Name: Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę tworzenia humanizowanych myszy hu-NSG do badań nad replikacją i latencją HIV. Model ten umożliwia analizę infekcji oraz testowanie terapii antyretrowirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health [granty numery R01AI29329, R01AI42552 i R01HL07470 dla J.J.R.] oraz National Cancer Institute of the National Institutes of Health [grant numer P30CA033572 na wsparcie City of Hope Integrative Genomics, Analytical Pharmacology, and Analytical Cytometry Cores]. Następujący odczynnik został uzyskany za pośrednictwem NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: WIRUS HIV BaL.

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami sprawdzonymi i zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Mieście Nadziei (IACUC) prowadzony przez głównego badacza tego badania (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tkanka wątroby ludzkiego płodu została uzyskana z Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA), organizacji non-profit, zgodnie z przepisami federalnymi i stanowymi. Sprzedawca posiada własną Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) i spełnia wymagania dotyczące ochrony osób. Ludzkie PBMC są izolowane z odrzuconych próbek krwi obwodowej od anonimowych zdrowych dawców z Centrum Krwiodawstwa City of Hope (Duarte, Kalifornia), bez identyfikacji ze względu na wiek, rasę, płeć lub pochodzenie etniczne. IRB#/REF#: 97071/075546
1. Ogólna praktyka aseptyki
<ol>
	<li>Przeprowadzaj eksperymenty z kulturami tkankowymi w wyznaczonych komorach z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przechowuj pożywkę do hodowli tkankowych i suplementy w sterylnych warunkach, a przed użyciem przefiltruj za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotowane ludzkie HSC należy przechowywać w sterylnych probówkach i przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia.</li>
	<li>W wyniku poważnego niedoboru odporności należy obchodzić się z myszami NSG w sposób aseptyczny. Noś jednorazowy fartuch chirurgiczny, czepek do włosów, maskę na twarz, ochraniacze na buty i rękawiczki, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Zdezynfekuj powierzchnię stołu, uchwyt na napromieniowanie i komorę indukcyjną do znieczulenia środkiem sterylizującym na bazie dwutlenku chloru (np. Clidox) przed i po eksperymentach.</li>
	<li>Zastosuj maść do oczu na bazie ropy naftowej po krwawieniu zaoczodołowym, aby zapobiec suchości oczu.</li>
	<li>Zmiana diety na zawierającą antybiotyki, aby zapobiec infekcji spowodowanej krwawieniem zaoczodołowym.</li>
</ol>
2. Postępowanie z wirusem HIV, zakażonymi gryzoniami i próbkami krwi/tkanek zawierającymi wirusa
UWAGA: HIV jest ludzkim patogenem klasy 3; zasady postępowania muszą być dokładnie przestrzegane.
<ol>
	<li>Z próbkami zawierającymi wirusa HIV należy obchodzić się w wyznaczonej przestrzeni laboratoryjnej BSL2+/3. Na czas transportu należy bezpiecznie zablokować odczynniki zawierające wirusy w pojemniku dodatkowym. Przed transportem zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię wszystkich pojemników, dokładnie przecierając 10% wybielaczem i izopropanolem.</li>
	<li>Wszystkie odpady zawierające wirusy należy przechowywać w przeznaczonych do tego pojemnikach z 2-3 warstwami worków na odpady niebezpieczne biologicznie. Przed usunięciem odpadów należy je zdezynfekować, obficie spryskując je roztworem jodu/etoksylowanego nonylofenolu (np. Wescodyne) i autoklawem.</li>
	<li>Nosić środki ochrony osobistej: czepek do włosów, osłonę twarzy, osłonę twarzy zapobiegającą rozpryskiwaniu, ochraniacze na buty, jednorazowy fartuch chirurgiczny i rękawice dwuwarstwowe.</li>
	<li>Z zarażonymi gryzoniami należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością. Przeprowadzaj zastrzyki i pobieranie krwi, gdy myszy są pod narkozą (kroki 5.1-5.2, 6.3-6.5, 7.3 i 8.1-8.2).</li>
</ol>
3. Izolacja hematopoetycznych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kolagenazy/dypazy do trawienia tkankowego.
	<ol>
		<li>Rozpuścić kolagenazę/proszek dypazy w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 100 mg/ml i przechowywać kolagenazę/roztwór podstawowy dypazy w 150 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Do pracy z roztworem kolagenazy należy rozcieńczyć 150 μl kolagenazy/dypazy z 15 ml RPMI 1640 uzupełnionym 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny. 
		UWAGA: Końcowe stężenie kolagenazy/dypazy do trawienia tkanek wynosi 1 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą sterylnej żyletki pokrój tkankę wątroby płodu (16-24 tydzień ciąży) na małe kawałki (około 2-3mm3 wielkości), a następnie trawij roztworem kolagenazy/dypazy (1 mg / ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dostosuj objętość roztworu trawiącego tak, aby wszystkie fragmenty tkanki były całkowicie zanurzone. Użyj tylnego końca tłoka strzykawki, aby delikatnie zmielić próbkę tkanki, aby ułatwić trawienie.</li>
