Name: Reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj reometrię siłowo-zaciskową do badania właściwości mechanicznych hydrożeli białkowych przy użyciu systemu PID. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę siły i analizę małych próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Research Growth Initiative (Nagroda nr 101X340), National Science Foundation, Major Research Instrumentation Program (Grant No. PHY-1626450), Greater Milwaukee Foundation (Nagroda Shawa) i University of Wisconsin System (grant na badania stosowane).

1. Przygotowanie roztworu odczynników
<ol>
	<li>Przygotować wyjściowy roztwór białkowy, rozpuszczając/rozcieńczając białko będące przedmiotem zainteresowania do pożądanego stężenia, używając buforu Tris [20 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu i 150 mM NaCl, pH 7,4]. 
	UWAGA: Najmniejsze stężenie białka, dla którego sieciowanie prowadzi do hydrożeli, zależy od użytego białka i zwykle wynosi > 1 mM.</li>
	<li>Przygotować zapasy roztworów roztworów nadsiarczanu amonu (APS) (1 M) i chlorku tris(bipirydyny)rutenu(II) ([Ru(bpy)3]2+) (6,67 mM) przez rozpuszczenie proszków APS i [Ru(bpy)3]2+ w buforze Tris.</li>
</ol>
2. Synteza hydrożelu na bazie białek
<ol>
	<li>Umieścić igłę 23 G na strzykawce o pojemności 1 ml za pomocą wciśniętego tłoka.</li>
	<li>Wytnij rurkę z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy 10 cm (o średnicy wewnętrznej 0.022 cala i średnicy zewnętrznej 0.044 cala) za pomocą żyletki. Przymocować igłę i strzykawkę do jednego końca rurki PTFE.</li>
	<li>Włożyć drugi koniec rurki do roztworu silanu i napełnić rurkę, cofając tłok strzykawki. Pozostaw tubkę na ~30 min.</li>
	<li>Usuń roztwór silanu i osusz rurkę sprężonym powietrzem. 
	UWAGA: Upewnij się, że cały roztwór silanu jest wysuszony i że w probówce nie pozostały żadne pozostałości.</li>
	<li>Zmieszać roztwór białka z APS i [Ru(bpy)3]2+ w probówce o pojemności 1,5 ml przy stałym stosunku objętości [np. 15:1:1 lub 15:0,5:0,5 (v:v:v)].</li>
	<li>Wirować roztwór fotoaktywny, aż całkowicie się wymiesza.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę z maksymalną prędkością (np. 14 000 x g), aby usunąć wszelkie pęcherzyki z roztworu.</li>
	<li>Włożyć otwarty koniec rurki z PTFE poddanej działaniu środka do mieszaniny fotoaktywnej i wciągnąć roztwór do probówki, cofając tłok strzykawki.</li>
	<li>Umieść załadowaną rurkę w odległości ~10 cm od lampy rtęciowej o mocy 100 W, aby zapobiec jej nagrzewaniu się i trzymaj ją tam do 30 minut w temperaturze pokojowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B). 
	UWAGA: W niektórych przypadkach czas ekspozycji na światło może wynosić nawet 30 s. W przypadku żeli fluorescencyjnych stosuje się tu krótsze czasy żelowania, aby ograniczyć fotowybielanie.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z igły i odetnij krawędzie rurki w pobliżu końców hydrożelu żyletką.</li>
	<li>Użyj igły 24 G, aby wytłaczać hydrożel do roztworu Tris (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: igły są używane, aby uniknąć jakichkolwiek nacięć lub uszkodzeń próbki hydrożelu.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo żele pod kątem wszelkich wad, które mogą powstać podczas wytłaczania lub z powodu pęcherzyków powietrza, a żele z wadami należy wyrzucić.</li>
</ol>
3. Nasadka hydrożelowa na bazie białka i konfiguracja reometru siłowo-zaciskowego
<ol>
	<li>Uruchom program sterujący przyrządem. Włącz silnik cewki drgającej. Ustaw pozycję cewki na wartość zbliżającą się do końca zakresu (np. 7.5 mm). 
	UWAGA: Zaleca się, aby pozycja cewki drgającej zbliżała się do końca maksymalnego zakresu ruchu, aby zmaksymalizować możliwe wydłużenie hydrożelu.</li>
	<li>Przesuń haki w kierunku z i ustaw je na zgięciu w kierunku x (który jest współrzędną ciągnięcia; patrz Rysunek 2B). Zapisz wartości mikrometrycznych dla kierunku x.</li>
	<li>Przeciąć 2 sterylne szwy na pasma o równej długości (2 - 3 cm; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3A i B).</li>
	<li>Zawiąż luźny podwójny węzeł od góry do każdego z pasm i umieść 2 pętle na haczyku podłączonym do czujnika siły (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C i 3D).</li>
	<li>Napełnij komorę doświadczalną buforem Tris i przenieś próbkę hydrożelu do wypełnionej komory za pomocą pęsety medycznej.</li>
	<li>Umieść cewkę drgającą i haki czujnika siły blisko powierzchni roztworu i wyrównaj haki we wszystkich kierunkach za pomocą manipulatorów pozycjonujących x/y/z.</li>
	<li>Za pomocą pęsety medycznej zawieś obie strony próbki hydrożelu białkowego na haczykach połączonych z cewką drgającą i czujnikiem siły (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
