Name: Aparatura do pobierania mikrokolumn tkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Poznaj metodę pobierania pełnej grubości skóry autologicznej z minimalnym uszczerbkiem miejsca pobrania. Technika ta umożliwia wysokowydajne zbieranie mikrokolumn tkankowych do badań nad regeneracją skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Armię, Marynarkę Wojenną, NIH, Siły Powietrzne, VA i Sprawy Zdrowia, aby wesprzeć wysiłki AFIRM II, pod numerem nagrody W81XWH-13-2-0054. U.S. Army Medical Research Acquisition Activity, 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 jest biurem przyznającym i zarządzającym akwizycją. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony.

Wszystkie prace z udziałem żywych zwierząt i próbek tkanek zwierzęcych zostały zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Produkcja igieł do zbioru
<ol>
	<li>Ustawienie etapu produkcji
	<ol>
		<li>Przymocuj żeńskie złącze luer lock do słupka i zamontuj słupek na stoliku obrotowym tak, aby luer lock znajdował się na środku stolika (Rysunek 1A).</li>
		<li>Ustaw ten pierwszy stopień obrotu pionowo i zamontuj go prostopadle do drugiego, poziomego stopnia obrotu (Rysunek 1B).</li>
		<li>Zamontuj stolik obrotu poziomego na dwuosiowym stoliku translacyjnym (Rysunek 1B).</li>
		<li>Przymocuj kombinację do stabilnej powierzchni, takiej jak optyczna płytka stykowa.</li>
		<li>Oddzielnie zamontuj narzędzie obrotowe na tej samej płytce stykowej, tak aby narzędzie było umieszczone równolegle do płytki stykowej i w przybliżeniu na tej samej wysokości, co złącze luer lock na etapie kombinacji obrotu/translacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Zamontuj dwie tarcze do cięcia koncentrycznie na narzędziu obrotowym (mniejsza diamentowa tarcza do cięcia o mniejszej ziarnistości na większej ściernicy do cięcia kamienia) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). 
		UWAGA: Różnica około 9 mm między średnicami obu kół jest na ogół wystarczająca.</li>
		<li>Umieść górne źródło światła z regulowanym ramieniem nad narzędziem obrotowym, tak aby światło było skierowane na koła tnące.</li>
		<li>Aby poprawić wizualizację, umieść mikroskop preparacyjny nad stanowiskiem produkcyjnym tak, aby okular był skupiony na tarczach tnących (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: Alternatywnie użytkownicy mogą nosić okulary powiększające.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmiana kształtu końcówki igły
	<ol>
		<li>Nosić okulary ochronne i maskę chirurgiczną, aby zapobiec przedostawaniu się drobnych cząstek metalu do oczu lub dróg oddechowych.</li>
		<li>Wybierz igły podskórne o odpowiednim rozmiarze, w oparciu o wymagania eksperymentalne.</li>
		<li>Zaznacz zamierzoną długość na każdej igle do zbioru. 
		UWAGA: Do zbioru ze skóry świni zazwyczaj wystarczają igły o średnicy 8 mm; Chociaż długość może się różnić w zależności od potrzeb eksperymentalnych (np. Grubość docelowej tkanki skórnej, rozmiar rozstawu igieł). Ogólnie rzecz biorąc, igła o rozmiarze 19 dobrze sprawdza się w przypadku skóry świń.</li>
		<li>Opuść igłę prostopadle do narzędzia obrotowego przy włączonym zasilaniu, używając krawędzi zewnętrznej tarczy tnącej do odcięcia nadmiaru długości igły, w miejscu zaznaczonym w kroku 1.2.3.</li>
		<li>Podłącz skróconą, igłę do żeńskiego złącza luer lock na etapie produkcji.</li>
		<li>Wyreguluj obrót w poziomie stage tak, aby igła znajdowała się pod kątem 12° równolegle do tarcz tnących na narzędziu obrotowym (zmiana kąta wpłynie na siłę wymaganą do wkłucia igły).</li>
		<li>Włącz lampę górną i dostosuj jej położenie, obserwując igłę w powiększeniu, aż światło odbije się od linii środkowej (wzdłuż) igły.</li>
		<li>Włącz narzędzie obrotowe, a następnie użyj etapu translacji, aby przesunąć igłę w kierunku wewnętrznej (diamentowej) tarczy tnącej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
		<li>Powoli dociskaj igłę do tarczy tnącej, aż tarcza tnąca osiągnie mniej więcej linię środkową igły (jak widać po odbiciu światła górnego wzdłuż linii środkowej).</li>
		<li>Powoli przesuwaj wyciętą powierzchnię igły z wewnętrznej tarczy diamentowej na zewnętrzną tarczę kamienną, aby wykończyć powierzchnię wyciętej igły drobniejszym polerowaniem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Wycofaj igłę z tarczy tnącej.</li>
		<li>Korzystając z pionowego stolika obrotu, obróć igłę o 180°.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.9-1.2.10, aby zmienić kształt drugiej strony igły. 
		UWAGA: Igła powinna teraz mieć dwie końcówki tnące o mniej więcej równej długości (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C i 2D).</li>
		<li>Usunąć igłę ze etapu produkcji.</li>
		<li>Oczyść wewnętrzny otwór metalowym drutem, który jest nieco mniejszy niż wewnętrzna średnica igły.</li>
		<li>Za pomocą ostrego drewnianego patyczka (np. odłamując koniec małego drewnianego patyczka na aplikatorze z bawełnianą końcówką), usuń wszelkie zadziory, które mogą być nadal przyczepione do krawędzi nowo uformowanej igły. 