	<li>Przepuść mieszaninę wytrawiającą przez sterylny nylonowy filtr siatkowy o średnicy 70 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Wzbogacanie dla CD34+ HSC przy użyciu systemu MACS zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Policz żywotny procent wzbogaconych HSC CD34 + za pomocą hemacytometru28 i przystąp do wstrzyknięcia dowątrobowego noworodkom myszy NSG.</li>
	<li>Pozostałe wzbogacone CD34+ HSC należy zamrozić w pożywce do zamrażania (np. CryoStor CS2) i zakonserwować komórki w zbiorniku z ciekłym azotem. Przy przyszłym użyciu należy ponownie przeliczyć realny procent rozmrożonych CD34+ HSC przed wstrzyknięciem. Przy zastosowaniu pożywek zamrażających żywotność po rozmrożeniu wynosi od 80 do 90%.</li>
</ol>
4. Dowątrobowe wstrzyknięcie ludzkich CD34+ HSC u noworodków NSG
UWAGA: Noworodki NSG 2-3 dni po urodzeniu są najbardziej odpowiednie do tej procedury, ponieważ są wystarczająco silne, aby wytrzymać napromieniowanie w połowie śmiertelnej dawce, a jednocześnie wystarczająco młode, aby mieć całkowicie upośledzony układ odpornościowy. Do wstrzyknięcia HSC nie jest wymagane znieczulenie.
<ol>
	<li>Umieść cały miot nowonarodzonych myszy NSG (zwykle 5-10 myszy obu płci) w sterylnej klatce do napromieniania w kształcie ciasta i wystaw na całkowitą dawkę promieniowania gamma 200-250 cGy ze źródła promieniowania cezu-137. Upewnij się, że dawka promieniowania mieści się w zakresie, ponieważ można zaobserwować znaczną utratę wagi, a nawet śmierć, gdy myszy NSG są narażone na wysokie dawki promieniowania. 12 
	UWAGA: Promieniowanie stanowi zagrożenie dla zdrowia, należy podjąć środki ochrony osobistej przed promieniowaniem.</li>
	<li>Po napromienianiu wstrzyknąć każdej nowonarodzonej myszy NSG 5 x 105 zdolnych do życia ludzkich CD34 + HSC za pomocą zestawu strzykawka/igła (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Bezpośrednio wstrzyknąć komórki do wątroby.</li>
</ol>
5. Walidacja wszczepienia poprzez krwawienie zaoczodołowe i analizę cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po 10-12 tygodniach od wstrzyknięcia HSC znieczulij myszy za pomocą aparatu do inhalacji izofluranu/tlenu. Dostosuj przepływ tlenu, aby utrzymać zawartość izofluranu na poziomie 4-5%. Znieczulenie trwa 3-5 minut, w zależności od konkretnej myszy. Prawidłowo znieczulone myszy wykazują powolny i głęboki wzorzec oddychania oraz brak reakcji na stymulację szczypania palców.</li>
	<li>Zbierz 50-100 μl krwi obwodowej od każdej myszy poprzez pobieranie próbek retro-orbitalnych28. Przechowuj próbki krwi w probówkach K2EDTA lub heparynizowanych probówkach do pobierania krwi, aby zapobiec krzepnięciu. 
	UWAGA: Probówki do pobierania krwi muszą mieć powłokę przeciwzakrzepową, aby mysie PBMC można było wyizolować z krwi pełnej do analizy cytometrii przepływowej. Wiadomo, że EDTA hamuje reakcje enzymatyczne, takie jak PCR i qRT-PCR; Tak więc, jeśli wymagane są dalsze reakcje enzymatyczne, należy użyć aparatu do pobierania krwi w heparyniźnie.</li>
	<li>Odwirować próbki krwi o masie 2 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia krwinek.
	<ol>
		<li>Po odwirowaniu przenieść supernatanty osocza do nowych probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli wymagana jest analiza cytokin.</li>
		<li>Lizować czerwone krwinki (RBC) w osadach krwinek w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy użyciu buforu do lizy czerwonych krwinek (tabela materiałów). 
		UWAGA: Jeśli próbki osocza nie są wymagane, należy bezpośrednio poddać lizie krew pełną roztworem do lizy bez wirowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostałe krwinki po lizie erytrocytów w odległości 300 x g osadzać osadem przez 5 minut w temperaturze 4 °C; odessać supernatant. Przemyć granulki komórek 0,01% BSA zawierającym DPBS, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
	<li>Blokuj komórki 100 μl 1x koktajlu blokującego (Tabela 3 dla przepisu) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zablokowaniu bezpośrednio dodać każdy roztwór przeciwciała do zawiesiny komórkowej o stężeniu 2 μl/106 komórek i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przeciwciała do walidacji wszczepienia to: anty-ludzkie CD45 (leukocyty, RRID: AB_2732068), anty-ludzkie CD3 (limfocyty T, RRID: AB_396896), anty-ludzkie CD4 (pomocnicze limfocyty T, RRID: AB_397037), anty-ludzkie CD8 (cytotoksyczne limfocyty T, RRID: AB_2722501), anty-ludzkie CD14 (monocyty, RRID: AB_10373536) i anty-ludzkie CD19 (limfocyty B, RRID: AB_10373382). Sugerowany panel przepływu znajduje się w Tabeli 4 i Tabeli materiałów dla numerów katalogowych, RRID i numerów partii. 
	UWAGA: Barwienie przeciwciał w roztworze blokującym eliminuje niespecyficzne wiązanie przeciwciał anty-ludzkich z mysimi markerami powierzchniowymi, ponieważ kilka markerów powierzchniowych ma wspólną homologię między człowiekiem a myszą.</li>
	<li>Wyizoluj ludzkie PBMC od zdrowych dawców i przygotuj jednobarwne kontrole kompensacji cytometrii przepływowej przy użyciu oczyszczonych ludzkich PBMC. Alternatywnie, użyj mikrosfer znakowanych fluorescencją jako kontroli kompensacji29.</li>