	<li>Zaciśnij 1 pętlę szwów wokół próbki hydrożelu na haku cewki drgającej, przytrzymując oba końce pętli szwów pęsetą medyczną i ciągnąc je jednocześnie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Powtórz krok 3.8 dla pętli podłączonej do czujnika siły (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
	UWAGA: Unikaj ekstremalnego zaciskania szwów, aby zapobiec uszkodzeniom strukturalnym i poprzecznemu przecięciu próbki hydrożelu.</li>
	<li>Zaciśnij pętle szwów na zgięciach każdego haczyka, aby zapobiec poślizgowi; użyj tych zagięć jako punktów odniesienia, aby znaleźć zerową separację między haczykami w kroku 3.2. Odetnij nadmiar szwów za pomocą nożyczek medycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
	<li>Przesuń dołączony hydrożel za pomocą manipulatorów z wzdłuż osi z w kierunku komory doświadczalnej, aby zanurzyć hydrożel w roztworze eksperymentalnym.</li>
	<li>Wyrównaj próbkę hydrożelu w y-z za pomocą manipulatorów tak, aby żel nie był pod żadnym naprężeniem.</li>
	<li>Wyzeruj czujnik siły i oddziel dwa haczyki za pomocą stopni x-mikrometrycznych, aż żel zacznie odczuwać siłę. Gdy tak się stanie, lekko przekręć mikrometryczną w kierunku x.</li>
	<li>Zapisz położenie obu manipulatorów dla silnika cewki drgającej i czujnika i wykorzystaj różnicę między tymi wartościami a wartościami zmierzonymi w kroku 3.2, aby obliczyć dokładną odległość między hakami mocującymi na początku eksperymentu.</li>
	<li>Ustaw zakres krzywej luzu na ~1,5 - 2 mm i zmierz luz żelowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Dla każdego pomiaru luzu drgawkowego staraj się, aby początek reżimu luzu był bliski początkowej pozycji cewki drgającej, co pozwala na uzyskanie optymalnej liczby punktów danych, aby dopasować się do 2 reżimów (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Długość żelu można określić z rozdzielczością mikronów, wykorzystując separację między hakami i przecięcie między 2 reżimami na krzywej zapasu czasu (patrz również krok 5.1). Ponieważ czujnik siły może dryfować w czasie z powodu zmian warunków doświadczalnych, część krzywej luzu, w której żel nie jest pod wpływem siły, informuje o tym możliwym dryfie. Program sterujący przyrządem automatycznie kompensuje tę różnicę podczas wysyłania polecenia wartości zadanej do pętli PID (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A wstawka).</li>
</ol>
4. Charakterystyka hydrożelu opartego na białkach przy użyciu pomiarów kontrolowanej rampy siły i stałej siły
<ol>
	<li>Eksperymenty z rampą siłową
	<ol>
		<li>Aby wykonać cykl narastania siły poprzez zwiększenie siły przy żądanej szybkości obciążenia (np. 0,01 mN/s), wprowadź siły początkowe i końcowe oraz czas trwania protokołu jako odwrócone "V". Następnie przytrzymaj żel na poziomie 0 mN (lub małej siły) przez > 200 s, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych i odzyskanie elastyczności żelu.</li>
		<li>Zapisz ślad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymenty ze stałą siłą
	<ol>
		<li>Wykonaj protokół stałej siły, przykładając małą siłę (np. 0,1 mN) przez 30 s, a następnie zwiększ siłę do stałej siły (np. 1 mN) przez określony czas (np. 120 s), a następnie schładzając siłę z powrotem do tej samej niskiej wartości (np. 0,1 mN) przez > 300 s, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych i odzyskanie elastyczności żelu.</li>
		<li>Po pierwszym impulsie dostosuj ustawienia PID, aby zmaksymalizować czas odpowiedzi pętli sprzężenia zwrotnego (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2D). 
		UWAGA: W przypadku sztywnych żeli i niewielkich zmian siły czas reakcji pętli jest ograniczony przez elektronikę czujnika siły i czas reakcji cewki i może wynosić nawet 5ms 7. W przypadku bardziej miękkich żeli i dużych zmian siły, czas reakcji jest podyktowany elastycznością hydrożeli (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
		<li>Zapisz ślad.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wykorzystując zmierzoną odległość między hakami i obliczoną pozycję cewki, gdy żel zacznie odczuwać siłę (Δx w <silnej klasie = "xfig" >Figura 4A wkładka), oblicz długość żelu L, korzystając z równania: 
	L = L0 + ∆x 
	W tym przypadku L0 jest odległością między hakami, mierzoną od położenia mikrometrycznych przed eksperymentem (krok 3.14). 
	UWAGA: W przypadku żeli o niskich stężeniach białka, które nie powodują pełnego usieciowania, zmierzona długość zmieni się ze śladu na ślad. Ponadto, przez długi czas, białka wewnątrz hydrożeli mogą doświadczać efektów starzenia25, co powoduje ogólne wydłużenie żelu.</li>
	<li>Znormalizuj zmierzone wydłużenie do długości żelu, aby uzyskać odkształcenie.</li>
	<li>Znormalizuj zmierzoną siłę do powierzchni poprzecznej, używając wewnętrznej średnicy rurki używanej do polimeryzacji.</li>
</ol>