		UWAGA: Igły do zbioru można w razie potrzeby polerować elektrolitycznie i sterylizować w autoklawie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanek skórnych
<ol>
	<li>Użyj igieł do zbierania, aby pobrać mikrokolumny skóry z tkanek ex vivo lub żywych zwierząt.</li>
	<li>W przypadku cienkiej tkanki skórnej ex vivo (zwłaszcza z próbek, w których brakuje podskórnego tłuszczu lub został on odcięty), należy przytrzymać tkankę docelową nad otworem probówki wirówkowej o pojemności 50 ml lub ułożyć dwa kawałki tkanki jeden na drugim, aby uniknąć uszkodzenia końcówek igieł poprzez uderzanie nimi o twarde powierzchnie. 
	UWAGA: W przypadku zbioru in vivo od żywych zwierząt zaleca się miejscowe podawanie lidokainy i epinefryny we wstrzyknięciu śródskórnym w celu złagodzenia analgezji i zmniejszenia krwawienia.</li>
	<li>Zmontuj urządzenie do zbioru zgodnie z potrzebną ilością mikrokolumn, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Opcja niskiej-średniej głośności:
	<ol>
		<li>Aby zebrać małe lub średnie ilości mikrokolumn, wystarczy napełnić standardową strzykawkę (strzykawki o pojemności 10-20 ml zwykle dobrze działają) zwykłą solą fizjologiczną i podłączyć ją do igły do zbierania.</li>
		<li>Całkowicie wbić igłę do pobrania w skórę dawcy, a następnie ją schować.</li>
		<li>Nacisnąć na tłok strzykawki, aby przepłukać sól fizjologiczną przez igłę do zbioru i usunąć mikrokolumnę, która utknęła w otworze igły.</li>
		<li>Aby przyspieszyć proces zbioru, powtórz krok 2.4.2 od 3 do 5 razy przed usunięciem mikrokolumn w kroku 2.4.3. 
		UWAGA: Zwykle wygodnie jest wyrzucić mikrokolumny do standardowego sitka komórkowego, aby ułatwić późniejsze zbieranie mikrokolumn.</li>
		<li>Jeśli igły zostaną zatkane, zwiększ nacisk na tłok, aby usunąć zablokowaną tkankę i usunąć zatkanie. Jeśli samo zwiększenie ciśnienia jest niewystarczające, włóż metalowy drut przez otwór końcówki igły, aby usunąć zatkanie w otworze igły.</li>
		<li>Mikrokolumny należy przechowywać zanurzone w soli fizjologicznej lub pożywce do czasu użycia, aby zapobiec wysuszeniu . 
		UWAGA: Przy doświadczonym operatorze opisana powyżej metoda może być stosowana do zbierania mikrokolumn z szybkością około 1 mikrokolumny na sekundę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcja dużej głośności:
	<ol>
		<li>Stwórz proste urządzenie wspomagane ssaniem, które można skonstruować tak, aby ułatwić zbieranie dużych ilości mikrokolumn. 
		UWAGA: Urządzenie składa się z igły do zbierania, strzykawki o pojemności 20 ml z dyszą typu luer lock, adaptera ssącego zwykle używanego do liposukcji (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A) oraz sterylnego kanistra ssącego.</li>
		<li>Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 20 ml.</li>
		<li>Podłączyć strzykawkę do adaptera ssącego.</li>
		<li>Zakończ składanie, podłączając igłę do pobierania do strzykawki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Użyj kawałka sterylnego przewodu ssącego, aby podłączyć adapter ssący do sterylnego kanistra ssącego. Upewnij się, że urządzenie do zbioru jest podłączone do wejścia kanistra, które umożliwia niezakłócony przepływ płynu do kanistra (co może wymagać podłączenia do portu kanistra, który jest oznaczony jako odpływ, a nie dopływ).</li>
		<li>Podłącz urządzenie do źródła podciśnienia. 
		UWAGA: Wymagany nacisk zależy od średnicy i długości igły, jak opisano wcześniej8. Dla aparatury opisanej w tym manuskrypcie system ssący spotykany w typowych salach operacyjnych jest na ogół wystarczający.</li>
		<li>Podłączyć igłę do pobierania próbek do strzykawki.</li>
		<li>Zbierz mikrokolumny, wkładając igłę do pobierania w skórę. 
		UWAGA: Mikrokolumny zostaną wciągnięte do strzykawki przez odsysanie, a następnie przepłukane do kanistra ssącego.</li>
		<li>Podczas procedury zbioru należy okresowo zanurzać igłę do zbioru w pojemniku ze sterylną solą fizjologiczną, aby przepłukać system. 
		UWAGA: To płukanie solą fizjologiczną ułatwia transport mikrokolumny i zapewnia jej nawodnienie. Alternatywnie, adapter luer MFF można podłączyć do zamka luer strzykawki, a za pomocą rurki połączeniowej również do wiszącego worka kroplowego z solą fizjologiczną.</li>
		<li>Trzymaj pod ręką metalowy drut lub igłę o mniejszej średnicy, która jest nieco mniejsza niż wewnętrzna średnica igły do zbioru. Jeśli igła zostanie zatkana, można ją usunąć, wkładając metalowy drut do otworu igły.</li>
		<li>Gdy w kanistrze zgromadzi się żądana ilość mikrokolumn, odłącz urządzenie od ssania, a następnie wylej zawartość kanistra ssącego przez filtr, aby zebrać mikrokolumny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pobraniu należy nałożyć miejscową maść z antybiotykiem na miejsca dawcze. 
	UWAGA: Dodatkowe opatrunki na ogół nie są wymagane w miejscach dawczych.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li>
<li>Singh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenging+the+Conventional+Therapy%3A+Emerging+Skin+Graft+Techniques+for+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Challenging the Conventional Therapy: Emerging Skin Graft Techniques for Wound Healing.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4), 524-530 (2015).</li>
