Name: Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj technikę Adipo-Clear do oczyszczania tkanek tłuszczowych w celu trójwymiarowego obrazowania. Metoda usuwa nadmiar lipidów zachowując architekturę tkanki, umożliwiając badanie organizacji adipocytów i ich interakcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christinie Pyrgaki, Tao Tong i Alison North z Centrum Zasobów Bioobrazowania na Uniwersytecie Rockefellera za pomoc i wsparcie. Dziękujemy również Xiphiasowi Ge Zhu za montaż filmu. Prace te były wspierane przez Human Frontier Science Program Organization (PC).

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Rockefellera.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Wykonaj standardową perfuzję dosercową z ~20 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze 4 °C, aż krew zostanie całkowicie usunięta z tkanki.</li>
	<li>Zmienić perfuzat na ~20 ml roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS) w temperaturze 4 °C, aż szyja i ogon znacznie się usztywnią. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Roztwory należy sporządzać wewnątrz dygestoria.</li>
	<li>Ostrożnie przeanalizuj interesujące Cię poduszeczki tłuszczowe, aby usunąć całą poduszeczkę tłuszczową, nie uszkadzając jej. Używaj kleszczy z końcami, aby uniknąć szczypania lub ściskania tkanki. Unikaj zanieczyszczania wypreparowanej tkanki jakimkolwiek futrem.</li>
	<li>Po utrwaleniu tkanki w 4% PFA w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Dla każdej poduszeczki tłuszczowej po utrwaleniu ~10 ml roztworu utrwalającego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyj chusteczkę 3 razy (po 1 godzinie) 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przechowywać tkankę przez krótki okres (do 2 tygodni) w 1x PBS w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem. W przypadku długotrwałego przechowywania (np. 1-2 lata) należy zmienić bufor na 1x PBS z 0,05% azydkiem sodu (jako środek konserwujący). 
	UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny po spożyciu doustnym lub wchłonięciu przez skórę. Stężone roztwory azydku sodu (o stężeniu 5% lub większym) należy przenosić pod wyciągiem.</li>
</ol>
2. Delipidacja i przepuszczalność
Czas: 1-2 dni
<ol>
	<li>Przygotować gradient metanolu 20%, 40%, 60% i 80% z buforem B1n (tabela 1) (v/v), np. dla buforu 20% metanolu/B1n wymieszać 20 ml metanolu i 80 ml buforu B1n. Przechowywać wszystkie w temperaturze 4 °C. Kryształy glicyny wytrącają się z 60% i 80% metanolu/B1n z powodu nasycenia. Unikaj usuwania kryształów; Roztwór płynny należy stosować do następujących rodzajów prania. 
	UWAGA: Metanol jest lotny, drażniący i łatwopalny. Unikać kontaktu ze skórą lub oczami.</li>
	<li>Delikatnie usuń włosy z próbki pod mikroskopem preparacyjnym. Wszelkie włosy, kłaczki lub zanieczyszczenia przyczepione do próbki spowodują cienie podczas obrazowania. Przenieść oczyszczoną próbkę do nowej probówki.</li>
	<li>Wszystkie poniższe czynności należy wykonać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że wskazano inaczej. W przypadku małych próbek (np. tylnych podskórnych/okołogonadalnych poduszek tłuszczowych od młodych chudych myszy) należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 1,6 ml roztworu. W przypadku dużych próbek lub próbek o wysokiej zawartości lipidów (np. poduszek tłuszczowych od otyłych myszy) należy użyć probówek o pojemności 5 ml z 4 ml roztworu.
	<ol>
		<li>Umieścić probówki zawierające próbki poziomo na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na ~ 100 obr./min. Upewnij się, że próbki mogą swobodnie poruszać się wewnątrz probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnić próbkę w stopniowanej serii 20%, 40%, 60%, 80% i 100% buforu metanol/B1n przez wskazany czas (tabela 2). Zminimalizuj ilość przenoszonego roztworu.</li>
	<li>Odlipidować próbkę 100% dichlorometanem (DCM) (3 razy), przy czym czas inkubacji jest wskazany w tabeli 2. Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec drugiego i trzeciego płukania DCM. Jeśli nie, należy wydłużyć czas inkubacji, aby zapewnić pełną delipidację (np. wydłużyć z 30 minut do 1-2 godzin). 
	UWAGA: DCM należy obchodzić się z dygestoriami. Do inkubacji należy używać szklanych pojemników do przechowywania i probówek do mikrowirówek wykonanych z polipropylenu. Probówki do mikrowirówek nie powinny być używane do długotrwałego przechowywania DCM. Szalki Petriego i pipety serologiczne wykonane z polistyrenu nie są kompatybilne z DCM. DCM jest bardzo niestabilny. Szybko przenieść próbkę do świeżego roztworu, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 100% metanolem przez wskazany czas (Tabela 2).</li>