	<li>Przeanalizuj próbki krwi obwodowej za pomocą cytometru przepływowego i określ ilościowo procent ludzkich komórek CD45 +, ludzkich komórek CD3 +, ludzkich komórek CD14 + i ludzkich komórek CD19 + od całkowitych komórek krwi obwodowej.
	<ol>
		<li>W przypadku dalszych badań nad zakażeniem wirusem HIV i latencją należy obliczyć odsetek limfocytów T CD4 + i limfocytów T CD8 + w komórkach CD3 +. 
		UWAGA: Zazwyczaj stosunek CD4:CD8 między 1,5 a 2,5 jest obserwowany przed zakażeniem wirusem HIV30.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza zakażenia wirusem HIV myszy hu-NSG i wiremii w osoczu za pomocą qRT-PCR
<ol>
	<li>Rozmnażaj wirusa HIV BaL w ludzkich PBMC od zdrowych dawców, zbieraj w 10 dniu po zakażeniu i miareczkuj za pomocą p24 ELISA kit31.</li>
	<li>Wybierz myszy hu-NSG z ponad 20% ludzkimi komórkami CD45 + we krwi obwodowej pod kątem zakażenia wirusem HIV.</li>
	<li>Znieczulenie myszy hu-NSG za pomocą aparatu do inhalacji izofluranu/tlenu (krok 5.1).</li>
	<li>Po potwierdzeniu, że zwierzę jest znieczulone, wstrzyknąć wirusa HIV BaL w dawce 200 ng p24 na mysz drogą dootrzewnową. 
	UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność z igłą, nie używaj jej ponownie i wyrzuć natychmiast po użyciu do wyznaczonego ostrego pojemnika. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia po podaniu wirusa.</li>
	<li>Trzy tygodnie po zakażeniu znieczulij myszy hu-NSG i zbierz krew obwodową przez krwawienie zaoczodołowe za pomocą heparynizowanych kapilar i probówek zbiorczych.</li>
	<li>Oddzielić osocze i komórki krwi przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 20 minut.</li>
	<li>Liza erytrocytów. Zablokować i wybarwić pozostałe komórki krwi przeciwciałami do analizy cytometrii przepływowej (sekcja 5.3-5.8). 
	UWAGA: Analiza cytometrii przepływowej powinna koncentrować się na porównaniu stosunku CD4:CD8 przed i po zakażeniu. Oczekuje się znacznego spadku liczby komórek CD4 +, ponieważ antygen CD4 służy jako koreceptor do wnikania wirusa.</li>
	<li>Użyj próbek osocza do analizy wiremii HIV za pomocą qRT-PCR. Wyizoluj wirusowe RNA z próbek osocza za pomocą mini zestawu wirusowego RNA. Wykonać qRT-PCR z starterami LTR specyficznymi dla HIV-1 i zestawami sond (szczegóły sekwencji w Tabeli 5), korzystając z protokołu producenta.</li>
</ol>
7. Doustne podawanie cART i walidacja supresji wirusa (opcjonalnie)
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny dla badań dotyczących rokowania HIV, wirusologii lub patofizjologii związanej z infekcją podczas ostrej fazy infekcji. Leczenie cuART zakażonego HIV hu-NSG służy do podsumowania latencji HIV wśród pacjentów otrzymujących cART. Pomyślnie zakażonym wirusem HIV myszom hu-NSG podaje się cART przez 4 tygodnie. Schemat cART składa się z fumaranu dizoproksylu tenofowiru (TDF; 300 mg/kapsułkę), emtrycytabiny (FTC; 200 mg/kapsułkę) i raltegrawiru (RAL; 400 mg/kapsułkę). Dawka cART w leczeniu myszy hu-NSG zakażonych wirusem HIV jest dostosowywana w zależności od powierzchni ciała (Tabela 1, Równanie 1, Tabela 2)32.
<ol>
	<li>Oblicz ilość każdego leku wymaganą dla każdej klatki w ciągu jednego tygodnia leczenia, biorąc pod uwagę objętość butelki z wodą, liczbę myszy w każdej klatce oraz średnie dzienne spożycie wody wynoszące 4 ml na mysz. 
	UWAGA: Kluczowym punktem na tym etapie jest upewnienie się, że każda mysz otrzymuje dzienną dawkę w promieniu 4 ml od wody pitnej.</li>
	<li>Zmiel wszystkie trzy leki w dostosowanych dawkach na drobny proszek i rozpuść mieszaninę proszku w słodzonej wodzie (np. Medidrop Suralose). Zmieniaj butelkę na wodę co tydzień ze świeżo rozpuszczonym koktajlem cART dostarczanym w słodzonej wodzie. 
	UWAGA: Lek w proszku może nie rozpuścić się natychmiast, należy energicznie wstrząsnąć, aby uzyskać jednorodną zawiesinę przed powrotem butelki do klatki do przechowywania.</li>
	<li>Pobieraj próbki krwi obwodowej przez krwawienie zaoczodołowe co dwa tygodnie i analizuj zarówno stosunek CD4:CD8 za pomocą cytometrii przepływowej (sekcja 5.3-5.8), jak i miano wirusa w osoczu za pomocą qRT-PCR (sekcja 6.6). 
	UWAGA: Zazwyczaj po 4 tygodniach leczenia miano wirusa w osoczu zmniejsza się poniżej granicy wykrywalności i przywracany jest typowy stosunek CD4:CD8.</li>
</ol>
8. Walidacja odbicia wirusa po wycofaniu cART (opcjonalnie)
UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla walidacji modelu opóźnienia, ponieważ odbicie wirusa po odłączeniu cART dostarcza bezpośrednich dowodów na istnienie rezerwuaru opóźnień. Zaleca się również, aby służył jako eksperyment kontrolny w badaniach terapeutycznych nad lekami supresyjnymi z odbicia HIV.
<ol>
	<li>Plan wycofania cART po tym, jak miano wirusa w osoczu z próbek krwi obwodowej spadnie poniżej granicy wykrywalności, a stosunek CD4:CD8 zostanie przywrócony do zakresu od 1,5 do 2,5.</li>
	<li>Pobieraj próbki krwi obwodowej przez krwawienie zaoczodołowe co 2 tygodnie po odstawieniu cART. Należy ściśle monitorować zmiany miana wirusa w osoczu (sekcja 6.6), a także stosunek CD4:CD8 (sekcja 5.3-5.8).</li>
</ol>

