Name: Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9 w komórkach HEK293T. Ta metoda umożliwia szybką analizę zdarzeń biochemicznych o niskiej częstotliwości, co jest kluczowe dla badań nad metabolizmem lipidów i rozwoju terapii przeciwmiażdżycowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują hojnemu wsparciu finansowemu od NHLBI/NIH (K08 HL124068 i LRP HMOT1243), NCATS/NIH poprzez UCSF Clinical and Translational Science Institute Catalyst Program (UL1 TR000004), Senatu Akademickiego UCSF, Fundacji Hellmana, Gilead Sciences Research Scholar Award, Pfizer ASPIRE Cardiovascular Award (wszystkie dla Johna S. Chorby) i Instytutu Medycznego Howarda Hughesa (dla Adri M. Galvana i Kevana M. Shokata).

1. Mutogeneza celowana wektora proteazy
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zamów syntetyczne oligonukleotydy w celu wprowadzenia interesującej mutacji, stosując modyfikację standardowych protokołów mutogenezy ukierunkowanej12. Standardowe odsolone primery (bez dodatkowej puryfikacji) są w pełni wystarczające. 
	Uwaga: Ogólne podejście do projektowania primerów polega na tworzeniu primerów częściowo nakładających się, jak wskazano w Tabeli 1, przy użyciu kalkulatora temperatury topnienia (Tm) specyficznego dla używanej polimerazy.</li>
	<li>Przygotuj reakcje łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) dla mutogenezy ukierunkowanej w lodzie, zgodnie z Tabelą 2.</li>
	<li>Przeprowadź cykle PCR zgodnie z Tabelą 3.</li>
	<li>Naniesienie 2 - 5 µL każdej reakcji PCR na 1% żel agarozowy i zwizualizuj produkty, aby potwierdzić pomyślną amplifikację. 
	Uwaga: Pomyślny PCR wykaże pojedynczy, wyraźny prążek DNA o wielkości odpowiadającej markerowi matrycy (~7.8 kB).</li>
	<li>Dodaj 0.5 µL (na 25-µL reakcję) enzymu DpnI i inkubuj próbki w 37 °C przez 1 h.</li>
	<li>Transformuj 2 µL reakcji do chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli. 
	Uwaga: Szybko rosnący szczep E. coli skróci czas inkubacji, jednak każdy szczep klonujący będzie odpowiedni.</li>
	<li>Wysiej transformanty na agar Luria-Bertani (LB) zawierający 50 - 100 µg/mL karbenicyliny. Inkubuj płytki przez noc w 37 °C.</li>
	<li>Wybierz 2 - 4 kolonie do hodowli w małej skali (2 - 5 mL podłoża LB z 50 - 100 µg/mL karbenicyliny). Inkubuj hodowlę w 37 °C przy 220 rpm aż do zmętnienia.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidowe DNA z komórek, używając zestawu do puryfikacji DNA plazmidowego (tj. „miniprep”) zgodnie z instrukcjami producenta. Oznacz stężenie eluowanego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Przeprowadź dokładne sekwencjonowanie DNA plazmidowego w serwisie sekwencjonowania metodą Sangera (np. w jednostce centralnej lub komercyjnej). Przygotuj próbki DNA zgodnie ze specyfikacją serwisu. Primery, które zostały pomyślnie zastosowane w poprzednich reakcjach sekwencjonowania, wymieniono w Tabeli 4. 
	Uwaga: Ze względu na amplifikację PCR całego plazmidu, zaleca się sekwencjonowanie całego regionu kodującego PCSK9 dla każdego mutanta.</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowy test proteolizy oparty na lucyferazie
<ol>
	<li>Wysiew komórek (dzień 0) 
	<ol>
		<li>Do eksperymentów należy wykorzystać komórki HEK293T o niskim numerze pasażu, hodowane w podłożu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Wszystkie prace z komórkami należy prowadzić w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza aż do momentu przeprowadzenia pomiaru aktywności lucyferazy. Należy oszacować liczbę potrzebnych dożków i płytek, przyjmując, że transfekcje dla każdego badanego warunku zostaną wykonane w trzech powtórzeniach.</li>
		<li>Oddziel komórki HEK293T od ścianek kolby hodowlanej, traktując je minimalną objętością 0,05% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA), wystarczającą do pokrycia komórek. Inaktywuj trypsynę-EDTA, dodając dwie objętości pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS, a następnie przenieś komórki do sterylnej probówki. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (po uprzednim barwieniu błękitem trypanu). Odwiruj zawartość probówki z prędkością 500 x g przez 5 min w celu regeneracji komórek.</li>
		<li>Odssać pożywkę zawierającą trypsynę i zawiesić komórki w pożywce hodowlanej do stężenia 2 x 105 komórek/ml. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 µL komórek do każdego dołka białej płytki 96-dołkowej (o nieprzezroczystym dnie), co daje końcowe stężenie wysiewu 2 x 104 komórek/dołek. 
		Uwaga: W przypadku pierwszych eksperymentów pomocne może być dodatkowe wysianie komórek na równoległą płytkę 96-dołkową z przezroczystym dnem, aby monitorować wzrost i adhezję komórek w trakcie protokołu oraz ułatwić przyszłe rozwiązywanie problemów.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 24 h.</li>
		<li>Przygotować płytkę matrycową z plazmidami w formacie 96 dołków. Każdy plazmid rozcieńczyć w buforze elucyjnym (Tris-HCl, pH 8,5) do stężenia 50 ng/µL w pojedynczym dołku płytki 96-dołkowej.
		<ol>