	<li>Opcjonalnie: Jeśli próbka nie jest dobrze perfundowana, kolor hemoglobiny z pozostałych czerwonych krwinek może powodować silną autofluorescencję. Wybielać 5% H2O2 w metanolu (1 objętość 30% H2O2 do 5 objętości metanolu) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie uwodnić próbkę w odwróconej serii metanol/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% metanolu/B1n i 100% buforu B1n (2 razy) przez wskazany czas (tabela 2).</li>
	<li>Przemywać próbkę buforem PTxwH (tabela 1) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdelipidowaną próbkę należy przechowywać w buforze PTxwH w temperaturze 4°C (do 1 roku) lub natychmiast przejść do etapu barwienia immunologicznego.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne całego wierzchowca
Czas: 8-10 dni
Uwaga: Wszystkie poniższe kroki powinny być wykonane w RT, chyba że zaznaczono inaczej, z potrząsaniem i ochroną przed światłem. W przypadku małych próbek należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 1,6 ml roztworu. W przypadku dużych próbek należy użyć probówek o pojemności 5 ml z 4 ml roztworu. Zaleca się, aby najpierw zwalidować przeciwciała na małych fragmentach tkanki lub skrawkach tkanek poddanych działaniu metanolu.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze PTxwH do zalecanego stężenia. Odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciała o stężeniu ~20 000 x g przez 10 minut, aby zapobiec wprowadzaniu osadów lub agregacji przeciwciał.</li>
	<li>Zdelipidowaną próbkę inkubować z pierwszorzędowym roztworem przeciwciał przez wskazany czas (Tabela 2).</li>
	<li>Przemyć próbkę buforem PTxwH w serii etapów inkubacji: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h i przez noc.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze PTxwH do zalecanego stężenia. Odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciała o sile ~20 000 x g przez 10 minut, aby zapobiec wprowadzaniu osadów lub agregacji przeciwciał. 
	Uwaga: Aby uniknąć wysokiego tła spowodowanego autofluorescencją tkanek, zaleca się przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforami, które emitują światło w obszarach czerwonych i dalekiej czerwieni. W zależności od liczby linii laserowych dostępnych w mikroskopie, w jednej próbce można jednocześnie zobrazować do 3-4 znaczników.</li>
	<li>Inkubować próbkę z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez wskazany czas (tabela 2).</li>
	<li>Przemyć próbkę buforem PTxwH w serii etapów inkubacji: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h i przez noc.</li>
	<li>Opcjonalnie: W przypadku typów tkanek, które są delikatne, utrwal wybarwioną tkankę za pomocą 4% PFA w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C, aby zachować morfologię tkanki. 
	Uwaga: Ten krok może zwiększyć tło obrazowania. Nie jest konieczne wykonywanie tego kroku w przypadku tkanki tłuszczowej.</li>
	<li>Przemyć próbkę 1x PBS w serii etapów inkubacji: 5 min, 10 min i 30 min.</li>
	<li>Delikatnie usuń kłaczki z próbki pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie tkanek
Czas: 1-2 dni
<ol>
	<li>Opcjonalnie: Osadź próbkę w agarozie, aby ułatwić montaż próbki do mikroskopii arkuszowej. 
	Uwaga: Ten krok jest zdecydowanie zalecany w przypadku tkanki tłuszczowej w celu ustabilizowania jej kształtu podczas obrazowania.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do zatapiania z 1% agarozą w 1x PBS (w/v). Schłodzić roztwór do zatapiania do temperatury ~ 40 °C, aby uniknąć wystawienia próbki na działanie nadmiernego ciepła.</li>
		<li>Oczyszczoną próbkę umieścić w formie (np. na szalce Petriego lub łódce wagowej) i ułożyć ją w żądanej pozycji. Unikaj przenoszenia płynów. Delikatnie wylać roztwór do zatapiania na próbkę. Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Pozwól, aby agaroza całkowicie zastygła w temperaturze pokojowej. Wyciąć blok zawierający próbkę. 
		Uwaga: Wszystkie poniższe etapy, w tym inkubację przez noc, należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, z potrząsaniem i ochroną przed światłem. W przypadku małych próbek należy użyć probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml z 1,6 ml roztworu. W przypadku dużych próbek należy użyć probówek o pojemności 5 ml z 4 ml roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnić próbkę w gradiencie metanolu za pomocąH2O: 25%, 50%, 75% i 100% (3 razy) przez wskazany czas (Tabela 2). 
	Uwaga: Próbkę można pozostawić na noc na etapie 100% metanolu.</li>
