Name: Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Poznaj ulepszoną metodę cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie, która eliminuje tradycyjny transfer i zwiększa wydajność. Technika ta poprawia integralność preparatów z tkanek myszy i Danio rerio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31400936, 31460260) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Jiangxi w Chinach (20171BAB215020). Dziękujemy również wspólnemu programowi Uniwersytetu Nanchang i Uniwersytetu Królowej Marii w Londynie za wsparcie tych prac.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Nanchang.
1. Złóż sprzęt i podłącz mikrotom
<ol>
	<li>Zaprojektuj parametr zgodnie z wymaganiami (Uzupełniające <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1).</li>
	<li>Prześlij parametr do lokalnej fabryki w celu wyprodukowania tablic akrylowych.</li>
	<li>Złóż wszystkie części po kolei: Użyj chloroformu, aby połączyć 7 komercyjnych płyt akrylowych w zbiornik z kanałem sekcyjnym i kąpielą wodną (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1). 
	UWAGA: Chloroform wytwarza substancje toksyczne, gdy styka się ze światłem i tlenem. Zamontuj urządzenie w dygestorium.</li>
	<li>Zamontuj rurowy elektryczny element grzejny przez otwór w płycie akrylowej #1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, grot strzałki).</li>
	<li>Aby zainstalować regulator temperatury, utwórz mały otwór na akrylowej płycie #2 za pomocą wiertarki elektrycznej i zainstaluj czujnik temperatury (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, strzałka). Zainstaluj termostat cyfrowy na zbiorniku (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2A). 
	UWAGA: Czujnik temperatury powinien znajdować się nie dalej niż 1 cm pod powierzchnią wody.</li>
	<li>Aby zapewnić dostęp do zasilania, wyreguluj napięcie poniżej 24 V przed włączeniem urządzenia.</li>
	<li>Wyjmij tackę na odpady sekcyjne z mikrotomu.</li>
	<li>Połącz kanał sekcji z uchwytem ostrza mikrotomu za pomocą neutralnego uszczelniacza silikonowego (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 2B). 
	UWAGA: Nie rozmazuj żadnego neutralnego uszczelniacza silikonowego nad górną częścią ostrza, aby stare ostrze można było łatwo wymienić.</li>
	<li>Suszyć przez noc, aby chloroform i neutralny uszczelniacz silikonowy miały czas na zastygnięcie.</li>
	<li>Zamontuj ostrze w uchwycie ostrza. Wlej wodę do łaźni wodnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Powierzchnia wody powinna dotykać górnej części ostrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D, grot strzałki).</li>
</ol>
2. Sekcja parafiny
UWAGA: Zanieczyszczenia często gromadzą się na górnych lub dolnych krawędziach bloku wosku i na powierzchni wody. Te zanieczyszczenia powinny być regularnie usuwane.
<ol>
	<li>Wykonaj konwencjonalne cięcie parafiny10.
	<ol>
		<li>Zaciśnij próbkę zatopioną w parafinie na obrotowym mikrotomie i umieść ostrze w uchwycie ostrza.</li>
		<li>Obróć pokrętło i podziel próbkę na sekcje.</li>
		<li>Przenieść wstęgę z cząstkami parafiny do łaźni wodnej o temperaturze 38,5 °C.</li>
		<li>Po rozłożeniu podnieś skrawki na szkiełko mikroskopowe z powierzchni wody.</li>
		<li>Szkiełka suszyć przez noc w piekarniku w temperaturze 42 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ulepszone cięcie parafiny (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
	<ol>
		<li>Włącz sprzęt.</li>
		<li>Otwórz grzałkę z przełącznikiem wykrywania temperatury i ustaw docelową temperaturę w zakresie od 38,0 °C do 40,0 °C na 1 godzinę z wyprzedzeniem, aby podgrzać wodę.</li>
		<li>Zmodyfikuj blok parafiny uzyskany przez zatapianie parafiny, a następnie umieść blok parafiny na zacisku kasety mikrotomu i zablokuj go. 
		UWAGA: Górne i dolne granice bloku parafinowego należy zmodyfikować poziomo, aby wstęga sekcji nie tworzyła łuku i nie mogła przepływać przez kanał wąskich sekcji.</li>
		<li>Szybko zbliż się do próbki, wycinając grubsze fragmenty.</li>
		<li>Dostosuj do odpowiedniej grubości przekroju (10 μm dla mózgów dorosłych myszy, nerek dorosłych myszy i zarodków mózgów myszy, 4 μm dla oczu danio pręgowanego). Obróć pokrętło, a sekcje automatycznie wejdą do kanału sekcji i wanny.</li>
		<li>Dziel próbkę powolnym i równomiernym ruchem cięcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
		UWAGA: Grubość pierwszej sekcji zostanie zmieniona po zatrzymaniu pokrętła na kilka minut. Ostrza jednorazowe należy wymienić, gdy sekcje mają kolejne zadrapania.</li>
		<li>Wprowadź sekcje do komory kąpieli, aby unosiły się w linii (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, 3C). 
		UWAGA: Jeśli część głowicy przylega do ścianki komory, użyj prowadnicy szczotki, aby utrzymać ją w ruchu.</li>
		<li>Przyklej skrawki do szkiełek mikroskopowych. Po całkowitym rozłożeniu sekcji w łaźni wodnej oddziel kilka sekcji pęsetą. Następnie podnieś je z kąpieli wodnej na szkiełka mikroskopowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
		UWAGA: Sekcje należy zbierać z tylnej części kąpieli wodnej, ponieważ te w kanale sekcji i przedniej części kąpieli wodnej nie będą jeszcze w pełni rozłożone.</li>
		<li>Wysuszyć szkiełka, umieszczając je na noc w piekarniku o temperaturze 42 °C. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj barwienia Hematoxylin-Eozyny (HE) w celu oceny ulepszonej metody8.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li>
<li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li>
<li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid-Cut%3A+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).</li>
<li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).</li>
</ol>

