Name: Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Naucz się immunohistochemicznego wykrywania 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się siatkówce myszy. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie zmian epigenetycznych w chromatinie podczas rozwoju nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem SBIR (1R44EY027654-01A1).

Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Dziecięcego w Oakland Research Institute i przestrzegały oświadczenia Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącego wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Przygotowanie tkanek do barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Eutanazja myszy C57 BL / 6J w dniu embrionalnym (E) 16, dniu po urodzeniu (P) 0, P15 i P90 za pomocą dwutlenku węgla (CO2), a następnie dekapitacji (myszy E16 i P0).</li>
	<li>Natychmiast wyłuszczyć oczy myszy przekłute igłą 29G1/2 po grzbietowej stronie oka. Inkubować przez 5 minut (min) w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (1x PBS) o pH 8,0 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby wykonać muszle oczne z P0, P15 i P90, wypreparuj rogówkę i soczewkę cienkimi nożyczkami okulistycznymi, podczas gdy oczy są w 4% PFA. 
	UWAGA: Pomiń ten krok w przypadku oczu E16, ponieważ oczy są za małe.</li>
	<li>Zamocuj muszle oczne (P0, P15 i P90) i całe oczy (E16) w 4% PFA na 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj muszki oczne i całe oczy dwukrotnie w 1 ml 1x PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Cryoprotect kubki oczne i całe oczy w 1xPBS, pH 8,0 zawierającym 10% sacharozy przez 1 godzinę. Przechowywać w 20% sacharozy w 1x PBS przez 1 godzinę, a następnie nasycić 30% sacharozy w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia zanurzyć muszle oczne i całe oczy w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (500 μl) w krioformach, zamrozić błyskawicznie w kąpieli suchego lodu i etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Usunąć formy z osadzonymi muszlami ocznymi i całymi oczami z temperatury -80 °C i pozostawić do zrównoważenia do -20 °C przez 1 godzinę przed kriosekcją.</li>
	<li>Przeciąć przekroje poprzeczne siatkówki (o grubości 12 μm) równolegle do osi skroniowo-nosowej przez głowę nerwu wzrokowego za pomocą kriostatu w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zamontuj skrawki siatkówki na szkiełkach mikroskopowych53 i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne przeciwciałami 5-mC i 5-hmC
<ol>
	<li>Oceń odcinki siatkówki zamontowane na szkiełkach za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Hydrofobowy długopis barierowy zmniejsza objętość przeciwciała potrzebnego do zabarwienia tkanki.</li>
	<li>Przemyć odcinki siatkówki jednorazowo 200 μl 1x PBS przez 10 min.</li>
	<li>Przepuszczalność skrawków siatkówki za pomocą 200 μl 0,1% Triton X-100 w 1x PBS (PBS-T) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Denaturować skrawki siatkówki przez 30 minut za pomocą 200 μL świeżo przygotowanego 2 N kwasu solnego (HCl) w 1x PBS w inkubatorze o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Konieczne jest staranne miareczkowanie leczenia HCl, aby zoptymalizować sygnał 5mC.</li>
	<li>Zawsze uwzględniaj kontrpróby biologiczne (3-4), optymalizując sygnał 5mC54. 
	UWAGA: Przeprowadziliśmy pobieranie antygenu w 4 punktach czasowych (15 min, 30 minut, 1 h i 2 h) i stwierdziliśmy, że 30-minutowa inkubacja jest optymalna dla sygnału 5mC. Dłuższa inkubacja z HCl degraduje strukturę jąder, prowadząc do niemożności zlokalizowania sygnału 5mC do jądra.</li>
	<li>Po denaturacji zneutralizować skrawki siatkówki, dodając 100 μL 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3) na skrawki siatkówki przez 10 min.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 500 μl roztworu blokującego (5% przedimmunologicznej normalnej surowicy koziej w 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.</li>
	<li>Po zablokowaniu dodać przeciwciała anty-5mC; anty-5hmC rozcieńczone w stosunku 1:500 w roztworze blokującym do odcinków siatkówki.</li>
	<li>Skrawki siatkówki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
	<li>Następnego dnia przemyć skrawki siatkówki 3 razy (za każdym razem 10-15 min) 0,1% PBS-T, a następnie inkubować w roztworze blokującym z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (kozia anty-królicza i kozia anty-mysia IgG, rozcieńczona; 1:1000), zawierającą roztwór DAPI (4', 6-diamidino-2-fenyloindol) (1 μg/ml) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w roztworze blokującym. 
