Adipo-Clear: metoda oczyszczania tkanek do trójwymiarowego obrazowania tkanki tłuszczowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii tkanki tłuszczowej, takie jak to, w jaki sposób różne składniki tkanki tłuszczowej oddziałują na siebie w całej tkance. Główną zaletą tej techniki jest to, że w pełni usuwa nadmiar lipidów zgromadzonych w tkance tłuszczowej przy zachowaniu jej trójwymiarowej architektury. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w trójwymiarową organizację tkanki tłuszczowej, może być również ogólnie stosowana do innych tkanek o wysokiej zawartości lipidów, takich jak gruczoł pamięci i węzły chłonne.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy delipidacji i oczyszczania wymagają wystarczającego czasu inkubacji, co może być trudne do określenia. Zacznij od użycia tępo zakończonych kleszczy, aby wypreparować interesującą nas poduszeczkę tłuszczową ze świeżo perfundowanego modelu zwierzęcego. Ostrożnie usuń całą podkładkę mody, nie ściskając ani nie ściskając tkanki ani nie zanieczyszczając wypreparowanej tkanki futrem.

Umieść poduszeczkę tłuszczową w około 10 mililitrach roztworu utrwalającego w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów i zamocuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia po umyciu próbki PBS delikatnie usuń wszelkie zanieczyszczenia z próbki pod mikroskopem preparacyjnym. Włosy, kłaczki lub inne zanieczyszczenia przyczepione do próbki spowodują cienie podczas obrazowania.

Przenieść czystą próbkę do probówki polipropylenowej zawierającej lodowaty 20-procentowy bufor metanolu B1N. Umieść probówkę zawierającą próbkę poziomo na wytrząsarce orbitalnej, ustaw ją na 100 obr./min i potrząsaj przez 30 minut do 1 godziny, w zależności od wielkości próbki. Upewnij się, że próbki mogą swobodnie poruszać się wewnątrz probówki.

Kontynuuj odwadnianie próbek za pomocą stopniowanej serii 40 procent, 60 procent i 80 procent metanolu w buforze B1N, a następnie 100 procent metanolu. Zminimalizuj rozwiązanie do przenoszenia. Po odwodnieniu zastąp 100-procentowy roztwór metanolu 100-procentowym dichlorometanem lub DCM w celu odlipidowania próbki.

Powtórzyć płukanie dwukrotnie, postępując zgodnie z czasami inkubacji podanymi w tabeli 2. Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec drugiego i trzeciego płukania DCM. Jeśli nie, wydłuż czas inkubacji, aby zapewnić pełną delipidację.

Po odlipidowaniu przemyć dwukrotnie 100% metanolem przez czas wskazany w tabeli 2. Ponownie uwodnić próbkę w odwróconej serii metanolu B1N w czasie wskazanym w tabeli 2. Po ponownym uwodnieniu przemyć próbkę buforem PTXWH przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

Próbka jest teraz gotowa do barwienia immunologicznego lub może być przechowywana w buforze PTXWH w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez okres do 1 roku. Najpierw rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze PTXWH do zalecanego stężenia. Następnie odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciał o stężeniu 20 tysięcy G przez 10 minut, aby zapobiec wprowadzaniu osadów lub agregacji przeciwciał.

Ważne jest, aby wybrać odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe, które są kompatybilne z leczeniem metanolem i DCM. Nowe przeciwciała należy walidować za pomocą małych fragmentów tkanek lub skrawków tkanek poddanych działaniu metanolu. Inkubować zdelipidowaną próbkę z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych przez 3 do 5 dni, w zależności od wielkości próbki.

Po wstępnej inkubacji przemyć próbkę kilkoma zmianami buforu PTXWH. Następnego dnia rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze PTXWH do zalecanego stężenia. Odwirować rozcieńczony roztwór przeciwciał jak poprzednio.

