Wysokoprzepustowy test lucyferazy do oceny proteolizy proteazy jednoobrotowej PCSK9
28 sierpnia 2018
Ten protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej proteazy o niskiej aktywności i pojedynczej rotacji w kontekście komórkowym. W szczególności metoda ta jest stosowana do oceny aktywności proteolitycznej PCSK9, kluczowego czynnika napędzającego metabolizm lipidów, którego aktywność proteolityczna jest wymagana do jego ostatecznej funkcji hipercholesterolemicznej.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii PCSK9, takie jak to, które leki lub zmiany genetyczne wpływają na funkcję proteolityczną PCSK9. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybki i amplibiliczny odczyt zdarzenia biochemicznego o z natury niskiej częstotliwości. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku miażdżycowej choroby serca, ponieważ funkcja proteolityczna PCSK9 jest wymagana do jej ostatecznego wpływu na poziom cholesterolu w surowicy.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w sam PCSK9, może być również stosowana do innych systemów biochemicznych, takich jak inne proteazy o wewnętrznie niskiej aktywności proteolitycznej. Aby rozpocząć, odessać pożywkę z każdej limfocytów T HEK293. Umyj PBS i potraktuj minimalną objętością 0,5% trypsyny-EDTA.
I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut, aby oddzielić komórki od kolby macierzystej. Dodaj dwa tomy DMEM uzupełnione 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę-EDTA. Następnie kilkakrotnie odpipetować płyn w kolbie w górę i w dół, usuwając przylegające komórki i przenosząc je do sterylnej probówki.
Następnie usuń małą porcję komórek. Zabarwić równą objętością błękitu trypanowego i przenieść wybarwione komórki na szkiełko, a następnie użyć automatycznego licznika komórek do policzenia komórek. Odwirować probówkę o stężeniu 500 razy G przez pięć minut, aby odzyskać komórki.
Następnie należy odessać pożywkę i rozpuść komórki i pożywkę hodowlaną do pożądanego stężenia. Za pomocą pipety wielokanałowej i sterylnego koryta przenieś 100 mikrometrów komórek z każdej studzienki na białą płytkę 96-dołkową. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.
Następnie przygotuj płytkę plazmidów do pożądanego stężenia do transfekcji, w tym cztery studzienki dla plazmidu kontroli pozytywnej, plazmidu kontroli ujemnej i buforu wolnego od plazmidu. Najpierw przygotuj mieszankę główną rozcieńczonego odczynnika do transfekcji lipidów i odczynnika do wstępnego kompleksowania DNA. Następnie, używając pipety wielokanałowej i sterylnego koryta, podwielokrotność 16,8 mikrolitrów rozcieńczonego odczynnika do wstępnego kompleksowania DNA do każdej studzienki płytki głębokiej studzienki.
Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 3,2 mikrolitra każdego plazmidu z płytki głównej do każdej studzienki płytki głębinowej. Następnie za pomocą pipety dodaj 20 mikrolitrów rozcieńczonej mieszaniny odczynników do transfekcji lipidów do każdego dołka płytki i dokładnie wymieszaj. Przykryj płytki i pozostaw je w temperaturze pokojowej na 10 do 15 minut, aby utworzyć kompleksy lipidowo-DNA.
Następnie za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usuń pożywkę z 293 limfocytów T w płytce 96-dołkowej. Następnie zastąp pożywkę 95 mikrolitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny transfekcyjnej do każdego odpowiedniego dołka.
Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Najpierw należy przygotować roztwory podstawowe wymagane do wytworzenia odczynnika do oznaczania celendantynozyny o podwójnej mocy, w tym trzy molowe askorbinian sodu w PBS, pięć molowych chlorków sodu w wodzie destylowanej, 10 miligramów na mililitr BSA w PBS i dwa milimolowe Coelenterazine w zakwaszonym metanolu. Następnie przygotuj wystarczającą ilość odczynników Coelenterazine do odczytu lucyferazy.
Z oddzielnym odczynnikiem dla komórek w pożywce. Następnie należy wymieszać wszystkie odczynniki oczekiwane dla Coelenterazine. Przefiltrować mieszaninę przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.