<ol><li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+chemical+denaturants+affect+the+mechanical+folding+and+unfolding+of+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?</a> Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).</li>
<li>Carrion-Vazquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+chemical+unfolding+of+a+single+protein%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).</li>
<li>Wiita, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+chemistry+of+thioredoxin+catalysis+with+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force.</a> Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).</li>
<li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li>
<li>Plumere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+hydrogel+protects+hydrogenase+from+high-potential+deactivation+and+oxygen+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage.</a> Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).</li>
<li>Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201402205">Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties.</a> Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).</li>
<li>Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.macromol.7b02160">Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry.</a> Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).</li>
<li>Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolyte+effects+on+protein+stability+and+solubility%3A+A+balancing+act+between+backbone+and+side-chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains.</a> Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).</li>
<li>Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+dependency+of+biochemical+reactions+measured+by+single-molecule+force-clamp+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).</li>
<li>Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worm-Like+Ising+Model+for+Protein+Mechanical+Unfolding+under+the+Effect+of+Osmolytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes.</a> Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).</li>
<li>Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectrocatalytic+hydrogels+from+electron-conducting+metallopolypeptides+coassembled+with+bifunctional+enzymatic+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).</li>
<li>Sathaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+peptide-+and+protein-based+physical+hydrogels%3A+are+everyday+measurements+just+scratching+the+surface%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Biocompatible+and+Biodegradable+Protein+Hydrogel+with+Green+and+Red+Autofluorescence%3A+Preparation%2C+Characterization+and+In+Vivo+Biodegradation+Tracking+and+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling.</a> Scientific Reports. 6, 19370(2016).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).</li>
<li>Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Strategy+for+Utilizing+Voice+Coil+Servoactuators+in+Tensile+Tests+of+Low+Volume+Protein+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).</li>
<li>Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+bioactive+protein+hydrogels+by+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).</li>
<li>Thompson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+hydrogels+crosslinked+solely+by+receptor-ligand+interactions%3A+tunability%2C+rationalization+of+physical+properties%2C+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture.</a> Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).</li>
<li>Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+behaviour+of+hydrogel-based+composites+for+tissue+engineering+under+mechanical+load%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load.</a> Biomedical Materials. 12 (2), (2017).</li>
<li>Desai, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin-Based+Rubber-Like+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).</li>
<li>Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick+filament+mechano-sensing+is+a+calcium-independent+regulatory+mechanism+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>McDonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dependence+of+loaded+shortening+in+rat+skinned+cardiac+myocytes+and+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology-London%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).</li>
<li>Wu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+synthetic+protein+hydrogels+with+predictable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00397-014-0824-9">Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear.</a> Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).</li>
<li>Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28272024">Multidomain proteins under force.</a> Nanotechnology. 28 (17), 174003(2017).</li>
<li>Valle-Orero, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.201703630">Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).</li>
<li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+protein+unfolding+leads+to+highly+elastic+and+tough+protein+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li>
<li>Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinks+for+3D+bioprinting%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterial+Science%22%5BJournal%5D)">Bioinks for 3D bioprinting: an overview.</a> Biomaterial Science. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisujemy technikę reometrii siłowo-zaciskowej w celu zbadania odpowiedzi biomechanicznej hydrożeli na bazie białek o małej objętości. Dodatkowo dostarczany jest protokół do syntezy jednolitej cylindrycznej próbki hydrożelu białkowego o małej objętości. Przedstawiono również protokół, który opisuje, w jaki sposób wiązać różne rodzaje hydrożeli na bazie białek o różnej elastyczności, nie powodując żadnych odkształceń mechanicznych ani uszkodzeń próbek hydrożelu na bazie białka lub ślizgania się żelu na hacz...

