Reometria siłowo-zaciskowa do charakteryzowania hydrożeli na bazie białek

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykorzystuje PID, który jest proporcjonalnym systemem pochodnych całki do stosowania protokołów kontrolowanej siły do próbek hydrożelu białkowego i wykorzystuje małą objętość próbki. Protokoły zacisku sił pozwalają na prostą interpretację danych, podczas gdy małe objętości mają kluczowe znaczenie podczas pracy z trudnymi do wyprodukowania białkami, które są dostępne tylko w niewielkich ilościach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania i scharakteryzowania nowych materiałów biometrycznych o trwałej elastyczności, wykorzystujących charakterystyczne dla białek przejście polegające na składaniu i ponownym składaniu.

Metoda ta może odpowiedzieć na pytania z zakresu mechaniki tkanek i biomateriałów, umożliwiając pomiary miliardów cząsteczek białek za jednym pociągnięciem i symulując zatłoczone środowiska specyficzne dla tkanek biologicznych. Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania roztworów odczynników zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zsyntetyzować hydrożel na bazie białka, najpierw przymocuj igłę o rozmiarze 23 na strzykawce o pojemności jednego mililitra za pomocą wciśniętego tłoka.

Następnie przetnij 10-centymetrową rurkę z politetrafluoroetylenu lub PTFE za pomocą żyletki. Przymocować igłę i strzykawkę do jednego końca rurki PTFE. Włożyć drugi koniec rurki do roztworu silanu i napełnić rurkę, cofając tłok strzykawki.

Pozostaw tubkę na około 30 minut. Następnie usuń roztwór silanu i osusz rurkę sprężonym powietrzem. Teraz wymieszaj roztwór białka z APS i chlorkiem tris(bipirydyny)rutenu(II) w 1,5-mililitrowej probówce, zachowując stały stosunek objętości.

Wirować roztwór fotoaktywny, aż całkowicie się wymiesza. Następnie odwiruj mieszaninę z maksymalną prędkością, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z roztworu. Podczas ładowania fotoaktywnej mieszanki hydrożelowej do rurki teflonowej mogą tworzyć się pęcherzyki, co prowadzi do uszkodzenia próbki.

Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza, należy trzymać końcówkę rurki teflonowej w mieszance roztworu podczas procesu ładowania i powoli cofać tłok strzykawki. Włożyć otwarty koniec rurki z PTFE poddanej działaniu środka do mieszaniny fotoaktywnej i wciągnąć roztwór do probówki, cofając tłok strzykawki. Teraz umieść załadowaną rurkę w odległości około 10 centymetrów od 100-watowej lampy rtęciowej, aby zapobiec jej nagrzewaniu się i trzymaj ją tam do 30 minut w temperaturze pokojowej.

Wyjmij rurkę z igły i odetnij krawędzie rurki w pobliżu końców hydrożelu żyletką. Następnie użyj igły o rozmiarze 24, aby wytłoczyć hydrożel do roztworu Tris. Sprawdź wzrokowo żele pod kątem wszelkich wad, które mogą powstać podczas wytłaczania lub z powodu pęcherzyków powietrza, i wyrzuć wszelkie wadliwe żele.

Uruchom program sterowania przyrządem i włącz silnik cewki drgającej. Następnie ustaw pozycję cewki na wartość zbliżającą się do końca zakresu. Przemieszcz haki w kierunku Z i wyrównaj je na zgięciu w kierunku X.

Następnie zapisz wartości mikrometrycznych dla kierunku X. Teraz zawiąż luźny węzeł z podwójnym rękawem na końcu pasma szwu, tak aby średnica pętli wynosiła około czterech milimetrów. Następnie odetnij pętelkę od pasma.

Powtórz tę czynność, aby utworzyć drugą pętlę. Następnie umieść dwie pętle na haku podłączonym do czujnika siły. Napełnij komorę doświadczalną buforem Tris i przenieś próbkę hydrożelu do wypełnionej komory za pomocą pęsety medycznej.

Umieść haki cewki drgającej i czujnika siły blisko powierzchni roztworu i wyrównaj haki we wszystkich kierunkach z manipulatorami pozycjonującymi XYZ. Za pomocą pęsety medycznej zawieś obie strony próbki hydrożelu białkowego na haczykach połączonych z cewką drgającą i czujnikiem siły. Typowym błędem jest zbyt mocne zaciśnięcie pętli szwów wokół próbek hydrożelu podczas procesu mocowania.

Może to prowadzić do powstania karbu i przecięcia próbki hydrożelu. Ostrożnie zaciśnij jedną pętlę szwów wokół próbki hydrożelu na haku cewki drgającej, przytrzymując oba końce pętli szwów pęsetą medyczną i ciągnąc je jednocześnie. Powtórz ten krok dla pętli podłączonej do czujnika siły.