A następnie po filtracji dodać Coelenterazine. Wyjąć komórki z inkubatora 24 godziny po transfekcji. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 50 mikrolitrów kondycjonowanego podłoża z każdej studzienki na świeżą białą płytkę 96-dołkową.
Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 mikrolitrów nielitycznego odczynnika Coelenterazine o podwójnej mocy do płytki zawierającej tylko kondycjonowane podłoże. Następnie delikatnie potrząsaj talerzem w ciemności przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie powtórz ten krok, dodając odczynnik lityczny o podwójnej mocy do płytki zawierającej komórki.
Po inkubacji zmierz luminescencję płytki zawierającej tylko podłoże i płytki zawierającej komórkę w czytniku płytek. Na koniec wyrzuć płytki i zapisz pliki do dalszej analizy danych. Ważne jest, aby inkubować odczynnik lucyferazy z płytką zawierającą tylko pożywkę i płytką zawierającą komórkę przez ten sam czas, ponieważ dane dla tych płytek są bezpośrednio porównywane.
W tym protokole specyficzność sekwencji rozszczepienia proteazy PCSK9 w miejscach substratów od P6 do P6 Prime oceniono za pomocą testu lucyferazy. Zmiany w sekwencji rozszczepienia w pozycjach od P6 i P4 do P1 Prime są słabo tolerowane przez proteazę. Ale pozycje od P5 i P2 Prime do P6 Prime są bardziej elastyczne w zmianie.
Ponadto wyniki pokazują, że optymalne sekwencje rozszczepienia są zasadniczo takie same jak sekwencje typu Wild. Względna aktywność rozszczepienia biblioteki błędnych wycinków znalezionych w klinice została porównana z proteazą typu dzikiego. Spośród 84 ocenianych snipów, ponad połowa wykazała znaczące zmiany w aktywności w porównaniu z proteazą typu dzikiego, co sugeruje, że zmiany w aktywności proteazy są często obserwowane w populacji klinicznej.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa lub testy wychwytu cholesterolu w hepatocytach, aby ocenić zmiany w zdolności proteolitycznej PCSK9 na wpływ PCSK9 na receptor LDL.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę oceny aktywności proteolitycznej białka PCSK9, kluczowego regulatora metabolizmu lipidów. Technika ta umożliwia szybki odczyt rzadkich zdarzeń biochemicznych, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli PCSK9 w hipercholesterolemii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Enzymologia proteolityczna
- Metabolizm lipidów
Wstęp
- PCSK9 jest niezbędny do regulacji poziomu cholesterolu w surowicy.
- Zrozumienie jego funkcji proteolitycznej może pomóc w opracowywaniu leków.
- Metoda ta może zostać zastosowana również do innych proteaz o niskiej aktywności.
- Badania te mają znaczenie dla leczenia miażdżycowej choroby serca.
Cel badania
- Ocena aktywności proteolitycznej PCSK9 w kontekście komórkowym.
- Określenie wpływu leków lub zmian genetycznych na funkcję PCSK9.
- Dostarczenie informacji możliwych do zastosowania w innych układach biochemicznych.
Zastosowane metody
- Odssać pożywkę z komórek HEK293 T.
- Przemyć komórki PBS.
- Potraktować komórki 0,5% Trypsyną-EDTA.
- Zastosować metodę umożliwiającą uzyskanie amplyfikowalnych odczytów aktywności proteolitycznej.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczną ocenę rzadko występujących zdarzeń proteolitycznych.
- Uzyskane informacje mogą wpłynąć na strategie terapeutyczne w zakresie kontroli poziomu cholesterolu.
- Potencjalne zastosowania obejmują również inne proteazy.
Wnioski
- Technika ta pogłębia zrozumienie roli PCSK9 w metabolizmie lipidów.
- Stanowi ona podstawę do badania innych proteaz o niskiej aktywności.