	<li>Inkubować próbkę w 100% DCM przez 1 godzinę z wytrząsaniem (3 razy). Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec każdego prania DCM. Jeśli nie, wydłuż czas inkubacji, aby zapewnić całkowite usunięcie metanolu. Próbkę można pozostawić na noc na etapie 100% DCM.</li>
	<li>Inkubować próbkę w eterze dibenzylowym (DBE) przez noc z łagodnym wstrząsaniem, aby uzyskać dopasowanie współczynnika załamania światła. 
	Uwaga: Próbka ostatecznie stanie się przezroczysta w świetle widzialnym. 
	UWAGA: DBE jest niebezpieczny. Unikać kontaktu ze skórą. Obsługuj go pod wyciągiem w dwuwarstwowych rękawicach. Wyrzuć rękawice, gdy tylko zostaną zanieczyszczone DBE. Do inkubacji należy używać szklanych pojemników i probówek do mikrowirówek (polipropylenowych). Probówki do mikrowirówek nie powinny być używane do długotrwałego przechowywania DBE. Szalki Petriego i pipety serologiczne wykonane z polistyrenu nie są kompatybilne z DBE. Wyczyść wszelkie rozlane płyny 100% etanolem.</li>
	<li>Inkubować próbkę ze świeżym DBE, lekko wstrząsając przez 2 godziny. Przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej w ciemności lub przejść bezpośrednio do obrazowania. 
	Uwaga: Zaleca się, aby próbki zostały zobrazowane w ciągu miesiąca. Chociaż niektóre fluorofory są bardziej stabilne niż inne, nie zaleca się długotrwałego przechowywania próbek na tym etapie.</li>
</ol>
5. Mikroskopia
<ol>
	<li>Obrazowanie za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi, który jest kompatybilny z DBE. 
	Uwaga: Tylko obiektywy, które są zatwierdzone do obrazowania na bazie rozpuszczalników organicznych i dopasowane do współczynnika załamania światła DBE, mogą być używane jako obiektywy zanurzające w obrazowaniu zanurzonym w DBE.
	<ol>
		<li>Zamontuj próbkę zatopioną w agarozie na uchwycie, który może zapobiegać ruchowi podczas obrazowania. Zanurzyć próbkę w komorze wypełnionej DBE.</li>
		<li>Zbierz stos z pokrywający całą próbkę (np. powiększenie 1-2X), aby uzyskać rozkład/strukturę markera w całej tkance.</li>
		<li>Przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu (np. powiększenie 4-12X), aby przybliżyć obszary zainteresowania i zobrazować szczegółowe struktury. 
		Uwaga: Kolagen jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do powstania macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki tłuszczowej, która otacza wszystkie komórki tłuszczowe13. Kolagen ma typowe spektrum emisyjne w zakresie od 400 nm do 550 nm14. Obrazowanie próbki za pomocą linii lasera 488 (zielona) i zebranie wyemitowanego światła w zakresie długości fali, który leży w widmie emisyjnym kolagenu (np. 525-550 nm) dostarczy sygnał autofluorescencji tkanki, który, jak wcześniej wykazano, wyznacza kontur komórki tłuszczowej i ogólną architekturę tkanki12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu dwufotonowego.
	<ol>
		<li>Umieść próbkę zatopioną w agarozie w szkiełku komorowym ze szklanym dnem, nie dotykając żadnych plastikowych części (lub innej komory obrazowania zgodnej z DBE, która może być uszczelniona). Upewnij się, że DBE nie wycieka.</li>
		<li>Wybierz obiektywy o większych odległościach roboczych, aby uzyskać głębszą penetrację. 
		Uwaga: Obrazowanie powinno być wykonywane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub dwufotonowego przez szklane dno szkiełka komory. Należy unikać bezpośredniego kontaktu próbki z obiektywami zanurzeniowymi, które nie są zalecane w przypadku obrazowania opartego na DBE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3934003/">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development%2C+expansion+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li>
<li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li>
<li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+A+Simple%2C+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li>
<li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis%3A+Role+of+Collagen+VI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging%3A+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry+EJH%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li>
<li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li>
<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Adipo-Clear to prosta i solidna metoda oczyszczania tkanki tłuszczowej, którą można łatwo wykonać w zwykłym laboratorium. W porównaniu z innymi metodami oczyszczania na bazie rozpuszczalników, takimi jak iDISCO/iDISCO+10,11,12, Adipo-Clear jest szczególnie zoptymalizowany do oczyszczania tkanki tłuszczowej i innych tkanek o wysokiej zawartości tłuszczu. Etap delipidacji całkowicie usuwa lipidy z tkanki tłuszczowej, a tym samym u...

