Name: Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj modyfikację wektorów bakulowirusa do ekspresji wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów. Ta metoda umożliwia tanie wytwarzanie rekombinowanych białek do badań krystalograficznych i cryo-EM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez nowe fundusze na rozpoczęcie nauki przez Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej dla Guozhou Xu.

UWAGA: Używany jest system komórek owadów/bakulowirusa ze zmodyfikowanymi wektorami ekspresji do ekspresji i krystalizacji wydzielniczych białek roślinnych.
1. Modyfikacja wektora ekspresji bakulowirusa za pomocą peptydu sygnałowego GP67 do ekspresji wydzielania białek roślinnych
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj fragment DNA zawierający miejsce cięcia 5' BglII13, sekwencję sygnału wydzielania GP67 oraz miejsce wielokrotnego klonowania z NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI i XhoI (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Ponieważ zarówno DNA trawione przez BglII, jak i BamHI skutkowało tymi samymi końcami adhezyjnymi, zlinearyzowany wektor może ligować do strawionego fragmentu DNA, podczas gdy zarówno miejsca BglII, jak i BamHI w sekwencji ligacji wyżarzonej zostaną zmutowane do sekwencji, która nie jest rozszczepialna ani przez BglII, ani przez BamHI14.</li>
	<li>Trawić 4 μg DNA za pomocą BglII i XhoI oraz 4 μg DNA wektora ekspresyjnego za pomocą BamHI i XhoI14. Zmieszać 10 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego z DNA w buforze reakcyjnym o 1x stężeniu (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu i 100 μg/ml BSA, pH 7,9 w 25 °C) i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
	<ol>
		<li>Oczyść wycięty fragment DNA i zlinearyzowany wektorowy DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej 1x bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP i 10 mM DTT, pH 7,5 w 25 °C) i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α zgodnie ze standardowym protokołem transformacji i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej ampicillin-LB16. Zbierz 5 - 10 kolonii i hoduj każdą kolonię w 2 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny przy 220 obr./min i 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin.</li>
	<li>Wyekstrahuj DNA każdego plazmidu za pomocą zestawu do miniprzygotowania DNA17 i potwierdź klony przez sekwencjonowanie DNA za pomocą startera AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>Amplifikacja PCR fragmentu genu A. thaliana TDR kodującego reszty 30 - 642 z syntetycznego konstruktu genu TDR (starter do przodu: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, starter odwrotny: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplifikuj DNA przez 30 cykli w buforze reakcyjnym polimerazy DNA zawierającym 0,5 mM mieszaniny dNTP, 0,2 μM starterów, 0,1 μg matrycowego DNA, 0,4 mM MgCl2 i 1 jednostkę reakcyjną polimerazy DNA.
	<ol>
		<li>W przypadku etapów cyklu PCR należy ustawić początkową denaturację na 95 °C przez 30 s, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę, z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić zarówno fragment PCR, jak i zmodyfikowany wektor za pomocą enzymów endonukleazy restrykcyjnej NotI i BamHI. Liguj fragment genu za pomocą wektora zlinearyzowanego. Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej bufor reakcyjny ligazy DNA T4 i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α zgodnie ze standardowym protokołem transformacji i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej ampicillin-LB16. Potwierdź prawidłowe klony za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
</ol>
2. Modyfikacja wektora ekspresji bakulowirusa za pomocą peptydu sygnałowego hemoliny owadów do ekspresji wydzielania białek roślinnych
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj fragment DNA zawierający miejsce cięcia 5' BglII13, sekwencję sygnałową wydzielania hemoliny owadów oraz miejsce wielokrotnego klonowania z NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI i XhoI (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Trawić 4 μg DNA za pomocą BglII i XhoI oraz 4 μg DNA wektora ekspresyjnego za pomocą BamHI i XhoI14. Zmieszać 10 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego z DNA w buforze reakcyjnym o 1x stężeniu (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu i 100 μg/ml BSA, pH 7,9 w 25 °C) i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
	<ol>
		<li>Oczyść wycięty fragment DNA i zlinearyzowany wektorowy DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej 1x bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP i 10 mM DTT, pH 7,5 w 25 °C) i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α i wybierz kolonie na płytce agarowej ampicyliny-LB. Zbierz 5 - 10 kolonii i hoduj każdą kolonię w pożywce LB o pojemności 2 ml zawierającej 100 μg/ml ampicyliny przy 220 obr./min i 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin.</li>
	<li>Ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do miniprepu DNA17 i potwierdź klony przez sekwencjonowanie DNA za pomocą startera AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.</li>
	<li>PCR-amplify A. thaliana Kinaza Receptora Pyłkowego 3 (PRK3) fragment genu kodujący reszty 20 - 237 z syntetycznego konstruktu genu PRK3 (starter do przodu: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, starter odwrotny: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplifikuj DNA przez 30 cykli w buforze reakcyjnym polimerazy DNA zawierającym 0,5 mM mieszaniny dNTP, 0,2 μM starterów, 0,1 μg matrycowego DNA, 0,4 mM MgCl2 i 1 jednostkę reakcyjną polimerazy DNA.
	<ol>
		<li>Dla etapów cyklu PCR należy ustawić początkową denaturację na 95 °C przez 30 s, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 30 s w każdym cyklu, a końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić zarówno fragment PCR, jak i zmodyfikowany wektor za pomocą enzymów endonukleazy restrykcyjnej NotI i BamHI. Liguj fragment genu za pomocą wektora zlinearyzowanego. Zmieszać 100 ng zlinearyzowanego wektorowego DNA z 400 ng strawionego fragmentu DNA w 10-μl mieszaninie reakcyjnej ligacji zawierającej bufor reakcyjny ligazy DNA T4 i 5 jednostek ligazy DNA T4. Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 16 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Przekształć 5 μl mieszaniny ligacyjnej w 100 μl komórek kompetentnych DH5α zgodnie ze standardowym protokołem transformacji i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej ampicillin-LB16. Potwierdź prawidłowe klony za pomocą sekwencjonowania DNA.</li>
</ol>
