Name: Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych tkanek serca bez rusztowań przy użyciu sferoidów. Technika zapewnia zadowalającą integralność strukturalną i synchroniczne kurczenie się tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy podają następujące źródło finansowania: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research.

1. Przygotowanie kardiomiocytów
<ol>
	<li>Pokryj 6-dołkowe płytki macierzą błony podstawnej i hodowlą ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), jak opisano wcześniej17.</li>
	<li>Rozróżnij hiPSC na hiPSC-CM, korzystając z wcześniej opisanych metod18.</li>
	<li>Po 16 - 18 dniach po różnicowaniu zawiesić kardiomiocyty, przepłukując każdą studzienkę 2 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia lub magnezu, a następnie inkubować z 1 ml / studzienkę trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę lub odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przy użyciu równej objętości pożywki komórkowej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej B-27 (pożywka komórkowa RPMI/B-27). Pipetuj w górę i w dół, aby poluzować przylegające komórki.</li>
	<li>Zebrać zawieszone kardiomiocyty za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml pożywki komórkowej RPMI/B-27.</li>
	<li>Połączyć 20 μl zawiesiny komórkowej z równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Użyj ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórkowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie fibroblastów
<ol>
	<li>Rozpocznij hodowlę ludzkiej linii komórkowej fibroblastów serca (HCF) (typ komorowy dorosłego), jak opisano wcześniej16.</li>
	<li>Zawiesić HCF, inkubując je z odpowiednią ilością trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej16. W przypadku kolby T175 użyto 10 ml trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek.</li>
	<li>Zneutralizować trypsynę lub odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przy użyciu równej objętości pożywki, następnie przenieść próbkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml pożywki wzrostowej fibroblastów (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Połączyć 20 μl zawiesiny komórek HCF z równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność nowej zawiesiny komórek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Zainicjuj hodowlę linii komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), jak opisano wcześniej17. Zawiesić HUVEC, inkubując je z odpowiednią ilością trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela Materiałów) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej17. Zneutralizować trypsynę lub odczynnik do dysocjacji komórek (patrz Tabela materiałów) za pomocą równej objętości pożywki, następnie przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować zawiesinę komórek przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad. 
	UWAGA: W przypadku kolby T175 użyto 10 ml trypsyny lub odczynnika do dysocjacji komórek.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Połączyć 20 μl zawiesiny HUVEC i zabarwić ją równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórek.</li>
</ol>
4. Tworzenie sferoid wiszących kropli
<ol>
	<li>Umieść wiszące urządzenie do kroplowania, które zawiera 850 mikroporów (każdy o średnicy 350 μm) w sterylnych płytkach 6-dołkowych.</li>
	<li>Wyizoluj trzy typy komórek, jak opisano powyżej: hiPSC-CM, HCF i HUVEC. Połącz je w proporcji 70% iPSC-CM, 15% HCF i 15% HUVEC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z pożywką komórkową RPMI/B-27 w stężeniu 2 475 000 komórek na ml.</li>
	<li>Dozować 4 ml zawiesiny komórek (2 475 000 komórek na ml) do każdej studzienki systemu wiszących kropli o bardzo niskim nasadce (o średnicy mikroporów 350 μm) osadzonej na płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Sferoidy utworzą się spontanicznie w ciągu 12 godzin od dozowania zawiesiny komórek do wiszącego urządzenia kroplowego. Kontynuować hodowlę przez łącznie 72 godziny (3 dni) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% w celu dojrzewania sferoid.</li>
