / studzienkę SFM, a następnie dodaj 500 μl SFM do każdej studzienki.</li>
		<li>Powoli dodawaj kroplami mieszaninę odczynnika do transfekcji dsRNA (lub plazmidowego DNA) do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować odczynnik do transfekcji z komórkami przez 5 godzin.
		<ol>
			<li>W przypadku eksperymentów RNAi polegających na knockdown transkryptów kodowanych przez wirusa współinfekującego (np. VACV), odczynnik do transfekcji po 5-godzinnym okresie inkubacji transfekcji należy zastąpić inokulum wirusa zawierającym VSV-LUC (z lub bez VACV lub innego wirusa współinfekującego) (etap 3). Następnie zastąp inokulum wirusa zawierające VSV-LUC kompletną pożywką wzrostową 2 hpi. Testy LUC (krok 4) można następnie przeprowadzić na wyekstrahowanych lizatach w różnych punktach czasowych, aby określić, czy knockdown koinfekujących transkryptów wirusa prowadzi do utraty ratunku VSV-LUC.</li>
			<li>W przypadku eksperymentów RNAi z udziałem RNAi transkryptów L. dispar, zastąp mieszaninę transfekcji kompletną pożywką wzrostową i pozwól na knockdown przez 24 godziny przed zakażeniem VSV-LUC (krok 4). Testy LUC (krok 4) można następnie przeprowadzić na wyekstrahowanych lizatach w różnych punktach czasowych, aby określić, czy knockdown transkryptów L. dispar sprzyja ratowaniu VSV-LUC.</li>
			<li>W przypadku eksperymentów obejmujących transfekcję wektorów ekspresji plazmidu eksprymujących kandydujące immunomodulatory, należy zastąpić odczynnik do transfekcji i pozwolić na ekspresję białka przez 24 godziny przed zakażeniem VSV-LUC (krok 4). Testy LUC (krok 4) można następnie przeprowadzić na wyekstrahowanych lizatach w różnych punktach czasowych w celu określenia, czy ekspresja potencjalnych białek immunomodulujących sprzyja ratowaniu VSV-LUC. 
			UWAGA: Opisane tutaj warunki transfekcji przy użyciu 1 μg/studzienkę plazmidowego DNA skutkują skutecznością transfekcji na poziomie 40–60%13.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral tropism.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 281(2012).</li>
<li>Werden, S. J., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cell+signaling+in+poxvirus+tropism%3A+the+case+of+the+M-T5+host+range+protein+of+myxoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).</li>
<li>McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+determinants+of+viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytokine determinants of viral tropism.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).</li>
<li>Silva, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+shRNA+libraries+covering+the+mouse+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).</li>
<li>Moffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).</li>
<li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Experimental Biology and Medicine. 236 (8), Maywood, NJ. 962-967 (2011).</li>
<li>Marceau, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li>
<li>Savidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Zika+Virus+and+Dengue+Virus+Dependency+Factors+using+Functional+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics.</a> Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).</li>
<li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+genomic+screening%3A+elucidating+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).</li>
<li>Gammon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+vertebrate+DNA+virus+protein+disarms+invertebrate+immunity+to+RNA+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis.</a> Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).</li>
<li>Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+enters+cells+through+vesicles+incompletely+coated+with+clathrin+that+depend+upon+actin+for+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization.</a> PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394(2009).</li>
<li>Duntsch, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+virus+vectors+as+oncolytic+agents+in+the+treatment+of+high-grade+gliomas+in+an+organotypic+brain+tissue+slice-glioma+coculture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model.</a> Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).</li>
<li>Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-permissive+infection+of+insect+%28gypsy+moth%29+LD-652+cells+by+Vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus.</a> Virology. 248 (1), 74-82 (1998).</li>
