Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metylacji DNA, takie jak zmiany chromatyny podczas rozwoju siatkówki w postmitotycznej siatkówce. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją solidnie stosować na dowolnych odcinkach ze wszystkich tkanek siatkówki myszy przenoszących dystrybucję 5-metylocytozyny, 5-hydroksymetylocytozyny, które są przetwarzane w podobny sposób. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania i barwienia tkanek są trudne do nauczenia, ponieważ w przypadku stosowania zamrożonych preparatów histologicznych można utracić cenną organizacyjną i oryginalną tkankę.

Resztę procedury zademonstruje Pablo Diaz, pracownik naukowy z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj igły o rozmiarze 29 o średnicy jednego pół cala, aby przekłuć oczy zdekapitowanej myszy poddanej eutanazji po grzbietowej stronie oczu. Aby uzyskać muszle oczne, należy natychmiast wyłuszczyć oczy, przecinając wokół twardówki cienkimi nożyczkami okulistycznymi, aby usunąć rogówkę i soczewkę.

Utrwal muszle oczne i całe oczy E16 w 4% paraformaldehydzie lub PFA w 1xPBS pH 8,0 przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj je dwukrotnie w jednym mililitrze 1xPBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Aby kriochronić gałki oczne i całe oczy, inkubuj je w 1xPBS pH 8,0 z 10% sacharozą w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie w 20% sacharozy w 1xPBS przez godzinę. I wreszcie w 30% sacharozy w 1xPBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zanurz muszle oczne i oczy w masie o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) w krioformach.

Następnie zamroź je w kąpieli etanolowej z suchym lodem i utrzymuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem kriosekcji usuń formy z osadzonymi muszlami ocznymi i oczami z 80 stopni Celsjusza. Umieść je w uchwycie kriostatu i pozwól im osiągnąć równowagę do 20 stopni Celsjusza przez godzinę.

Za pomocą kriostatu w temperaturze 20 stopni Celsjusza przeciąć przekroje siatkówki o grubości 12 mikrometrów równolegle do osi skroniowo-nosowej przez głowę nerwu wzrokowego. Zamontuj skrawki na szkiełkach mikroskopowych i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć barwienie immunologiczne, użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć odcinki siatkówki zamontowane na szkiełkach.

Umyj skrawki raz 200 mikrolitrami 1xPBS przez 10 minut. Przepuszczać skrawki za pomocą 200 mikrolitrów PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie denaturuj je 200 mikrolitrami świeżo przygotowanego, starannie miareczkowanego 2 normalnego kwasu solnego w 1xPBS przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zoptymalizować sygnał 5mC.

Po denaturacji dodaj 100 mikrolitrów 0,1 Tris-HCl pH 8,3 na skrawki siatkówki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby je zneutralizować. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu blokującego. I inkubować sekcje w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Dodać odpowiednie przeciwciała, rozcieńczone w stosunku 1 do 500 w roztworze blokującym, do skrawków i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj skrawki trzy razy przez 10 do 15 minut każdy 0,1% PBST. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1 do 1000 w roztworze blokującym zawierającym roztwór DAPI w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie umyj szkiełka trzykrotnie jednym mililitrem 0,1% PBST przez 10 minut każde. Po ostatnim umyciu dodaj wodne podłoże montażowe. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym.

A następnie kontynuuj mikroskopię konfokalną. Po barwieniu immunologicznym siatkówki w E16 sygnał 5mC był silny w chromocentrach jąder komórkowych i obecny na znacznie niższym poziomie w całych jądrach komórkowych. Barwienie 5hmC stwierdzono wyłącznie w jądrach komórkowych i nie było go w chromocentrach.

W siatkówce P0 zarówno sygnały 5mC, jak i 5hmC były obecne w zewnętrznej warstwie neuroblastów i wewnętrznej warstwie neuroblastów. Sygnał 5mC był silny w chromocentrach i na peryferiach jądra komórkowego, a słabszy pomiędzy chromocentrami jąder komórkowych. Barwienie 5hmC było ograniczone do jądra komórkowego.

W siatkówce P15, w zewnętrznej warstwie jądrowej, wykryto sygnał 5mC w chromocentrach jąder komórkowych i na obrzeżach jądra. Natomiast sygnał 5hmC znajdował się we wszystkich jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów. W wewnętrznej warstwie komórek jądrowych i zwojowych sygnał 5mC był silny w chromocentrach jąder komórkowych i słaby w całych jądrach komórkowych.

Natomiast sygnał 5hmC stwierdzono we wszystkich jądrach komórkowych z wyjątkiem chromocentrów. W fotoreceptorach dorosłych pręcików sygnał 5mC był ograniczony do chromocentrum i peryferii jądrowej, podczas gdy sygnał 5hmC był ograniczony do peryferii jądrowej. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o leczeniu wycinków histologicznych z optymalną ekspozycją HCl, która wynosi 30 minut.

Jeśli ekspozycja jest mniejsza lub większa, optymalne wyniki nie mogą być powtarzalne. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa, spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak kwantyfikacja zmian w pomiarze 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rozwojem neuronalnym do badania zmian epigenetycznych w chromatynie.

Nie zapominaj, że praca z HCl i PFA może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak odpowiednia utylizacja.