	<li>Po 72 godzinach hodowli zbierz sferoidy przez pory na dnie systemu wiszących kropli, umieszczając urządzenie w naczyniu z podłożem i delikatnie je obracając, aby uwolnić sferoidy z wiszącego urządzenia kroplowego.</li>
</ol>
5. Tworzenie łat 3D przy użyciu nowatorskiej formy sieciowej
<ol>
	<li>Podstawa, dolna kwadratowa płyta, dolna siatka i 10 warstwowych siatek bocznych są montowane w celu stworzenia nowatorskiej formy za pomocą pary sterylnych kleszczyków. Najpierw ułóż i wyrównaj podstawę, dolną kwadratową płytę i dolną siatkę za pomocą słupków narożnych. Następnie ułóż i ułóż 10 bocznych siatek w naprzemiennych kierunkach, aby utworzyć siatkę z drobnych zębów ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Przepłucz podstawę napełniającą PBS lub medium, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe, a następnie przenieś zmontowaną formę na podstawę napełniającą.</li>
	<li>Zwilż wnękę formy siatkowej PBS lub pożywką w ten sam sposób. Powoli napełniaj sferoidy do założonej wnęki o pożądanym rozmiarze (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm lub 6 x 6 x 1 mm). 
	Uwaga: Upewnij się, że 120% przewidywanej objętości sferoid jest wprowadzane do wnęki, tak aby agregaty komórek były ściśle połączone i pozostały statyczne.</li>
	<li>Zamontuj górną siatkę i górną kwadratową płytę na słupkach narożnych i zabezpiecz korki i rurki mocujące, aby zapobiec wypłukaniu sferoid.</li>
	<li>Przenieś napełniony system formy siatkowej na 6-dołkową płytkę z 6 ml pożywki komórkowej RPMI/B-27 lub do sterylnego pojemnika z wystarczającą ilością pożywki, aby pokryć całą zmontowaną formę.</li>
	<li>Inkubować 6-dołkową płytkę z wypełnionym systemem pleśni na wahadłowej wytrząsarce przez 7 - 10 dni w temperaturze 3 000 - 4 000 x g. 
	UWAGA: Czas trwania inkubacji zależy od wielkości plastrów sercowych. W przypadku większych plastrów czas inkubacji będzie musiał zostać wydłużony w celu dojrzewania plastra sercowego.</li>
</ol>
6. Usunięcie łatki z nowej formy sieciowej
<ol>
	<li>Wyjmij system formy z podłoża i umieść go na wysterylizowanej macie manipulacyjnej w sterylnym naczyniu o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Wyjmij rurkę mocującą, korki, górną kwadratową płytkę i górną siatkę. Ostrożnie wysuń warstwowe siatki boczne jedna po drugiej za pomocą sterylnych kleszczy. Po deniuulacji uzyskuje się nienaruszoną łatkę serca na szczycie dolnej siatki.</li>
	<li>Podnieś dolną siatkę z plastrem za pomocą sterylnych kleszczyków i przenieś dolną siatkę do 35-milimetrowego naczynia z 5 ml pożywki RPMI/B27. Delikatnie poluzuj plaster z dolnej siatki, powoli obracając siatkę w naczyniu lub za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Po oderwaniu od dolnej siatki tkanka serca może być hodowana za pomocą pożywki RPMI/B27.</li>
	<li>Kontynuuj inkubację swobodnie unoszącej się trójwymiarowej łaty serca w naczyniu o średnicy 35 mm. Funkcjonalne dudnienie synchroniczne można zaobserwować już po 24 godzinach od wyjęcia z formy.</li>
	<li>Po wyjęciu łaty z formy siatkowej należy zwrócić uwagę, że jej kształt jest zachowany z zachowaniem integralności, a intensywność synchronicznego bicia wzrasta z czasem. 
	UWAGA: Plastry serca oparte na pleśni 3D wykazywały integrację elektryczną składowych kardiosfer po dekaniulacji. Zaobserwowaliśmy częstotliwość dudnień w zakresie od 60 do 80 uderzeń na minutę, która utrzymywała się przez ponad 60 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
<li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).</li>
<li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li>
<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie tej metody polega na jej odtwarzalności i skuteczności uzyskanej wielowarstwowej tkanki serca. W dziedzinie inżynierii tkankowej serca jednym z obecnych celów jest zidentyfikowanie metody konstruowania bijących, wielowarstwowych i funkcjonalnych trójwymiarowych plastrów serca. Przedstawiamy wydajną i powtarzalną metodę tworzenia wielowarstwowych tkanek serca poprzez bezpośrednie ręczne wysiewanie sferoid złożonych z kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów do nowej formy siatkowej. Forma siatkowa stoso...