3. Produkcja i amplifikacja konstruktów bakulowirusa zawierających kasetę ekspresji rekombinowanego białka
<ol>
	<li>Użyj 100 ng plazmidu konstruktu, aby przekształcić 40 μl komórek kompetentnych DH10Bac zgodnie z protokołem systemu ekspresji bakulowirusa1. Inkubować płytki transformacyjne w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Weź dwie białe kolonie z każdej płytki transformacyjnej, zaszczep każdą kolonię w 2 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Postępuj zgodnie z protokołem systemu ekspresji bakulowirusa1, aby wyodrębnić i zweryfikować DNA bakcydu. Podwielokrotność każdego DNA należy umieścić w dwóch probówkach o pojemności 20 μl każda i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Poniższe kroki wymagają działania aseptycznego.</li>
	<li>Hoduj monowarstwę komórek Sf9 w pożywce hodowlanej z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 μg/ml (lub 100 I.U./ml) antybiotykami penicylinowo-streptomycynowymi w temperaturze od 27 °C do 80% zbiegu w 6-dołkowej płytce. Oszacuj procent zbiegu na podstawie procentu pokrytego obszaru na płytce kultury tkankowej.</li>
	<li>Przygotuj następujące roztwory w dwóch sterylnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
	<ol>
		<li>Probówka 1: Do każdej transfekcji rozcieńczyć 20 μl bakmidowego DNA w 100 μl nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków. Delikatnie wymieszać rozcieńczenie, przesuwając bok tuby.</li>
		<li>Probówka 2: Dla każdej transfekcji rozcieńczyć 8 μl odczynnika do transfekcji lipidów w 100 μl nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków. Dokładnie wymieszać rozcieńczenie, pipetując w górę i w dół przez 6 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz oba roztwory, delikatnie je wymieszaj, pipetując powoli w górę iw dół przez 3x i inkubuj przez 20 - 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę komórek jednowarstwowych Sf9 2x 3 ml nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków. Do każdej transfekcji dodać 0,8 ml nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków do każdej probówki zawierającej mieszaninę lipid-DNA. Delikatnie wymieszać zawartość probówek, pipetując powoli w górę i w dół przez 3 razy. Odessać media płuczące z płytek i nałożyć próbki na mieszaninę transfekcyjną.</li>
	<li>Po dodaniu mieszaniny do transfekcji inkubować transfekowaną płytkę przez 5 godzin w temperaturze 27 °C. Zastąp pożywkę do transfekcji kompletną pożywką do hodowli komórkowych Sf9 zawierającą 10% FBS i 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml) antybiotyki penicylinowo-streptomycynowe. Inkubować transfekowaną płytkę w temperaturze 27 °C przez 4 dni.</li>
	<li>Zebrać i amplifikować rekombinowanego bakulowirusa.
	<ol>
		<li>Zebrać supernatant z zakażonej płytki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml po 4 dniach inkubacji. Obracać supernatant w temperaturze 1010 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Wyrzucić osad i zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku. 
		UWAGA: To jest wirus P0. Może być podawany i przechowywany w temperaturze -80 °C przez dłuższy okres czasu.</li>
		<li>Aby amplifikować każdy rekombinowany wirus, wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 na 150-milimetrowej płytce do 80% konfluencji. Odessać pożywkę z płytki, dodać 2 ml wirusa P0 do komórek przylegających do płytki i inkubować płytkę przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 °C. Kołysz płytką co 15 minut, aby wymieszać podłoże z komórkami.
		<ol>
			<li>Dodać 25 ml kompletnej pożywki Grace's zawierającej 10% FBS i 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml) antybiotyków penicylinowo-streptomycynowych. Inkubować płytkę przez 3 dni w inkubatorze o temperaturze 27 °C w celu uzyskania wirusa pasażu P1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zebrać supernatant z zakażonej płytki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować w temperaturze 1010 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórek. Zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku. 
		UWAGA: Wirus P1 może być podawany na porcje i przechowywany w temperaturze -80 °C przez dłuższy okres czasu.</li>
		<li>Aby amplifikować wirusa z pasażu P1 do P2, należy wyhodować monowarstwę komórek Sf9 na płytce o średnicy 150 mm do 90% konfluencji, odessać pożywkę z płytki, dodać 2 ml wirusa P1 do płytki i inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 °C.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.8.2 i 3.8.3 w celu uzyskania pasaży P2 i P3 wirusów. Nie należy przechowywać wirusa P3 dłużej niż 2 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekspresja białek, oczyszczanie za pomocą NiNTA i krystalizacja
<ol>
	<li>Wyhodować 1 l komórek owadów Hi5 w pożywce hodowlanej z 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml) antybiotyków penicylinowo-streptomycynowych do gęstości 2 x 10,6 przy 100 obr./min w wytrząsarce inkubatora o temperaturze 27 °C. Wirować komórki w temperaturze 570 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w 20 ml świeżo wyprodukowanego wirusa P3 i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Delikatnie potrząśnij butelką wirową, aby ponownie zawiesić komórki 1x co 15 minut.</li>
	<li>Przenieść komórki do 1 l pożywki hodowlanej z antybiotykami penicylinowo-streptomycynowymi o stężeniu 100 μg/ml (lub 100 j.m./ml), hodować komórki z prędkością 100 obr./min w inkubatorze o temperaturze 27 °C przez 72 godziny. Wirować komórki w temperaturze 1,010 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.</li>
	<li>Za pomocą pasków wskaźnika pH należy dostosować pH supernatantu do 8,0, dodając 0,1 M HCl lub 0,1 M NaOH i dodać bufor wiążący o końcowym stężeniu, zawierający 20 mM buforu Tris o pH 8,0, 100 mM NaCl i 5 mM imidazolu. Dodać pewną ilość żywicy NiNTA (10 - 40 ml) w oparciu o szacowaną wydajność eksprymowanego białka rekombinowanego znakowanego His.
	<ol>
		<li>Mieszać roztwór na mieszadle magnetycznym z małą prędkością w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Przemyć żywicę i wymyć związane białko zgodnie ze standardowym protokołem oczyszczania NiNTA18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczone białko należy poddać chromatografii jonowymiennej i chromatografii filtracji żelowej, a także innym metodom oczyszczania białek, aby uzyskać jednorodną próbkę. 
	UWAGA: W przypadku ektodomeny TDR jako żelowy bufor filtracyjny zastosowano 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl. Dla ektodomeny PRK3 jako preferowany żelowy bufor filtracyjny zastosowano 20 mM bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl.</li>
</ol>

