Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biologii strukturalnej wydzielanych białek, takie jak określanie struktury białek za pomocą krystalografii i krio-EM. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza ona dużą ilość rekombinowanych wydzielanych białek przy stosunkowo niskich kosztach określania struktury białek. Najpierw zsyntetyzuj fragment DNA zawierający pięć głównych miejsc cięcia BglII, sekwencję sygnału wydzielania będącą przedmiotem zainteresowania w miejscu wielokrotnego klonowania, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie trawić cztery mikrogramy DNA za pomocą BglII i X1 oraz cztery mikrogramy DNA wektora ekspresyjnego za pomocą BamH1 i X1. Wymieszaj 10 jednostek każdego enzymu restrykcyjnego z DNA w buforze reakcyjnym o stężeniu 1X. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Dodać 10 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej ligacji zawierającej 1X bufor reakcyjny ligazy DNA T4 i pięć jednostek ligazy DNA T4 do świeżej 1,5 mililitrowej probówki Eppendorfa.

Następnie dodaj 100 nanogramów zlinearyzowanego wektorowego DNA i 400 nanogramów strawionego fragmentu DNA. Inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Przekształć pięć mikrolitrów mieszaniny ligacyjnej w 100 mikrolitrów komórek kompetentnych DH5 alfa i wybierz powstałe kolonie na płytce agarowej Ampicillin LB, jak opisano w protokole tekstowym.

Wybierz od pięciu do 10 kolonii, przenosząc każdą z nich do dwóch mililitrów pożywki LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Hoduj te kolonie w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min w 37 stopniach Celsjusza przez 16 godzin. Następnie użyj zestawu DNA Miniprep, aby wyekstrahować każde DNA plazmidu.

Potwierdź klony przez sekwencjonowanie DNA za pomocą startera sekwencjonowania do przodu, jak opisano w protokole tekstowym. Używając 100 nanogramów plazmidu konstrukcyjnego, przekształć 40 mikrolitrów komórek kompetentnych DH10Bac, jak opisano w protokole tekstowym. Inkubować płytki transformacyjne w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Podnieś dwie białe kolonie z każdej płytki transformacyjnej i zaszczep każdą kolonię w dwóch mililitrach pożywki LB zawierającej kanamycynę, gentamycynę i tetracyklinę. Wyodrębnij i zweryfikuj DNA bakcydu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podziel każde DNA na dwie probówki, przenosząc 20 mikrolitrów do każdej probówki.

Następnie przechowuj probówki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do kontynuowania. Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane aseptycznie. Na sześciodołkowej płytce wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 w pożywce hodowlanej z 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 mikrogramami na mililitr antybiotyków penicylina-streptomycyna w temperaturze od 27 stopni Celsjusza do 80% zgrywki.

Do każdej transfekcji dodać 100 mikrolitrów nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych Sf9 bez antybiotyków do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Rozcieńczyć 20 mikrolitrów bakimidowego DNA w każdej probówce i delikatnie strzepnąć, aby wymieszać. Następnie dodaj 100 mikrolitrów nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórkowych Sf9 bez antybiotyków do 1,5 mililitrowej probówki dla każdej transfekcji.

Rozcieńczyć osiem mikrolitrów odczynnika do transfekcji lipidów w każdej probówce i wymieszać, dokładnie pipetując sześć razy w górę iw dół. Połączyć te dwa roztwory i wymieszać je, delikatnie pipetując powoli trzy razy w górę i w dół. Inkubować przez 20 do 40 minut w temperaturze pokojowej.

Umyć każdą studzienkę płytki hodowlanej dwukrotnie, używając trzech mililitrów nieuzupełnionej pożywki hodowlanej Sf9 bez antybiotyków do każdego przemycia. Następnie dodaj 0,8 mililitra nieuzupełnionej pożywki do hodowli komórek Sf9 bez antybiotyków do każdej probówki zawierającej mieszaninę lipidowego DNA. Powoli pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby wymieszać.

Odessać pożywkę płuczącą z płytek i nałożyć próbki na mieszaninę transfekcyjną. Inkubować transfekowaną płytkę przez pięć godzin w temperaturze 27 stopni Celsjusza. Następnie zastąp pożywkę do transfekcji kompletną pożywką do hodowli komórkowych Sf9, która zawiera 10% FBS i 100 mikrogramów na mililitr antybiotyków penicylina-streptomycyna.

Inkubować w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez cztery dni. Następnie zebrać supernatant w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Wiruj z prędkością 1 010 razy g przez pięć minut, aby usunąć resztki komórek.

Wyrzucić osad i zdekantować supernatant do czystej probówki. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego roku lub do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Aby amplifikować każdy rekombinowany wirus, najpierw wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 na 150-milimetrowej płytce do 80% konfluencji.

Następnie odessać pożywkę i dodać dwa mililitry wirusa P0 do każdej studzienki. Inkubować przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 stopni Celsjusza, kołysząc płytką co 15 minut, aby wymieszać podłoże z komórkami. Następnie dodaj 25 mililitrów kompletnej pożywki Grace's Products zawierającej 10% FBS i 100 mikrogramów na mililitr antybiotyków penicylina-streptomycyna.

Inkubować płytkę przez trzy dni w inkubatorze o temperaturze 27 stopni Celsjusza, aby uzyskać wirusa pasażu P1. Następnie zbierz supernatant w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Wiruj z prędkością 1 010 razy g przez pięć minut, aby usunąć resztki komórek.

Zdekantować supernatant do czystej probówki i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego roku lub do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Aby amplifikować wirusa z pasażu P1 do P2, najpierw wyhoduj monowarstwę komórek Sf9 na 150-milimetrowej płytce do 90% konfluencji. Po osiągnięciu pożądanego zbiegu, zassać pożywkę.

Dodaj dwa mililitry wirusa P1 i inkubuj przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 27 stopni Celsjusza. Powtórz etapy amplifikacji, aby uzyskać pasaże P2 i P3 wirusa. W tym badaniu dwa zmodyfikowane wektory ekspresyjne bakulowirusa pFastBac1 są używane do ekspresji wydzielanych białek za pomocą sekwencji sygnałowej gp67 lub hemoliny poprzez zastąpienie wewnętrznej sekwencji sygnałowej genu docelowego.

PBEC gp67 jest z powodzeniem wykorzystywany do ekspresji domen zewnątrzkomórkowych receptora a-thal-leano TDR. Podczas gdy hemolina PBEC1 jest z powodzeniem wykorzystywana do ekspresji domeny zewnątrzkomórkowej PRK3. Następnie oczyszczone białka są zagęszczane do pięciu miligramów na mililitr i poddawane przesiewowemu krystalizacji.

Warunki, w których powstały wstępne kryształy dla każdego białka, są optymalizowane do momentu zaobserwowania kryształów białka większych niż 20 mikrometrów. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, że badają jakość białek za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, wielokątowego rozpraszania światła i innych testów na stan braku agregacji rekombinowanego białka. Nie zapomnij, aby sprawdzić czystość białka również za pomocą srebrnej barwie.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak krystalografia rentgenowska i krio-EM, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak trójwymiarowe struktury wytworzonego białka. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią strukturalną do badania właściwości strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych wydzielanych białek pochodzących z roślin i ssaków. Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym w celu wizualizacji pasm DNA na żelu agarozowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie ochrony przed promieniowaniem UV, osłony twarzy, okularów okularowych, fartucha laboratoryjnego.

Również podczas robienia należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z mocnymi kwasami i zasadami.