Celem obecnej inżynierii tkankowej serca jest opracowanie terapii zastępującej lub naprawiającej strukturę i funkcję uszkodzonej tkanki mięśnia sercowego1. Metody tworzenia trójwymiarowych modeli tkanki serca wykazujących ważne właściwości kurczliwe i elektrofizjologiczne natywnej tkanki serca szybko się rozwijają2,3. W badaniach zbadano i wykorzystano różne strategie4,5. Metody te obejmują zarówno stosowanie specyficznych syntetycznych i naturalnych bioaktywnych hydrożeli, takich jak żelatyna, kolagen, fibryna i peptydy6, po technologie osadzania biotuszem2 i technologie biodruku7. 
Wykazano, że metody bez rusztowań mogą wytwarzać porównywalne tkanki jak metody oparte na biomateriale, bez wad związanych z włączaniem obcego materiału rusztowania8. Oren Caspi i wsp. wykazali, że inkorporacja różnych typów komórek umożliwia generowanie wysoce unaczynionej ludzkiej tkanki serca zaprojektowanej przez człowieka9. Chin i in. opracowali metodę druku 3D do tworzenia łat sercowych ze sferoid. Powstałe plastry składają się z kardiomiocytów, fibroblastów i komórek śródbłonka w stosunku 70:15:1510. Wykazano, że sferoidy są skutecznymi "elementami budulcowymi" w tworzeniu tkanki serca bez rusztowań, ponieważ są odporne na niedotlenienie i mają wystarczającą integralność mechaniczną do implantacji11,12. Wcześniejsze badania wykazały kilka metod wytwarzania sferoidów, w tym zastosowanie metody wiszącej kropli, kolb przędzarki13, systemy mikroprzepływowe14 oraz nieprzylegające powierzchnie hodowlane niepokryte lub pokryte mikropleśniami agarozowymi<klasa sup='xref'>15. W tym protokole używamy urządzenia do zawieszania kropli, które zawiera mikropory do kondensacji setek sferoid jednocześnie.
To badanie przedstawia nowatorską i efektywną metodę tworzenia tkanki sercowej bez rusztowań, która obejmuje ręczne umieszczanie sferoid w kwadratowej jamie formy i inkubację tkanki na wytrząsarce w celu dojrzewania. W zwykłych warunkach hodowli statycznej dyfuzja tlenu jest ograniczona do zewnętrznych aspektów konstruktu tkankowego, co prowadzi do martwicy centralnej. Jednak w przypadku formy siatkowej wszystkie sferoidy osadzone w formie są zanurzane w mediach o stałym ruchu płynnym, co pozwala na zwiększoną dyfuzję składników odżywczych i tlenu. Dodatkowo ta metoda oparta na formie pozwala na jednoczesne tworzenie plastrów tkankowych o różnej wielkości przy minimalnym wysiłku ręcznym, a powstałą tkankę można łatwo usunąć z formy. Ta nowatorska metoda pozwala na wydajne i powtarzalne tworzenie wielowarstwowych plastrów serca bez rusztowań.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie fibroblasty serca (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 Składa się z podłoża podstawowego</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF Pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana E8 pożywka&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1517001</td><td>Pożywka hodowlana HiPSC</td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Trypsyna i odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Pożywka RPMI Pożywka</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>RPMI z suplementem B-27 to pożywka hodowlana hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x)</td><td>Pożywka Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI z suplementem B-27 to pożywka hodowlana hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy Roztwór, 0,4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nowatorska forma siatkowa&nbsp;</td><td>TissueByNet Co., Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Wisząca płytka opadająca</td><td>Kuraray Co., Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Ten protokół opisuje nowatorską i łatwą metodę tworzenia trójwymiarowych (3-D) tkanek serca bez dodatkowego materiału na rusztowania. Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CM), ludzkie fibroblasty serca (HCF) i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są izolowane i wykorzystywane do wytworzenia zawiesiny komórkowej z 70% iPSC-CM, 15% HCF i 15% HUVEC. Są one hodowane wspólnie w systemie "wiszącej kropli" o bardzo niskim nasadce, który zawiera mikropory do kondensacji setek sferoid jednocześnie. Komórki agregują się i spontanicznie tworzą bijące sferoidy po 3 dniach wspólnej hodowli. Sferoidy są zbierane, wysiewane do nowej jamy pleśni i hodowane na wytrząsarce w inkubatorze. Sferoidy stają się dojrzałą tkanką funkcjonalną po około 7 dniach od wysiewu. Powstałe w ten sposób wielowarstwowe tkanki składają się ze zrośniętych sferoid o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia. Ta nowa metoda ma obiecujący potencjał jako powtarzalna i opłacalna metoda tworzenia zmodyfikowanych tkanek do leczenia niewydolności serca w przyszłości.