Do niedawna tkanka tłuszczowa była postrzegana jako amorficzny zbiór komórek tłuszczowych. W ciągu ostatnich kilku dekad nasze zrozumienie stało się bardziej wyrafinowane, a tłuszcz jest obecnie uznawany za złożony narząd zawierający różne typy adipocytów, a także prekursory adipocytów, komórki odpornościowe, fibroblasty, naczynia krwionośne i projekcje nerwowe. Interakcje między tymi komórkami rezydującymi w tkance tłuszczowej mają wyraźny wpływ na tkankę tłuszczową oraz fizjologię i patofizjologię organizmu1. Chociaż nowe badania ujawniły ważne mechanizmy molekularne leżące u podstaw niektórych interakcji, bardziej wszechstronne zrozumienie wymaga wiarygodnego profilowania strukturalnego całej tkanki w trzech wymiarach (3D).
Nasza obecna wiedza na temat morfologii tkanki tłuszczowej opiera się głównie na analizie histologicznej cienkich odcinków (5 μm) ze stosunkowo dużym powiększeniem obrazowania (ponad 10X)2,3. Takie podejście ma jednak kilka istotnych ograniczeń. Po pierwsze, skomplikowane struktury nitkowate, takie jak nerwy współczulne i układ krążenia, o których wiadomo, że odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej4,5,6,7, są trudne do oceny za pomocą cienkich przekrojów. Po drugie, ze względu na pozornie amorficzny kształt i brak reprezentatywnych jednostek strukturalnych, na których można by się skupić, trudno jest docenić struktury tkanki tłuszczowej wyłącznie na podstawie barwienia przekrojowego. Po trzecie, tkanka tłuszczowa ma bardzo wysoką zawartość lipidów, co stwarza wyzwania w uzyskaniu spójnych odcinków seryjnych, które są odpowiednie do rekonstrukcji anatomicznej 3D, konwencjonalnej metody stosowanej do badania morfologii całego mózgu8. Biorąc pod uwagę te czynniki, istnieje ogromne zapotrzebowanie na kompleksowe podejście, które może zapewnić wizualizację 3D całego magazynu tłuszczu przy jednoczesnym osiągnięciu rozdzielczości komórkowej.
3D wolumetryczne obrazowanie całego narządu jest trudne ze względu na zasłaniające efekty rozpraszania światła. Głównym źródłem rozpraszania światła w tkankach biologicznych są granice faz lipidowo-wodnych. Chociaż wysiłki mające na celu wyeliminowanie rozproszenia poprzez usunięcie lipidów trwają od ponad wieku, w ostatnim czasie pojawiło się wiele innowacji9. Jedną z takich nowo opracowanych metod oczyszczania tkanek jest obrazowanie 3D narządów oczyszczonych rozpuszczalnikiem z wykorzystaniem znakowania immunologicznego (iDISCO/iDISCO+)10,11. Jednak tkanka tłuszczowa stanowi szczególne wyzwanie ze względu na wysoki poziom lipidów, dlatego wymagane są dodatkowe modyfikacje protokołu iDISCO/iDISCO+, aby w pełni wydobyć lipidy, jednocześnie chroniąc tkankę przed zapadnięciem się. Opracowany przez nas zmodyfikowany protokół, obecnie nazywany Adipo-Clear, wykorzystuje delipidację tkanki tłuszczowej na bazie metanolu/dichlorometanu w celu uzyskania optymalnej przezroczystości odpowiedniej dla obrazowania wolumetrycznego o wysokiej rozdzielczości12. Ponieważ etap delipidacji w dużej mierze wygasza endogenne białka fluorescencyjne, takie jak GFP i RFP, wizualizacja takich białek musi być osiągnięta przez znakowanie immunologiczne. Ogólnie rzecz biorąc, ten prosty i solidny protokół można zastosować do badania organizacji na poziomie tkankowym komórek rezydujących w tkance tłuszczowej, śledzenia linii komórek progenitorowych adipocytów i morfogenezy tkanki tłuszczowej podczas rozwoju.

