Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Ta metoda wykrywania oparta na nanoporach wykazała potencjał w zakresie fizycznego charakteryzowania i identyfikowania pojedynczych cząsteczek. Praca z nanocząstkami metali, która jest celem tego filmu, stanowi wyzwanie dla naszego zrozumienia tego, co ogranicza dokładność i precyzję pomiaru. Główną zaletą tej techniki jest to, że aparat ten ma większą szerokość pasma niż tradycyjna konfiguracja pamięci dwuwarstwowej lipidów, co pozwala nam zobaczyć szybsze wyniki i więcej reakcji w nanoporach.

Technika ta była możliwa, ponieważ na początku lat 90. wykazano, że bramkowanie w nanoporach białkowych, czyli przełączanie między różnymi stanami, może być kontrolowane, a cząsteczki mogą wiązać się ze ścianą porów. Technika ta jest opracowywana do komercyjnych zastosowań sekwencjonowania DNA, ponieważ wykorzystuje minimalną ilość próbek. Nie wymaga etykiet fluorescencyjnych i wykorzystuje znacznie dłuższe długości odczytu niż konwencjonalne metody.

Technika ta została również opracowana w celu rozróżniania polimerów na podstawie ich wielkości z większą dokładnością i szybkością niż elektroforeza żelowa i chromatografia. Najpierw przygotuj 500 mililitrów roztworu jednomolowego chlorku sodu i 10-milimolowego fosforanu monosodowego w ultraczystej wodzie jako elektrolit. Najlepiej jest używać świeżych roztworów i próbek z tą konkretną konfiguracją.

Ponadto odkryliśmy, że wysokiej jakości woda dejonizowana jest bardzo ważna dla pomyślnego tworzenia membran. Następnie połącz jeden miligram liofilizowanego monomerycznego proszku hemolizyny S.aureus typu dzikiego z jednym mililitrem ultraczystej wody. Nie zapominaj, że praca z białkiem toksyny alfa hemolizyny Staph aureus może być niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy postępować zgodnie ze środkami ostrożności zawartymi w karcie charakterystyki. Następnie przygotuj cztery mililitry po pięć miligramów na mililitr DPhyPC w endokainie w szklanej fiolce scyntylacyjnej. Zakryj fiolkę nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do miesiąca.

Następnie rozpuść 57,6 miligrama hydratu kwasu 12-fosfowolframowego w 10 mililitrach elektrolitu, aby uzyskać dwumilimolowy roztwór polioksometalianu. Podziel roztwór POM na dwie pięciomililitrowe porcje. Użyj trzymolowego wodorotlenku sodu, aby dostosować pH jednego roztworu POM do 5,5.

Aby rozpocząć przygotowania do testu, zmontuj komórkę testową płaskiego dwuwarstwowego aparatu do elektrofizjologii lipidów. Najpierw zetrzyj srebrny drut papierem ściernym o ziarnistości 600 i zanurz go w dostępnym w handlu wybielaczu na bazie podchlorynu sodu na 10 minut, aby uzyskać elektrodę drucianą srebrno-srebrno-chlorkową. Wypłucz i osusz drut elektrodowy przed włożeniem go do kwarcowej kapilary aparatu.

Trzymaj elektrodę wewnątrz membrany kwarcowo-nanoporowej lub QNM, oddzielając kapilarnę i zbiornik. Następnie umieść w zbiorniku cylindryczną elektrodę osadkową srebrno-chlorkowo-srebrną zamontowaną na srebrnym drucie. Podłącz obie elektrody do płytki drukowanej wzmacniacza.

Następnie otwórz program do akwizycji danych i uruchom zasilanie przy zerowym napięciu miliwoltów. Upewnij się, że między elektrodami w pustym ogniwie nie jest wykrywany prąd stały. Podczas tej demonstracji ważne jest, aby obserwować, w jaki sposób ciśnienie transkapilarne może wpływać na tworzenie się błony i późniejsze tworzenie się nanoporów.

Bez poprawnego wykonania tych dwóch kroków eksperymenty nie zadziałają. Załaduj około jednego mililitra elektrolitu do strzykawki i podłącz go do przewodu płynu podłączonego do zbiornika. Dodaj elektrolit do zbiornika, aż powierzchnia QNM zostanie zanurzona, na co wskazuje prąd jonowy między elektrodami nasycającymi wzmacniacz.

Jeśli wzmacniacz nie jest nasycony, odblokuj QNM, przykładając napięcie pop plus lub minus jeden wolt lub zwiększając ciśnienie kapilarne o około 300 milimetrów słupa rtęci. W razie potrzeby użyj obu technik. Gdy wzmacniacz się nasyci, należy pobrać elektrolit ze zbiornika, aż poziom roztworu spadnie poniżej QNM, na co wskazuje prąd powracający do zera.

Aby rozpocząć proces tworzenia dwuwarstwy lipidowej, podnieś poziom roztworu elektrolitu znacznie powyżej powierzchni QNM i zanotuj, ile roztworu to zajęło. Następnie zanurz końcówkę pipety o pojemności 10 mikrolitrów w roztworze DPHyPC i wciągnij wszystkie widoczne lipidy do końcówki. Przyłóż końcówkę pipety do powierzchni roztworu elektrolitu i pozwól lipidowi przepłynąć z pipety przez granicę faz powietrze-woda.