Autorzy posiadają patent na to urządzenie i deklarują brak sprzecznych interesów.

Aby poprawić morfologię przekroju parafiny i rozwiązać problem marnowania czasu podczas konwencjonalnego cięcia parafiny, stworzyliśmy ulepszoną metodę cięcia parafiny, która łączy cięcie i rozwijanie. Ta ulepszona metoda opiera się na prostym sprzęcie, który składa się z kanału sekcyjnego, łaźni wodnej i grzałki z przełącznikiem wykrywania temperatury. Taśma sekcji wchodzi do łaźni wodnej przez kanał sekcji i rozwija się automatycznie podczas cięcia. Dlatego metoda ta poprawia jakość i wydajność cięcia parafiny, co zost...

Badanie morfologiczne jest ważne w badaniach biologicznych. Chociaż nowa technologia pozwoliła naukowcom obserwować swoje cele bezpośrednio z całej tkanki lub organizmu1,2,3, cięcie próbki na cienkie sekcje, a następnie barwienie, pozostaje podstawową metodą nie tylko morfologii tkanki, ale także białka ukierunkowanego bezpośrednio w tkance. W mikroskopii świetlnej wykorzystuje się trzy typy przekrojów: parafinowy, mrożony i półcienki. Chociaż kriosekcja jest powszechna w celu ochrony antygenowości tkanek, a przygotowanie próbki jest proste, morfologia zatrzymanej tkanki jest słaba i nieodpowiednia do cienkiego cięcia4,5. Cięcie parafiny jest najczęściej stosowaną metodą wykazywania dobrze zachowanej morfologii. Ponieważ próbki są całkowicie odwodnione i zatopione w wosku, bloki parafiny mogą być przechowywane w nieskończoność. Ponadto w wyniku cięcia parafiny powstają cienkie odcinki, które poprawiają dostęp sondy biologicznej w dalszych eksperymentach i zmniejszają nakładanie się warstwy komórkowej w kierunku Z.
Jednak konwencjonalne cięcie parafiny jest żmudne i wymaga umiejętności operatora. Skrawki parafiny ulegają utrwalaniu, odwadnianiu, zatapianiu, cięciu i unoszeniu się. Co ważne, przenoszenie taśm sekcyjnych z uchwytu noża do kąpieli wodnej jest konieczne, ale trudne dla młodszych operatorów. Szczególnie w suchym powietrzu wstęgi sekcji skręcają się z powodu elektryczności statycznej i są trudne do rozłożenia na powierzchni ciepłej wody. Aby poprawić jakość przekroju, zaleca się zwilżenie odsłoniętej powierzchni tkanki między przejściami ostrza mikrotomu, chłodzenie bloków wosku poprzez zanurzenie ich w lodowatej wodzie lub podniesienie wilgotności za pomocą nawilżacza w pobliżu mikrotomu6,7. Nowsze metody poprawy przekroju parafiny obejmują hybrydowe zatapianie parafiny, kriosekcję8 oraz komercyjny system transferu sekcji assistance9. Chociaż metody te częściowo poprawiają szybkość i jakość cięcia parafiny, sprawiają, że cięcie jest znacznie bardziej kłopotliwe, a komercyjne systemy przenoszenia sekcji są drogie.