	UWAGA: Unikać wysuszania skrawków podczas wszystkich etapów immunodetekcji.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie 1 ml 0,1% PBS-T.</li>
	<li>Po ostatnim umyciu zamontuj sekcje z wodnym medium montażowym pod szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij bezbarwnym lakierem do paznokci.</li>
</ol>
3. Immunohistochemia konfokalna
<ol>
	<li>Ustaw sekcje tak, aby strona nabłonka barwnikowego siatkówki była zawsze skierowana w jedną stronę (np. do góry), aby uzyskać spójność.</li>
	<li>Wykonaj przechwytywanie obrazu wybarwionych immunologicznie skrawków siatkówki przy 63-krotnym powiększeniu (powiększenie soczewki obiektywu) z 2-krotnym lub 3-krotnym zoomem.</li>
	<li>Generuj wiele sekcji optycznych każdego wybranego obrazu (stosy z) we wszystkich 3 kanałach (czerwonym, zielonym i niebieskim, RGB) w kroku 0,35 μm. 
	UWAGA: Końcowe powiększenie próbki uwidocznionej z 10-20X (powiększenie soczewki obiektywu) wyniesie odpowiednio 63X w połączeniu z (zwykle używaną) soczewką okularową 10X. 
	Wizualizacja skompresowanego stosu optycznego w celu zlokalizowania sygnału 5mC i 5hmC</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metylacja i hydroksymetylacja DNA są dynamicznymi i odwracalnymi modyfikacjami DNA, które modulują różnorodny zakres mechanizmów biologicznych w komórkach rozwijających się, jak i postmitotycznych. W tym miejscu opisujemy powtarzalną technikę wykrywania modyfikacji DNA 5mC i 5hmC in situ za pomocą techniki immunohistochemicznej (przy użyciu przeciwciał anty-5mC i anty-5hmC) w zamrożonych odcinkach siatkówki myszy utrwalonych paraformaldehydem oraz podajemy wytyczne dotyczące poprawy i standaryzacji wyników, zwłaszcza podczas porównywania kilku różnych próbek. Wcześniej użyliśmy tej metody do nakreślenia zmian 5mC w siatkówce myszy z celowaniem specyficznym dla siatkówki genów metylotransferazy DNA Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b i zgłosiliśmy (oczekiwane) wyczerpanie znaczników 5mC w ich siatkówkach7.
Krytycznym krokiem w wykrywaniu immunohistochemicznym w 5 mC jest optymalizacja leczenia wycinków histologicznych HCl: oczekuje się, że mniej niż 15-minutowa obróbka wstępna nie przyniesie powtarzalnych wyników, podczas gdy nadmierne leczenie HCl niszczy architekturę jądrową. Najlepszy wynik uzyskaliśmy po 30 minutowej inkubacji z HCl. Zalecamy, aby zawsze używać świeżo rozcieńczonego HCl i świeżo przygotowanego 4% roztworu PFA do denaturacji DNA i utrwalenia tkanki siatkówki.
Aby rozwiązać problemy z wynikami, zalecamy dołączenie trzech do czterech powtórzeń biologicznych przy jednoczesnej optymalizacji sygnału 5mC. Podczas gdy każdy pojedynczy zestaw barwienia immunohistochemicznego może generować nieco inne wyniki (mniej lub bardziej jasne obszary heterochromatyczne), co jest oczekiwane w metodzie immunohistochemicznej, oczekuje się, że rozkład jądrowy 5mC i 5hmC w poszczególnych zestawach sekcji będzie bardzo powtarzalny, o ile przestrzegany jest protokół.