<table><tbody><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270991</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>Eter benzylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Królik poliklonalna hydroksylaza anty-tyrozynowa</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Koza poliklonalna anty-CD31 / PECAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td>Końcowe stężenie 2 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Szczurzy monoklonalny anty-CD68, klon FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>Końcowe stężenie 2 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anty-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>Końcowe stężenie 5-10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>Końcowe stężenie 5-10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Osioł anty-szczurzy IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>Końcowe stężenie 5-10 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Komora obrazowania</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z arkuszem świetlnym</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>do wizualizacji mikroskopii</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Tkanka tłuszczowa odgrywa kluczową rolę w homeostazie energetycznej i termoregulacji. Składa się z różnych typów adipocytów, a także prekursorów adipocytów, komórek odpornościowych, fibroblastów, naczyń krwionośnych i wypustek nerwowych. Chociaż kontrola molekularna specyfikacji typu komórki i sposobu interakcji tych komórek jest coraz bardziej nakreślona, bardziej kompleksowe zrozumienie tych komórek rezydujących w tłuszczu można osiągnąć, wizualizując ich rozmieszczenie i architekturę w całej tkance. Istniejące podejścia immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne do analizy histologii tkanki tłuszczowej opierają się na cienkich skrawkach zatopionych w parafinie. Jednak cienkie skrawki wychwytują tylko niewielką część tkanki; W rezultacie wnioski mogą być stronnicze w zależności od tego, jaka część tkanki jest analizowana. Dlatego opracowaliśmy technikę oczyszczania tkanki tłuszczowej, Adipo-Clear, aby umożliwić kompleksową trójwymiarową wizualizację wzorców molekularnych i komórkowych w całych tkankach tłuszczowych. Adipo-Clear został zaadaptowany z iDISCO/iDISCO+, ze specyficznymi modyfikacjami wprowadzonymi w celu całkowitego usunięcia lipidów zmagazynowanych w tkance przy jednoczesnym zachowaniu natywnej morfologii tkanki. W połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych demonstrujemy tutaj zastosowanie metody Adipo-Clear do uzyskania wysokorozdzielczych obrazów wolumetrycznych całej tkanki tłuszczowej.

