Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Protokół ten opisuje nowatorską i łatwą metodę tworzenia trójwymiarowej tkanki serca opartą na formie, która wykorzystuje sferoidy jako narzędzie do tworzenia tkanki serca bez rusztowania. W naszych eksperymentach wyizolowano trzy typy komórek, ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych, ludzkie fibroblasty serca i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i wykorzystano je do wytworzenia zawiesiny komórkowej. Z 70% kardiomiocytami, 15% fibroblastami i 15% komórkami śródbłonka w stożkowej tubie o pojemności 50 ml.

Następnie dozujemy zawiesinę komórek do każdej studzienki systemu wiszących kropli o bardzo niskim nasadce, co spowoduje spontaniczne uformowanie się setek bijących sferoid po trzech dniach. Sferoidy są następnie zbierane i umieszczane w nowej jamie pleśni. Tkanka jest następnie przechowywana w sterylnym pojemniku z pożywką, na wytrząsarce w inkubatorze przez kilka dni.

Pleśń jest następnie usuwana, w wyniku czego powstaje łata tkankowa wolna od rusztowań o integralności mechanicznej. Wiszące urządzenie upuszczające to wielokrotnego użytku, ultra niska studnia z 850 mikroporami, każdy o średnicy 350 mikronów. Wisząca kropla jest kompatybilna ze standardowymi płytkami sześciodołkowymi.

Po wykonaniu zawiesiny komórek dozujemy cztery mililitry zawiesiny komórek zawierającej 10 milionów komórek, do każdej studzienki systemu wiszących kropli. Urządzenia są hodowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 95%. Po 72 godzinach obserwuje się spontaniczne tworzenie się bijących sferoid o średniej średnicy 350 mikronów.

Sferoidy zbiera się poprzez umieszczenie wiszącego urządzenia upuszczającego w innym naczyniu z podłożem i delikatne obracanie, aby uwolnić sferoidy i umożliwić im dryfowanie przez pory na dnie systemu wiszących kropli. Jest to schemat nowatorskiej formy do trójwymiarowego, pozbawionego rusztowań, tworzenia tkanki serca. Zawiera matę manipulacyjną, podstawę do napełniania i nowatorską formę.

Nowa forma składa się z podstawy, dolnej kwadratowej płyty, dolnej siatki, 10 warstw bocznych siatek wykonanych z drobnych zębów ze stali nierdzewnej. Górna siatka, górna kwadratowa płyta, rurki mocujące i kołki blokujące. System Novel Mold może tworzyć tkanki o różnych rozmiarach, w tym dwa na dwa milimetry, cztery na cztery milimetry i sześć na sześć milimetrów.

Dolna podstawa, kwadratowa płyta i dolna siatka są układane w stosy i wyrównywane za pomocą słupków narożnych. 10 warstw siatek bocznych jest następnie układanych w stosy w naprzemiennych kierunkach, aby utworzyć siatkę z drobnych zębów ze stali nierdzewnej, za pomocą pary sterylnych kleszczy. Baza wypełniająca jest następnie przepłukiwana roztworem buforu fosforanowego 1X lub PBS, w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego przed umieszczeniem sferoid w nowej formie.

Po zwilżeniu nowej wnęki formy w tym samym metanie, sferoidy są osadzane w założonej wnęce o pożądanej wielkości. Po osadzeniu nadmiar medium spływa przez formę siatkową, pozwalając sferoidom wypełnić się i przyjąć kształt predefiniowanej wnęki. Górna siatka i górna kwadratowa płyta są następnie montowane na słupkach narożnych, a kołki blokujące i rurki mocujące są mocowane, aby zapobiec wypłukiwaniu sferoid

Wypełniony nowy system form jest przenoszony na sześciodołkową płytkę z sześcioma milimetrami pożywki uzupełnionej B-27, a następnie utrzymywany w inkubatorze na wahadłowej wytrząsarce przez siedem do dziesięciu dni, przy 30 do 40 obr./min. Czas inkubacji może ulec zmianie w zależności od wielkości plastra sercowego. Po inkubacji system wyjmuje się i usuwa rurkę podtrzymującą, korki, górną kwadratową płytkę i górną siatkę.

Warstwowe siatki boczne są następnie ostrożnie wysuwane jedna po drugiej, uważając, aby nie naruszyć tkanki. Po usunięciu wszystkich siatek bocznych, na wierzchu siatki dolnej uzyskuje się nienaruszoną łatkę serca. Funkcjonalne bicie synchroniczne obserwuje się w ciągu 24 godzin.

Ta nowatorska metoda oparta na formie jest wydajną i łatwą metodą tworzenia trójwymiarowych tkanek serca wolnych od rusztowań, przy minimalnym wysiłku ręcznym. Powstałe wielowarstwowe tkanki składają się ze stopionych sferoid o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia. Ta nowatorska metoda oparta na formach stanowi opłacalną i skalowalną alternatywę dla obecnych metod biowytwarzania tkanek inżynieryjnych.