Oprócz unikalnych właściwości fizycznych, hydrożele na bazie białek mają nadzieję zrewolucjonizować spektroskopię sił, umożliwiając pomiar kilku miliardów cząsteczek za jednym razem, umożliwiając w ten sposób badanie białek w zatłoczonych środowiskach, podobnych do tych spotykanych w skórze i innych tkankach. Domeny białkowe pozostają pofałdowane wewnątrz hydrożeli, co pozwala na badanie ich biomechanicznej odpowiedzi na siłę, partnerów wiążących i warunki chemiczne. Dodatkowo, odpowiedź biomechaniczna domen białkowych wewnątrz hydrożeli przypomina odpowiedź obserwowaną w technikach spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek. Na przykład chemiczne denaturanty i utleniacze zmniejszają stabilność stanu złożonego, zarówno na poziomie domeny pojedynczego białka1,2,3, jak i na poziomie makroskopowym4,5,6,7. Podobnie, osmolity zwiększają stabilność pojedynczych białek8,9, co prowadzi do zmniejszenia odpowiedzi lepkosprężystej hydrożeli, dla tych samych warunków siły7,10.
Zaimplementowano kilka podejść do syntezy hydrożeli na bazie białek, za pomocą interakcji fizycznych11,12 lub kowalencyjnego sieciowania4,13. Reakcje kowalencyjne pozwalają na stałe miejsca sieciowania, a te hydrożele mogą odzyskać stan początkowy po usunięciu zaburzeń mechanicznych lub chemicznych. Skuteczne podejście do kowalencyjnego sieciowania opiera się na tworzeniu kowalencyjnych wiązań węgiel-węgiel między odsłoniętymi aminokwasami tyrozynowymi przy użyciu nadsiarczanu amonu (APS) jako utleniacza i soli rutenu (II) jako inicjatora (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1)14. Po wystawieniu na działanie białego światła roztwór skoncentrowanych białek można przekształcić w hydrożel. Kontrolując, kiedy rozpoczyna się reakcja, mieszanina białkowo-APS może być wstrzykiwana do dowolnej formy odlewniczej, takiej jak probówki z politetrafluoroetylenu (PFTE) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B i 1C), co pozwala na użycie bardzo małej objętości roztworu15. Co więcej, zastosowanie światła białego do wywołania reakcji sieciowania powoduje ograniczone wybielanie białek fluorescencyjnych i pozwala na formułowanie hydrożeli kompozytowych z markerami fluorescencyjnymi (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). Inne metody tworzenia hydrożelu oparte na białkach wykorzystują sieciowanie oparte na interakcji kowalencyjnej SpyTag-SpyCatcher16, sieciowanie aminowe za pomocą aldehydu glutarowego13, lub interakcje biotyna-streptawidyna17.
Dynamiczna analiza mechaniczna (DMA) jest obecnie techniką szeroko stosowaną do badania hydrożeli na bazie polimerów13,18. Chociaż DMA może stosować protokoły stałej siły do biomateriałów, wymaga modułów Younga powyżej 10 kPa i dużych objętości próbek powyżej 200 μL19. Ze względu na te ograniczenia, hydrożele białkowe są na ogół zbyt miękkie, aby można je było badać za pomocą tej techniki. Ponieważ zmodyfikowane poliproteiny są trudniejsze do syntezy niż polimery, ponieważ wymagają żywego systemu do produkcji, tak duże objętości są w najlepszym razie nieefektywne4,15. Co więcej, większość tkanek biologicznych jest bardziej miękka niż 10 kPa. Opracowano kilka podejść do próbek biologicznych, zwłaszcza w badaniu elastyczności mięśni20,21. Techniki te mogą również działać w trybie sprzężenia zwrotnego w celu przyłożenia stałej siły, ale są zoptymalizowane dla próbek o małych średnicach (w zakresie mikronów) narażonych na działanie siły przez bardzo krótki czas (zwykle krótszy niż 1 s).