<li>Seet, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxviruses+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Poxviruses and immune evasion.</a> Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).</li>
<li>Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cell+Cultures+and+Vaccinia+Virus+Stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).</li>
<li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cidofovir+resistance+in+vaccinia+virus+is+linked+to+diminished+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice.</a> Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).</li>
<li>Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+recombinant+vaccinia+virus+for+expression+of+small+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases.</a> Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).</li>
<li>Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+Caenorhabditis+elegans+with+Vesicular+Stomatitis+Virus+via+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li>
<li>Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+vaccinia+virus%3A+effects+of+interferon+on+viral+replication+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread.</a> Virology. 341 (2), 284-300 (2005).</li>
<li>Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+reporter+viruses+for+quantifying+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualizes+Experiments%22%5BJournal%5D)">Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression.</a> Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522(2014).</li>
<li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+transcriptome+of+the+Asian+gypsy+moth+Lymantria+dispar+identifies+numerous+transcripts+associated+with+insecticide+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).</li>
<li>Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+of+the+Lymantria+dispar+%28gypsy+moth%29+larval+midgut+in+response+to+infection+by+Bacillus+thuringiensis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis.</a> PloS One. 8 (5), e61190(2013).</li>
<li>Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymantria+dispar+IPLB-Ld652Y+cell+line+transcriptome+comprises+diverse+virus-associated+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts.</a> Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).</li>
<li>Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+cell+lines+expressing+baculovirus+P35%3A+resistance+to+apoptosis+and+nutrient+stress%2C+and+increased+glycoprotein+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).</li>
<li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li>
<li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li>
<li>Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%2C+chikungunya+and+dengue%3A+the+causes+and+threats+of+new+and+re-emerging+arboviral+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases.</a> BMJ Global Health. 3, (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisaliśmy proste testy oparte na fluorescencji i luminescencji w celu wykrycia warunków, które ratują replikację VSV w restrykcyjnych hodowlach komórek lepidoptera. Nieudane zakażenie VSV w komórkach lepidoptera tworzy doskonały stosunek sygnału do szumu podczas oznaczania ekspresji genu VSV. Na przykład, sygnały LU wykryte w lizatach z pojedynczych infekcji VSV-LUC były ~1000 razy wyższe niż w pozorowanych lizatach, ale sygnały te zmieniły się tylko około dwukrotnie w ciągu 72-godzinnego przebiegu czasu. W przeci...

Zdolność wirusa do produktywnej replikacji w określonym gospodarzu jest częściowo zależna od dostępności czynników komórek gospodarza, które wspierają wnikanie wirusa i jego replikację1. Zakres wirus-gospodarz może być również podyktowany zdolnością wirusa do przeciwdziałania komórkowej obronie przeciwwirusowej, która w przeciwnym razie utrudniałaby replikację wirusa2,3. To właśnie wynik tych złożonych interakcji wirus-gospodarz ostatecznie decyduje o tym, czy wirus będzie w stanie zakończyć swój cykl życiowy w danym gospodarzu. Biorąc pod uwagę potencjalnie patogenne konsekwencje dla gospodarza w przypadku replikacji wirusa, kluczowe znaczenie ma opracowanie strategii eksperymentalnych, aby pogłębić nasze zrozumienie kluczowych interakcji wirus-gospodarz, które mogą przechylić równowagę między infekcjami nieudanymi i produktywnymi. Wyjaśnienie cech molekularnych interakcji między wirusem a gospodarzem będzie miało zasadnicze znaczenie dla opracowania nowych i alternatywnych strategii leczenia przeciwwirusowego.