Technika ta ma również ograniczenia, ponieważ konsekwentnie obserwowaliśmy zmienność rozkładu 5mC w jądrach komórek fotoreceptorowych w tej samej sekcji. Odkryliśmy, że niektóre jądra wykazywały silny sygnał 5mC, podczas gdy sąsiednie jądra komórkowe nie wykazywały sygnału 5mC. Wynika to z ograniczenia w demaskowaniu antygenu 5mC przez leczenie HCl w zamrożonych skrawkach.
Znaczenie tej techniki umożliwia lokalizację 5 mC bez obróbki DNazą i proteinazą K, co prowadzi do lepszego zachowania chromocentrów. Oczekuje się, że technika ta będzie działać niezawodnie na wszystkich skrawkach wszystkich tkanek zwierzęcych kręgowców, zawierających ślady 5mC, 5hmC i przetwarzanych z podobnym podejściem, nie tylko siatkówki myszy, tak długo, jak długo przestrzegany będzie protokół.

Epigenetyczna regulacja rozwoju i postmitotycznej homeostazy siatkówki myszy to ekscytujący obszar badań, który obiecuje przynieść nowe zrozumienie biologicznych mechanizmów kontrolujących retinogenezę i determinację losu komórki, funkcji metabolicznych specyficznych dla typu komórki, a także patologii komórek, śmierci i regeneracji komórek1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Chromatyna ulega dynamicznym zmianom w rozwoju, a także w odpowiedzi na zmienne sygnały zewnętrzne, niezależnie od tego, czy jest to stres, metabolizm czy bodźce śmierci komórki6,14,15,16,17,18. W jądrach myszy chromatyna dzieli się na aktywną euchromatynę i nieaktywną heterochromatynę6,19,20. W jądrze interfazowym euchromatyna znajduje się w wewnętrznym obszarze jądra, podczas gdy heterochromatyna wyściela obwód jądra i jąderko. Ten wzór nazywa się konwencjonalnym i jest wysoce konserwatywny u eukariontów. Natomiast jądra pręcików u zwierząt prowadzących nocny tryb życia, takich jak myszy i szczury, mają odwrócony wzór, w którym jądro jest zajęte przez heterochromatynę w środku otoczoną euchromatyną, tworząc najbardziej zewnętrzną powłokę6,18,20. W momencie narodzin jądra pręcików mają konwencjonalną architekturę jądrową. Inwersja jąder pręcików zachodzi podczas rozwoju poprzez przebudowę konwencjonalnej architektury jądrowej. Podczas tego procesu obwodowa heterochromatyna oddziela się od peryferii jądra, a chromocentra łączą się ze sobą, tworząc pojedyncze chromocentrum w środku jądra6,18.
Metylacja genomowego DNA uczestniczy w kontrolowaniu lokalnej konformacji chromatyny21. Metylacja DNA zachodzi w pozycji 5' reszt cytozyny dinukleotydów CpG, które są wzbogacone w region promotorowy wielu genów w genomach myszy22,23,24,25,26, a także w regionach międzygenowych i intronowych, które przenoszą elementy regulatorowe27. Metylacja wysp CpG w promotorach proksymalnych21,24 i sekwencje CpG w wzmacniaczach genów27,28 jest ważny w regulacji dynamicznego stanu dwuwartościowej chromatyny, zawierającej wiele genów rozwojowych/czynników transkrypcyjnych odgrywających ważną rolę w rozwoju, raku i starzeniu się29,30,31,32,33,34. Trzy metylotransferazy DNA (DNMT) uczestniczą w metylacji DNA podczas rozwoju myszy35. Wszystkie trzy DNMT ulegają ekspresji podczas rozwoju siatkówki myszy36, a specyficzne dla siatkówki zmiany w genach Dnmt wpływają na rozwój siatkówki2,7. Hydroksymetylocytozyna (5hmC) jest produktem utleniającym demetylacji 5-metylocytozyny (5mC). Trzy enzymy translokacji Ten-Eleven (TET) uczestniczą w demetylacji 5mC37,38,39. Modyfikacja hydroksymetylo-C jest wzbogacona w promotory, ciała genów i międzygenowe sekwencje genomowe w bogatych w geny i aktywnie transkrybowanych regionach27,40.