Hydrożele na bazie białek zostały pomyślnie przebadane za pomocą zmodyfikowanych technik reometrycznych. Na przykład odlanie hydrożelu w kształcie pierścienia pozwala na użycie reometrii ekstensywnej do pomiaru zmiany doświadczanej siły w funkcji extension4,22. Inne podejścia do badania właściwości reologicznych hydrożeli na bazie białek wykorzystują kontrolowaną reometrię naprężeń ścinających. Techniki te pozwalają również osiągnąć małą objętość próbki i tolerują miękkie materiały. Jednak metody te nie są w stanie naśladować sił ciągnących, które powodują rozwijanie się białka in vivo, a moduł Younga jest obliczany na podstawie złożonych teorii, które wymagają różnych założeń i poprawek23.
Niedawno opisaliśmy nowe podejście, które wykorzystuje małą ilość białek, polimeryzowanych wewnątrz probówek o średnicy < 1 mm. Naszą pierwszą implementacją tej techniki było działanie w trybie zacisku długotrwałego, w którym żel był rozciągany zgodnie z pożądanym protokołem15. W tej metodzie białka doświadczają ciągłych zmian zarówno w rozciągliwości, jak i sile, podczas gdy domeny się rozwijają, co sprawia, że interpretacja danych jest uciążliwa. Niedawno opisaliśmy nową technikę reometrii siłowo-zaciskowej, w której pętla sprzężenia zwrotnego może wystawić hydrożele białkowe o małej objętości na działanie predefiniowanego protokołu siły7 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Analogowy system PID porównuje siłę zmierzoną przez czujnik siły z wartością zadaną wysłaną z komputera i dostosowuje przedłużenie żelu poprzez przesuwanie cewki drgającej, aby zminimalizować różnicę między dwoma wejściami. To "zaciśnięcie" siły pozwala teraz na nowe rodzaje eksperymentów w celu zmierzenia biomechaniki hydrożeli białkowych.
W trybie narastania siły, hydrożel białkowy na uwięzi doświadcza stałego wzrostu i spadku siły w czasie. PID kompensuje wszelkie odkształcenia lepkosprężyste poprzez zmianę wydłużenia w sposób nieliniowy, w zależności od rodzaju preparatu białkowego i hydrożelowego. Główną zaletą rampy siły jest to, że umożliwia ona kwantyfikację standardowych parametrów, takich jak moduł Younga i rozpraszanie energii, w wyniku rozwijania i ponownego fałdowania domen białkowych.
W trybie stałej siły, przyłożona siła zmienia się w sposób krokowy. W tym trybie żel rozciąga się i kurczy elastycznie, gdy siła jest odpowiednio zwiększana lub zmniejszana, po czym następuje odkształcenie zależne od czasu. To odkształcenie lepkosprężyste, mające miejsce, gdy żel doświadcza stałej siły, jest bezpośrednio związane z rozwijaniem/ponownym fałdowaniem domeny. W uproszczony sposób to rozszerzenie może być postrzegane jako ekwiwalent kilku miliardów śladów pojedynczych cząsteczek uśrednionych razem i zmierzonych jednocześnie. Protokoły stałej siły mogą być stosowane do badania pełzania i relaksacji hydrożeli białkowych w funkcji siły i czasu. W funkcji siły, dla hydrożeli białkowych na bazie BSA, wykazaliśmy niedawno, że istnieje liniowa zależność między elastycznym i lepkosprężystym przedłużeniem i odrzutem przy zastosowanym odkształceniu7.
Tutaj szczegółowo opisujemy działanie reometru z zaciskiem siłowym przy użyciu żeli kompozytowych wykonanych z mieszaniny białka L (8 domen24, przedstawionego jako L8) i konstruktu białkowego L-eGFP (L-eGFP), który sprawia, że cały hydrożel jest fluorescencyjny i łatwy do zademonstrowania.