<ol><li>Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCID+mouse+models+of+human+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">SCID mouse models of human stem cell engraftment.</a> Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
<li>Walsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mouse+Models+of+Clinical+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Humanized Mouse Models of Clinical Disease.</a> Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+system+investigation%3A+progress%2C+promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nature reviews. Immunology. 7, (2007).</li>
<li>Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+in+HIV+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells in HIV infection and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).</li>
<li>McCune, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCID-hu+mouse%3A+murine+model+for+the+analysis+of+human+hematolymphoid+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function.</a> Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).</li>
<li>Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+functional+human+immune+system+to+mice+with+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency.</a> Nature. 335, 256(1988).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+defects+in+innate+and+adaptive+immunologic+function+in+NOD%2FLtSz-scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice.</a> Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).</li>
<li>Ohbo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+hematopoiesis+in+mice+with+a+truncated+mutant+of+the+interleukin-2+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain.</a> Blood. 87 (3), 956-967 (1996).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma%28c%29%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R+gamma+null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD%2FSCID%2FIL2+receptor+%7Bgamma%7D+chain%28null%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+the+functions+of+human+B+and+T+cells+in+humanized+NOD%2Fshi-scid%2Fgammac%28null%29+%28NOG%29+mice+%28hu-HSC+NOG+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+immunology%22%5BJournal%5D)">The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice).</a> International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).</li>
<li>McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+cord+blood+engraftment+between+immunocompromised+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains.</a> Blood. 116 (2), 193-200 (2010).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nature. 9 (7), 959-963 (2003).</li>
<li>Melkus, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nature medicine. 12, 1316(2006).</li>
<li>Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+immune+system+in+immunodeficient+mice+through+combined+human+fetal+thymus%2Fliver+and+CD34%2B+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation.</a> Blood. 108 (2), 487-492 (2006).</li>
<li>Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/299390362_Humanized_Mice_in_Translational_Immunology">Humanized Mice in Translational Immunology.</a> Translational Immunology. , 285-326 (2016).</li>
<li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2710598/">Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC.</a> Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).</li>
<li>Halkias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+aspects+of+human+T-cell+development+and+migration+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice.</a> Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).</li>
<li>Satheesan, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29343582">HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART.</a> Journal of virology. , (2018).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-targeted+aptamer-siRNA+conjugate-directed+transcriptional+regulation+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1.</a> Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+RNA+aptamer+against+human+CCR5+specifically+targets+HIV-1+susceptible+cells+and+inhibits+HIV-1+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity.</a> Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).</li>
<li>Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+highly+active+antiretroviral+therapy+%28HAART%29+in+patients+with+advanced+HIV+infection%3A+impact+on+medical%2C+palliative+care%2C+and+quality+of+life+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pain+and+symptom+management%22%5BJournal%5D)">The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes.</a> Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).</li>
<li>Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+of+Finding+a+Cure+for+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection.</a> Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).</li>
<li>Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoirs+and+latency+models%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV reservoirs and latency models.</a> Virology. 411 (2), 344-354 (2011).</li>
<li>Van Herck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sampling+from+the+retro-orbital+plexus%2C+the+saphenous+vein+and+the+tail+vein+in+rats%3A+comparative+effects+on+selected+behavioural+and+blood+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables.</a> Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).</li>
<li>Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+12-color+flow+cytometry+panel+to+study+lymphocyte%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+subsets+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans.</a> Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).</li>
<li>Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%3ACD8+ratio+as+a+frontier+marker+for+clinical+outcome%2C+immune+dysfunction+and+viral+reservoir+size+in+virologically+suppressed+HIV-positive+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+International+AIDS+Society%22%5BJournal%5D)">CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients.</a> Journal of the International AIDS Society. 18, 20052(2015).</li>
<li>van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+propagation+of+HIV-1+on+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells.</a> Nature protocols. 3, 363(2008).</li>
<li>Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+translation+from+animal+to+human+studies+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dose translation from animal to human studies revisited.</a> FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).</li>
<li>Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+approaches+to+the+study+of+HIV-1+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental approaches to the study of HIV-1 latency.</a> Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).</li>
<li>Marsden, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+in+the+Humanized+BLT+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">HIV Latency in the Humanized BLT Mouse.</a> Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).</li>
<li>Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT+humanized+mice+as+a+small+animal+model+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection.</a> Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).</li>
<li>Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+strategies+for+HIV-1+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Developing strategies for HIV-1 eradication.</a> Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+stem+cell+memory+T+cells+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+hematology+%26+oncology%22%5BJournal%5D)">The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies.</a> Journal of hematology & oncology. 8, 113(2015).</li>
<li>Chun, T. -W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).</li>
<li>Redel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+regulation+of+latency+in+the+monocyte-macrophage+lineage+and+in+CD4%2B+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes.</a> Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+of+the+Latent+Reservoir+for+HIV-1+Using+a+Viral+Outgrowth+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay.</a> PLoS pathogens. 9 (5), e1003398(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Myszy z obniżoną odpornością wszczepione ludzkimi komórkami/tkankami wykazują cechy fizjologiczne podobne do ludzkich i stanowią ogromną wartość dla badań patologicznych, patofizjologicznych i immunologicznych dotyczących chorób specyficznych dla człowieka. Wśród wielu szczepów myszy z obniżoną odpornością, model NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) jest najbardziej niedobór odporności ze względu na brak zarówno odporności wrodzonej, jak i nabytej, a także ablację sygnalizacji cytokin specyfic...