<li>Tam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+Skin+Harvesting%3A+Autologous+Skin+Grafting+without+Donor-site+Morbidity%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Fractional Skin Harvesting: Autologous Skin Grafting without Donor-site Morbidity.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 1 (6), 47(2013).</li>
<li>Tam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+full-thickness+skin+by+microcolumn+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of full-thickness skin by microcolumn grafting.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (10), 2796-2805 (2017).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hair+and+other+skin+appendages%3A+A+microenvironment-centric+view%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hair and other skin appendages: A microenvironment-centric view.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (5), 759-766 (2016).</li>
<li>Fernandes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mechanical+fractional+skin+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Micro-mechanical fractional skin rejuvenation.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 216-223 (2013).</li>
<li>Rettinger, C. L., Fletcher, J. L., Carlsson, A. H., Chan, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+epithelialization+and+improved+wound+healing+metrics+in+porcine+full-thickness+wounds+transplanted+with+full-thickness+skin+micrografts%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Accelerated epithelialization and improved wound healing metrics in porcine full-thickness wounds transplanted with full-thickness skin micrografts.</a> Wound Repair and Regeneration. 25 (5), 816-827 (2017).</li>
<li>Franco, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/270571598_Fractional_Skin_Harvesting_Device_Operational_Principles_and_Deployment_Evaluation">Fractional skin harvesting: device operational principles and deployment evaluation.</a> Journal of Medical Devices. 8 (4), 041005(2014).</li>
<li>Rasmussen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+autologous%2Fallogeneic+constructs+for+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Military+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric autologous/allogeneic constructs for skin regeneration.</a> Military Medicine. 179, 8 Suppl 71-78 (2014).</li>
<li>Ter Horst, B., Chouhan, G., Moiemen, N. S., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+keratinocyte+delivery+in+burn+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in keratinocyte delivery in burn wound care.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 123, 18-32 (2018).</li>
<li>Wong, V. W., Levi, B., Rajadas, J., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niches+for+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell niches for skin regeneration.</a> International Journal of Biomaterials. 2012, 926059(2012).</li>
<li>Manstein, D., Herron, G. S., Sink, R. K., Tanner, H., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+photothermolysis%3A+a+new+concept+for+cutaneous+remodeling+using+microscopic+patterns+of+thermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fractional photothermolysis: a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 34 (5), 426-438 (2004).</li>
<li>Iriarte, C., Awosika, O., Rengifo-Pardo, M., Ehrlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+applications+of+microneedling+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical%2C+Cosmetic+and+Investigational+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Review of applications of microneedling in dermatology.</a> Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 10, 289-298 (2017).</li>
<li>Anderson, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+treatment+of+traumatic+scars+with+an+emphasis+on+ablative+fractional+laser+resurfacing%3A+consensus+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Laser treatment of traumatic scars with an emphasis on ablative fractional laser resurfacing: consensus report.</a> Journal of the American Medical Association Dermatology. 150 (2), 187-193 (2014).</li>
<li>Hogan, S., Velez, M. W., Ibrahim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedling%3A+a+new+approach+for+treating+textural+abnormalities+and+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cutaneous+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Microneedling: a new approach for treating textural abnormalities and scars.</a> Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. 36 (4), 155-163 (2017).</li>
<li>Manuskiatti, W., Fitzpatrick, R. E., Goldman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effectiveness+and+side+effects+of+carbon+dioxide+laser+resurfacing+for+photoaged+facial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term effectiveness and side effects of carbon dioxide laser resurfacing for photoaged facial skin.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 40 (3), 401-411 (1999).</li>
</ol>