Wraz z pojawieniem się interferencji RNA (RNAi)4,5 i narzędzi do edycji genomu (np. CRISPR-Cas9, nukleazy palców cynkowych, TALENs)6,7, eksperymentalnie wykonalne stało się zmienianie ekspresji czynników komórkowych w skali całego genomu i badanie wpływu tych zmian na replikację wirusa. Rzeczywiście, przeprowadzono liczne badania przesiewowe oparte na RNAi i edycji genomu w typach komórek gospodarza bezkręgowców i kręgowców, które ujawniły nowe aspekty interakcji wirus-gospodarz8,9,10,11,12. Badania te zazwyczaj wykorzystują reportery kodujące wirusy, takie jak lucyferazy świetlików (LUC) lub białka fluorescencyjne (np. GFP, DsRed), które zapewniają wygodny sposób ilościowej oceny ekspresji genów wirusa jako odczytu dla replikacji wirusa9,12. Ta strategia pozwala naukowcom zidentyfikować czynniki gospodarza, które promują lub antagonizują replikację wirusa, o czym świadczy odpowiednio wzrost lub spadek sygnałów reporterowych wirusa9,12. Jednak w zdecydowanej większości przypadków badania przesiewowe zostały przeprowadzone przy użyciu wirusów, które są dobrze przystosowane do typu komórki gospodarza, w której są badane. Chociaż strategia ta może być ważna dla zrozumienia koewolucyjnych relacji między patogenami wirusowymi a ich naturalnymi gospodarzami, stwarza fundamentalne obawy dotyczące ich wykorzystania w odkrywaniu czynników przeciwwirusowych gospodarza. W takich przypadkach poszukuje się wzmocnienia sygnału reporterowego wirusa po knockdown RNAi lub inaktywacji czynnika komórkowego, który normalnie utrudnia replikację wirusa. Po pierwsze, jeśli wirus jest już zdolny do solidnej replikacji w komórce gospodarza badanej w warunkach kontrolnych, zakres dynamiczny ekranu (tj. zdolność do rozróżnienia między sygnałami reporterowymi tła i wzmocnionymi sygnałami reporterowymi wirusa) może być ograniczony. Po drugie, problem ten jest dodatkowo spotęgowany przez sytuacje, w których wirus jest dobrze przystosowany do komórki gospodarza i skutecznie przeciwdziała szlakom obronnym gospodarza, które są celem w ekranie.
Ze względu na powyższe obawy dotyczące tradycyjnych metod badania interakcji wirus-gospodarz, opracowaliśmy nowy paradygmat do badania interakcji wirus-gospodarz, który wykorzystuje naturalnie nieudane infekcje arbowirusowe w komórkach owadów lepidoptera. Strategia ta wywodzi się z obserwacji, że dobrze przebadany ludzki arbowirus, VSV, ulega nieudanej infekcji w komórkach pochodzących od cygańskiej (L. dispar)13. VSV jest naturalnie przenoszony przez muchówki (tj. muchy piaskowe) na gospodarzy ssaków i wykazano eksperymentalnie, że infekuje szeroki zakres bezkręgowców i kręgowców zarówno w hodowli komórkowej, jak i in vivo14. Jednoniciowy genom RNA VSV o ujemnym znaczeniu o długości 11 kb koduje pięć subgenomowych mRNA, z których każdy ulega translacji na białka tworzące wirion otoczkowy. Jednak systemy odwróconej genetyki VSV pozwoliły na stworzenie szczepów kompetentnych do replikacji, kodujących LUC lub białka fluorescencyjne, oprócz pięciu naturalnych produktów genu VSV15,16,17. Ponieważ te białka reporterowe nie są włączane do wirionu VSV, zapewniają wygodny odczyt ekspresji genu VSV, która zachodzi po wejściu. Używając szczepów VSV kodujących GFP lub LUC, wykazaliśmy wcześniej, że ekspresja genu VSV jest poważnie ograniczona po wejściu komórek LD652 i że miano VSV nie wzrasta przez 72 godziny po infekcji (hpi). Natomiast koinfekcja komórek LD652 VSV i wirusem ospy ssaków, wirusem krowianki (VACV), prowadzi do logarytmicznego wzrostu zarówno ekspresji genu VSV, jak i miana do tego punktu czasowego. VACV ulega wczesnej ekspresji genów, replikacji DNA i późnej ekspresji genów w infekcjach komórek LD652, ale cykl replikacji VACV jest ostatecznie nieudany z powodu niepełnej morfogenezy wirionu18. Duży ~192-kb genom DNA VACV koduje > 200 białek, z których wiele wykazuje właściwości immunomodulujące, które promują replikację wirusa poprzez supresję odpowiedzi immunologicznej gospodarza19. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że "uratowanie" replikacji VSV w komórkach LD652 przez koinfekcję VACV było prawdopodobnie pośredniczone przez immunomodulatory VACV, które hamowały odpowiedzi L. dispar, normalnie ograniczając replikację VSV. Na poparcie tego, traktowanie komórek LD652 inhibitorem polimerazy II RNA gospodarza aktynomycyną D również ratuje replikację VSV w komórkach LD652, co wskazuje, że zależne od transkrypcji odpowiedzi gospodarza blokują replikację VSV po wejściu13.