			<li>Przygotować po 4 dołeczki dla plazmidu kontroli pozytywnej (WT)8, plazmid kontroli negatywnej (S386A)8oraz bufor bez plazmidu (do transfekcji pozorowanych). Jeśli planowane są leki lub inne zabiegi oparte na komórkach, należy przygotować płytkę główną z plazmidem kontroli pozytywnej (WT) w każdym dołku, wraz z 4 dołkami z plazmidem kontroli negatywnej (S386A) oraz 4 dołkami z buforem bez plazmidu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja (dzień 1)
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę do transfekcji w formacie płytki 96-dołkowej, wykorzystując płytki 96-dołkowe z głębokimi dołkami. Transfekcje przeprowadzić w trzech powtórzeniach, pamiętając o przygotowaniu wystarczającej ilości odczynników, aby uwzględnić straty podczas pipetowania i przenoszenia cieczy. 
		Uwaga: Poniższe obliczenia pozwalają na przygotowanie ilości odczynnika wystarczającej do przeprowadzenia analizy na jednej płytce 96-dołkowej w trzech powtórzeniach (zachowawczo oszacowano dla 420 dołków).
		<ol>
			<li>Przygotuj master mix z rozcieńczonego odczynnika do transfekcji lipidowej, dodając 50.4 µL odczynnika do 2050 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Przygotować mieszaninę główną (master mix) odczynnika do prekompleksacji DNA, dodając 33.6 µL odczynnika do 1730 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.</li>
			<li>Przy użyciu pipety wielokanałowej odnieść alikwoty 16.8 µL rozcieńczonej mieszaniny odczynników do prekompleksacji DNA do każdego dołka płytki głębokodołkowej.</li>
			<li>Za pomocą pipety wielokanałowej odnieść porcje 3.2 µL (160 ng) każdego plazmidu z płytki matki do każdego dołka płytki głębokodołkowej.</li>
			<li>Za pomocą pipety wielokanałowej odmierzyć porcje 20 µL do każdego dołka płytki i wymieszać zawartość każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Przykryć płytki i pozostawić je w temperaturze pokojowej (RT) na 10–15 min w celu utworzenia kompleksów lipid-DNA. 
			Uwaga: Po transfekcji końcowy skład każdego dołka będzie następujący: 40 ng DNA, 0.12 µL odczynnika do transfekcji oraz 0.08 µL odczynnika do prekompleksacji DNA, a zawartość każdej dołki będzie wynosić 10 µL w całkowitej objętości (pożywka z obniżoną zawartością surowicy).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ostrożnie wymień pożywkę w komórkach 293T na płytkach 96-dołkowych, używając pipety wielokanałowej i dbając o to, aby nie uszkodzić komórek. Odessaną pożywkę zastąp 95 µL pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS. 
		Uwaga: Jest to odpowiedni moment na potraktowanie komórek wybranym lekiem.</li>
		<li>Dodaj 10 µL mieszaniny do transfekcji do odpowiednich dołków poprzez pipetę wielokanałową. Delikatnie zakręć płytką, aby wymieszać zawartość dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 h. 
		Uwaga: końcowa objętość w dołkach wynosi 105 µLaby uwzględnić parowanie w ciągu 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza (dzień 2)
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwory stokowe odczynników do celenterazyny: 3 M askorbinian sodu [rozpuszczony w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), przygotowany na świeżo], 5 M NaCl, 10 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA; rozpuszczonej w PBS, przygotowanej na świeżo) oraz 2 mM celenterazyny (rozpuszczonej w zakwaszonym metanolu zawierającym 200 µL (3 N HCl na każde 10 ml). 
		Uwaga: Roztwór koelenterazyny o stężeniu 2 mM można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze -80 °C or w ciemności.</li>
		<li>Przygotować 2-krotne roztwory odczynnika coelenterazyny do pomiaru lucyferazy, przygotowując osobny odczynnik dla komórek i osobny dla pożywki, zgodnie z Tabela 5Wymieszać wszystkie odczynniki z wyjątkiem coelenterazyny, a następnie przefiltrować mieszaninę przez filtr o rozmiarze porów 0,22-µm przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego, a następnie dodać coelenterazynę. Odczynniki należy chronić przed światłem do momentu ich naniesienia na płytki. 
		Uwaga: Ze względu na ubytek roztworu podczas filtracji, należy przygotować taką ilość odczynnika, aby uwzględnić straty wynikające zarówno z procesu filtracji, jak i z przenoszenia cieczy. Tabela 5 przedstawia stężenia końcowe odczynników 2x (a także ilość roztworu zapasu niezbędną do odczytu jednej płytki 96-dołkowej z jednym odczynnikiem).</li>
		<li>Wyjmij komórki z inkubatora 24 h po transfekcji. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50 µL mediumu warunkującego z każdej studzienki do nowej płytki 96-dołkowej z białym (nieprzezroczystym) dnem.
		<ol>
			<li>Oznakuj płytki, wskazując, czy zawierają one medium, czy komórki. Jeśli dokonano transfekcji w więcej niż jednej płytce 96-dołkowej, oznakuj płytki w taki sposób, aby każda płytka z medium była przypisana do odpowiadającej jej płytki macierzystej z komórkami.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przy użyciu pipety wielokanałowej dodać 50 µL 2x nielitycznego odczynnika celenterazyny do płytki zawierającej wyłącznie medium kondycjonowane. Delikatnie kołysać lub wstrząsać płytką w ciemności przez 5–10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 50 µL dodaj 2x litycznego odczynnika koelenterazyny do płytki zawierającej komórki. Delikatnie kołysz lub wstrząsaj płytką w ciemności przez 5–10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po inkubacji zmierz luminescencję płytki zawierającej wyłącznie medium za pomocą czytnika płytek. Następnie zmierz luminescencję płytki z komórkami w tym samym czytniku płytek.</li>