Istnieje wiele opisanych podejść do określania zmieniających się wzorców metylacji DNA w komórkach41,42,43,44,45,46, niektóre z nich umożliwiają ilościowe określenie globalnych zmian metylacji DNA, podczas gdy inne koncentrują się na precyzyjnych zmianach w regionach bogatych w CpG w obrębie promotory i wzmacniacze. Podano również metody wykrywania i oznaczania ilościowego 5hmC47, w tym metodą immunohistochemii13. Techniki immunohistochemiczne, które umożliwiają solidne monitorowanie zmian 5mC i 5hmC w jądrach rozwijających się i postmitotycznych komórek, są bardzo pouczające dla określenia dynamiki chromatyny in situ w odpowiedzi na zewnętrzne lub wewnętrzne zmiany wpływające na komórki4,13,48,49. Podejście to jest jednak podatne na niedocenianie zmian metylacji i hydroksymetylacji DNA ze względu na trudności techniczne, związane z wykrywaniem modyfikacji cytozyny w preparatach histologicznych. Dzieje się tak, ponieważ niepolarne zasady DNA, w tym cytozyna modyfikowana 5mC i 5hmC, są ukryte w środku dwuniciowego DNA helix50 i wymagają demaskowania. Jest to szczególnie trudne w przypadku zamrożonych preparatów histologicznych, które mogą szybko stracić informacyjną organizację pierwotnej tkanki po zastosowaniu surowego traktowania.
Siatkówka myszy jest doskonałym modelem do analizy wpływu metylacji DNA na rozwój neuronów i homeostazę postmitotyczną. Istnieje tylko 6 typów neuronów (fotoreceptory pręcikowe i czopkowe, komórki amakrynowe, dwubiegunowe, poziome i zwojowe), jeden typ komórek glejowych (glej Mullera) i jeden typ komórek neuroepitelialnych (nabłonek barwnikowy siatkówki)<klasa sup = "xref">51. Stwierdzono, że typy komórek siatkówki mają wyraźne wzorce metylacji DNA18,19, który ostatnio był badany w rozdzielczości jednozasadowej1,5,9,12. Niedawno informowaliśmy o zastosowaniu immunohistochemii do wyznaczania wzorca dystrybucji 5mC w jądrach komórek siatkówki i zmian w jądrach siatkówki dorosłej myszy, gdzie wszystkie trzy metylotransferazy DNA zostały usunięte przez celowanie warunkowe7. W porównaniu z wieloma doniesieniami, w których obecność metylacji DNA w komórkach siatkówki mogła być postrzegana jedynie jako pozytywny lub negatywny sygnał w komórkach hipermetylowanych poddawanych apoptozie, nasze podejście umożliwiło wykrycie specyficznego ułożenia chromatyny w jądrach komórek siatkówki, co my i kilka grup zgłaszaliśmy i omawialiśmy wcześniej5,6,7,18,19,36,52. W tym miejscu szczegółowo opisujemy immunohistochemiczną (IHC) technikę wykrywania 5mC i 5hmC w zamrożonych odcinkach histologicznych utrwalonych paraformaldehydem, a także demonstrujemy dane, które udało nam się odtworzyć z naszego oryginalnego raportu7.