Powyższe obserwacje sugerują, że naturalnie restrykcyjna natura komórek LD652 do infekcji VSV może stanowić stosunkowo niskie tło podczas badań przesiewowych pod kątem warunków, które wzmacniają sygnały reporterowe kodowane przez VSV (tj. te, które hamują obronę przeciwwirusową gospodarza). W tym miejscu przedstawiamy metody stosowania testów fluorescencyjnych lub opartych na LUC do badań przesiewowych w kierunku stanów, które łagodzą ograniczenie VSV w komórkach Lepidoptera. Po pierwsze, pokazujemy, w jaki sposób te testy można wykorzystać do identyfikacji kodowanych wirusowo czynników immunomodulujących, które łamią ograniczenie VSV podczas eksperymentów z koinfekcją lub poprzez ektopową ekspresję potencjalnych czynników wirusowych. Jako przykład ilustrujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy te techniki przesiewowe do identyfikacji białek A51R kodowanych przez pokswirusa jako nowej rodziny czynników immunomodulujących, które ratują replikację VSV przy braku innych czynników poxvirus13. Po drugie, pokazujemy, w jaki sposób badania przesiewowe RNAi w restrykcyjnych infekcjach komórkowych VSV-LD652 mogą być wykorzystane do bezpośredniej identyfikacji eukariotycznych czynników gospodarza zaangażowanych w ograniczenie arbowirusa13.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>CELLTREAT</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>10 cm szalki do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>C430167</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Medium dla owadów</td><td>Sigma</td><td>G8142</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 420</td><td>Sigma</td><td>14420C</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> wzrostowa <td>1:1 mieszanina Grace's Insect Medium i EX-Cell 420 Pożywka bez surowicy zawierająca również 1% roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy i 10% płodowej surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100&czasy ;)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka wolna od surowicy (SFM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td></td></tr><tr><td>Arabinozyd cytozyny</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td><td>Corning</td><td>25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy reporterowej 5x</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1483</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe mikropłytki</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-FLAG</td><td>Wako</td><td>014-22383</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało lucyferazy przeciwko świetlikom</td><td>Abcam</td><td>ab21176</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-aktynowe</td><td>Sigma</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-VSV M</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. John Connor (Boston University)</td></tr><tr><td>Mysz anty-VACV I3L</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. David Evans (University of Alberta)</td></tr><tr><td>8-dołkowe naczynie komorowe</td><td>Lab-Tek II</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żywotności komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek FLUOstar</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Olympus</td><td>v1.18</td><td>cellSens</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Eppendorf 5702 Wirówka wentylowana Eppendorf</td><td></td><td>22628102</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc System obrazowania w podczerwieni</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>Odyssey Fc</td><td></td></tr><tr><td>LD652</td><td>komórki N/A</td><td>N/A</td><td>Dr. Basil Arif (Zasoby naturalne Kanada) Komórki</td></tr> <tr><td>BSC-40</td><td>Komórki ATCC</td><td>CRL-2761</td><td></td></tr><tr><td>Komórki BHK</td><td>Komórki ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Komórki</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Komórki BSC-1 Zestaw</td> do transkrypcji i oczyszczania <td>ATCC</td><td>CCL-26</td><td></td></tr><tr><td>in vitro Zestaw do oczyszczania</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Qiagen</td><td>Numer katalogowy: 28104</td><td></td></tr></tbody></table>

zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

platformy przesiewowe oparte na interferencji RNA i edycji genomu były szeroko stosowane do identyfikacji czynników komórek gospodarza, które ograniczają replikację wirusa. Jednak te badania przesiewowe są zwykle przeprowadzane w komórkach, które są naturalnie permisywne dla badanego patogenu wirusowego. W związku z tym solidna replikacja wirusów w warunkach kontrolnych może ograniczać zakres dynamiczny tych ekranów. Co więcej, badania te mogą nie być w stanie łatwo zidentyfikować komórkowych szlaków obronnych, które ograniczają replikację wirusa, jeśli wirus jest dobrze przystosowany do gospodarza i zdolny do przeciwdziałania obronie przeciwwirusowej. W tym artykule opisujemy nowy paradygmat badania interakcji wirus-gospodarz za pomocą badań przesiewowych, które koncentrują się na naturalnie nieudanych infekcjach arbowirusami, takimi jak wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Pomimo zdolności VSV do replikacji w szerokim zakresie owadów muchówek i ssaków, VSV ulega nieudanej infekcji po wprowadzeniu w różne linie komórkowe pochodzące od owadów z rzędu Lepidoptera, takich jak cygańska (Lymantria dispar). Jednak te nieudane infekcje VSV można "uratować", gdy obrona przeciwwirusowa komórek gospodarza jest zagrożona. Opisujemy, w jaki sposób szczepy VSV kodujące wygodne geny reporterowe i restrykcyjne linie komórkowe L. dispar mogą być sparowane w celu skonfigurowania badań przesiewowych w celu identyfikacji czynników gospodarza zaangażowanych w ograniczenie arbowirusa. Ponadto pokazujemy również przydatność tych narzędzi przesiewowych w identyfikacji czynników kodowanych wirusowo, które ratują replikację VSV podczas koinfekcji lub ekspresji ektopowej, w tym tych kodowanych przez wirusy ssaków. Naturalne ograniczenie replikacji VSV w komórkach L. dispar zapewnia wysoki stosunek sygnału do szumu podczas badań przesiewowych pod kątem warunków, które sprzyjają ratowaniu VSV, umożliwiając w ten sposób zastosowanie uproszczonych testów opartych na luminescencji i fluorescencji do monitorowania zmian w replikacji VSV. Metodologie te są cenne dla zrozumienia wzajemnych zależności między odpowiedziami przeciwwirusowymi gospodarza a wirusowymi czynnikami unikania odporności.

Jako przykład zastosowania obrazowania żywych komórek do monitorowania ratowania replikacji VSV po koinfekcji VACV, komórki LD652 wysiano do naczynia z 8 komorami, a następnie poddano infekcji pozornej lub infekcji VSV-DsRed (MOI = 1) w obecności lub absence VACV-FL-GFP (MOI = 25). Ponieważ VSV-DsRed wykazuje ekspresję DsRed jako wolne białko i nie jest on połączony z białkami strukturalnymi VSV (Rycina 1A), jest on wykrywany dopiero po wniknięciu VSV i rozpo...

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii wirusów, takie jak, które czynniki gospodarza ograniczają replikację arbowirusa, a co za tym idzie, które białka unikające odporności kodowane przez wirusa przezwyciężają te mechanizmy ograniczania gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wykorzystanie uproszczonych testów luminescencyjnych i fluorescencyjnych do określenia warunków komórkowych, które pozwalają arbowirusom na replikację w nieudanej infekcji w komórkach owadów z rzędu Lepidoptera. Ponieważ replikacja arbowirusów w tle w komórkach łuskoskrzydłych jest minimalna, wykrycie warunków, które pozwalają na replikację arbowirusa, staje się stosunkowo proste.Na początek utrzymuj komórki LD652 w 10-centymetrowych naczyniach poddanych kulturze tkankowej i przechodź komórki, gdy osiągną 80% konfluencji. Kilkakrotnie pipetować pożywkę na monowarstwę komórki, aby usunąć komórki, a następnie rozcieńczyć próbkę w pożywce wzrostowej do przybliżonej gęstości 100 tysięcy komórek na mililitr. Następnie przenieś jeden mililitr rozcieńczonej kultury do każdego dołka 24-dołkowej płytki.Następnie pozwól komórkom osiąść przez co najmniej godzinę. 