Autorzy są współtwórcami patentów związanych z technologią opisaną w tym artykule, z których otrzymali dochody z licencji i opłat licencyjnych za pośrednictwem swojej instytucji, Massachusetts General Hospital. J. Tam jest również konsultantem firmy Medline Industries, Inc., która posiada licencję komercyjną na tę technologię.

Opisane tutaj metody mają na celu umożliwienie pobierania mikrokolumn tkankowych w ilościach wystarczających do badań in vivo na dużych zwierzętach, przy użyciu narzędzi wykonanych z dostępnych na rynku materiałów laboratoryjnych. Przyrząd ten był wcześniej używany do pobierania tkanek z wyciętej skóry ludzkiej 4,9, jak również żywejskóry świń3. Opisane parametry szczególne to te, które uznano za najbardziej odpowiednie do stosowa...

Autologiczny przeszczep skóry jest podstawą leczenia ran, ale jest ograniczony przez niedobór i zachorowalność miejsca dawczego, co doprowadziło do wspólnych wysiłków w ostatnich dziesięcioleciach w celu opracowania nowych opcji terapeutycznych, które zastąpiłyby konwencjonalne przeszczepy skóry1,2. Niedawno opracowaliśmy alternatywną metodę pobierania skóry, aby wykorzystać korzyści płynące z przeszczepu skóry o pełnej grubości, jednocześnie minimalizując zachorowalność w miejscu dawczym. Zbierając skórę o pełnej grubości w postaci małych (~0,5 mm średnicy) "mikrokolumn", miejsca dawcze są w stanie zagoić się szybko i bez blizn w normalnych warunkach (potencjalne wyjątki znajdują się w sekcji dyskusji poniżej)3. Mikrokolumny mogą być stosowane bezpośrednio w łożyskach ran, aby przyspieszyć zamykanie ran, zmniejszyć skurcze3 i przywrócić różnorodny zakres typów komórek naskórka i skóry właściwej oraz funkcjonalnych struktur przydatków4, z których wiele nie jest dostępnych w konwencjonalnym przeszczepie skóry o podzielonej grubości lub obecnych bioinżynieryjnych substytutach skóry5. Zdolność mikrokolumn do wspomagania gojenia i ich miejsc dawczych do gojenia się bez blizn została niezależnie potwierdzona przez inne grupy badawcze6,7.
Wcześniej opracowaliśmy laboratoryjny system zbierania, aby umożliwić zbieranie mikrokolumn na dużą skalę8; jednak ten system składa się z wielu niestandardowych komponentów, które nie są powszechnie dostępne. W tym miejscu szczegółowo opisujemy proces produkcji igieł do zbioru, a także proste systemy zbierania, wykonane w większości z gotowych komponentów, które można wykorzystać do uzyskania dużych zbiorów. Aparatura opisana w tym manuskrypcie nadaje się do badań in vitro i pracy na zwierzętach, ale nie do stosowania u ludzi. Urządzenie kliniczne z zezwoleniem FDA do stosowania tej techniki u ludzi jest dostępne na rynku, ale nie będzie tutaj szczegółowo omawiane.