<ol><li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).</li>
<li>Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+3a+protein+and+the+assembly+of+coronavirus-like+particles+in+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system.</a> Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).</li>
<li>Possee, R. D., King, L. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17951765">Baculovirus Transfer Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).</li>
<li>Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+two+cell+lines+from+the+insect+Spodoptera+frugiperda+%28Lepidoptera%3B+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae).</a> In Vitro. 13, 213-217 (1977).</li>
<li>Hink, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+insect+cell+line+from+the+cabbage+looper%2C+Trichoplusia+ni%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni.</a> Nature. 226, 466-467 (1970).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).</li>
<li>Wickham, T. J., Nemerow, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+growth+methods+and+recombinant+protein+production+in+BTI-Tn-5B1-4+insect+cells+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system.</a> Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).</li>
<li>Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+expression+of+alkaline+phosphatase+as+a+reporter+gene+for+evaluation+of+production%2C+glycosylation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion.</a> Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).</li>
<li>Murphy, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression%2C+secretion%2C+and+large-scale+purification+of+recombinant+HIV-1+gp120+in+insect+cell+using+the+baculovirus+egt+and+p67+signal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides.</a> Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).</li>
<li>Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolin%3A+an+insect-immune+protein+belonging+to+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily.</a> Science. 250, 1729-1732 (1990).</li>
<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+CLE+peptide+perception+by+plant+receptors+implicated+from+structural+and+functional+analyses+of+TDIF-TDR+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions.</a> PLoS One. 12, e0175317(2017).</li>
<li>Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Domain+of+Pollen+Receptor+Kinase+3+is+structurally+similar+to+the+SERK+family+of+co-receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors.</a> Scientific Reports. 8, 2796(2018).</li>
<li>Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a gene.</a> Science. 203, 614-625 (1979).</li>
<li>Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+inserting+specific+DNA+sequences+into+cloning+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles.</a> Gene. 1, 81-92 (1976).</li>
<li>Xu, W., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Vaccine-Derived+Polioviruses%2C+Relevance+for+the+Global+Polio+Eradication+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative.</a> Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Reddy, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+alpha+subunit+of+the+epithelial+sodium+channel%2C+ENaC%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC.</a> Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).</li>
<li>Harris, T. J., Emtage, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+genes+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous genes in E. coli.</a> Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).</li>
<li>Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optimization+of+heterologous+protein+expression+in+E.+coli%3A+Roadblocks+and+reinforcements%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+BIological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements.</a> International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).</li>
<li>Guo, Y., Yang, F., Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+Protein+Secretion+in+Yeast+and+Animal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).</li>
<li>Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+pathway+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein secretion pathway in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).</li>
<li>Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+protein+secretion+in+yeast%3A+strategies+and+impact+on+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).</li>
<li>Wormald, M. R., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins%3A+glycan+presentation+and+protein-fold+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.</a> Structure. 7, R155-R160 (1999).</li>
<li>Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+and+History+of+Glyco-Engineering+in+Insect+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems.</a> Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).</li>
<li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor%2C+DORN1%2C+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+BIology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li>
<li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells%3A+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li>
<li>Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+hydrophobin-assisted+recombinant+protein+production+in+tobacco+BY-2+suspension+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells.</a> Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).</li>
<li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biorąc pod uwagę różnorodność wielkości i stabilności tysięcy białek obecnych w systemach biologicznych, często laboratorium badawcze decyduje, który heterologiczny system ekspresji należy wybrać do ekspresji określonego białka. System ekspresji E. coli jest często pierwszym wyborem do ekspresji białek ze względu na krótki cykl życia bakterii, niski koszt pożywki hodowlanej i względną łatwość skalowania19. Jednak w przypadku ekspresji dużych białek eukariotycznych o rozmiarach większych n...