Ponieważ tworzenie odpowiednich modeli zwierzęcych dla ludzkich chorób jest kluczem do znalezienia lekarstwa, odpowiednie modele zwierzęce były od dawna poszukiwane i ulepszane z biegiem czasu. Opracowano wiele szczepów mysich modeli z obniżoną odpornością, które umożliwiają wszczepianie ludzkich komórek i/lub tkanek, a następnie wykonywanie funkcji humanizowanych1,2. Takie humanizowane modele myszy mają kluczowe znaczenie dla badań nad chorobami specyficznymi dla ludzi3,4,5.
Zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) wynikający z zakażenia ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) jest jednym z przykładów. Przed ustanowieniem humanizowanych modeli mysich, ograniczenia etyczne i techniczne ograniczały przedkliniczne badania na zwierzętach nad HIV/AIDS do naczelnych innych niż ludzie3. Jednak wysokie koszty i wymagania dotyczące specjalistycznej opieki nad takimi zwierzętami utrudniają badania nad HIV/AIDS w typowych warunkach akademickich. HIV infekuje przede wszystkim ludzkie limfocyty T CD4+ i wpływa na rozwój i odpowiedź immunologiczną innych ludzkich komórek odpornościowych, takich jak limfocyty B, makrofagi i komórki dendrytyczne6; Dlatego duże zapotrzebowanie na małe modele zwierzęce przeszczepione z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym.
Przełom nastąpił w 1988 roku, kiedy stworzono myszy CB17-scid z mutacją Prkdcscid i wykazały się udanym wszczepieniem ludzkiego układu odpornościowego1. Mutacja Prkdc scid powoduje wadliwe funkcje komórek T i B oraz ablację adaptacyjnego układu odpornościowego u myszy, umożliwiając w ten sposób wszczepienie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) i płodowych tkanek krwiotwórczych7,8. Niemniej jednak w tym modelu często obserwuje się niski poziom wszczepienia; Możliwe przyczyny to: 1) szczątkowa wrodzona aktywność immunologiczna modulowana przez komórki NK (natural killer) oraz 2) późne stadium rozwoju mysich limfocytów T i B (nieszczelność)5. Późniejszy rozwój modelu myszy bez otyłości z cukrzycą (NOD) osiągnął radykalną regulację w dół aktywności komórek NK; W ten sposób jest w stanie wspierać wyższy poziom i bardziej zrównoważone wszczepianie składników ludzkiego układu odpornościowego<klasa SUP="xref">9. Aby jeszcze bardziej stłumić lub zahamować rozwój odporności wrodzonej, stworzono modele mysie z obcięciem lub całkowitym nokautem łańcucha γ receptora interleukiny-2 (Il2rg) na tle (NOD)-scid. Il2rg, znany również jako wspólny łańcuch γ receptora cytokiny, jest nieodzownym składnikiem różnych receptorów cytokin 10,11,12,13. Szczepy takie jak NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) i NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) wykazują silne zakłócenie sygnalizacji cytokin myszy i całkowitą ablację rozwoju komórek NK, a także poważne upośledzenie odporności adaptacyjnej14,15,16.
Trzy humanizowane modele myszy z mutacją scid i nokautem Il2rg są często wykorzystywane w badaniach nad HIV/AIDS: model BLT (szpik kostny/wątroba/grasica), model PBL (leukocyty krwi obwodowej) i model SRC (SCID Repopulating Cell)3. Model BLT jest tworzony poprzez chirurgiczne przeszczepienie ludzkiej płodowej wątroby i grasicy pod mysią torebkę nerkową wraz z dożylnym wstrzyknięciem wątroby płodu HSCs3,17,18. Mysi model BLT oferuje wysoką skuteczność wszczepiania, rozwój ludzkich komórek krwiotwórczych we wszystkich liniach i ustanowienie silnego ludzkiego układu odpornościowego; dodatkowo limfocyty T są kształcone w ludzkiej autologicznej grasicy i wykazują ograniczoną odpowiedź immunologiczną HLA4,5,17,19. Jednak wymóg zabiegów chirurgicznych pozostaje główną wadą modelu BLT. Mysi model PBL ustala się przez dożylne wstrzyknięcie ludzkich obwodowych komórek limfatycznych. Model PBL zapewnia wygodę i pozwala na udane wszczepienie komórek T, ale jego zastosowanie jest ograniczone ze względu na niewystarczającą liczbę komórek B i komórek szpikowych, ogólny niski poziom wszczepienia oraz wystąpienie ciężkiej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)3,20. Mysi model SRC uzyskuje się poprzez wstrzyknięcie ludzkich HSC nowonarodzonym lub młodym dorosłym myszom SCID. Wykazuje średnią skuteczność wszczepienia powyżej 25% (ocenianą jako procent CD45 we krwi obwodowej) i wspiera wieloliniowy rozwój wstrzykiwanych HSC oraz opracowanie wrodzonego ludzkiego układu odpornościowego. Jednak ograniczeniem modelu SRC jest to, że odpowiedź limfocytów T jest ograniczona przez H2 myszy, a nie przez ludzką HLA14,21.
Mysi model SRC jest uważany za łatwy i niezawodny model do przedklinicznych badań HIV/AIDS na małych zwierzętach, czego przykładem jest konsekwentne wszczepianie ludzkiego układu odpornościowego i udany rozwój układu krwiotwórczego. Wcześniej informowaliśmy o ustanowieniu modelu myszy NSG Hu-SRC-SCID (hu-NSG) i opisaliśmy jego zastosowanie w badaniach replikacji i opóźnień HIV22,23,24. Ten mysi model hu-NSG wykazuje wysoki poziom naprowadzania szpiku kostnego, podatność na zakażenie wirusem HIV oraz rekapitulację zakażenia wirusem HIV i patogenezy. Dodatkowo, mysi model hu-NSG odpowiednio reaguje na skojarzoną terapię przeciwretrowirusową (cART) i podsumowuje odbicie wirusa w osoczu po wycofaniu cART, potwierdzając ustanowienie rezerwuaru latencji HIV25,26,27. Ten rezerwuar latencji HIV jest dodatkowo uzasadniony przez produkcję kompetentnych do replikacji wirusów HIV ex vivo indukowanych przez ludzkie spoczynkowe limfocyty T CD4 + wyizolowane od zakażonych i leczonych cART myszy hu-NSG.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół tworzenia mysiego modelu hu-NSG z noworodków myszy NSG, w tym procedury związane z zakażeniem HIV i leczeniem cART w celu rozwoju latencji. Oczekujemy, że ten protokół zaoferuje nowy zestaw podejść w badaniach na zwierzętach nad wirusem HIV w odniesieniu do wirusologii HIV, latencji i leczenia.