<table><tbody><tr><td>Tarcza diamentowa</td><td>Dremel</td><td>545</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna (19G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-98</td><td>Można użyć innych rozmiarów igieł, w zależności od potrzeb eksperymentalnych</td></tr><tr><td>Kamienne koło</td> Strzykawka <td>Dremel</td><td>540</td><td></td></tr><tr><td>(20 ml z blokadą typu luer)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-124-967</td><td></td></tr><tr><td>Adapter ssący</td><td>Tulip Medical</td><td>PA20BD</td><td>Opcjonalnie, do zbioru dużych ilości</td></tr><tr><td>Kanister ssący</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-212</td><td>Opcjonalnie, do zbioru dużych ilości. Sterylizuj przed użyciem.</td></tr><tr><td>Rurka ssąca</td><td>Medline</td><td>DYND50216H</td><td>Opcjonalnie, do zbioru dużych ilości</td></tr></tbody></table>

aparatura do pobierania mikrokolumn tkankowych

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

Ten manuskrypt opisuje proces produkcji aparatu laboratoryjnego, wykonanego z gotowych komponentów, który może być używany do zbierania mikrokolumn tkanki skórnej o pełnej grubości. Niewielki rozmiar mikrokolumn pozwala na szybkie gojenie się miejsc dawczych bez powodowania bliznowacenia w miejscu dawczym, podczas gdy pobieranie tkanki o pełnej grubości umożliwia włączenie wszystkich komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników tkanki skórnej, w tym tych związanych z głębszymi obszarami skóry właściwej i strukturami skóry przydatków, które nie zostały jeszcze pomyślnie odtworzone przy użyciu konwencjonalnych technik inżynierii tkankowej. Mikrokolumny mogą być stosowane bezpośrednio w ranach skóry w celu przyspieszenia gojenia lub mogą być wykorzystywane jako autologiczne źródło komórek/tkanek dla innych podejść inżynierii tkankowej. Igły do pobierania są wytwarzane poprzez modyfikację standardowych igieł podskórnych i mogą być używane samodzielnie do pobierania niewielkich ilości tkanek lub w połączeniu z prostym systemem pobierania opartym na ssaniu (również wykonanym z powszechnie dostępnych materiałów laboratoryjnych) do zbioru na dużą skalę, aby ułatwić badania na dużych modelach zwierzęcych.

Igły do pobierania powinny umożliwiać pozyskiwanie mikrokolumn tkanki skórnej o pełnej grubości z sukcesem na poziomie około 80-90%, a każda mikrokolumna powinna zawierać naskórek, skórę właściwą oraz niewielką ilość tkanki tłuszczowej podskórnej (Rycina 4). Jeśli współczynnik sukcesu pobierania jest niski lub włożenie igły w tkankę staje się trudne, prawdopodobnie konieczna jest wymiana igły na nową. Jeśli współczynnik sukcesu pobierania pozostaje stale nisk...

Tutaj opisujemy protokół produkcji igieł do pobierania igieł, które mogą być używane do pobierania tkanki skórnej o pełnej grubości bez powodowania bliznowacenia miejsca dawczego. Igły można łączyć z prostym systemem zbierania, aby uzyskać zbiory na dużą skalę.