W naszych eksperymentach wykorzystaliśmy zawiesinę komórkową składającą się z 70% iPSC-CMs, 15% HCFs i 15% HUVECs w pożywce RPMI/B-27 przy stężeniu 2 475 00 komórek na mL. Po przygotowaniu zawiesiny komórkowej, do każdego otworu systemu kropel wiszących o ultra-niskim stopniu przylegania (ultra-low attachment hanging drop system) naniesiono 4 mL zawiesiny, zgodnie z opisem w kroku 4.3 protokołu. Zastosowanie systemu kropel wiszących doprowadziło do spontanicznego utworzenia się setek biją...

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Protokół ten opisuje nowatorską i łatwą metodę tworzenia trójwymiarowej tkanki serca opartą na formie, która wykorzystuje sferoidy jako narzędzie do tworzenia tkanki serca bez rusztowania. W naszych eksperymentach wyizolowano trzy typy komórek, ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych, ludzkie fibroblasty serca i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej i wykorzystano je do wytworzenia zawiesiny komórkowej. Z 70% kardiomiocytami, 15% fibroblastami i 15% komórkami śródbłonka w stożkowej tubie o pojemności 50 ml.Następnie dozujemy zawiesinę komórek do każdej studzienki systemu wiszących kropli o bardzo niskim nasadce, co spowoduje spontaniczne uformowanie się setek bijących sferoid po trzech dniach. Sferoidy są następnie zbierane i umieszczane w nowej jamie pleśni. Tkanka jest następnie przechowywana w sterylnym pojemniku z pożywką, na wytrząsarce w inkubatorze przez kilka dni.Pleśń jest następnie usuwana, w wyniku czego powstaje łata tkankowa wolna od rusztowań o integralności mechanicznej. Wiszące urządzenie upuszczające to wielokrotnego użytku, ultra niska studnia z 850 mikroporami, każdy o średnicy 350 mikronów. Wisząca kropla jest kompatybilna ze standardowymi płytkami sześciodołkowymi.Po wykonaniu zawiesiny komórek dozujemy cztery mililitry zawiesiny komórek zawierającej 10 milionów komórek, do każdej studzienki systemu wiszących kropli. Urządzenia są hodowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i wilgotności 95%. Po 72 godzinach obserwuje się spontaniczne tworzenie się bijących sferoid o średniej średnicy 350 mikronów.Sferoidy zbiera się poprzez umieszczenie wiszącego urządzenia upuszczającego w innym naczyniu z podłożem i delikatne obracanie, aby uwolnić sferoidy i umożliwić im dryfowanie przez pory na dnie systemu wiszących kropli. Jest to schemat nowatorskiej formy do trójwymiarowego, pozbawionego rusztowań, tworzenia tkanki serca. Zawiera matę manipulacyjną, podstawę do napełniania i nowatorską formę.Nowa forma składa się z podstawy, dolnej kwadratowej płyty, dolnej siatki, 10 warstw bocznych siatek wykonanych z drobnych zębów ze stali nierdzewnej. Górna siatka, górna kwadratowa płyta, rurki mocujące i kołki blokujące. System Novel Mold może tworzyć tkanki o różnych rozmiarach, w tym dwa na dwa milimetry, cztery na cztery milimetry i sześć na sześć milimetrów.Dolna podstawa, kwadratowa płyta i dolna siatka są układane w stosy i wyrównywane za pomocą słupków narożnych. 