<table><tbody><tr><td>Przetwornik siły SI-KG4A</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SI-KG4A</td> Rozwiązania w zakresie liniowego silnika cewki <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> drgającej LFA2010 <td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td><td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek tris(bipirydyny)rutenu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544981-1G</td><td></td></tr><tr><td>EKSPRESOWE MATERIAŁY MEDYCZNE&nbsp; 6-0 NYLON SZEW 12/PK</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0395626</td><td></td></tr><tr><td>Tylko strzykawka 1 ml, końcówka Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr> silanu, rurka PTFE z mikrootworem <tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>, 0,022 "ID x 0,042" OD, 100 stóp / rolka</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna, 23 Gauge</td><td>Profesjonaliści w zakresie zaopatrzenia medycznego</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki dozujące Jensen Global JG24-1.5X Red IT - 24 gauge</td><td>KIMCO</td><td>JG24-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>USH-103D USHIO 100W Lampa rtęciowa o krótkim łuku</td><td>ALB</td><td>USH-103D USHIO</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td>medyczna</tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>medyczne</tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kod komputerowy i projekt CAD części niestandardowych mogą być udostępnione na życzenie odpowiedniemu autorowi.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

Tutaj opisujemy metodę reometrii siłowo-zaciskowej, aby scharakteryzować właściwości biomechaniczne hydrożeli na bazie białek. Metoda ta wykorzystuje analogowy układ proporcjonalno-całkująco-pochodnej (PID) do zastosowania protokołów kontrolowanej siły na cylindrycznych próbkach hydrożelu na bazie białek, które są uwiązane między liniowym silnikiem cewki drgającej a przetwornikiem siły. Podczas pracy system PID dostosowuje wydłużenie próbki hydrożelu zgodnie z predefiniowanym protokołem siły, minimalizując różnicę między siłami zmierzonymi i zadanymi siłami. To unikalne podejście do hydrożeli na bazie białek umożliwia wiązanie próbek hydrożelowych o bardzo małej objętości (< 5 μl) o różnych stężeniach białka. W przypadku protokołów rampy siłowej, w których przyłożone naprężenie wzrasta i maleje liniowo w czasie, system umożliwia badanie zachowań elastyczności i histerezy związanych z (nie)fałdowaniem białek oraz pomiar standardowych parametrów sprężystości i lepkosprężystości. Przy stałej sile, gdzie impuls siły ma kształt schodkowy, odpowiedź sprężysta, ze względu na zmianę siły, jest oddzielona od odpowiedzi lepkosprężystej, która pochodzi z rozwijania i ponownego fałdowania domeny białkowej. Ze względu na małą objętość próbki i wszechstronność w stosowaniu różnych zaburzeń mechanicznych, reometria siłowo-zaciskowa jest zoptymalizowana do badania mechanicznej odpowiedzi białek pod wpływem siły przy użyciu podejścia masowego.

Rysunek 1A przedstawia schemat reakcji fotoaktywnej wykorzystanej do syntezy hydrożelu L-EGP/L8 . Rysunek 1B pokazuje mieszaninę hydrożelu w rurce PTFE przed i po fotoaktywacji. Rysunek 1C przedstawia wyciśnięty hydrożel L-eGFP-L8 w roztworze Tris. Próbka hydrożelu nie posiada wad strukturalnych, takich jak nacięcia. Hydrożele z wyraźnie widocznymi uszkodzeniami należy odrzucić....

Nowa technika reometrii siłowo-zaciskowej jest używana do badania właściwości mechanicznych próbek hydrożelu na bazie białek o małej objętości, połączonych między silnikiem cewki drgającej a czujnikiem siły. Analogowy układ proporcjonalno-całkująco-pochodny (PID) pozwala na "zaciśnięcie" doświadczanej siły do pożądanego protokołu.

Reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykorzystuje PID, który jest proporcjonalnym systemem pochodnych całki do stosowania protokołów kontrolowanej siły do próbek hydrożelu białkowego i wykorzystuje małą objętość próbki. Protokoły zacisku sił pozwalają na prostą interpretację danych, podczas gdy małe objętości mają kluczowe znaczenie podczas pracy z trudnymi do wyprodukowania białkami, które są dostępne tylko w niewielkich ilościach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania i scharakteryzowania nowych materiałów biometrycznych o trwałej elastyczności, wykorzystujących charakterystyczne dla białek przejście polegające na składaniu i ponownym składaniu.Metoda ta może odpowiedzieć na pytania z zakresu mechaniki tkanek i biomateriałów, umożliwiając pomiary miliardów cząsteczek białek za jednym pociągnięciem i symulując zatłoczone środowiska specyficzne dla tkanek biologicznych. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania roztworów odczynników zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zsyntetyzować hydrożel na bazie białka, najpierw przymocuj igłę o rozmiarze 23 na strzykawce o pojemności jednego mililitra za pomocą wciśniętego tłoka.Następnie przetnij 10-centymetrową rurkę z politetrafluoroetylenu lub PTFE za pomocą żyletki. Przymocować igłę i strzykawkę do jednego końca rurki PTFE. Włożyć drugi koniec rurki do roztworu silanu i napełnić rurkę, cofając tłok strzykawki.Pozostaw tubkę na około 30 minut. Następnie usuń roztwór silanu i osusz rurkę sprężonym powietrzem. Teraz wymieszaj roztwór białka z APS i chlorkiem tris(bipirydyny)rutenu(II) w 1,5-mililitrowej probówce, zachowując stały stosunek objętości.Wirować roztwór fotoaktywny, aż całkowicie się wymiesza. Następnie odwiruj mieszaninę z maksymalną prędkością, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z roztworu. Podczas ładowania fotoaktywnej mieszanki hydrożelowej do rurki teflonowej mogą tworzyć się pęcherzyki, co prowadzi do uszkodzenia próbki.Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza, należy trzymać końcówkę rurki teflonowej w mieszance roztworu podczas procesu ładowania i powoli cofać tłok strzykawki. Włożyć otwarty koniec rurki z PTFE poddanej działaniu środka do mieszaniny fotoaktywnej i wciągnąć roztwór do probówki, cofając tłok strzykawki. Teraz umieść załadowaną rurkę w odległości około 10 centymetrów od 100-watowej lampy rtęciowej, aby zapobiec jej nagrzewaniu się i trzymaj ją tam do 30 minut w temperaturze pokojowej.Wyjmij rurkę z igły i odetnij krawędzie rurki w pobliżu końców hydrożelu żyletką. Następnie użyj igły o rozmiarze 24, aby wytłoczyć hydrożel do roztworu Tris. Sprawdź wzrokowo żele pod kątem wszelkich wad, które mogą powstać podczas wytłaczania lub z powodu pęcherzyków powietrza, i wyrzuć wszelkie wadliwe żele.Uruchom program sterowania przyrządem i włącz silnik cewki drgającej. Następnie ustaw pozycję cewki na wartość zbliżającą się do końca zakresu. Przemieszcz haki w kierunku Z i wyrównaj je na zgięciu w kierunku X.Następnie zapisz wartości mikrometrycznych dla kierunku X. Teraz zawiąż luźny węzeł z podwójnym rękawem na końcu pasma szwu, tak aby średnica pętli wynosiła około czterech milimetrów. Następnie odetnij pętelkę od pasma.Powtórz tę czynność, aby utworzyć drugą pętlę. Następnie umieść dwie pętle na haku podłączonym do czujnika siły. Napełnij komorę doświadczalną buforem Tris i przenieś próbkę hydrożelu do wypełnionej komory za pomocą pęsety medycznej.Umieść haki cewki drgającej i czujnika siły blisko powierzchni roztworu i wyrównaj haki we wszystkich kierunkach z manipulatorami pozycjonującymi XYZ. Za pomocą pęsety medycznej zawieś obie strony próbki hydrożelu białkowego na haczykach połączonych z cewką drgającą i czujnikiem siły. Typowym błędem jest zbyt mocne zaciśnięcie pętli szwów wokół próbek hydrożelu podczas procesu mocowania.Może to prowadzić do powstania karbu i przecięcia próbki hydrożelu. Ostrożnie zaciśnij jedną pętlę szwów wokół próbki hydrożelu na haku cewki drgającej, przytrzymując oba końce pętli szwów pęsetą medyczną i ciągnąc je jednocześnie. Powtórz ten krok dla pętli podłączonej do czujnika siły.Zaciśnij pętle do szwów na zgięciach każdego haczyka, aby zapobiec poślizgowi. Użyj tych zagięć jako punktów odniesienia, aby znaleźć zerową separację między hakami. Odetnij nadmiar długości szwów za pomocą nożyczek medycznych.Przesuń dołączony hydrożel za pomocą manipulatorów Z wzdłuż osi Z w kierunku komory doświadczalnej, aby zanurzyć hydrożel w roztworze doświadczalnym. Wyrównaj próbkę hydrożelu w YZ za pomocą manipulatorów tak, aby żel nie był pod żadnym naprężeniem. Wyzeruj czujnik siły i oddziel dwa haki za pomocą stopni X mikrometru, aż żel zacznie odczuwać siłę.Gdy tak się stanie, lekko przekręć mikrometryczną w kierunku X. Zapisz położenie obu manipulatorów silnika cewki drgającej i czujnika. Następnie użyj