Aparatura do pobierania mikrokolumn tkankowych

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na podstawowe pytania w dziedzinie regeneracji tkanki skórnej, czyli jak zastąpić różne typy komórek i struktury, które są zawarte w naturalnej skórze. Główną zaletą tej techniki jest to, że autologiczna skóra o pełnej grubości może być pobierana przy minimalnej zachorowalności w miejscu dawczym. Procedurę zademonstruje Bill Farinelli, który jest pracownikiem naukowym w naszym laboratorium.Rozpocznij tę procedurę od ustawienia etapu produkcyjnego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zamontuj dwie tarcze tnące koncentrycznie na narzędziu obrotowym. Użyj mniejszego koła do cięcia diamentów o dolnej siatce na większym ściernicy do cięcia kamienia o wyższej siatce.Umieść górne źródło światła z regulowanym ramieniem nad narzędziem obrotowym tak, aby światło było skierowane na koła tnące. Aby poprawić wizualizację, umieść mikroskop preparacyjny nad zestawem produkcyjnym tak, aby okular był skupiony na tarczach tnących. Podczas zmiany kształtu końcówki igły należy nosić okulary ochronne i maskę chirurgiczną, aby zapobiec przedostawaniu się drobnych cząstek metalu do oczu lub dróg oddechowych.Wybierz igły podskórne o odpowiednim rozmiarze w oparciu o wymagania eksperymentalne. Zaznacz zamierzoną długość na każdej igle do zbioru. Opuść igłę prostopadle do narzędzia obrotowego przy włączonym zasilaniu, używając krawędzi zewnętrznej tarczy tnącej, aby odciąć nadmiar długości igły w zaznaczonym punkcie.Podłączyć skróconą igłę do żeńskiego złącza Luer lock na etapie produkcji. Wyreguluj obrót w poziomie stage tak, aby igła znajdowała się pod kątem 12 stopni równolegle do tarcz tnących na narzędziu obrotowym. Włącz lampę górną i dostosuj jej położenie, obserwując igłę w powiększeniu, aż światło odbije się od linii środkowej igły.Włącz narzędzie obrotowe. Następnie użyj etapu translacji, aby przesunąć igłę w kierunku wewnętrznej tarczy tnącej. Powoli dociskaj igłę do tarczy tnącej, aż tarcza tnąca osiągnie mniej więcej linię środkową igły.Powoli przesuwaj wyciętą powierzchnię igły z wewnętrznej tarczy diamentowej na zewnętrzną tarczę kamienną, aby wykończyć powierzchnię ciętej igły drobniejszym połyskiem. Wycofaj igłę z tarczy tnącej. Korzystając ze stolika obrotu w pionie, obróć igłę o 180 stopni.Powtórz te czynności, aby zmienić kształt drugiej strony igły. Teraz usuń igłę ze sceny produkcji. Oczyść wewnętrzny otwór metalowym drutem, który jest nieco mniejszy niż wewnętrzna średnica igły.Za pomocą ostrego drewnianego patyczka usuń wszelkie zadziory, które mogą być jeszcze przyczepione do krawędzi nowo uformowanej igły. Gdy potrzebna jest duża objętość mikrokolumn, należy usunąć tłok z 20-mililitrowej strzykawki. Następnie podłączyć strzykawkę do adaptera ssącego.Zakończ montaż, podłączając igłę do pobierania próbek do strzykawki. Użyj kawałka sterylnego przewodu ssącego, aby podłączyć adapter ssący do sterylnego kanistra ssącego. Upewnij się, że urządzenie do zbioru jest podłączone do wejścia kanistra, które umożliwia niezakłócony przepływ płynu do kanistra.Teraz podłącz urządzenie do źródła podciśnienia. Zbierz mikrokolumny, wkładając igłę do zbierania w skórę. Sporadycznie zanurzaj igłę do zbioru w pojemniku ze sterylną solą fizjologiczną podczas procedury zbioru, aby przepłukać system.Trzymaj pod ręką metalowy drut lub igłę, która jest nieco mniejsza niż wewnętrzna średnica igły do zbioru. Jeśli igła zostanie zatkana, można ją usunąć, wkładając metalowy drut do otworu igły. Gdy w kanistrze zgromadzi się żądana ilość mikrokolumn, odłącz urządzenie od ssania.Następnie wylej zawartość kanistra ssącego przez filtr, aby zebrać mikrokolumny. Na zdjęciu gotowa igła do zbioru oglądana z przodu i z boku. Zwróć uwagę na dwa punkty cięcia na końcówce.Igły do pobierania powinny być w stanie zbierać mikrokolumny z tkanki skórnej o pełnej grubości z około 80 do 90% skutecznością. Na tym rysunku znaczniki wyboru reprezentują jeden milimetr. Każda mikrokolumna powinna zawierać naskórek, skórę właściwą i trochę tłuszczu podskórnego.Mikrokolumny mogą być stosowane bezpośrednio do gojenia się ran lub mogą być łączone z różnymi materiałami matrycowymi w celu uzyskania konstruktów kombinowanych. Mikrokolumny mogą być również utrzymywane w hodowli do badań in vitro. Podczas zbioru dużych ilości należy pamiętać o okresowym płukaniu solą fizjologiczną.Chociaż metoda ta została opracowana do leczenia ran skóry, podobną zasadę można zastosować do innych układów narządów, takich jak mięśnie, w których potrzebny jest autologiczny przeszczep tkanki.