Konieczne jest, aby laboratorium badawcze było w stanie produkować duże ilości jednorodnych białek rekombinowanych do charakterystyki biochemicznej i biofizycznej, szczególnie do badań krystalograficznych rentgenowskich. Istnieje wiele dobrze ugruntowanych heterologicznych systemów ekspresji, takich jak Escherichia coli, drożdże, komórki owadów, komórki ssaków, komórki roślinne itp. Wśród nich system ekspresji komórek owadów, w którym pośredniczy bakulowirus, jest jedną z najczęściej stosowanych technik wytwarzania dużych ilości strukturalnie pofałdowanych rekombinowanych białek eukariotycznych o dużych rozmiarach do krystalizacji białek1.
Wektory ekspresyjne systemu ekspresji bakulowirusa są zaprojektowane tak, aby zawierały silną polihedrynę lub promotor P10, aby uzyskać wysoką wydajność rekombinowanych białek wewnątrzkomórkowych2,3. Aby wytworzyć rekombinowanego bakulowirusa, gen będący przedmiotem zainteresowania jest klonowany do wektora owada zawierającego locus polihedryny (polh) w genomie wielonukleopolihedrowirusowym Autographa californica. Powstała konstrukcja jest następnie sekwencjonowana i weryfikowana jest jej poprawna otwarta ramka odczytu (ORF). Prawidłowy konstrukt jest następnie wprowadzany do komórki owada gospodarza w procesie transfekcji. Gen będący przedmiotem zainteresowania jest wprowadzany do genomu wirusa w drodze rekombinacji homologicznej. Zdarzenie to powoduje wytworzenie rekombinowanego genomu wirusa, który następnie replikuje się, tworząc rekombinowane cząsteczki wirusa z pączkami1.
Najczęściej używane komórki owadów w systemie ekspresji to komórki Sf9 i High Five (Hi5). Komórki Sf9 są klonalnym izolatem Sf21, pochodzącym z komórek jajnika poczwarki Spodoptera frugiperda, a komórki Hi5 są izolatem klonalnym pochodzącym z rodzicielskiej linii komórek jajnikowych Trichoplusia ni TN-3684,5. Kotransfekcja, amplifikacja wirusa i testy płytki nazębnej są przeprowadzane na komórkach Sf9, podczas gdy komórki Hi5 są zwykle wybierane do wytwarzania większych ilości rekombinowanych białek6. Warto zauważyć, że komórki Hi5 nie nadają się do generowania i amplifikacji progenii wirusa ze względu na ich skłonność do wytwarzania zmutowanych wirusów. Tradycyjnie uważa się, że zakres temperatur 25 - 30 °C jest dobry do hodowli komórek owadów. Doniesiono jednak, że 27 - 28 °C to optymalna temperatura dla wzrostu komórek owadów i infekcji7,8.
Wprowadzenie silnej sekwencji sygnałowej poprzedzającej gen jest potrzebne do wysokiej ekspresji wydzielanych białek. Sekwencja sygnałowa skutecznie prowadziłaby translowane białko rekombinowane do retikulum endoplazmatycznego w celu wydzielania białka i modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do prawidłowego fałdowania i stabilizacji3. Sekwencje peptydów sygnałowych, takie jak białko otaczające bakulowirusa GP64/67, melityna pszczoły miodnej i inne, zostały wybrane w celu ułatwienia ekspresji wydzielniczych białek rekombinowanych w systemach ekspresji, w których pośredniczy bakulowirus3. Wykazano, że wprowadzenie peptydu sygnałowego GP67 poprawia wydajność ekspresji wydzielanego białka rekombinowanego w porównaniu z użyciem wewnętrznego peptydu sygnałowego docelowego genu 9. Hemolin to białko hemolimfy gigantycznej jedwabnej Hyalophora cecropia, wywołane infekcją bakteryjną10. Ze względu na stosunkowo wysoki poziom indukowanej ekspresji, sekwencja peptydu sygnałowego genu może być wykorzystana do pośredniczenia w ekspresji wydzielania rekombinowanych białek w układzie komórkowym bakulowirusa-owada.
Receptor Receptora Czynnika Hamującego Różnicowanie Elementów Tchheary (TDR) i Kinaza Receptora Pyłkowego 3 (PRK3) należą do rodziny białek roślinnych Kinaza Receptora Powtórzeniowego Bogatych w Leucynę (LRR-RLK)11,12. W celu zbadania struktury i funkcji tej rodziny roślinnych białek receptorowych, a także w celu ułatwienia charakterystyki strukturalnej i biochemicznej innych białek wydzielanych przez rośliny, zmodyfikowano system ekspresji komórek bakulowirusa i owadów w celu poprawy jakości białka i wydajności produkcji. Domeny zewnątrzkomórkowe zarówno TDR, jak i PRK3 zostały z powodzeniem wyrażone przy użyciu dwóch zmodyfikowanych wektorów ekspresyjnych w systemie ekspresji komórek bakulowirusa-owada. Krystalizacji uległy zarówno domeny zewnątrzkomórkowe białek TDR, jak i PRK3. W artykule opisano ekspresję i oczyszczanie dużych ilości rekombinowanych wydzielanych białek roślinnych za pomocą dwóch zmodyfikowanych wektorów ekspresji bakulowirusa poprzez włączenie sekwencji sygnałowej GP67 lub hemoliny między promotorem a wieloma miejscami klonowania.