W tym protokole pokazujemy, jak krok po kroku tworzyć proste, tanie i elastyczne urządzenia, które można podłączyć do uchwytu ostrza obrotowego mikrotomu. To urządzenie składa się z kanału sekcyjnego, łaźni wodnej i grzałki z przełącznikiem wykrywania temperatury. Po przecięciu dziesiątki sekcji wpływają do kanału kształtownika i wchodzą bezpośrednio do łaźni wodnej, rozkładając się w ten sposób automatycznie. Poprawia to wydajność cięcia parafiny i sprawia, że technologia ta jest wygodniejsza. Stosując tę metodę, więcej wycinków hipokampa dorosłej myszy, wycinków nerki dorosłej myszy, embrionalnych 15,5-dniowych (E15,5) odcinków mózgu myszy i wycinków oczu dorosłego danio pręgowanego zebrano w krótszym czasie i pozostało ono bardziej nienaruszone morfologicznie. Metoda ta może być również stosowana do innych próbek tkanek, które wymagają przyspieszonego cięcia parafiny przy jednoczesnym uniknięciu utraty rozróżnienia sekcji.

<table><tbody><tr><td>Inkubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Pokrywka</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., pokrywka</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany moduł zatapiania parafiny</td><td>Leica</td> Komercyjna płyta akrylowa Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Trichlorometan</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Pokrywka</td><td>67-66-3</td><td></td></tr> Rurowy <tr><td></td> elektryczny element grzejny (12 V 200 W)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury (12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutralny uszczelniacz</td><td></td><td></td><td>silikonowy Połącz kanał wodny z uchwytem noża do mikrotomów</td></tr><tr><td>Transformator napięcia</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze jednorazowe</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna&nbsp;</td><td>Baso Diagnostyka Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microslide Sail Marka</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny balsam</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Pokrywka</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe&nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna do sekcji parafinowych</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&nbsp;- Zimna płyta</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr> spray <tr><td>odstraszający parafinę&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Cięcie tkanki zatopionej w parafinie jest szeroko stosowane w histologii i patologii. Jest to jednak żmudne. Aby udoskonalić tę metodę, kilka firm komercyjnych opracowało złożone systemy przenoszenia przekrojów wykorzystujące płynną wodę. Aby uprościć tę technologię, stworzyliśmy prostą metodę przy użyciu domowego sprzętu, który łączy cięcie i pływanie w prostej komorze termostatycznej; Dzięki temu sekcje automatycznie wchodzą do łaźni wodnej na powierzchni wody. Hipokamp z mózgów dorosłych myszy, nerek dorosłych myszy, embrionalnych mózgów myszy i oczu dorosłych danio pręgowanego przecięto przy użyciu zarówno konwencjonalnego przekroju parafinowego, jak i przedstawionej metody dla porównania. Analiza statystyczna pokazuje, że nasza ulepszona metoda pozwoliła zaoszczędzić czas i pozwoliła uzyskać wyższą jakość sekcji. Ponadto cięcie parafinowe całej próbki w krótkim czasie jest łatwe dla młodszych operatorów.