apparatus-for-harvesting-tissue-microcolumns

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje technikę uzyskiwania pojedynczej komórki z heterogenicznej populacji komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej. Pojedyncza wyizolowana komórka może być wykorzystana do dalszych badań genomicznych lub badań nad rakiem.

Pobieranie próbek pojedynczych komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej: technika zbierania komórek docelowych z heterogenicznej populacji komórek

W tym filmie prezentujemy protokół uzyskiwania drobno zmielonego proszku macierzy zewnątrzkomórkowej z liofilizowanej tkanki bezkomórkowej metodą kriomielenia. Sproszkowany ECM zachowuje swój skład biochemiczny i może być stosowany do syntezy mikronośników.

Kriomielenie tkanki pozbawionej komórek: technika uzyskiwania drobnego proszku macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten film demonstruje procedurę wytwarzania mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą elektrorozpylania. Te mikronośniki symulują natywne mikrośrodowisko specyficzne dla tkanek i są stabilne w długoterminowych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro.

Wytwarzanie rusztowań biologicznych przez elektronatryskiwanie: technika generowania rusztowań mikronośnikowych pochodzących z zewnątrzkomórkowej macierzy tkanki pozbawionej komórek

W tym filmie demonstrujemy ekstrakcję metabolitów z nerki dawcy za pomocą sondy SPME. Wyekstrahowane metabolity można wykorzystać do przeprowadzenia analizy metabolomicznej i lipidomicznej w celu oceny jakości narządu do przeszczepu.

Pobieranie próbek mikroekstrakcji do fazy stałej: technika ekstrakcji próbki z tkanek przeszczepu oparta na sondzie

Ten film demonstruje metodę generowania trójwymiarowych rusztowań astrocytów w mikrokolumnach hydrożelowych. Wnętrze mikrokolumn pokryte jest kolagenem. Wprowadzane są astrocyty, które przylegają do kolagenu i przy dalszej inkubacji samoorganizują się w trójwymiarowe rusztowanie.

Metoda in vitro do generowania rusztowań astrocytów w mikrokolumnach hydrożelowych

Źródło: Struzyna, L. A. et al., Anatomicznie inspirowane trójwymiarowe sieci neuronowe mikrotkankowe do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje rozwój sieci neuronowych opartych na inżynierii mikrotkankowej przy użyciu mikrokolumny hydrożelowej z rdzeniem macierzy zewnątrzkomórkowej. Zasiane agregaty neuronalne przylegają, rozszerzają projekcje i tworzą ustrukturyzowane sieci neuronowe, przyczyniając się do postępu w rozwoju neurologicznym i...

Opracowanie sieci neuronowej opartej na inżynierii mikrotkankowej przy użyciu mikrokolumny na bazie hydrożelu

Marginating-pulmonary leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy selektywne zbieranie tej subpopulacji leukocytów płucnych poprzez wymuszoną perfuzję płuc u szczurów i myszy. Leukocyty płucne z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby krwiopochodne i płucne.

Selektywne pobieranie leukocytów płucnych z marginesem

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Ten protokół opisuje opłacalną metodę przyspieszenia ekstrakcji DNA plazmidowego. Wykorzystując niestandardowe, drukowane 3D stojaki kompatybilne ze standardowymi wirującymi stojakami do płytek, naukowcy mogą przetwarzać jednocześnie do 48 kolumn wirujących z kołkami lub do 116 kolumn wirujących bez kołków, co znacznie skraca czas obsługi w porównaniu z ręcznymi metodami mikrowirówkowych.

Ekstrakcja DNA metodą kolumnową o średniej przepustowości z wykorzystaniem racków 24-dołkowych

Poznaj metodę pobierania pełnej grubości skóry autologicznej z minimalnym uszczerbkiem miejsca pobrania. Technika ta umożliwia wysokowydajne zbieranie mikrokolumn tkankowych do badań nad regeneracją skóry.

Aparatura do pobierania mikrokolumn tkankowych

Przeglądaj więcej filmów