Zaciśnij pętle do szwów na zgięciach każdego haczyka, aby zapobiec poślizgowi. Użyj tych zagięć jako punktów odniesienia, aby znaleźć zerową separację między hakami. Odetnij nadmiar długości szwów za pomocą nożyczek medycznych.

Przesuń dołączony hydrożel za pomocą manipulatorów Z wzdłuż osi Z w kierunku komory doświadczalnej, aby zanurzyć hydrożel w roztworze doświadczalnym. Wyrównaj próbkę hydrożelu w YZ za pomocą manipulatorów tak, aby żel nie był pod żadnym naprężeniem. Wyzeruj czujnik siły i oddziel dwa haki za pomocą stopni X mikrometru, aż żel zacznie odczuwać siłę.

Gdy tak się stanie, lekko przekręć mikrometryczną w kierunku X. Zapisz położenie obu manipulatorów silnika cewki drgającej i czujnika. Następnie użyj różnicy między tymi wartościami a poprzednio zmierzonymi, aby obliczyć dokładną odległość między hakami do uwięzi na początku eksperymentu.

Aby wykonać cykl narastania siły poprzez zwiększanie siły przy żądanej szybkości obciążenia, wprowadź początkowe i końcowe wartości siły, a także czas trwania protokołu, który pojawia się jako odwrócona litera V, po której następuje stała niska siła przez około 200 sekund, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych przed następnym cyklem. Wykonaj protokół stałej siły, przykładając niewielką siłę przez 30 sekund. Następnie zwiększ siłę do stałej siły przez określony czas, a następnie stłumić siłę z powrotem do tej samej niskiej wartości przez ponad 300 sekund, aby umożliwić ponowne złożenie domen białkowych i odzyskanie elastyczności żelu.

Na koniec przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Każdy pomiar rozpoczyna się od krzywej zapasu czasu. Poprzez dopasowanie dwóch linii określana jest zerowa siła działająca na czujnik i rzeczywista długość żelu.

Rzeczywista długość żelu jest obliczana na podstawie przecięcia pasowań i położenia mikrometrycznych. System reometrii siłowo-zaciskowej może stosować dwa różne typy protokołów. W trybie narastania siły próbka hydrożelu doświadcza protokołu zmiany siły w czasie, który przypomina tryb odwróconej V.In stałej siły, przyłożone naprężenie zmienia się w sposób krokowy.

Podczas pomiarów system PID dostosowuje wydłużenie hydrożelu, zmieniając położenie cewki tak, aby podążała za wstępnie zdefiniowaną wartością zadaną z protokołu siły. Odkształcenie jest następnie obliczane, dzieląc zmierzone wydłużenie na rzeczywistą długość żelu. Naprężenie określa się, dzieląc przyłożoną siłę na pole przekroju poprzecznego próbki hydrożelu.

Ślady Force Ramp są najlepiej reprezentowane jako naprężenie w funkcji odkształcenia. Moduł Younga można obliczyć na podstawie miary nachylenia w fazie obciążenia. Histereza powoduje rozproszenie energii pochodzące z rozkładania i ponownego fałdowania białka.

Ślady siły stałej najlepiej przedstawić jako funkcję czasu. Zmiana odkształcenia może być wykorzystana do pomiaru szybkości rozkładania i ponownego składania poprzez dopasowanie podwójnej wykładniczej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wysuszeniu silanu z probówki przed dodaniem białka, odwirowaniu mieszanki białkowej w celu usunięcia pęcherzyków, sprawdzeniu pęcherzyków po wstrzyknięciu mieszanki białkowej do probówki i wyrzuceniu wszelkich mechanicznie uszkodzonych hydrożeli po wytłoczeniu z probówki.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą początkowo miały trudności z przymocowaniem żeli do haczyków za pomocą szwów chirurgicznych bez powodowania uszkodzenia próbki hydrożelu. Wyciskanie żelu z tubki może również uszkodzić hydrożel. Metoda ta umożliwia zastosowanie protokołów stałej siły na próbkach hydrożelowych o małej objętości.

Eksperymenty te pozwalają na rozdzielenie zachowań elastycznych i lepkosprężystych oraz badanie mechaniki rozwijania i fałdowania białek w podejściu masowym. Po opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom z dziedziny nauk o materiałach badać nowe miękkie biomateriały, takie jak hydrożele na bazie poliprotein, które mają doskonały potencjał do służenia jako rusztowania inżynierii tkankowej, systemy dostarczania leków i biologiczny atrament do druku 3D. Metoda ta nie tylko zapewnia wgląd w mechanikę hydrożeli na bazie białek, ale może być również stosowana w innych systemach, takich jak pomiar odpowiedzi izometrycznej włókien mięśniowych lub elastyczności tkanek, takich jak skóra.