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>29G1/2 ULTRA-FINE</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne</td><td>Fine Science tools, Inc.&nbsp;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Długopis PAP</td><td>RPICORP.com</td><td>195505</td><td></td></tr><tr><td>Microslide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Mikroskop elektronowy Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optyczny środek tnący (OCT)</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>VWR analityczny&nbsp;</td><td>BDH7204-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8,3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5mC</td><td>Genway Biotech&nbsp;</td><td>GWB-BD5190</td><td></td></tr><tr><td>5hmC</td><td>Aktywny motyw</td><td>39791</td><td></td></tr><tr><td>LaminB1</td><td>Abcam</td><td>Ab16048</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Koza Ant-Królik IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-225-1444</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Kozia Mrówka IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-585-166</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICRM HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>388114</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Immunohistochemical Detection of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine in Developing and Postmitotic Mouse Retina

Epigenetyka rozwoju siatkówki to dobrze zbadana dziedzina badań, która obiecuje przynieść nowy poziom zrozumienia mechanizmów różnych chorób zwyrodnieniowych siatkówki u ludzi i wskazać nowe podejścia do leczenia. Architektura jądrowa siatkówki myszy jest zorganizowana w dwa różne wzory: konwencjonalny i odwrócony. Konwencjonalny wzór jest uniwersalny, w którym heterochromatyna jest zlokalizowana na obrzeżach jądra, podczas gdy aktywna euchromatyna znajduje się we wnętrzu jądra. W przeciwieństwie do tego, odwrócony wzór jądrowy jest unikalny dla jąder komórek fotoreceptora dorosłego pręcika, w których heterochromatyna lokalizuje się w centrum jądrowym, a euchromatyna znajduje się na obrzeżach jądra. Metylację DNA obserwuje się głównie w chromocentrach. Metylacja DNA jest dynamiczną kowalencyjną modyfikacją reszt cytozyny (5-metylocytozyny, 5 mC) dinukleotydów CpG, które są wzbogacone w regiony promotorowe wielu genów. Trzy metylotransferazy DNA (DNMT1, DNMT3A i DNMT3B) uczestniczą w metylacji DNA podczas rozwoju. Wykrywanie 5mC za pomocą technik immunohistochemicznych jest bardzo trudne, co przyczynia się do zmienności wyników, ponieważ wszystkie zasady DNA, w tym zasady zmodyfikowane 5mC, są ukryte w dwuniciowej helisie DNA. Jednak szczegółowe określenie rozkładu 5mC podczas opracowywania jest bardzo pouczające. W tym miejscu opisujemy powtarzalną technikę niezawodnego immunohistochemicznego wykrywania 5mC i innego epigenetycznego markera DNA 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), który kolokalizuje się z "otwartą", transkrypcyjnie aktywną chromatyną w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Aby określić rozmieszczenie 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) podczas rozwoju siatkówki oraz w siatkówce pomitotycznej, przeprowadzono immunohistochemiczne barwienie przekrojów siatkówki myszy C57BL/6J z dni E16, P0, P15 i P90 przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5mC i 5hmC.
W dniu E16 barwienie 5mC było intensywne w chromocentrach jąder komórkowych, podczas gdy w pozostałej części jąder komórkowych obserwowano słabe barwienie (Rycina 1a). Barwienie 5hmC ograniczało się do jąder komórkowych i nie występowało w chromocentrach (Rycina 1b).
W siatkówce P0 sygnał 5mC był zlokalizowany w chromocentry jądra komórkowego oraz na obwodzie jądra (Rysunek 2a, strzałka i grot strzałki). Zaobserwowano również słabe barwienie 5mC pomiędzy chromocentry jąder komórkowych. Sygnał 5hmC był wyraźnie obecny w jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentry (Rysunek 2b). Stwierdzono, że więcej jąder wykazuje barwienie na 5mC i 5hmC w wewnętrznej warstwie neuroblastów (INBL) (Rysunek 2c, linia przerywana)
W siatkówce P15 stwierdzono silne barwienie 5mC i 5hmC w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL), wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) oraz warstwie komórek zwojowych (GCL) (Rycina 3). W ONL (fotoreceptory pręcikowe) sygnał 5mC występował w chromocentrach jąder komórkowych oraz na obwodzie jądra (Ryciny 3a-3c, 3g). Sygnał 5hmC stwierdzono w całych jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów (Ryciny 3d-3f). Transmisyjna mikroskopia elektronowa przeprowadzona na siatkówce P15 wykazuje rozmieszczenie domen heterochromatycznych w jądrach komórek pręcikowych podobne do tego, które stwierdzono przy użyciu sygnału przeciwciała przeciwko 5mC (Rycina 3h oraz 3i).