10 warstw siatek bocznych jest następnie układanych w stosy w naprzemiennych kierunkach, aby utworzyć siatkę z drobnych zębów ze stali nierdzewnej, za pomocą pary sterylnych kleszczy. Baza wypełniająca jest następnie przepłukiwana roztworem buforu fosforanowego 1X lub PBS, w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego przed umieszczeniem sferoid w nowej formie.Po zwilżeniu nowej wnęki formy w tym samym metanie, sferoidy są osadzane w założonej wnęce o pożądanej wielkości. Po osadzeniu nadmiar medium spływa przez formę siatkową, pozwalając sferoidom wypełnić się i przyjąć kształt predefiniowanej wnęki. Górna siatka i górna kwadratowa płyta są następnie montowane na słupkach narożnych, a kołki blokujące i rurki mocujące są mocowane, aby zapobiec wypłukiwaniu sferoid.Wypełniony nowy system form jest przenoszony na sześciodołkową płytkę z sześcioma milimetrami pożywki uzupełnionej B-27, a następnie utrzymywany w inkubatorze na wahadłowej wytrząsarce przez siedem do dziesięciu dni, przy 30 do 40 obr./min. Czas inkubacji może ulec zmianie w zależności od wielkości plastra sercowego. Po inkubacji system wyjmuje się i usuwa rurkę podtrzymującą, korki, górną kwadratową płytkę i górną siatkę.Warstwowe siatki boczne są następnie ostrożnie wysuwane jedna po drugiej, uważając, aby nie naruszyć tkanki. Po usunięciu wszystkich siatek bocznych, na wierzchu siatki dolnej uzyskuje się nienaruszoną łatkę serca. Funkcjonalne bicie synchroniczne obserwuje się w ciągu 24 godzin.Ta nowatorska metoda oparta na formie jest wydajną i łatwą metodą tworzenia trójwymiarowych tkanek serca wolnych od rusztowań, przy minimalnym wysiłku ręcznym. Powstałe wielowarstwowe tkanki składają się ze stopionych sferoid o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia. Ta nowatorska metoda oparta na formach stanowi opłacalną i skalowalną alternatywę dla obecnych metod biowytwarzania tkanek inżynieryjnych.

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej.  Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

W tych badaniach podajemy metodologię nowatorskich, noworodkowych, mysich rusztowań serca do wykorzystania w badaniach regeneracyjnych.

Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Modele dostosowane do potrzeb pacjenta zwiększają pewność siebie chirurga i współpracowników podczas opracowywania lub uczenia się planów chirurgicznych. Drukarki trójwymiarowe (3D) generują odpowiednie szczegóły do przygotowania chirurgicznego, ale nie są w stanie odtworzyć wierności dotykowej tkanek. Przedstawiono protokół szczegółowo opisujący tworzenie specyficznych dla pacjenta, silikonowych modeli serca, łączących precyzję druku 3D z symulowaną tkanką silikonową.

Tworzenie specyficznych dla pacjenta silikonowych modeli serca z zastosowaniami w planach przedoperacyjnych i szkoleniach praktycznych

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę tworzenia trójwymiarowych tkanek serca bez rusztowań przy użyciu sferoidów. Technika zapewnia zadowalającą integralność strukturalną i synchroniczne kurczenie się tkanek.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Przeglądaj więcej filmów