Humanizowany mysi model^NOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Kwestie te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad HIV/AIDS, takie jak mechanizm molekularny i rokowanie zakażenia wirusem HIV oraz jak i gdzie powstaje rezerwuar latencji. Zaletą tej techniki jest to, że jest nieinwazyjna i ustaliła myszy hu-NSG, które muszą leczyć rozwój wieloliniowy na przeszczepionych ludzkich komórkach macierzystych, które są podatne na zakażenie wirusem HIV i są podatne na cART. Rozpocznij od przefiltrowania strawionej, ludzkiej, płodowej, wątrobowej tkanki płucnej próbki gnojowicy przez sterylne, nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki i wzbogacenie o CD34 + HSC przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych zgodnie z instrukcjami producenta.

Po zliczeniu ponownie zawiesić HSC przy stężeniu od dwóch razy dziesięć do siódmych żywotnych komórek na mililitr w świeżych DPBS na lodzie. Następnie umieść cały noworodek myszy NOD/SCID/gamma lub NSG w sterylnej klatce do napromieniania w kształcie ciasta i potraktuj zwierzęta 200 do 250 stopniami Celsjusza promieniowania gamma ze źródła promieniowania cezowego-137. Następnie załaduj komórki do specjalnie wykonanej strzykawki Hamilton 80508 o pojemności 50 mikrolitrów wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 i wstrzyknij każdemu nowonarodzonemu zwierzęciu bezpośrednio do wątroby pięć razy dziesięć do jednej piątej zdolnych do życia ludzkich CD34 + HSC i 25 mikrolitrów DPBS.

Dziesięć do dwunastu tygodni po zakażeniu odwiruj próbki krwi z orbity, obwodowej krwi od każdej myszy przez wirowanie i przenieś supernaty osocza do probówek mikrowirówek w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. W celu walidacji wszczepienia HSC ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek i wyciągnąć zawiesiny komórek do 1,5-milimetrowej probówki mikrowirówkowej na dziesięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie zbierz pozostałe białe krwinki przez odwirowanie przez dwa przemycia w 0,5 mililitra świeżej, 0,01% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA, w DPBS na płukanie.

Po drugim myciu zablokuj komórki 100 mikrolitrami koktajlu blokującego na dwadzieścia minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie oznacz odpowiednim koktajlem przeciwciał o stężeniu 2 mikrolitry na jedno do szóstego stężenia. Po 30 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza umyj komórki dwa razy w świeżym DPBS plus BSA i oceń próbki krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami w celu ilościowego określenia procentu ludzkich komórek CD45 + CD3 + CD14 + lub CD19 + w próbce. Następnie oblicz stosunek limfocytów T CD4 + do CD8 + i oceń miano wirusa w próbkach osocza zgodnie ze standardowymi, ilościowymi, odwrotną transkryptazą i protokołami PCR.

Aby ocenić skutki zakażenia wirusem HIV, należy dostarczyć wirusa HIV beli znieczulonym myszom NSG z ponad 20-procentową populacją ludzkich komórek CD45 + we krwi obwodowej, w stężeniu 200 nanogramów P24 na mysz przez podanie dootrzewnowe, pobierając próbki krwi przez krwawienie zaoczodołowe co dwa tygodnie i analizuj zarówno stosunek CD4 do CD8, jak i miano wirusa w osoczu, jak pokazano. W celu walidacji supresji wirusa należy co tydzień przez 4 tygodnie pobierać zakażone ludzkie zwierzęta NSG ze świeżą, skojarzoną terapią antyretrowirusową lub cART w słodzonej wodzie, pobierając próbki krwi przez krwawienie zaoczodołowe co dwa tygodnie i analizując zarówno stosunek CD4 do CD8, jak i miano wirusa w osoczu, jak pokazano. Aby ocenić odbicie wirusa, gdy miano wirusa w osoczu jest poniżej granicy wykrywalności, a stosunek CD4 do CD8 zostaje przywrócony między 1,5 a 2,5, należy pobrać próbki krwi obwodowej przez krwawienie zaoczodołowe co 2 tygodnie po wycofaniu cART i ocenić próbki, jak wykazano.

Podczas wstępnej walidacji wszczepienia liczba ludzkich komórek CD45 + powinna wynosić od 20 do 80 procent, a podzbiory ludzkich leukocytów powinny pojawiać się jako odrębne populacje w analizie cytometrii przepływowej. Stosunek komórek CD4 + do CD8 + utrzymuje się między 1,5 a 2,5 u zdrowych osób, podczas gdy znaczne wyczerpanie komórek T CD4 + obserwuje się zwykle po infekcji wirusowej. Warto zauważyć, że zdrowy stosunek zostaje przywrócony w odpowiedzi na leczenie cART.

Wykrywanie miana wirusa w osoczu za pomocą ilościowego RT PCR w trakcie infekcji i schematu cART można wykreślić i wykorzystać do oceny skuteczności odpowiednio dostarczania wirusa i leczenia przeciwwirusowego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w badania wirusologiczne HIV/AIDS i rozwój terapeutyczny, może być również stosowana do innych badań związanych z chorobami ludzkimi, takimi jak rak, cukrzyca i choroby autoimmunologiczne. Opracowanie mysiego modelu hu-NSG utorowało drogę naukowcom zajmującym się immunologią i onkologią do zbadania nowych dysfunkcji i patologii u ludzi, w szczególności badań mechanistycznych i terapeutycznych ukierunkowanych na przewlekłe zakażenie wirusem HIV i rezerwuar latencji.