		<li>Zutylizuj płytki i zapisz pliki do analizy danych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeprowadź wstępną analizę danych przy użyciu oprogramowania arkusza kalkulacyjnego. Utwórz arkusz zawierający wyniki z płytek z komórkami oraz płytek z medium.</li>
	<li>Ręcznie sprawdź dane z płytek z komórkami, aby zidentyfikować słabo transfekowane studzienki. Studzienki, w których odczyt wynosi &lt; 5% - 10% odczytu z plazmidu kontrolnego negatywnego (S386A), należy uznać za słabo transfekowane, co czyni interpretację tych danych wątpliwą.</li>
	<li>Oblicz średnią luminescencję tła dla każdej płytki na podstawie studzienek poddanych pozornej transfekcji (mock-transfected). Odejmij tło każdej płytki od wartości uzyskanych na danej płytce. 
	Uwaga: Wartość ta może być pomijalna w zależności od użytego czytnika płytek.</li>
	<li>Przetwórz dane, obliczając proporcję aktywności lucyferazy w medium w stosunku do całkowitej aktywności lucyferazy dla każdej studzienki. Ponieważ płytka z komórkami zawiera zarówno medium warunkujące, jak i komórki, a płytka z samym medium zawiera taką samą ilość medium warunkującego jak płytka z komórkami, właściwe jest zastosowanie poniższego równania: 
	<img alt="Wzór na wydzielaną lucyferazę: 2×RLU_MEDIUM/(RLU_MEDIUM+RLU_CELLS), równanie analizy biochemicznej." src="/files/ftp_upload/58265/58265eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie RLU = względne jednostki luminescencji, odczyt z czytnika płytek po odjęciu tła.</li>
	<li>Oblicz średnią ilość wydzielonej lucyferazy dla studzienek kontroli pozytywnej (WT) oraz kontroli negatywnej (S386A).</li>
	<li>Oceń ogólną jakość eksperymentu, obliczając czynnik Z (Z-factor)13: 
	<img alt="Równanie czynnika Z; analiza statystyczna jakości testu, obraz wzoru: 1-3(σ_ACTIVE+σ_INACTIVE)/|μ_ACTIVE-μ_INACTIVE|" src="/files/ftp_upload/58265/58265eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	Uwaga: Wartości aktywne pochodzą ze studzienek kontroli pozytywnej (WT), a wartości nieaktywne ze studzienek kontroli negatywnej (S386A). Wartości bliższe 1 wskazują na wyższą jakość eksperymentu. W przypadku wartości poniżej 0 należy rozważyć powtórzenie eksperymentu lub optymalizację procedury.</li>
	<li>Przenieś dane z programu arkusza kalkulacyjnego do oprogramowania do naukowej analizy danych.</li>
	<li>Znormalizuj aktywność wydzielonej lucyferazy do średnich wartości kontroli pozytywnej (WT) i kontroli negatywnej (S386A), przyjmując kontrolę pozytywną jako 1, a kontrolę negatywną jako 0.</li>
	<li>Oczyść dane z wartości odstających, stosując metodę regresji i usuwania wartości odstających (ROUT), ustawiając maksymalny wskaźnik fałszywych odkryć (FDR) na 1%.</li>
	<li>Oceń istotność statystyczną różnic, porównując dane dla każdego wariantu mutanta (lub mutanta) ze średnią aktywnością WT (znormowaną do wartości 1). Przeprowadź wielokrotne nieparowane testy t, korygując wyniki dla wielokrotnych porównań metodą Holma-Sidaka przy α = 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9a+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li>
<li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variations+in+PCSK9%2C+low+LDL%2C+and+protection+against+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li>
<li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li>
<li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li>
<li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li>
<li>Pettersen, D., Fjellström, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li>
<li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li>
<li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li>
<li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NARC-1%2FPCSK9+and+its+natural+mutants%3A+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+%28LDL%29+receptor+and+LDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li>
<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91(2008).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li>
<li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+subtilisin%2Fkexin+type+9+%28PCSK9%29+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li>
<li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprotein+convertase+%28PC%29+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and%2For+PC5%2F6A%3A+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane powyżej procedury eksperymentalne przedstawiają metodę przezwyciężenia wewnętrznie niskiej aktywności proteazy jednoobrotowej PCSK9 i solidnej oceny jej funkcji proteolitycznej. Kluczowa koncepcja testu opiera się na przekształceniu zdarzenia pojedynczego obrotu w enzymatycznie amplifikowany odczyt. Do mocnych stron testu należą stosunkowo krótkie ramy czasowe i łatwość użycia reportera lucyferazy, a także jego skalowalność do podejść o wysokiej przepustowości. Ponadto test ocenia proteolizę w jej natywnym, komór...