Inkubować próbkę z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 3 do 5 dni, w zależności od wielkości próbki. Ponownie przemyć próbkę buforem PTXWH w serii etapów inkubacji, jak poprzednio. Następnego dnia przemyj próbkę 1XPBS przez 5 minut, 10 minut, a następnie 30 minut.

Osadź tkankę tłuszczową w agarozie, aby ułatwić montaż próbki do mikroskopii z lekkim arkuszem. Najpierw przygotuj roztwór do osadzania z 1 procentem agarozy w 1XPBS. Schłodzić roztwór do zatapiania do około 40 stopni Celsjusza, aby uniknąć wystawienia próbki na nadmierne ciepło.

Unikając przenoszenia płynów, umieść oczyszczoną próbkę tkanki w formie i ułóż ją w żądanej pozycji. Następnie delikatnie wlej roztwór do zatapiania na próbkę, unikając pęcherzyków powietrza. Wszelkie pęcherzyki powietrza należy przesunąć na obrzeża, zanim agaroza zastygnie.

Gdy agaroza całkowicie zastygnie, wytnij blok zawierający próbkę. Przenieść próbkę do 25 procent metanolu w wodzie, chronić przed światłem i inkubować z wytrząsaniem przez czas pokazany w tabeli 2. Kontynuować odwadnianie próbki za pomocą gradientu metanolu.

Inkubować próbkę w 100 procentach DCM przez 1 godzinę z wytrząsaniem. Próbki umyte przez DCM łatwo wysychają w powietrzu, co wpływa na klarowność próbki i powoduje rozmycie obrazu. Ważne jest, aby szybko przenieść próbki do świeżego roztworu, aby zapobiec wysuszeniu.

Próbka powinna opaść na dno rurki pod koniec każdego prania DCM. Inkubować próbkę w eterze dibenzylowym lub DBE przez noc z łagodnym wstrząsaniem w celu uzyskania dopasowania współczynnika załamania światła. Próbka w końcu stanie się przezroczystym, niewidzialnym światłem.

Następnego dnia, po inkubacji próbki ze świeżym DBE z łagodnym wstrząsaniem przez 2 godziny, należy przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej w ciemności lub przejść bezpośrednio do obrazowania. Aby zobrazować próbkę za pomocą mikroskopu arkuszowego światła, który jest zgodny z DBE, zamontuj próbkę osadzoną w agarozie na uchwycie, który może zapobiegać ruchowi podczas obrazowania. Aby zobrazować próbkę za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub dwufotonowego, umieść próbkę zatopioną w agarozie w szkiełku podstawowym ze szklanym dnem.

Skanowanie tylnej podskórnej poduszeczki tłuszczowej za pomocą mikroskopu z lekkim arkuszem o małym powiększeniu pokazuje organizację zrazikową adipocytów. Bardziej szczegółowe informacje, takie jak rozmiar adipocytów, można ujawnić, powiększając obszary zainteresowania przy większym powiększeniu. Tylną podskórną poduszeczkę tłuszczową barwioną hydroksylazą tyrozyny, markerem współczulnego układu nerwowego, zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w jasnym arkuszu.

Barwienie TH ujawniło struktury, które wyglądają jak duże wiązki nerwowe, jak wskazuje strzałka tutaj. Unerwienie naczyń krwionośnych, a także gęsta arboryzacja końcowa w miąższu tkankowym ujawniają się również przez barwienie TH. Używając cząsteczki adhezji komórek śródbłonka płytek krwi lub PCAM1 znanego również jako CD31 jako markera do oznaczania naczyń krwionośnych, obserwuje się, że wszystkie adipocyty stykają się z naczyniami włosowatymi w całej tkance, co wspiera wysokie zapotrzebowanie na wydajną wymianę składników odżywczych i tlenu w tłuszczu.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią tkanki tłuszczowej do zbadania dodatkowych pytań, takich jak wczesna morfogeneza tkanek i mapowanie losów progenitorów adipocytów. Może być również stosowany do badania histologii ludzkiej tkanki tłuszczowej. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem, metanolem, dichlorometanem i eterem dibenzylowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestorium i środków ochrony osobistej.