30 minut przed infekcją rozmrozić łodygi lucyferazy VSV i wirusa krowianki na lodzie. Następnie rozcieńczyć lucyferazy VSV z wirusem krowianki i bez niego do SFM, tak aby uzyskać MOI odpowiednio 10 i 25.Ostrożnie odessać dojrzałe pożywki LD652, aby uniknąć naruszenia monowarstwy komórek, i zaszczepić każdą studzienkę 0,2 mililitra wirusa. Następnie dodaj sterylne SFM do dodatkowych studzienek, aby służyły jako pozorowane zakażone kontrole negatywne. Inkubować komórki w inokulum przez dwie godziny w temperaturze 27 stopni Celsjusza.Następnie usuń inokulum przez aspirację i zastąp je jednym milimetrem pożywki wzrostowej LD652 w każdym dołku. Następnie pozwól, aby infekcja postępowała jeszcze przez 24 do 72 godzin. Najpierw ostrożnie odessaj supernatant i dodaj jeden mililitr DPBS do każdej studzienki.Za pomocą tłoka strzykawki zeskrobać komórki do DPBS. Następnie przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej i wiruj przez 20 minut przy 400-krotności grawitacji i czterech stopniach Celsjusza. W międzyczasie rozcieńczyć pięciokrotnie bufor reporterowy do lizy w sterylnej wodzie.Po odwirowaniu zassać DPBS bez naruszania osadu. Następnie ponownie zawiesić pelety w 150 mikrolitrach jednorazowego RLB. Następnie inkubować próbkę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza, a następnie szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.Następnie przechowuj lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy. Rozmrozić lizaty na lodzie i odpipetować 20 mikrolitrów lizatu do dołków 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj 100 mikrolitrów regionu testowego lucyferazy do każdej studzienki płytki.Natychmiast zmierz natężenie światła za pomocą lumenometru. W warunkach pojedynczej infekcji komórki LD652 ograniczają replikację lucyferazy VSV. W ten sposób obserwuje się tylko niewielki sygnał lucyferazy.Koinfekcja powoduje jednak znacznie wyższe sygnały lucyferazy. W warunkach pojedynczej infekcji komórki LD652 również ograniczają replikację VSV dsRED, dlatego tylko niewielka liczba komórek wykazuje sygnał dsRED. Jednoczesne zakażenie wirusem krowianki powoduje jednak, że większość komórek wyświetla sygnały dsRED pod koniec czasu.Około 2% komórek z pojedynczych infekcji było dsRED dodatnich przez 65 godzin po zakażeniu. Natomiast około 77% współzakażonych komórek było dodatnich dsRED w tym samym punkcie czasowym. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o optymalizacji punktów czasowych, w których zostaną wykonane testy lucyferazy lub punkty czasowe obrazowania żywych komórek, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na replikację VSV i wytworzenie wykrywalnego sygnału.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak knockdown czynników gospodarza za pośrednictwem interferencji RNA, w celu zidentyfikowania potencjalnych czynników przeciwwirusowych gospodarza ograniczających replikację arbowirusa. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią wirusów do zdefiniowania roli białek A51R kodowanych przez wirusa ospy w promowaniu replikacji i patogenezy wirusa ospy. Nie zapominaj, że praca z wirusami eukariotycznymi może być niezwykle niebezpieczna i ważne jest, aby podjąć odpowiednie środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.

arbovirus-infections-as-screening-tools-for-identification-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Virochip to panwirulowa macierz mikroukładów zaprojektowana do jednoczesnego wykrywania wszystkich znanych wirusów, a także nowych wirusów, w oparciu o konserwatywną homologię sekwencji. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić badanie z użyciem Virochip w celu analizy próbek klinicznych pod kątem obecności wirusów znanych i nieznanych.

Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Celem protokołu jest zademonstrowanie technik używanych do badania chorób wirusowych poprzez izolację i ilościowe określenie wirusa Zika z wielu narządów u myszy po zakażeniu.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Zika z wielu narządów myszy

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.

Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj metody identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników gospodarza ograniczających replikację arbowirusów przy użyciu komórek LD652 i testów luminescencyjnych.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza (Wideo) | JoVE Journal

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Przeglądaj więcej filmów