Przygotowane metodą Adipo-Clear całe poduszki tłuszczowe można obrazować w 3D, aby przeanalizować, jak morfologia tkanki i interakcje komórkowe zmieniają się w stanach szczupłości oraz otyłości. Metodę tę można łatwo zastosować do analizy ogólnej struktury tkanki tłuszczowej poprzez zbieranie sygnału autofluorescencji tkanki w kanale zielonym. Wykazaliśmy wcześniej, że sygnał autofluorescencji w tkance tłuszczowej pokrywa się z barwieniem perilipiny, powszechnie stosowanego markera do wyz...

Ze względu na wysoką zawartość lipidów, tkanka tłuszczowa była trudna do wizualizacji przy użyciu tradycyjnych metod histologicznych. Adipo-Clear to technika oczyszczania tkanek, która umożliwia solidne znakowanie i wolumetryczne obrazowanie fluorescencyjne tkanki tłuszczowej w wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbki, obróbki wstępnej, barwienia, czyszczenia i montażu do obrazowania.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej, takie jak to, w jaki sposób różne składniki tkanki tłuszczowej oddziałują na siebie w całej tkance. Główną zaletą tej techniki jest to, że w pełni usuwa nadmiar lipidów zgromadzonych w tkance tłuszczowej przy zachowaniu jej trójwymiarowej architektury. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w trójwymiarową organizację tkanki tłuszczowej, może być również ogólnie stosowana do innych tkanek o wysokiej zawartości lipidów, takich jak gruczoł pamięci i węzły chłonne.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy delipidacji i oczyszczania wymagają wystarczającego czasu inkubacji, co może być trudne do określenia. Zacznij od użycia tępo zakończonych kleszczy, aby wypreparować interesującą nas poduszeczkę tłuszczową ze świeżo perfundowanego modelu zwierzęcego. Ostrożnie usuń całą podkładkę mody, nie ściskając ani nie ściskając tkanki ani nie zanieczyszczając wypreparowanej tkanki futrem.Umieść poduszeczkę tłuszczową w około 10 mililitrach roztworu utrwalającego w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów i zamocuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia po umyciu próbki PBS delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia z próbki pod mikroskopem preparacyjnym. Włosy, kłaczki lub inne zanieczyszczenia przyczepione do próbki spowodują cienie podczas obrazowania.Przenieść czystą próbkę do probówki polipropylenowej zawierającej lodowaty 20-procentowy bufor metanolu B1N. Umieść probówkę zawierającą próbkę poziomo na wytrząsarce orbitalnej, ustaw ją na 100 obr./min i potrząsaj przez 30 minut do 1 godziny, w zależności od wielkości próbki. Upewnij się, że próbki mogą swobodnie poruszać się wewnątrz probówki.Kontynuuj odwadnianie próbek za pomocą stopniowanej serii 40 procent, 60 procent i 80 procent metanolu w buforze B1N, a następnie 100 procent metanolu. Zminimalizuj rozwiązanie do przenoszenia. Po odwodnieniu zastąp 100-procentowy roztwór metanolu 100-procentowym dichlorometanem lub DCM w celu odlipidowania próbki.Powtórzyć płukanie dwukrotnie, postępując zgodnie z czasami inkubacji podanymi w tabeli 2. Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec drugiego i trzeciego płukania DCM. Jeśli nie, wydłuż czas inkubacji, aby zapewnić pełną delipidację.Po odlipidowaniu przemyć dwukrotnie 100% metanolem przez czas wskazany w tabeli 2. Ponownie uwodnić próbkę w odwróconej serii metanolu B1N w czasie wskazanym w tabeli 2. Po ponownym uwodnieniu przemyć próbkę buforem PTXWH przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.Próbka jest teraz gotowa do barwienia immunologicznego lub może być przechowywana w buforze PTXWH w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez okres do 1 roku. Najpierw rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze PTXWH do zalecanego stężenia. Następnie odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciał o stężeniu 20 tysięcy G przez 10 minut, aby zapobiec wprowadzaniu osadów lub agregacji przeciwciał.Ważne jest, aby wybrać odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe, które są kompatybilne z leczeniem metanolem i DCM. Nowe przeciwciała należy walidować za pomocą małych fragmentów tkanek lub skrawków tkanek