Udoskonalona metoda zwiększyła liczbę nienaruszonych przekrojów parafinowych. Przetestowano tę nową metodę na tkance hipokampa dorosłych myszy, nerkach dorosłych myszy, embrionalnych mózgach myszy oraz oczach rybek zebra. Do zbiornika dodano wodę, a temperaturę wody utrzymywano w zakresie od 38.0 °C do 40.0 °C. Po seryjnym przygotowaniu próbek tkankowych wykonano ich cięcia i porównano je z konwencjonalnym sekcjonowaniem. Nowa metoda zapobiegła utracie przekrojów i zwiększyła proporcję ni...

Tutaj prezentujemy protokół mający na celu poprawę podziału parafiny. Metoda ta łączy cięcie i pływanie za pomocą prostej studzienki termostatycznej, aby uniknąć procesu przenoszenia wymaganego przez metodę konwencjonalną. W rezultacie znacznie poprawiła się wydajność i liczba nienaruszonych skrawków parafiny.

Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie morfologii, takie jak sekcja parafinowa. Główną zaletą tej techniki jest to, że kulminacja procesu cięcia i składania oraz unikanie procesu przenoszenia, który jest wymagany metodą konwencjonalną. Na początek zbierz wszystkie wstępnie przetworzone części w dygestorium.Użyj chloroformu, aby połączyć siedem desek akrylowych, jak pokazano tutaj. Produktem końcowym będzie zbiornik wyposażony w kanał sekcyjny i łaźnię wodną. Zamontuj rurowy elektryczny element grzejny przez otwór w płycie akrylowej numer dwa.Za pomocą wiertarki elektrycznej wykonaj mały otwór w płycie akrylowej numer siedem i zainstaluj cyfrowy termostat na zbiorniku, upewniając się, że znajduje się on co najmniej jeden centymetr poniżej poziomu zamierzonej powierzchni wody, co wskazuje kropka na zbiorniku. Dostosuj napięcie tak, aby było poniżej 24 woltów przed włączeniem urządzenia. Wyjmij tackę na odpady sekcyjne z mikrotomu.Następnie użyj neutralnego szczeliwa silikonowego, aby połączyć kanał sekcji z uchwytem ostrza mikrotomu, uważając, aby nie dostać się uszczelniacza powyżej górnej części ostrza. Pozostaw zestaw do wyschnięcia na noc, aby dać czas na zestalenie się chloroformu i neutralnego szczeliwa silikonowego. Następnego dnia zainstaluj ostrze w uchwycie ostrza.Dodaj wodę do łaźni wodnej, upewniając się, że powierzchnia wody dotyka tylko górnej części ostrza. Po wykonaniu konwencjonalnego cięcia parafiny włącz sprzęt, aby rozpocząć ulepszone cięcie parafiny. Użyj przełącznika wykrywania temperatury, aby otworzyć grzejnik.Ustaw docelową temperaturę w zakresie od 38 stopni Celsjusza do 40 stopni Celsjusza na godzinę, aby podgrzać wodę. Użyj noża, aby zmodyfikować blok parafiny uzyskany przez zatapianie parafiny. Następnie umieść blok na kasecie mikrotomu clamp i zablokuj go.Wytnij grubsze sekcje, aby szybko zbliżyć się do próbki. Dostosuj do odpowiedniej grubości przekroju dla próbek. Obracanie pokrętła ręcznego spowoduje automatyczne załadowanie sekcji do sekcji, kanału i wanny.Następnie pokrój próbkę powolnym i równomiernym ruchem cięcia. Poprowadź sekcje do komory kąpieli tak, aby unosiły się w linii. Jeśli część głowicy przylega do ścianki komory, użyj prowadnicy szczotki, aby utrzymać ją w ruchu.Po całkowitym rozłożeniu skrawków w kąpieli wodnej za pomocą pęsety oddziel kilka, a następnie podnieś je na szkiełku mikroskopowym. Przełóż szkiełka do piekarnika nastawionego na 42 stopnie Celsjusza do wyschnięcia przez noc. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony, aż będą gotowe do analizy.Gdy będziesz gotowy do analizy, użyj barwienia hematoksyliną-eozyną, aby ocenić skrawki przy użyciu ulepszonej metody. W tym badaniu zastosowano ulepszoną metodę przygotowania skrawków parafiny dla tkanki hipokampa dorosłej myszy, nerek dorosłych myszy, embrionalnych mózgów myszy i oczu danio pręgowanego. Jak pokazano tutaj, nowa metoda pozwala uniknąć utraty skrawków i zwiększa udział nienaruszonych skrawków w każdym typie badanej tkanki.Podczas wykonywania przekroju całych serii zaobserwowano, że metoda ta przyspiesza prędkość cięcia parafiny we wszystkich badanych próbkach. Innymi słowy, metoda ta zapewnia wyższą jakość cięcia parafiny w krótszym czasie niż metoda konwencjonalna. Szeregowe odcinki siatkówki wzrokowej danio pręgowanego są następnie obserwowane przez barwienie hematoksyliną-eozyną.Stwierdzono, że skrawki zebrane przy użyciu ulepszonej metody mają lepszą integralność niż te zebrane przy użyciu konwencjonalnej metody cięcia parafiny. Chociaż nie ma znaczących różnic w jakości większości zebranych części w porównaniu z tymi dwiema metodami, niektóre części zebrane metodą konwencjonalną są postrzegane jako mające stosunkowo niską jakość. Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak wyciąg.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby ostrożnie dodawać wodę i unikać przepełnienia.