<table><tbody><tr><td>Wytrząsarka inkubatora</td><td>VWR</td><td>Model Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>VWR</td><td>Model 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>BECKMAN</td><td>Model J-6</td><td>z obrotowym wirnikiem kubełkowym</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>Do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>DNA Termocykler</td><td>BIO-RAD</td><td>Model C1000 Touch</td><td>Do amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>wytrząsarki inkubatora</td> DNA <td>New Brunswick Scientific</td><td>Model I 24</td><td>Do uprawy kultur baceria</td></tr><tr><td>Synteza DNA klienta</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>Endonukleaza restrykcyjna</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>Endonukleaza restrykcyjna</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Endonukleaza restrykcyjna</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Endonukleaza restrykcyjna</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Ligacja DNA</td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Oczyszczanie DNA z żelu Agorase</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Oczyszczanie plazmidowego DNA z hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>Do elektroferozy żelu DNA</td></tr><tr><td>MAX Wydajność DH5&alpha; kompetentna komórka</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>Do transformacji mieszaniny ligacji DNA</td></tr><tr><td>Lennox L LB Bulion</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>Do wytwarzania kultur bakterii</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Siarczan Kanamycyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>MAX Skuteczność DH10Bac kompetentne komórki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>Do wytwarzania bacmid DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>Do transformacji DNA</td></tr><tr><td>Odczynnik CellFECTIN II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>Odczynnik do transfekcji komórek owadów</td></tr><tr><td>System ekspresji Bac-to-Bac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>Zestaw do ekspresji komórek bakulowirusa i owadów</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>Do izolacji współistniejącego DNA Bacmid</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>Do izolacji powtarzającego się Bacmid DNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>Wektor ekspresyjny Baculorirus</td></tr><tr><td>Komórki Sf9 Thermo</td><td> Ogniwa monowarstwowe Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9</td></tr><tr><td>Ogniwa Hi5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>Komórki owadzie High Five</td></tr><tr><td>Grace' s pożywka dla owadów, nieuzupełniona</td><td>pożywka Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 transfekcja komórek</td></tr><tr><td>Grace' s pożywka dla owadów, uzupełniona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 jednowarstwowa pożywka do hodowli komórkowych kompletna</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>Sf9 zawiesinowa pożywka do hodowli komórkowych bez FBS</td></tr><tr><td>Express Five SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10 000 I.U./ml)</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS Certyfikowane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>Płytki płaskodenne</td></tr><tr><td>150 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>100/opakowanie</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 probówek / worek</td></tr><tr><td>15 ml stożkowe probówki wirówkowe z zakrętką</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 probówek / worek</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe z zakrętką</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 probówek / worek</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>Paski wskaźnikowe pH z żywicy NiNTA</td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