- Otrzymane wyniki mogą przyczynić się do postępów w leczeniu miażdżycowej choroby serca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena funkcji proteolitycznej proteaz o pojedynczym obrocie, takich jak PCSK9, jest kluczowa dla walidacji celu w procesie odkrywania leków w kardiologii. Ten test umożliwia wysokoprzepustową analizę zaburzeń genetycznych i farmakologicznych, co wspiera usuwanie ryzyka mechanistycznego i zwiększa pewność predykcyjną w identyfikacji związków wiodących. Łączy on mechanizm biochemiczny z wynikiem fenotypowym poprzez powiązanie aktywności proteazy z odczytem sekrecyjnej lucyferazy.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez badanie wpływu wariantów genetycznych lub związków chemicznych na funkcję proteolityczną PCSK9.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybki, amplifikowalny odczyt niskoczęstotliwościowych zdarzeń biochemicznych w kontekście komórkowym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę klinicznych polimorfizmów SNP typu missense oraz skuteczności inhibitorów w celu selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Łączy międzycząsteczkową proteolizę z aktywnością wydzielanej lucyferazy w celu ilościowego, homogenicznego wykrywania.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z formatem 96-dołkowym, umożliwiająca przesiewanie bibliotek mutantów lub zbiorów małych cząsteczek.
- Gotowość testu: Wykorzystanie pożywki kondycjonowanej do pomiarów nielitycznych, co zmniejsza zmienność i umożliwia profilowanie kinetyczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy aktywność proteolityczną in vitro z późniejszymi efektami wpływającymi na receptor LDL i wychwyt cholesterolu w hepatocytach.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia zależności struktura-funkcja, wskazując, które pozycje substratu tolerują mutacje w celu projektowania inhibitorów.
- Pewność prognostyczna: Wykazuje, że ponad połowa klinicznych SNP zmienia aktywność, co dostarcza informacji niezbędnych do interpretacji wariantów w stratyfikacji pacjentów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w etap wczesnego odkrywania leków, umożliwiając ocenę modulacji celu przed przejściem do testów komórkowych lub fenotypowych, co stanowi mechanistyczny pomost między oddziaływaniem na cel a skutkiem funkcjonalnym.
- Biologia odkrywcza: Pozwala badać wpływ zaburzeń na funkcję proteaz, wspierając walidację celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Umożliwia wysokoprzepustową ocenę wariantów genetycznych lub związków chemicznych, wykorzystując sekrecję lucyferazy jako wskaźnik cięcia proteolitycznego.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty luminescencji z medium kondycjonowanego, co pozwala na porównanie wyników między różnymi warunkami oraz normalizację względem liczby komórek.
- Badania translacyjne: Dostarcza danych do dalszych analiz, takich jak pobieranie cholesterolu w hepatocytach, w celu oceny znaczenia fizjologicznego zmian proteolitycznych.
- Zastosowania szerokie: Metoda adaptowalna do innych proteaz o niskiej aktywności, służąca jako platforma do walidacji celów proteolitycznych w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośredni pomiar funkcji proteolitycznej w kontekście fizjologicznie istotnym.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowany, powtarzalny schemat pracy z minimalnym nakładem czasu pracy manualnej i skalowalnym odczytem za pomocą czytnika płytek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie modulacji celu z mechanizmem biochemicznym, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapeutyków celowanych w PCSK9 z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o skuteczność proteolityczną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek ssaków, transfekcji przejściowej oraz w testach opartych na lucyferazie.
- Zależne od czytnika płytek z detekcją luminescencji oraz optymalizacji wydajności transfekcji w komórkach HEK293 T.
- Wymaga standaryzacji postępowania z medium warunkującym oraz czasów inkubacji odczynników w celu dokładnego porównania sygnałów litycznych i nielitycznych.
- Adaptacja do innych proteaz wymaga ponownego zaprojektowania substratu i walidacji powiązania reportera lucyferazy z zdarzeniem cięcia.
- Ograniczone do proteaz, w których cięcie można powiązać z sekrecją lucyferazy; nieodpowiednie dla proteaz wewnątrzkomórkowych lub o wielokrotnym obrocie bez wprowadzenia modyfikacji.