<table><tbody><tr><td>CD34 MicroBead Kit, człowiek</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07932</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>Zamów hodowców zamiast myszy eksperymentalnych</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-806-3204</td><td>Zamów za pośrednictwem obiektu dla zwierząt, przedmiot zastrzeżony</td></tr><tr><td>Środek dezynfekujący Clidox</td><td>Fisher Sicentific</td><td>NC9189926</td><td></td></tr><tr><td>Wescodyne</td><td>Fisher Sicentific</td><td>19-818-419</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 80508 strzykawka/igła</td><td>Hamilton</td><td>80508</td><td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>probówka do pobierania krwi (K2EDTA)</td> <td>BD Bioscience</td><td>367843</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do pobierania krwi (heparyna)</td> <td>BD Bioscience</td><td>365965</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna (heparynowana)</td> <td>Fisher Sicentific</td><td>22-362574</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td><td>Thermofisher</td><td>4444434</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 P24 ELISA (zestaw 5 płytek)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>IgG z ludzkiej surowicy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506-100MG</td><td></td></tr><tr><td>IgG z mysiej surowicy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5381-10MG</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Mysz anty-ludzka CD45 (klon HI30)</td><td>BD Biosciences</td><td>564586</td><td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD3 (klon SK7)</td><td>BD Biosciences</td><td>557851</td><td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td></tr><tr><td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (klon RPA-T4)</td><td>BD Biosciences</td><td>558116</td><td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td></tr><tr><td>BUV395 Mysz anty-ludzka CD8 (klon RPA-T8)</td><td>BD Biosciences</td><td>563795</td><td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td></tr><tr><td>APC-Alexa Fluor 750 Mysz anty-ludzka CD14 (TuK4)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1427</td><td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td><td>ThermoFisher</td><td>MHCD1904</td><td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td></tr></tbody></table>