PCSK9 jest ukierunkowany na degradację receptora LDL (LDL-R), podnosząc poziom cholesterolu LDL (LDL-C) i prowadząc do miażdżycowej choroby serca1,2. Terapie ukierunkowane na PCSK9 zdecydowanie obniżają poziom LDL-C i poprawiają wyniki sercowo-naczyniowe u pacjentów, nawet jeśli są dodane do agresywnej terapii obniżającej stężenie lipidów za pomocą statyn3,4. Obecnie zatwierdzone terapie ograniczają się jednak do podejść opartych na przeciwciałach i cierpią z powodu braku opłacalności5,6. Aby rozwiązać ten problem, potrzebne są mniej kosztowne alternatywy terapeutyczne, sposób na identyfikację pacjentów, którzy mogą uzyskać większe korzyści, lub jedno i drugie.
Podejścia małocząsteczkowe mogą być ukierunkowane na wewnątrzkomórkowy PCSK9, zapewnić lepszą drogę podania i obniżyć koszty, co czyni je "Świętym Graalem" w tej dziedzinie7. Jednak PCSK9 okazał się trudny do leczenia za pomocą małych cząsteczek. Z punktu widzenia proteazy, celowanie w funkcję proteolityczną PCSK9 jest atrakcyjną strategią, ponieważ autoproteoliza jest etapem ograniczającym szybkość dojrzewania PCSK9 8 i jest wymagana dla maksymalnego wpływu na LDL-R9. Do tej pory jednak strategia ta nie odniosła sukcesu, prawdopodobnie ze względu na unikalną biochemię PCSK9: PCSK9 rozszczepia tylko siebie10, przeprowadzając reakcję pojedynczego obrotu, a po samorozszczepieniu prodomena PCSK9 pozostaje związana w miejscu aktywnym jako autoinhibitor11, uniemożliwiając odczyt jakiejkolwiek dalszej aktywności proteazy.
Ten artykuł przedstawia metodę oceny funkcji proteolitycznej PCSK9 w sposób wysokoprzepustowy8. Dzięki mutagenezie ukierunkowanej na miejsce badacze mogą wykorzystać ten test do zbadania wpływu kodowania SNP znalezionych w klinice, aby ocenić ich wpływ na proteolizę, etap ograniczający szybkość dojrzewania PCSK9. Ponadto metoda ta będzie przydatna w projektowaniu wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji modulatorów proteolizy PCSK9, które zgodnie z przewidywaniami ostatecznie zakłócą prezentację PCSK9 w stosunku do LDL-R (i modulują efekt hipercholesterolemiczny PCSK9). Wreszcie, protokół ten można dostosować do innych proteaz o wewnętrznie niskiej aktywności, pod warunkiem, że i) można znaleźć określoną parę substrat-proteaza oraz ii) można ustalić odpowiednią wewnątrzkomórkową kotwicę dla substratu.