Barwienie 5mC w INL i GCL było silne w chromocentrach jąder komórkowych, a słabe barwienie zaobserwowano również w całych jądrach komórkowych (Ryciny 3j-3l i 3r-3t). W przeciwieństwie do 5mC, sygnał 5hmC lokalizował się w całych jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów w INL i GCL (Ryciny 3m-3o i 3u-3w). Zaobserwowano silny sygnał 5hmC na obrzeżach jąder komórkowych w GCL.
W dojrzałych fotoreceptorach pręcikowych sygnał 5mC ograniczał się do chromocentrum i peryferii jąder komórkowych (Rysunki 4a-4c), podczas gdy sygnał 5hmc był ograniczony do peryferii jądra (Rysunki 4d-4f).
<img alt="Immunofluorescencja barwienia 5mC i 5hmC; analiza metylacji DNA; obraz mikroskopowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Lokalizacja 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w siatkówce myszy w 16. dniu embrionalnym. 
Immunobarwienie siatkówki myszy C57BL/6J przeciwciałami przeciwko 5mC (czerwony, a) oraz 5hmC (zielony, b). W dniu E16 sygnał 5mC jest bardzo silny w chromocentrach jąder komórkowych, a także występuje w całych jądrach komórkowych na znacznie niższym poziomie. Barwienie 5hmC było ograniczone wyłącznie do jąder komórkowych. Panel c przedstawia nałożony obraz 5mC i 5hmC. Jądra są wybarwione DAPI (niebieski, c). Wstawki przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazach. Pasek skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja komórek siatkówki wykazująca metylację 5mC, 5hmC, barwienie DAPI, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Barwienie immunohistochemiczne 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w siatkówce myszy w 0. dniu po urodzeniu. 
Immunoznakowanie siatkówki myszy C57BL/6J przeciwciałami przeciwko 5mC (czerwony, a) i 5hmC (zielony, b). W siatkówce P0 5mC i 5hmC występują zarówno w zewnętrznej warstwie neuroblastów (ONBL), jak i w wewnętrznej warstwie neuroblastów (INBL). a) Sygnał 5mC jest intensywny w chromocentrach (strzałka) i na obwodzie jąder komórkowych (głowica strzałki). Słabe barwienie 5mC obserwuje się również pomiędzy chromocentrami jąder komórkowych. b) Barwienie 5hmC ogranicza się do jądra komórkowego, a silny sygnał obserwuje się w INBL (linia przerywana na panelu c). Panel c przedstawia obraz po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC. Jądra zostały wybarwione przeciwbarwnikiem DAPI (niebieski, c). Wstawki przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazach. Pasek skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna: rozkład 5mC i 5hmC w warstwach siatkówki; ONL, INL, GCL; barwienie DAPI." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rozkład 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylowej cytozyny w siatkówce myszy w 15. dniu po urodzeniu. 
Immunobarwienie siatkówki myszy C57BL/6J przeciwciałami anty-5mC oraz 5hmC (a-g, j-y). W zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) (fotoreceptory pręcikowe) sygnał 5mC (czerwony, a) zazwyczaj pokrywa się z chromocentrami jąder komórkowych (grot strzałki, b), a także lokalizuje się na obwodzie jądra (strzałka, b). Panel b (czerwony) i c (szary) przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazie a. Sygnał 5hmC (zielony, d) ogranicza się do całych jąder komórkowych z wyjątkiem chromocentrów. Panel e (zielony) i f (szary) przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazie d. Panel g przedstawia obraz po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC. Jądra przeciwbarwiono DAPI. Panele h i i to obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego jąder fotoreceptorów w 15. dobie po urodzeniu, ukazujące rozmieszczenie domen heterochromatyny. Czarny grot strzałki w panelu h wskazuje pojedyncze jądro fotoreceptora pręcikowego, powiększone w panelu i. Czerwone groty strzałek w panelu i wskazują domeny heterochromatyny wewnątrz jądra fotoreceptora pręcikowego, natomiast czerwone strzałki wskazują heterochromatynę na obwodzie jądra. W jądrach komórkowych warstwy wewnętrznej jądrowej (INL) (j-q) oraz warstwy komórek zwojowych (GCL) (r-y) sygnał 5mC (czerwony) lokalizuje się w chromocentrach obecnych na obwodzie, a słabe barwienie wykryto również w pozostałej części jąder komórkowych. Panel k (czerwony) i l (szary) przedstawiają powiększenie obszaru oznaczonego gwiazdką na obrazie j. Barwienie 5hmC (zielone) w jądrach komórkowych INL i GCL ogranicza się do całego jądra komórkowego. Zwróć uwagę na silne barwienie 5hmC na obwodzie jąder komórek GCL. Panel p i x przedstawiają obrazy po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC, natomiast panel q i y przedstawiają powiększenie obszarów oznaczonych gwiazdką odpowiednio na obrazach p i x. Jądra przeciwbarwiono DAPI. Pasek skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki mikroskopii fluorescencyjnej ukazujące czopki w zewnętrznej warstwie jądrowej, z zaznaczeniem charakterystycznych markerów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58274/58274fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4. Rozkład 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylozytozyny w jądrach fotoreceptorów pręcikowych siatkówki myszy C57BL/6J w 90. dniu po urodzeniu. 