różnicy między tymi wartościami a poprzednio zmierzonymi, aby obliczyć dokładną odległość między hakami do uwięzi na początku eksperymentu.Aby wykonać cykl narastania siły poprzez zwiększanie siły przy żądanej szybkości obciążenia, wprowadź początkowe i końcowe wartości siły, a także czas trwania protokołu, który pojawia się jako odwrócona litera V, po której następuje stała niska siła przez około 200 sekund, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych przed następnym cyklem. Wykonaj protokół stałej siły, przykładając niewielką siłę przez 30 sekund. Następnie zwiększ siłę do stałej siły przez określony czas, a następnie stłumić siłę z powrotem do tej samej niskiej wartości przez ponad 300 sekund, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych i odzyskanie elastyczności żelu.Na koniec przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Każdy pomiar rozpoczyna się od krzywej zapasu czasu. Poprzez dopasowanie dwóch linii określana jest zerowa siła działająca na czujnik i rzeczywista długość żelu.Rzeczywista długość żelu jest obliczana na podstawie przecięcia pasowań i położenia mikrometrycznych. System reometrii siłowo-zaciskowej może stosować dwa różne typy protokołów. W trybie narastania siły próbka hydrożelu doświadcza protokołu zmiany siły w czasie, który przypomina tryb odwróconej V.In stałej siły, przyłożone naprężenie zmienia się w sposób krokowy.Podczas pomiarów system PID dostosowuje wydłużenie hydrożelu, zmieniając położenie cewki tak, aby podążała za wstępnie zdefiniowaną wartością zadaną z protokołu siły. Odkształcenie jest następnie obliczane, dzieląc zmierzone wydłużenie na rzeczywistą długość żelu. Naprężenie określa się, dzieląc przyłożoną siłę na pole przekroju poprzecznego próbki hydrożelu.Ślady Force Ramp są najlepiej reprezentowane jako naprężenie w funkcji odkształcenia. Moduł Younga można obliczyć na podstawie miary nachylenia w fazie obciążenia. Histereza powoduje rozproszenie energii pochodzące z rozkładania i ponownego fałdowania białka.Ślady siły stałej najlepiej przedstawić jako funkcję czasu. Zmiana odkształcenia może być wykorzystana do pomiaru szybkości rozkładania i ponownego składania poprzez dopasowanie podwójnej wykładniczej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wysuszeniu silanu z probówki przed dodaniem białka, odwirowaniu mieszanki białkowej w celu usunięcia pęcherzyków, sprawdzeniu pęcherzyków po wstrzyknięciu mieszanki białkowej do probówki i wyrzuceniu wszelkich mechanicznie uszkodzonych hydrożeli po wytłoczeniu z probówki.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą początkowo miały trudności z przymocowaniem żeli do haczyków za pomocą szwów chirurgicznych bez powodowania uszkodzenia próbki hydrożelu. Wyciskanie żelu z tubki może również uszkodzić hydrożel. Metoda ta umożliwia zastosowanie protokołów stałej siły na próbkach hydrożelowych o małej objętości.Eksperymenty te pozwalają na rozdzielenie zachowań elastycznych i lepkosprężystych oraz badanie mechaniki rozwijania i fałdowania białek w podejściu masowym. Po opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom z dziedziny nauk o materiałach badać nowe miękkie biomateriały, takie jak hydrożele na bazie poliprotein, które mają doskonały potencjał do służenia jako rusztowania inżynierii tkankowej, systemy dostarczania leków i biologiczny atrament do druku 3D. Metoda ta nie tylko zapewnia wgląd w mechanikę hydrożeli na bazie białek, ale może być również stosowana w innych systemach, takich jak pomiar odpowiedzi izometrycznej włókien mięśniowych lub elastyczności tkanek, takich jak skóra.

force-clamp-rheometry-for-characterizing-protein-based-hydrogels

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Demonstrujemy produkcję i użycie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia wielokrotne pomiary mikroreologii śledzenia cząstek w celu zbadania reologicznych efektów powtarzających się przemian fazowych na miękkiej materii.

Połączenie mikrofluidyki i mikroreologii w celu określenia właściwości reologicznych miękkiej materii podczas powtarzających się przemian fazowych

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Organiczne materiały fotowoltaiczne (OPV) są z natury niejednorodne w skali nanometrów. Niejednorodność materiałów OPV w nanoskali wpływa na wydajność urządzeń fotowoltaicznych. W artykule opisano protokół pomiarów ilościowych właściwości elektrycznych i mechanicznych materiałów OPV o rozdzielczości poniżej 100 nm.

Równoczesne ilościowe pomiary przewodności i właściwości mechanicznych organicznych materiałów fotowoltaicznych za pomocą AFM

Poznaj reometrię siłowo-zaciskową do badania właściwości mechanicznych hydrożeli białkowych przy użyciu systemu PID. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę siły i analizę małych próbek.

Reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek

Przeglądaj więcej filmów