Wyzwaniem dla naukowców było wyrażenie rekombinowanych wydzielniczych białek eukariotycznych do badań strukturalnych i biochemicznych. System ekspresji komórek owadów, w którym pośredniczy bakulowirus, jest jednym z systemów używanych do ekspresji rekombinowanych eukariotycznych białek wydzielniczych z pewnymi modyfikacjami potranslacyjnymi. Białka wydzielnicze muszą być kierowane przez szlaki wydzielnicze w celu glikozylacji białek, tworzenia wiązań dwusiarczkowych i innych modyfikacji potranslacyjnych. Aby poprawić istniejącą ekspresję wydzielniczych białek roślinnych w komórkach owadów, wektor ekspresyjny bakulowirusa jest modyfikowany przez dodanie sekwencji peptydu sygnałowego GP67 lub hemoliny między promotorem a miejscami wielokrotnego klonowania. Ten nowo zaprojektowany, zmodyfikowany system wektorów z powodzeniem pozwolił uzyskać wysoką wydajność rozpuszczalnych, rekombinowanych, wydzielanych białek receptorów roślinnych Arabidopsis thaliana. Dwa z eksprymowanych białek roślinnych, zewnątrzkomórkowe domeny Arabidopsis TDR i receptorów błony plazmatycznej PRK3, skrystalizowano do badań krystalograficznych rentgenowskich. Zmodyfikowany system wektorów jest ulepszonym narzędziem, które potencjalnie może być wykorzystane do ekspresji rekombinowanych białek wydzielniczych również w królestwie zwierząt.

Jak pokazano na Rysunku 1, do ekspresji białek wydzielanych wykorzystano dwa zmodyfikowane wektory ekspresyjne bakulowirusowe pFastBac1, zawierające sekwencję sygnałową GP67 lub hemoliny, aby zastąpić rodzimą sekwencję sygnałową genu docelowego. Wykazano, że wirusowe GP67 i owadzie geny hemoliny zapewniają wysoki poziom ekspresji wydzielniczej w komórkach. Przewiduje się, że białka fuzyjne z dowolną z tych dwóch sekwencji sygnałowych będą charakteryzować się ...