humanizowany mysi modelnod/scid/il2rγ null (hu-nsg) do badań replikacji i latencji hiv

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Przepisy etyczne i wyzwania techniczne dla badań w zakresie patologii człowieka, immunologii i rozwoju terapeutycznego sprawiły, że małe modele zwierzęce cieszą się dużym zainteresowaniem. Dzięki bliskiemu genetycznemu i behawioralnemu podobieństwu do ludzi, małe zwierzęta, takie jak myszy, są dobrymi kandydatami na modele chorób ludzkich, dzięki którym można podsumować objawy i reakcje podobne do ludzkich. Co więcej, tło genetyczne myszy można zmienić, aby dostosować się do różnych wymagań. MyszNOD/SCID/IL2rγ null (NSG) jest jednym z najczęściej stosowanych szczepów myszy z obniżoną odpornością; Umożliwia wszczepienie ludzkich krwiotwórczych komórek macierzystych i/lub tkanek ludzkich, a następnie rozwój funkcjonalnego ludzkiego układu odpornościowego. Jest to kluczowy kamień milowy w zrozumieniu rokowania i patofizjologii chorób specyficznych dla człowieka, takich jak HIV/AIDS, oraz pomoc w poszukiwaniu lekarstwa. W niniejszym dokumencie przedstawiamy szczegółowy protokół generowania humanizowanego modelu myszy NSG (hu-NSG) poprzez przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych do kondycjonowanej promieniowaniem noworodkowej myszy NSG. Mysi model hu-NSG pokazuje wieloliniowy rozwój przeszczepionych ludzkich komórek macierzystych i podatność na zakażenie wirusem HIV-1. Podsumowuje również kluczowe cechy biologiczne w odpowiedzi na skojarzoną terapię przeciwretrowirusową (cART).

Analizę cytometryczną często przeprowadza się w celu walidacji czystości wyizolowanych HSCs, oceny poziomu engraftmentu, profilowania odpowiedzi immunologicznej na infekcję wirusową oraz badania skuteczności cART. Typowy panel przeciwciał zawiera od 4 do 6 poszczególnych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie; dlatego cytometr przepływowy wyposażony w wiele laserów i szeroki wybór filtrów jest niezbędny do uzyskania dokładnych wyników.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

Ten protokół zapewnia metodę tworzenia humanizowanych myszy (hu-NSG) poprzez dowątrobowe wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych do kondycjonowanych promieniowaniem noworodków NSG. Mysz hu-NSG jest podatna na zakażenie wirusem HIV i skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i służy jako odpowiedni model patofizjologiczny do badań replikacji i latencji HIV.

Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Kwestie te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad HIV/AIDS, takie jak mechanizm molekularny i rokowanie zakażenia wirusem HIV oraz jak i gdzie powstaje rezerwuar latencji. Zaletą tej techniki jest to, że jest nieinwazyjna i ustaliła myszy hu-NSG, które muszą leczyć rozwój wieloliniowy na przeszczepionych ludzkich komórkach macierzystych, które są podatne na zakażenie wirusem HIV i są podatne na cART. Rozpocznij od przefiltrowania strawionej, ludzkiej, płodowej, wątrobowej tkanki płucnej próbki gnojowicy przez sterylne, nylonowe sitko o średnicy 70 mikrometrów w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki i wzbogacenie o CD34 + HSC przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych zgodnie z instrukcjami producenta.Po zliczeniu ponownie zawiesić HSC przy stężeniu od dwóch razy dziesięć do siódmych żywotnych komórek na mililitr w świeżych DPBS na lodzie. Następnie umieść cały noworodek myszy NOD/SCID/gamma lub NSG w sterylnej klatce do napromieniania w kształcie ciasta i potraktuj zwierzęta 200 do 250 stopniami Celsjusza promieniowania gamma ze źródła promieniowania cezowego-137. Następnie załaduj komórki do specjalnie wykonanej strzykawki Hamilton 80508 o pojemności 50 mikrolitrów wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 i wstrzyknij każdemu nowonarodzonemu zwierzęciu bezpośrednio do wątroby pięć razy dziesięć do jednej piątej zdolnych do życia ludzkich CD34 + HSC i 25 mikrolitrów DPBS.Dziesięć do dwunastu tygodni po zakażeniu odwiruj próbki krwi z orbity, obwodowej krwi od każdej myszy przez wirowanie i przenieś supernaty osocza do probówek mikrowirówek w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. W celu walidacji wszczepienia HSC ponownie zawiesić granulki za pomocą 200 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek i wyciągnąć zawiesiny komórek do 1,5-milimetrowej probówki mikrowirówkowej na dziesięciominutową inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie zbierz pozostałe białe krwinki przez odwirowanie przez dwa przemycia w 0,5 mililitra świeżej, 0,01% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA, w DPBS na płukanie.Po drugim myciu zablokuj komórki 100 mikrolitrami koktajlu blokującego na dwadzieścia minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie oznacz odpowiednim koktajlem przeciwciał o stężeniu 2 mikrolitry na jedno do szóstego stężenia. Po 30 minutach w temperaturze 4 stopni Celsjusza umyj komórki dwa razy w świeżym DPBS plus BSA i oceń próbki krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami w celu ilościowego określenia procentu ludzkich komórek CD45 + CD3 + CD14 + lub CD19 + w próbce. Następnie oblicz stosunek limfocytów T CD4 + do CD8 + i oceń miano wirusa w próbkach osocza zgodnie ze standardowymi, ilościowymi, odwrotną transkryptazą i protokołami PCR.Aby ocenić skutki zakażenia wirusem HIV, należy dostarczyć wirusa HIV beli znieczulonym myszom NSG z ponad 20-procentową populacją ludzkich komórek CD45 + we krwi obwodowej, w stężeniu 200 nanogramów P24 na mysz przez podanie dootrzewnowe, pobierając próbki krwi przez krwawienie zaoczodołowe co dwa tygodnie i analizuj zarówno stosunek CD4 do CD8, jak i miano wirusa w osoczu, jak pokazano. W celu walidacji supresji wirusa należy co tydzień przez 4 tygodnie pobierać zakażone ludzkie zwierzęta NSG ze świeżą, skojarzoną terapią antyretrowirusową lub cART w słodzonej wodzie, pobierając próbki krwi przez krwawienie zaoczodołowe co dwa tygodnie i analizując zarówno stosunek CD4 do CD8, jak i miano wirusa w osoczu, jak pokazano. Aby ocenić odbicie wirusa, gdy miano wirusa w osoczu jest poniżej granicy wykrywalności, a stosunek CD4 do CD8 zostaje przywrócony między 1,5 a 2,5, należy pobrać próbki krwi obwodowej przez krwawienie zaoczodołowe co 2 tygodnie po wycofaniu cART i ocenić próbki, jak wykazano.Podczas wstępnej walidacji wszczepienia liczba ludzkich komórek CD45 + powinna wynosić od 20 do 80 procent, a podzbiory ludzkich leukocytów powinny pojawiać się jako odrębne populacje w analizie cytometrii przepływowej. Stosunek komórek CD4 + do CD8 + utrzymuje się między 1,5 a 2,5 u zdrowych osób, podczas gdy znaczne wyczerpanie komórek T CD4 + obserwuje się zwykle po infekcji wirusowej. Warto zauważyć, że zdrowy stosunek zostaje przywrócony w odpowiedzi na leczenie cART.Wykrywanie miana wirusa w osoczu za pomocą ilościowego RT PCR w trakcie infekcji i schematu cART można wykreślić i wykorzystać do oceny skuteczności odpowiednio dostarczania wirusa i leczenia przeciwwirusowego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w badania wirusologiczne HIV/AIDS i rozwój terapeutyczny, może być również stosowana do innych badań związanych z chorobami ludzkimi, takimi jak rak, cukrzyca i choroby autoimmunologiczne. Opracowanie mysiego modelu hu-NSG utorowało drogę naukowcom zajmującym się immunologią i onkologią do zbadania nowych dysfunkcji i patologii u ludzi, w szczególności badań mechanistycznych i terapeutycznych ukierunkowanych na przewlekłe zakażenie wirusem HIV i rezerwuar latencji.

humanized-nodscidil2rnull-hu-nsg-mouse-model-for-hiv-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Wideo demonstruje technikę generowania humanizowanego modelu myszy z opartą na komórkach macierzystych odpornością przeciwko ludzkiemu wirusowi niedoboru odporności (HIV). Ludzka tkanka grasicy płodu i zmodyfikowane hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są wszczepiane do torebki nerkowej myszy z poważnie obniżoną odpornością. HSC, które wyrażają chimeryczne receptory antygenowe (CAR) przeciwko wirusowi HIV, są mieszane w galaretowatej mieszaninie białek, która sprzyja ich kolokalizacji z...

Budowa humanizowanego modelu myszy z inżynieryjną odpornością na HIV

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Ten protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia humanizowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie odtworzone myszy z niedoborem odporności uzyskane przez wstrzyknięcie dośledzionowe ludzkich hepatocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + są podatne na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 i rekapitulują uszkodzenie wątroby, jak obserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

Ten protokół opisuje nowatorską metodę dostarczania doustnych leków antyretrowirusowych, które skutecznie hamują replikację RNA HIV-1 u humanizowanych myszy.

Doustne skojarzone leczenie przeciwretrowirusowe u humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV-1

Ten protokół opisuje, w jaki sposób połączenie infekcji EcoHIV z myszami Tmem119-EGFP oferuje cenny system biologiczny do badania zmian mikrogleju i rezerwuarów wirusa w modelach gryzoni zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV.

Identyfikacja komórek zakażonych ekoHIV u myszy transgenicznych manipulowanych mikroglejem

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Poznaj metodę tworzenia humanizowanych myszy hu-NSG do badań nad replikacją i latencją HIV. Model ten umożliwia analizę infekcji oraz testowanie terapii antyretrowirusowej.

Humanizowany mysi model^NOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Przeglądaj więcej filmów