<table><tbody><tr><td>Probówki PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>do PCR</td></tr><tr><td>Q5 Gorący start</td><td>New England Biolabs</td><td>M0493L</td> Mieszanina roztworów deoxynukleotydów <td>polimerazy DNA o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>New</td><td>England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>dNTP (do PCR)</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td><td>Autorzy</td><td>nie dotyczy</td><td>Dostępne od autorów</td></tr><tr><td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td><td>Autorzy</td><td>n/a</td><td>Dostępne od autorów</td></tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-201-100</td><td>Do żeli DNA</td></tr><tr><td>E-Gel Imager System z podstawą niebieskiego światła</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4466612</td><td>Do obrazowania żeli DNA</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Do żeli DNA</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Do żelu DNA Bufor do biegania</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>Do żelu DNA Bufor do biegania</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego</td><td>Millipore Sigma</td><td>3690</td><td>EDTA, do żelu DNA Bufor</td></tr><tr><td>do biegania 1 kb Drabinka DNA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D010</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>LB Płytki agarowe ze 100 &mikro; g/mL karbenicylina</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td>Płytki LB-Carb</td></tr><tr><td>One Shot Mach1 T Odporny na fagi Chemicznie kompetentny E. coliThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>C862003</td><td>Chemicznie kompetentne komórki</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>LB</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-5</td><td>Selektywny antybiotyk</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega BioTek</td><td>D6942-02</td><td>Oczyszczanie DNA Miniprep</td></tr><tr><td>Kit Spektrofotomer NanoDrop 2000 Spektrofotometr</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 293T Amerykańska</td><td>kolekcja kultur tkankowych (ATCC)</td><td>CRL-3216</td><td>HEK Komórki 293T</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11995065</td><td>DMEM, komórka ssaków Media</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Axenia Biologix</td><td>F001</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td>Trypsyna, do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td>Automatyczne zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka do komory do liczenia komórek ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>C10228</td><td>Szkiełka do liczenia komórek</td></tr><tr><td>CELLSTAR Płytki do hodowli tkankowych, białe, z białym dnem, z pokrywką</td><td>Grenier Bio-One</td><td>655083</td><td>Biała, 96-dołkowa płytka z białym dnem</td></tr><tr><td>TempPlate 96-dołkowa płytka do PCR bez listwy, naturalna</td><td>USA Scientific</td><td>1402-9596</td><td>96-dołkowa płytka do głównej płytki plazmidowej</td></tr><tr><td>Nunc 2,0 ml DeepWell Płytki</td><td>ThermoFisher Scientific 278743</td><td></td><td>96-dołkowa płytka głębinowa</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>Odczynnik do transfekcji lipidów, odczynnik Lf3K</td></tr><tr><td>P3000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td>odczynnik do wstępnego kompleksowania DNA, wyposażony w Lf3K</td></tr><tr><td>OptiMEM I Zredukowane podłoże surowicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Zredukowane podłoże surowicy do transfekcji</td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4034</td><td>Askorbinian sodu</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Albumina, surowica bydlęca, frakcja V, niska zawartość metali ciężkich</td><td>Millipore Sigma</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>BSA Metanol (HPLC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A4524</td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>VWR</td><td>JT9535-2</td><td>Skoncentrowany HCl</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Gold Biotechnology</td><td>CZ2.5</td> Filtr strzykawkowy <td>z substratem lucyferazy</td></tr><tr><td>, sterylny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-720-3</td><td>Filtr sterylny, PVDF, 0,22 i mikro; </td></tr><tr><td>Pipeta wielofunkcyjna Pipet-Lite L12-200XLS+</td>Pipeta <td>wielokanałowa</td> <td>Rainin 17013810 Pipeta</td><td></td></tr><tr><td>wielokanałowa Pipet-Lite Pipeta wielokanałowa L12-20XLS+</td><td>Pipeta wielokanałowa Rainin 17013808 Pipeta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wielofunkcyjna Pipet-Lite L12-10XLS+</td><td>Pipeta wielokanałowa Rainin</td><td>17013807</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynniki</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Korytko na odczynniki</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td>Probówki 15 ml</td></tr> Probówki wirówkowe<tr><td>, 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>probówki 50 ml</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Spark</td><td>Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td>Microsoft 2016 dla komputerów Mac</td><td>Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Software v7</td><td>Oprogramowanie do analizy danych naukowych</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej pcsk9