Barwienie 5mC (czerwone, a) jest wyraźnie widoczne w chromocentrum jąder komórkowych, a także słabo widoczne na obwodzie jądra. Panele b (czerwony) i c (szary) przedstawiają powiększenie obszaru zaznaczonego gwiazdką na obrazie a. Barwienie 5hmC (zielone, d) ogranicza się wyłącznie do obwodu jądra. Panele e (zielony) i f (szary) przedstawiają powiększenie obszaru zaznaczonego gwiazdką na obrazie d. Panel g przedstawia obraz po nałożeniu sygnałów 5mC i 5hmC, natomiast panel h jest powiększeniem obszaru zaznaczonego gwiazdką na obrazie g. Jądra zostały przeciwbarwione DAPI (niebieski). Pasek skali: 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58274/58274fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.</a>

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

The epigenetics of retinal development is a well-studied research field, which promises to bring a new level of understanding about the mechanisms of a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metylacji DNA, takie jak zmiany chromatyny podczas rozwoju siatkówki w postmitotycznej siatkówce. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją solidnie stosować na dowolnych odcinkach ze wszystkich tkanek siatkówki myszy przenoszących dystrybucję 5-metylocytozyny, 5-hydroksymetylocytozyny, które są przetwarzane w podobny sposób. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania i barwienia tkanek są trudne do nauczenia, ponieważ w przypadku stosowania zamrożonych preparatów histologicznych można utracić cenną organizacyjną i oryginalną tkankę.Resztę procedury zademonstruje Pablo Diaz, pracownik naukowy z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj igły o rozmiarze 29 o średnicy jednego pół cala, aby przekłuć oczy zdekapitowanej myszy poddanej eutanazji po grzbietowej stronie oczu. Aby uzyskać muszle oczne, należy natychmiast wyłuszczyć oczy, przecinając wokół twardówki cienkimi nożyczkami okulistycznymi, aby usunąć rogówkę i soczewkę.Utrwal muszle oczne i całe oczy E16 w 4% paraformaldehydzie lub PFA w 1xPBS pH 8,0 przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj je dwukrotnie w jednym mililitrze 1xPBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Aby kriochronić gałki oczne i całe oczy, inkubuj je w 1xPBS pH 8,0 z 10% sacharozą w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie w 20% sacharozy w 1xPBS przez godzinę. I wreszcie w 30% sacharozy w 1xPBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zanurz muszle oczne i oczy w masie o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) w krioformach.Następnie zamroź je w kąpieli etanolowej z suchym lodem i utrzymuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem kriosekcji usuń formy z osadzonymi muszlami ocznymi i oczami z 80 stopni Celsjusza. Umieść je w uchwycie kriostatu i pozwól im osiągnąć równowagę do 20 stopni Celsjusza przez godzinę.Za pomocą kriostatu w temperaturze 20 stopni Celsjusza przeciąć przekroje siatkówki o grubości 12 mikrometrów równolegle do osi skroniowo-nosowej przez głowę nerwu wzrokowego. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć barwienie immunologiczne, użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć odcinki siatkówki zamontowane na szkiełkach.Umyj skrawki raz 200 mikrolitrami 1xPBS przez 10 minut. Przepuszczać skrawki za pomocą 200 mikrolitrów PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie denaturuj je 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego, starannie miareczkowanego 2 normalnego kwasu solnego w 1xPBS przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zoptymalizować sygnał 5mC.Po denaturacji dodaj 100 mikrolitrów 0,1 Tris-HCl pH 8,3 na skrawki siatkówki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby je zneutralizować. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu blokującego. I inkubować sekcje w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez godzinę.Dodać odpowiednie przeciwciała, rozcieńczone w stosunku 1 do 500 w roztworze blokującym, do skrawków i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj skrawki trzy razy przez 10 do 15 minut każdy 0,1% PBST. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1 do 1000 w roztworze blokującym zawierającym roztwór DAPI w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie umyj szkiełka trzykrotnie jednym mililitrem 0,1% PBST przez 10 minut każde. Po ostatnim umyciu dodaj wodne podłoże montażowe. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym.A następnie kontynuuj mikroskopię konfokalną. Po barwieniu immunologicznym siatkówki w E16 sygnał 5mC był silny w chromocentrach jąder komórkowych i obecny na znacznie niższym poziomie w całych jądrach komórkowych. Barwienie 5hmC stwierdzono wyłącznie w jądrach komórkowych i nie było go w chromocentrach.W siatkówce P0 zarówno sygnały 5mC, jak i 5hmC były obecne w zewnętrznej warstwie neuroblastów i wewnętrznej warstwie neuroblastów. Sygnał 5mC był silny w chromocentrach i na peryferiach jądra komórkowego, a słabszy pomiędzy chromocentrami jąder komórkowych. Barwienie 5hmC było ograniczone do jądra komórkowego.W siatkówce P15, w zewnętrznej warstwie jądrowej, wykryto sygnał 5mC w chromocentrach jąder komórkowych i na obrzeżach jądra. Natomiast sygnał 5hmC znajdował się we wszystkich jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów. W wewnętrznej warstwie komórek jądrowych i zwojowych sygnał 5mC był silny w chromocentrach jąder komórkowych i słaby w całych jądrach komórkowych.Natomiast sygnał 5hmC stwierdzono we wszystkich jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów. W fotoreceptorach dorosłych pręcików sygnał 5mC był ograniczony do chromocentrum i peryferii jądrowej, podczas gdy sygnał 5hmC był ograniczony do peryferii jądrowej. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o leczeniu wycinków histologicznych z optymalną ekspozycją HCl, która wynosi 30 minut.Jeśli ekspozycja jest mniejsza lub większa, optymalne wyniki nie mogą być powtarzalne. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa, spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kwantyfikacja zmian w pomiarze 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem neuronalnym do badania zmian epigenetycznych w chromatynie.Nie zapominaj, że praca z HCl i PFA może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak odpowiednia utylizacja.

immunohistochemical-detection-5-methylcytosine-5

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

Ten film opisuje technikę dot-blot do określania poziomu metylacji DNA w ludzkich chondrocytach in vitro poprzez plamienie próbek DNA na nylonowej membranie i późniejszą wizualizację za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Pomaga to określić fenotyp chondrocytów na różnych etapach hodowli.

5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Ten artykuł opisuje protokół szybkiego i efektywnego czasoprzestrzennego monitorowania normalnej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego.

Szybkie i skuteczne czasoprzestrzenne monitorowanie prawidłowej i nieprawidłowej metylacji cytozyny w nienaruszonych zarodkach danio pręgowanego

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Naucz się immunohistochemicznego wykrywania 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się siatkówce myszy. Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie zmian epigenetycznych w chromatinie podczas rozwoju nerwowego.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy (Wideo) | JoVE Journal

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Przeglądaj więcej filmów