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biologii strukturalnej wydzielanych białek, takie jak określanie struktury białek za pomocą krystalografii i krio-EM. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza ona dużą ilość rekombinowanych wydzielanych białek przy stosunkowo niskich kosztach określania struktury białek. Najpierw zsyntetyzuj fragment DNA zawierający pięć głównych miejsc cięcia BglII, sekwencję sygnału wydzielania będącą przedmiotem zainteresowania w miejscu wielokrotnego klonowania, jak opisano w protokole tekstowym.Następnie trawić cztery mikrogramy DNA za pomocą BglII i X1 oraz cztery mikrogramy DNA wektora ekspresyjnego za pomocą BamH1 i X1. Wymieszaj 10 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego z DNA w buforze reakcyjnym o stężeniu 1X. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Dodać 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej ligacji zawierającej 1X bufor reakcyjny ligazy DNA T4 i pięć jednostek ligazy DNA T4 do świeżej 1,5 mililitrowej probówki Eppendorfa.Następnie dodaj 100 nanogramów zlinearyzowanego wektorowego DNA i 400 nanogramów strawionego fragmentu DNA. Inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Przekształć pięć mikrolitrów mieszaniny ligacyjnej w 100 mikrolitrów komórek kompetentnych DH5 alfa i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej Ampicillin LB, jak opisano w protokole tekstowym.Wybierz od pięciu do 10 kolonii, przenosząc każdą z nich do dwóch mililitrów pożywki LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Hoduj te kolonie w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min w 37 stopniach Celsjusza przez 16 godzin. Następnie użyj zestawu DNA Miniprep, aby wyekstrahować każde DNA plazmidu.Potwierdź klony przez sekwencjonowanie DNA za pomocą startera sekwencjonowania do przodu, jak opisano w protokole tekstowym. Używając 100 nanogramów plazmidu konstrukcyjnego, przekształć 40 mikrolitrów komórek kompetentnych DH10Bac, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować płytki transformacyjne w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Podnieś dwie białe kolonie z każdej płytki transformacyjnej i zaszczep każdą kolonię w dwóch mililitrach pożywki LB zawierającej kanamycynę, gentamycynę i tetracyklinę. Wyodrębnij i zweryfikuj DNA bakcydu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podziel każde DNA na dwie probówki, przenosząc 20 mikrolitrów do każdej probówki.Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do kontynuowania. Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane aseptycznie. Na sześciodołkowej płytce wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 w pożywce hodowlanej z 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 mikrogramami na mililitr antybiotyków penicylina-streptomycyna w temperaturze od 27 stopni Celsjusza do 80% zgrywki.Do każdej transfekcji dodać 100 mikrolitrów nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych Sf9 bez antybiotyków do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Rozcieńczyć 20 mikrolitrów bakimidowego DNA w każdej probówce i delikatnie strzepnąć, aby wymieszać. Następnie dodaj 100 mikrolitrów nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych Sf9 bez antybiotyków do 1,5 mililitrowej probówki dla każdej transfekcji.Rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji lipidów w każdej probówce i wymieszać, dokładnie pipetując sześć razy w górę iw dół. Połączyć te dwa roztwory i wymieszać je, delikatnie pipetując powoli trzy razy w górę i w dół. Inkubować przez 20 do 40 minut w temperaturze pokojowej.Umyć każdą studzienkę płytki hodowlanej dwukrotnie, używając trzech mililitrów nieuzupełnionej pożywki hodowlanej Sf9 bez antybiotyków do każdego przemycia. Następnie dodaj 0,8 mililitra nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków do każdej probówki zawierającej mieszaninę lipidowego DNA. Powoli pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby wymieszać.Odessać pożywkę płuczącą z płytek i nałożyć próbki na mieszaninę transfekcyjną. Inkubować transfekowaną płytkę przez pięć godzin w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Następnie zastąp pożywkę do transfekcji kompletną pożywką do hodowli komórkowych Sf9, która zawiera 10% FBS i 100 mikrogramów na mililitr antybiotyków penicylina-streptomycyna.Inkubować w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez cztery dni. Następnie zebrać supernatant w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Wiruj z prędkością 1 010 razy g przez pięć minut, aby usunąć resztki komórek.Wyrzucić osad i zdekantować supernatant do czystej probówki. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego roku lub do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Aby amplifikować każdy rekombinowany wirus, najpierw wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 na 150-milimetrowej płytce do 80% konfluencji.Następnie odessać pożywkę i dodać dwa mililitry wirusa P0 do każdej studzienki. Inkubować przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 stopni Celsjusza, kołysząc płytką co 15 minut, aby wymieszać podłoże z komórkami. Następnie dodaj 25 mililitrów kompletnej pożywki Grace's Products zawierającej 10% FBS i 100 mikrogramów na mililitr antybiotyków penicylina-streptomycyna.Inkubować płytkę przez trzy dni w inkubatorze o temperaturze 27 stopni Celsjusza, aby uzyskać wirusa pasażu P1. Następnie zbierz supernatant w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Wiruj z prędkością 1 010 razy g przez pięć minut, aby usunąć resztki komórek.Zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego roku lub do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Aby amplifikować wirusa z pasażu P1 do P2, najpierw wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 na 150-milimetrowej płytce do 90% konfluencji. Po osiągnięciu pożądanego zbiegu, zassać pożywkę.Dodaj dwa mililitry wirusa P1 i inkubuj przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 stopni Celsjusza. Powtórz etapy amplifikacji, aby uzyskać pasaże P2 i P3 wirusa. W tym badaniu dwa zmodyfikowane wektory ekspresyjne bakulowirusa pFastBac1 są używane do ekspresji wydzielanych białek za pomocą sekwencji sygnałowej gp67 lub hemoliny poprzez zastąpienie wewnętrznej sekwencji sygnałowej genu docelowego.PBEC gp67 jest z powodzeniem wykorzystywany do ekspresji domen zewnątrzkomórkowych receptora a-thal-leano TDR. Podczas gdy hemolina PBEC1 jest z powodzeniem wykorzystywana do ekspresji domeny zewnątrzkomórkowej PRK3. Następnie oczyszczone białka są zagęszczane do pięciu miligramów na mililitr i poddawane przesiewowemu krystalizacji.Warunki, w których powstały wstępne kryształy dla każdego białka, są optymalizowane do momentu zaobserwowania kryształów białka większych niż 20 mikrometrów. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że badają jakość białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, wielokątowego rozpraszania światła i innych testów na stan braku agregacji rekombinowanego białka. Nie zapomnij, aby sprawdzić czystość białka również za pomocą srebrnej barwie.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak krystalografia rentgenowska i krio-EM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak trójwymiarowe struktury wytworzonego białka. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną do badania właściwości strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych wydzielanych białek pochodzących z roślin i ssaków. Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym w celu wizualizacji pasm DNA na żelu agarozowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie ochrony przed promieniowaniem UV, osłony twarzy, okularów okularowych, fartucha laboratoryjnego.Również podczas robienia należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z mocnymi kwasami i zasadami.