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Konwertaza proproteinowa subtylizyna/keksyna typu 9 (PCSK9) to proteaza jednoobrotowa, która reguluje poziom lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w surowicy, a w konsekwencji choroby sercowo-naczyniowe. Chociaż proteoliza PCSK9 jest wymagana do uzyskania pełnego efektu hipercholesterolemii, ocena jego funkcji proteolitycznej jest trudna: wiadomo tylko, że PCSK9 sam się rozszczepia, przechodzi tylko jeden obrót, a po proteolizie zachowuje swój substrat w miejscu aktywnym jako autoinhibitor. Przedstawione tutaj metody opisują test, który pozwala przezwyciężyć te wyzwania. Test koncentruje się na proteolizie międzycząsteczkowej w kontekście komórkowym i łączy udane rozszczepienie z wydzielaną aktywnością lucyferazy, którą można łatwo odczytać w kondycjonowanym pożywce. Poprzez sekwencyjne etapy mutagenezy, transfekcji przejściowej i odczytu lucyferazy, test może badać proteolizę PCSK9 w warunkach zaburzeń genetycznych lub molekularnych w sposób wysokoprzepustowy. System ten doskonale nadaje się zarówno do biochemicznej oceny klinicznie odkrytych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu typu missense (SNP), jak i do badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów proteolizy PCSK9.