the-cutting-floating-method-for-paraffin-embedded-tissue-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Poniższy film opisuje, jak zachować morfologię tkanki za pomocą utrwalania formaliny i zatapiania parafiny.

Konserwacja tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE): metoda badania morfologii tkanek

W tym filmie pokazujemy przetwarzanie FFPE lub utrwalonych formaliną skrawków zatopionych w parafinie, uzyskanych z tkanki nowotworowej przewodu pokarmowego. Etapy deparafinowania i ponownego uwodnienia umożliwiają przetworzenie próbki tkanki do kolejnych zastosowań analitycznych.

Deparafinizacja i ponowne uwodnienie skrawków tkanek: dwuetapowa procedura usuwania wosku parafinowego z preparatów tkankowych FFPE, a następnie ponowne uwodnienie tkanek

Opisujemy test do przeszczepu jajników, odpowiedni do badań nad normalnym i przekształconym nabłonkiem żeńskiego układu rozrodczego. Mysia poduszka tłuszczowa umożliwia przeszczep dużych fragmentów tkanki, jest łatwo dostępna do zabiegu chirurgicznego i obrazowania oraz zapewnia najkorzystniejsze środowisko natywne dla tkanek pochodzenia Müllerowskiego.

Przeszczep do poduszeczki tłuszczowej jajnika myszy

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Opracowaliśmy metodę skutecznego usuwania, przetwarzania, cięcia i barwienia, w celu oceny histopatologicznej, tkanki sutka, która pierwotnie była utrwalona na szkiełkach jako całe wierzchowce. Metoda ta może sprzyjać gromadzeniu i ocenie całych wierzchowców gruczołu mlekowego w badaniach wytycznych dotyczących badań reprodukcyjnych i rozwojowych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) jest często wymagana w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną w celu wyboru terapii w medycynie spersonalizowanej. Nowatorski, niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, który umożliwia wysokiej jakości analizy morfologiczne, molekularne i FISH z tej samej próbki poprzez dodanie etapu po utrwaleniu przed przedstawieniem FISH.

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Opisujemy techniki utrwalania, zatapiania parafiny i cienkiego cięcia biofilmów kolonii mikroorganizmów. W przygotowanych próbkach za pomocą mikroskopii można uwidocznić podstrukturę biofilmu i wzorce ekspresji reporterowej.

Osadzanie parafiny i cienkie cięcie biofilmów kolonii drobnoustrojów do analizy mikroskopowej

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Poznaj ulepszoną metodę cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie, która eliminuje tradycyjny transfer i zwiększa wydajność. Technika ta poprawia integralność preparatów z tkanek myszy i Danio rerio.

Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia

Przeglądaj więcej filmów