Metoda cięcia i pływania tkanki zatopionej w parafinie do cięcia
5 września 2018
Tutaj prezentujemy protokół mający na celu poprawę podziału parafiny. Metoda ta łączy cięcie i pływanie za pomocą prostej studzienki termostatycznej, aby uniknąć procesu przenoszenia wymaganego przez metodę konwencjonalną. W rezultacie znacznie poprawiła się wydajność i liczba nienaruszonych skrawków parafiny.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie morfologii, takie jak sekcja parafinowa. Główną zaletą tej techniki jest to, że kulminacja procesu cięcia i składania oraz unikanie procesu przenoszenia, który jest wymagany metodą konwencjonalną. Na początek zbierz wszystkie wstępnie przetworzone części w dygestorium.
Użyj chloroformu, aby połączyć siedem desek akrylowych, jak pokazano tutaj. Produktem końcowym będzie zbiornik wyposażony w kanał sekcyjny i łaźnię wodną. Zamontuj rurowy elektryczny element grzejny przez otwór w płycie akrylowej numer dwa.
Za pomocą wiertarki elektrycznej wykonaj mały otwór w płycie akrylowej numer siedem i zainstaluj cyfrowy termostat na zbiorniku, upewniając się, że znajduje się on co najmniej jeden centymetr poniżej poziomu zamierzonej powierzchni wody, co wskazuje kropka na zbiorniku. Dostosuj napięcie tak, aby było poniżej 24 woltów przed włączeniem urządzenia. Wyjmij tackę na odpady sekcyjne z mikrotomu.
Następnie użyj neutralnego szczeliwa silikonowego, aby połączyć kanał sekcji z uchwytem ostrza mikrotomu, uważając, aby nie dostać się uszczelniacza powyżej górnej części ostrza. Pozostaw zestaw do wyschnięcia na noc, aby dać czas na zestalenie się chloroformu i neutralnego szczeliwa silikonowego. Następnego dnia zainstaluj ostrze w uchwycie ostrza.
Dodaj wodę do łaźni wodnej, upewniając się, że powierzchnia wody dotyka tylko górnej części ostrza. Po wykonaniu konwencjonalnego cięcia parafiny włącz sprzęt, aby rozpocząć ulepszone cięcie parafiny. Użyj przełącznika wykrywania temperatury, aby otworzyć grzejnik.
Ustaw docelową temperaturę w zakresie od 38 stopni Celsjusza do 40 stopni Celsjusza na godzinę, aby podgrzać wodę. Użyj noża, aby zmodyfikować blok parafiny uzyskany przez zatapianie parafiny. Następnie umieść blok na kasecie mikrotomu clamp i zablokuj go.
Wytnij grubsze sekcje, aby szybko zbliżyć się do próbki. Dostosuj do odpowiedniej grubości przekroju dla próbek. Obracanie pokrętła ręcznego spowoduje automatyczne załadowanie sekcji do sekcji, kanału i wanny.
Następnie pokrój próbkę powolnym i równomiernym ruchem cięcia. Poprowadź sekcje do komory kąpieli tak, aby unosiły się w linii. Jeśli część głowicy przylega do ścianki komory, użyj prowadnicy szczotki, aby utrzymać ją w ruchu.
Po całkowitym rozłożeniu skrawków w kąpieli wodnej za pomocą pęsety oddziel kilka, a następnie podnieś je na szkiełku mikroskopowym. Przełóż szkiełka do piekarnika nastawionego na 42 stopnie Celsjusza do wyschnięcia przez noc. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej przez czas nieokreślony, aż będą gotowe do analizy.
Gdy będziesz gotowy do analizy, użyj barwienia hematoksyliną-eozyną, aby ocenić skrawki przy użyciu ulepszonej metody. W tym badaniu zastosowano ulepszoną metodę przygotowania skrawków parafiny dla tkanki hipokampa dorosłej myszy, nerek dorosłych myszy, embrionalnych mózgów myszy i oczu danio pręgowanego. Jak pokazano tutaj, nowa metoda pozwala uniknąć utraty skrawków i zwiększa udział nienaruszonych skrawków w każdym typie badanej tkanki.
Podczas wykonywania przekroju całych serii zaobserwowano, że metoda ta przyspiesza prędkość cięcia parafiny we wszystkich badanych próbkach. Innymi słowy, metoda ta zapewnia wyższą jakość cięcia parafiny w krótszym czasie niż metoda konwencjonalna. Szeregowe odcinki siatkówki wzrokowej danio pręgowanego są następnie obserwowane przez barwienie hematoksyliną-eozyną.
Stwierdzono, że skrawki zebrane przy użyciu ulepszonej metody mają lepszą integralność niż te zebrane przy użyciu konwencjonalnej metody cięcia parafiny. Chociaż nie ma znaczących różnic w jakości większości zebranych części w porównaniu z tymi dwiema metodami, niektóre części zebrane metodą konwencjonalną są postrzegane jako mające stosunkowo niską jakość. Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak wyciąg
.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby ostrożnie dodawać wodę i unikać przepełnienia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół zaprojektowany w celu usprawnienia procesu skrawania sekcji parafiny poprzez połączenie cięcia i wypłukiwania wewnątrz komory termostatycznej, co eliminuje konieczność tradycyjnego procesu przenoszenia. Modyfikacja ta znacząco poprawia zarówno wydajność, jak i integralność sekcji parafiny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Histologia
- Neuronauka
- Techniki skrawania w parafinie
Wprowadzenie
- Konwencjonalne skrawanie w parafinie obejmuje wiele etapów przenoszenia, co często prowadzi do utraty przekrojów.