Odczekaj od dwóch do pięciu minut, aż lipid rozprowadzi się równomiernie w roztworze. Następnie powoli wycofaj elektrolit, aż powierzchnia roztworu znajdzie się poniżej QNM, a następnie powoli dodaj wystarczającą ilość elektrolitu, aby podnieść roztwór powyżej QNM, tworząc izolacyjną dwuwarstwową błonę lipidową. Jeśli dwuwarstwa nie utworzy się po trzech próbach, nałóż kolejną porcję lipidu, jak opisano wcześniej i powtórz proces.

Gdy wydaje się, że dwuwarstwa się uformowała, zwiększ ciśnienie w kapilarze, aby przebić dwuwarstwę, a następnie zreformuj ją, powoli obniżając i podnosząc poziom roztworu w taki sam sposób, jak poprzednio. Powtórz ten proces kilka razy, aby upewnić się, że QNM nie jest zatkany i utworzyła się dwuwarstwa. Następnie rozmrozić porcję białka alfa hemolizyny na lodzie lub w temperaturze pokojowej.

Napełnij zbiornik 250 nanogramami monomerycznego białka alfa hemolizyny i około 250 mikrolitrami ultraczystej wody. Następnie zastosuj odchylenie od 200 do 400 miliwoltów, aby wywołać tworzenie się porów. Aby ułatwić tworzenie się porów, zwiększ ciśnienie kapilarne o 40 do 200 milimetrów słupa rtęci, aby rozszerzyć dwuwarstwę z QNM.

Gdy utworzy się nanopor, zmniejsz odchylenie przyłożone do napięcia pomiarowego i zmniejsz ciśnienie do około połowy ciśnienia wprowadzania. Aby rozpocząć test, ponownie wyreguluj napięcie niezrównoważenia DC, aby upewnić się, że nie ma mierzonego prądu, gdy przyłożony potencjał jest ustawiony na zero. Następnie uzyskaj ślad prądu jonowego dla przyłożonego potencjału od 120 do minus 120 miliwoltów w stosunku do zbiornika.

Upewnij się, że nie ma żadnych zanieczyszczeń, na które wskazywałyby samoistne blokady prądowe. Dodaj od jednego do sześciu mikrolitrów dwumilimolowego roztworu klastra POM o pH 5,5 do zbiornika. Zastosuj pomiary szeregów czasowych prądu jonowego przy przyłożonym napięciu ujemnym 120 miliwoltów.

Ruch poszczególnych cząsteczek anionowego kwasu fosfowolframowego przez kanał alfa hemolizyny powodował przejściowe blokady, które zmniejszały średni prąd jonowy o otwartych porach o około 80%Czas trwania i prąd blokady są bezpośrednio związane z oddziaływaniem cząstka-por, co pozwala na różnicowanie form jonowych w histogramach względnych stosunków głębokości blokady. Przy pH 5,5 zaobserwowano dwa piki o proporcjach głębokości około 0,06 i 0,16. Na podstawie NMR fosforu, mniejszy pik był sześcioujemnym gatunkiem fosfotungstanu, a głównym pikiem był gatunek siedmioujemny.

Przy pH 7,5 względne stężenia przesunęły się do wyższego stosunku gatunków 6-minus do gatunków 7-minus. 20-krotny spadek liczby zdarzeń blokadowych w stosunku do pH 5,5 przypisano degradacji wolnych jonów fosforanowych i wolframowych. Dopasowanie rozkładów czasu przebywania wymagało wielu funkcji wykładniczych, wskazujących na wiele typów oddziaływań cząstka-pory w obrębie każdego gatunku jonowego.

Krótsze czasy przebywania przy pH 7,5 sugerowały słabsze interakcje cząstka-pory niż pH 5,5, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi zależne od pH zmiany względnej liczby stałych ładunków w lub w pobliżu światła kanału alfa hemolizyny. Woda dejonizowana o wysokiej czystości ma kluczowe znaczenie dla tej konkretnej konfiguracji. Zużyty wkład filtracyjny z substancjami organicznymi był prawdopodobną przyczyną tego, że nasze laboratorium nie było w stanie utworzyć membran na QNM przez wiele miesięcy.

Osoby, które są nowe w tej konkretnej wersji metody, mogą również mieć problemy, ponieważ błony są tak małe i istnieje sztuczka, aby uzyskać nanopory. Ta metoda, która została zapoczątkowana kilkadziesiąt lat temu, okazała się przydatna do analizy jonów, kwasów nukleinowych i polimerów syntetycznych, a także sekwencjonowania DNA. Może również znaleźć zastosowanie w biofizyce i podstawowej biologii komórki.

Na przykład procedura ta może być wykorzystana do badania właściwości fizycznych polimerów syntetycznych i biopolimerów w celu zbadania ich rozmiaru, interakcji z innymi cząsteczkami i innych ważnych pytań.