poddanych działaniu metanolu. Inkubować zdelipidowaną próbkę z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych przez 3 do 5 dni, w zależności od wielkości próbki.Po wstępnej inkubacji przemyć próbkę kilkoma zmianami buforu PTXWH. Następnego dnia rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze PTXWH do zalecanego stężenia. Odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciał jak poprzednio.Inkubować próbkę z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 3 do 5 dni, w zależności od wielkości próbki. Ponownie przemyć próbkę buforem PTXWH w serii etapów inkubacji, jak poprzednio. Następnego dnia przemyj próbkę 1XPBS przez 5 minut, 10 minut, a następnie 30 minut.Osadź tkankę tłuszczową w agarozie, aby ułatwić montaż próbki do mikroskopii z lekkim arkuszem. Najpierw przygotuj roztwór do osadzania z 1 procentem agarozy w 1XPBS. Schłodzić roztwór do zatapiania do około 40 stopni Celsjusza, aby uniknąć wystawienia próbki na nadmierne ciepło.Unikając przenoszenia płynów, umieść oczyszczoną próbkę tkanki w formie i ułóż ją w żądanej pozycji. Następnie delikatnie wlej roztwór do zatapiania na próbkę, unikając pęcherzyków powietrza. Wszelkie pęcherzyki powietrza należy przesunąć na obrzeża, zanim agaroza zastygnie.Gdy agaroza całkowicie zastygnie, wytnij blok zawierający próbkę. Przenieść próbkę do 25 procent metanolu w wodzie, chronić przed światłem i inkubować z wytrząsaniem przez czas pokazany w tabeli 2. Kontynuować odwadnianie próbki za pomocą gradientu metanolu.Inkubować próbkę w 100 procentach DCM przez 1 godzinę z wytrząsaniem. Próbki umyte przez DCM łatwo wysychają w powietrzu, co wpływa na klarowność próbki i powoduje rozmycie obrazu. Ważne jest, aby szybko przenieść próbki do świeżego roztworu, aby zapobiec wysuszeniu.Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec każdego prania DCM. Inkubować próbkę w eterze dibenzylowym lub DBE przez noc z łagodnym wstrząsaniem w celu uzyskania dopasowania współczynnika załamania światła. Próbka w końcu stanie się przezroczystym, niewidzialnym światłem.Następnego dnia, po inkubacji próbki ze świeżym DBE z łagodnym wstrząsaniem przez 2 godziny, należy przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej w ciemności lub przejść bezpośrednio do obrazowania. Aby zobrazować próbkę za pomocą mikroskopu arkuszowego światła, który jest zgodny z DBE, zamontuj próbkę osadzoną w agarozie na uchwycie, który może zapobiegać ruchowi podczas obrazowania. Aby zobrazować próbkę za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub dwufotonowego, umieść próbkę zatopioną w agarozie w szkiełku podstawowym ze szklanym dnem.Skanowanie tylnej podskórnej poduszeczki tłuszczowej za pomocą mikroskopu z lekkim arkuszem o małym powiększeniu pokazuje organizację zrazikową adipocytów. Bardziej szczegółowe informacje, takie jak rozmiar adipocytów, można ujawnić, powiększając obszary zainteresowania przy większym powiększeniu. Tylną podskórną poduszeczkę tłuszczową barwioną hydroksylazą tyrozyny, markerem współczulnego układu nerwowego, zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w jasnym arkuszu.Barwienie TH ujawniło struktury, które wyglądają jak duże wiązki nerwowe, jak wskazuje strzałka tutaj. Unerwienie naczyń krwionośnych, a także gęsta arboryzacja końcowa w miąższu tkankowym ujawniają się również przez barwienie TH. Używając cząsteczki adhezji komórek śródbłonka płytek krwi lub PCAM1 znanego również jako CD31 jako markera do oznaczania naczyń krwionośnych, obserwuje się, że wszystkie adipocyty stykają się z naczyniami włosowatymi w całej tkance, co wspiera wysokie zapotrzebowanie na wydajną wymianę składników odżywczych i tlenu w tłuszczu.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią tkanki tłuszczowej do zbadania dodatkowych pytań, takich jak wczesna morfogeneza tkanek i mapowanie losów progenitorów adipocytów. Może być również stosowany do badania histologii ludzkiej tkanki tłuszczowej. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem, metanolem, dichlorometanem i eterem dibenzylowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestorium i środków ochrony osobistej.