- Nowa metoda usprawnia ten proces, zwiększając uzyski nienaruszonych przekrojów.
- Udoskonalone skrawanie jest kluczowe dla dokładnej analizy morfologicznej w różnych tkankach biologicznych.
Cel badania
- Przedstawienie protokołu zwiększającego liczbę nieuszkodzonych skrawków parafinowych.
- Skrócenie czasu wymaganego do wykonywania skrawków parafinowych w badaniach biologicznych.
- Ułatwienie dokładniejszej analizy tkanek myszy oraz zebrafish.
Zastosowane metody
- Artykuł szczegółowo opisuje metodę z wykorzystaniem komory termostatycznej doycinania preparatów.
- Przeprowadzono zatopienie w parafinie orazycinanie tkanek hipokampa dorosłych myszy, nerek, zarodkowych mózgów myszy oraz oczu rybek danio pręgowanych.
- Przedstawiono ustawienia temperatury oraz konkretne kroki instalacji aparatury.
- Kluczowe etapy obejmują staranną konfigurację elementów grzejnych oraz proceduryycinania.
- Przygotowane skrawki są następnie barwione hematoksyliną i eozyną w celu przeprowadzenia oceny.
Główne wyniki
- Wykazano, że protokół ten pozwala na uzyskanie przekrojów wyższej jakości przy mniejszych stratach w porównaniu z metodami konwencjonalnymi.
- Zauważono zwiększoną integralność przekrojów w różnych typach tkanek, w szczególności w siatkówce oka danio pręgowanego oraz w tkankach mysich.
- Metoda ta przyspiesza proces skrawania w parafinie przy jednoczesnym zachowaniu jakości.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia bardziej efektywny protokół skrawania sekcji parafiny, który sprzyja zachowaniu integralności próbek tkankowych.
- Usprawnia ono badania morfologiczne, zapewniając uzyskanie wyników wyższej jakości w krótszym czasie.
- Wyniki te mają istotne znaczenie dla badaczy polegających na precyzyjnym skrawaniu sekcji w analizach histologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Krojenie preparatów w parafini pozostaje wąskim gardłem w procesach histologicznych, szczególnie w przypadku wysokoprzepustowej walidacji celów oraz przesiewów fenotypowych w biologii odkrywczej. Niniejsza metoda poprawia integralność skrawków i zwiększa przepustowość, redukując zmienność techniczną, która może zakłócać odczyty analiz końcowych i wysiłki zmierzające do minimalizacji ryzyka mechanistycznego. Poprzez zapewnienie niezawodnego i powtarzalnego przygotowania tkanek, wspiera ona pewność prognostyczną w badaniach nad oddziaływaniem na cel w modelach neuronauki i onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dzięki wysokiej jakości morfologii tkanek, co pozwala na lokalizację celu oraz analizę szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Ogranicza utratę skrawków oraz liczbę etapów ręcznego przenoszenia materiału, zwiększając uzysk tkanek użytecznych w ramach jednego eksperymentu.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia spójne wyniki histologiczne, które są kluczowe dla badań nad zaangażowaniem celu i mechanizmami działania.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanych, nieuszkodzonych przekrojów odpowiednich do analiz immunohistochemicznych i hybrydyzacji in situ.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje procesy krojenia, umożliwiając mniej doświadczonym operatorom zachowanie wysokiej jakości i powtarzalności.
- Gotowość do analizy: Umożliwia wiarygodną ocenę związków poprzez minimalizację artefaktów tkankowych utrudniających detekcję sygnału.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje wierność morfologiczną w systemach istotnych dla przebiegu choroby, w tym w tkankach mysich i ryb zebrafish.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej przy zmniejszeniu liczby błędów technicznych.
- Łagodzenie ryzyka: Redukuje szum biologiczny w badaniach podłużnych, wspierając decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o poziom ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po optymalizację wiodących związków, gdzie wiarygodna histologia dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez wykorzystanie nienaruszonych przekrojów tkanek do walidacji celów terapeutycznych i kolokalizacji biomarkerów.
- Przesiewanie: Poprawia powtarzalność testów dzięki dostarczaniu jednolitych przekrojów do obrazowania ilościowego i barwienia.
- Analityka: Generuje wysokiej jakości dane morfologiczne, umożliwiając dokładne porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość badań przedklinicznych dzięki spójnemu przygotowaniu tkanek u różnych gatunków i na różnych etapach rozwoju.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi skalowalną, niskokosztową możliwość zastosowania w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez ograniczenie ubytków w przekrojach i poprawę integralności morfologicznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy krojenia dzięki uproszczeniu sprzętu i zmniejszeniu zależności od operatora.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez przyspieszenie procesów histologicznych i ograniczenie marnotrawstwa odczynników wynikającego z wadliwych przekrojów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki niezawodnym danym histologicznym służącym do walidacji celów i farmakologii bezpieczeństwa.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu histologii oraz biegłość w obsłudze mikrotomu iy wlewania tkanek do parafiny.
- Niezbędny jest standardowy sprzęt laboratoryjny, w tym mikrotom, piecyk i odczynniki do barwienia, a także specjalna komora akrylowa.
- W celu zapewnienia powtarzalności wyników wymagana jest standaryzacja grubości skrawków, kontroli temperatury oraz przygotowania kąpieli wodnej w ramach całego zespołu.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację prędkości cięcia i grubości skrawków w zależności od rodzaju tkanki i gęstości badanych próbek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują bezpieczne obchodzenie się z chloroformem podczas montażu, co wymaga użycia wyciągu i zapewnienia odpowiedniej wentylacji.