modifying-baculovirus-expression-vectors-to-produce-secreted-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kompleksy białkowe katalizują kluczowe funkcje komórkowe. Szczegółowa charakterystyka funkcjonalna i strukturalna wielu istotnych kompleksów wymaga produkcji rekombinowanej. MultiBac to system komórkowy bakulowirusa/owadów specjalnie przystosowany do ekspresji białek eukariotycznych i ich kompleksów. MultiBac został wdrożony jako platforma o otwartym dostępie, a standardowe procedury operacyjne zostały opracowane w celu maksymalizacji jego użyteczności.

Platforma do produkcji kompleksu białkowego MultiBac w EMBL

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Tutaj opisujemy sposób na wyrażenie prawidłowo złożonych i funkcjonalnych antygenów powierzchniowych wirusa grypy pochodzących z nowego chińskiego wirusa H7N9 w komórkach owadów. Technikę tę można dostosować do ekspresji ektodomen dowolnych wirusowych lub komórkowych białek powierzchniowych.

Ekspresja funkcjonalnych rekombinowanych białek hemaglutyniny i neuraminidazy nowego wirusa grypy H7N9 przy użyciu systemu ekspresji bakulowirusa

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Ten protokół opisuje system ekspresji białek wywołany szokiem cieplnym (system komórkowy pDHsp/V5-His/sf9), który może być używany zarówno do ekspresji obcych białek, jak i oceny antyapoptotycznej aktywności potencjalnych obcych białek i ich skróconych aminokwasów w komórkach owadów.

Przejściowa ekspresja obcych genów w komórkach owadów (sf9) do testu funkcjonalnego białka

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

System wektorów ekspresyjnych bakulowirusa (BEVS) to solidna platforma do badania ekspresji i produkcji białkowych metylotransferaz argininowych (PRMT) do wykorzystania w badaniach biochemicznych, biofizycznych i strukturalnych. Miligramowe ilości materiału mogą być produkowane dla większości PRMT i innych białek będących przedmiotem zainteresowania, wymagających eukariotycznej platformy ekspresyjnej.

Produkcja rekombinowanych białek PRMT przy użyciu systemu wektorów ekspresyjnych bakulowirusa

Poznaj modyfikację wektorów bakulowirusa do ekspresji wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów. Ta metoda umożliwia tanie wytwarzanie rekombinowanych białek do badań krystalograficznych i cryo-EM.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Przeglądaj więcej filmów