Wysokoprzepustowy test proteolizy opiera się na rozwiązaniu trzech głównych problemów. Po pierwsze, aby zniwelować naturalnie niską wydajność proteazy PCSK9 działającej w cyklu pojedynczego obrotu, zastosowano proteazę PCSK9 pozbawioną hamującej prodomeny, w której sekwencja cięcia na końcu prodomeny jest połączona z lucyferazą zdolną do sekrecji14. Po drugie, aby zaspokoić potrzebę fałdowania się proteazy w kompleksie z jej hamującą prodomeną, oba polipeptydy są k...

Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii PCSK9, takie jak to, które leki lub zmiany genetyczne wpływają na funkcję proteolityczną PCSK9. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybki i amplibiliczny odczyt zdarzenia biochemicznego o z natury niskiej częstotliwości. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku miażdżycowej choroby serca, ponieważ funkcja proteolityczna PCSK9 jest wymagana do jej ostatecznego wpływu na poziom cholesterolu w surowicy.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w sam PCSK9, może być również stosowana do innych systemów biochemicznych, takich jak inne proteazy o wewnętrznie niskiej aktywności proteolitycznej. Aby rozpocząć, odessać pożywkę z każdej limfocytów T HEK293. Umyj PBS i potraktuj minimalną objętością 0,5% trypsyny-EDTA.I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut, aby oddzielić komórki od kolby macierzystej. Dodaj dwa tomy DMEM uzupełnione 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę-EDTA. Następnie kilkakrotnie odpipetować płyn w kolbie w górę i w dół, usuwając przylegające komórki i przenosząc je do sterylnej probówki.Następnie usuń małą porcję komórek. Zabarwić równą objęto

a-high-throughput-luciferase-assay-to-evaluate-proteolysis-single

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Ten film przedstawia procedurę pomiaru aktywności γ-sekretazy w genetycznie zmodyfikowanych komórkach ludzkich przy użyciu systemu indukowanego tetracykliną. Proces ten polega na indukowaniu ekspresji genu APP za pomocą tetracykliny, generowaniu peptydów β amyloidu i aktywacji produkcji lucyferazy. Następnie mierzy się bioluminescencję wynikającą z reakcji lucyferazy-substratu, odzwierciedlającą aktywność γ-sekretazy.

Test lucyferazy do pomiaru aktywności γ-sekretazy w komórkach ludzkich

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Udało nam się wygenerować dwa testy γ sekretazy specyficzne dla substratu. Oba przedstawione tutaj testy komórkowe mają na celu ilościowe określenie aktywności enzymatycznej γ-sekretazy poprzez wyniki reporterów lucyferazy świetlika.

Ilościowy pomiar białka prekursorowego amyloidu za pośrednictwem γ-sekretazy i rozszczepienia Notch w komórkowych platformach testowych reporterowych lucyferazy

Tutaj prezentujemy biosensor oparty na lucyferazie, który pozwala określić ilościowo aktywność kinazy dużego supresora nowotworów (LATS) - centralnej kinazy w szlaku sygnałowym Hippo. Ten bioczujnik ma różnorodne zastosowania w badaniach podstawowych i translacyjnych mających na celu zbadanie regulatorów szlaku hipopotama in vitro i in vivo.

Monitorowanie aktywności szlaku sygnałowego hipopotama za pomocą biosensora LATS (Large Tumor Suppressor) opartego na lucyferazie

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Poznaj wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9 w komórkach HEK293T. Ta metoda umożliwia szybką analizę zdarzeń biochemicznych o niskiej częstotliwości, co jest kluczowe dla badań nad metabolizmem lipidów i rozwoju terapii przeciwmiażdżycowych.

Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9

Przeglądaj więcej filmów