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości fluorescencyjnie znakowanych komórek w dużych tkankach, najlepiej byłoby, gdyby próbki biologiczne były obrazowane bez dzielenia na sekcje. 3DISCO to prosta procedura oczyszczania tkanek oparta na sekwencyjnej inkubacji z rozpuszczalnikami organicznymi. Po oczyszczeniu narządy stają się przezroczyste, co pozwala na kompleksowe skanowanie laserowe próbki.

Obrazowanie oczyściło nienaruszone systemy biologiczne na poziomie komórkowym za pomocą 3DISCO

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Przedmiotem niniejszego badania jest zademonstrowanie techniki barwienia immunologicznego i wizualizacji jako idealnej metody do obrazowania 3D architektury tkanki tłuszczowej i komponentu komórkowego.

Wizualizacja struktury 3D białej tkanki tłuszczowej za pomocą barwienia całościowego

Tworzenie nowych naczyń krwionośnych i unerwienie współczulne odgrywają kluczową rolę w przebudowie tkanki tłuszczowej. Pozostają jednak kwestie techniczne związane z wizualizacją i ilościowym pomiarem tkanki tłuszczowej. Poniżej przedstawiamy protokół, który pozwala skutecznie oznaczyć i ilościowo porównać gęstości naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w różnych tkankach tłuszczowych.

Współbarwienie naczyń krwionośnych i włókien nerwowych w tkance tłuszczowej

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Tutaj opisujemy prostą, tanią i szybką metodę oczyszczania struktury 3D zarówno mysjej, jak i ludzkiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą kombinacji markerów do wizualizacji układu naczyniowego, jąder, komórek odpornościowych, neuronów i białek płaszcza lipidowo-kropelkowego za pomocą obrazowania fluorescencyjnego.

Badanie struktury tkanki tłuszczowej poprzez oczyszczanie salicylanu metylu i obrazowanie 3D

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Tutaj prezentujemy zoptymalizowane protokoły oczyszczania tkanek do obrazowania mysiej aorty w trzech wymiarach (3D). Opisujemy najnowocześniejsze procedury barwienia immunologicznego, oczyszczania optycznego i obrazowania z zamiarem określenia anatomicznej bliskości obwodowego układu nerwowego z blaszkami miażdżycowymi i przydanką w miażdżycy.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanek aorty w miażdżycy

Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.

Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Poznaj technikę Adipo-Clear do oczyszczania tkanek tłuszczowych w celu trójwymiarowego obrazowania. Metoda usuwa nadmiar lipidów zachowując architekturę tkanki, umożliwiając badanie organizacji adipocytów i ich interakcji.

Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Przeglądaj więcej filmów