Name: Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Dowiedz się oceniać synergizm między przeciwciałem przeciwnowotworowym a lekami przeciwnowotworowymi w modelach przedklinicznych przy użyciu równania indeksu kombinacji Chou-Talalay. Ta metoda pozwala ilościowo określić interakcje lekowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant support: Fondation de Projet de L'Université de Nantes, les Bagouz' à Manon, La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique, comité du Morbihan, and comité de Vendée, une rose pour S.A.R.A.H, L'Etoile de Martin and la Société Française de Lutte contre les Cancers et les leucémies de L'Enfant et de de L'adolescent (SFCE). M.B. i J.F. są wspierani przez La Ligue Contre Le Cancer. Autorzy dziękują UTE-obiektowi Structure Fédérative de Recherche François Bonamy. Autorzy dziękują również dr S. Suzin (Inserm, Paryż) za dostarczenie komórek IMR5 oraz pani H. Estéphan za pomoc techniczną.

Hodowla zwierząt i procedura eksperymentalna zostały zatwierdzone przez rząd francuski (umowy #C44-278 i #APAFIS 03479.01). Opieka nad zwierzętami i procedury zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE i francuską ustawą #2013-118 o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.
1. Ocena interakcji między mAb 8B6 a topotekanem in vitro
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki w 96 dołkach 
	UWAGA: Skonsultuj się z komisją ds. zdrowia i bezpieczeństwa instytucji i postępuj zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa laboratoryjnego. Review informacje z karty charakterystyki substancji niebezpiecznej przed rozpoczęciem pracy z jakimikolwiek pożywkami, liniami komórkowymi lub odczynnikami. Używaj odpowiedniej sterylnej techniki i pracuj w okapie z przepływem laminarnym. Wszystkie roztwory/urządzenia używane do manipulowania komórkami muszą być sterylne. 
	UWAGA: Poniższy protokół został opracowany do użytku z komórkami przylegającymi. Wymagane są modyfikacje w celu zastosowania metody do nieprzylegających komórek rosnących w zawiesinie; W tym protokole stosuje się poczwórne duplikaty dla każdego warunku eksperymentalnego.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki IMR5 w kolbie T75.</li>
		<li>Pierwszego dnia (dzień 0) obserwuj hodowlę komórkową pod mikroskopem, aby sprawdzić zbieżność komórek. Odessać pożywkę komórkową z kolby, przemyć ją 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodać 3 ml 0,05% roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)/PBS. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze na 3 minuty (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>Zbadaj kulturę komórkową pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek. 
		UWAGA: W razie potrzeby umieść kolbę z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 3 do 5 minut, w zależności od typu komórki nowotworowej.</li>
		<li>Dodać 10 ml kompletnej pożywki komórkowej do kolby i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 300 x g. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym pożywce wzrostowej. Dostosuj objętość podłoża, aby uzyskać końcowe stężenie 1 x 105 komórek/ml.</li>
		<li>Wysiewaj 84 dołki z 96-dołkowej płytki hodowlanej z 104 komórkami każda, co daje 100 μl zawiesiny komórek. Postępuj zgodnie z eksperymentalnym układem pokazanym w Rysunek 2.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 18 godzin w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu leku 
	UWAGA: W przypadku badań uczulenia na lek/mAb należy zmodyfikować czas, czas trwania i stężenie leczenia, aby dopasować je do konkretnego leku/mAb, o którym mowa. Należy pamiętać, że stężenie początkowe jest 3x większe niż stężenie końcowe.
	<ol>
		<li>Następnego ranka (dzień 1) przygotuj następujące roztwory leków, używając kompletnej pożywki wzrostowej.
		<ol>
			<li>Przygotowanie roztworu mAb
			<ol>
				<li>Rozcieńczyć mAb w 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej w celu uzyskania roztworu roboczego przeciwciała o stężeniu mAb 240 μg/ml.</li>
				<li>Wykonaj pięć podwójnych seryjnych rozcieńczeń, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotowanie roztworu topotekanu
			<ol>
				<li>Rozcieńczyć lek jak wyżej, w 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej, aby otrzymać roztwór roboczy leku o końcowym stężeniu 120 nM.</li>
				<li>Wykonaj pięć podwójnych seryjnych rozcieńczeń, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Przygotowanie przeciwciał i roztworów leków
			<ol>
				<li>Rozcieńczyć lek i roztwory mAb w 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej, aby otrzymać roztwór o stężeniu 120 nM leku i 240 μg/ml mAb (roztworu roboczego).</li>
				<li>Wykonaj pięć podwójnych seryjnych rozcieńczeń, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby uzyskać końcowe stężenie, przenieś 50 μl każdego roztworu leku do odpowiednich studzienek, jak wskazano w układzie eksperymentalnym ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). 
		UWAGA: Przenieś 50 μl kompletnej pożywki wzrostowej do nietraktowanych dołków komórkowych, jak wskazano w <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2.</li>
		<li>Inkubować komórki przez 72 godziny w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test MTT
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl roztworu odczynnika MTT do każdego dołka.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu do lizy (10% SDS w 0,01 M HCl) do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej i dokładnie wymieszać pipetując.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w wilgotnej komorze (95% wilgotności).</li>
		<li>Odczytać absorbancję przy 570 nm (A570) i 620 nm (A620) za pomocą spektrofotometru. 
		UWAGA: Ponownie wymieszać każdą próbkę przez pipetowanie przed odczytaniem absorbancji; Absorbancja przy 620 nm pozwala na korekcję niespecyficznych wartości tła.</li>
		<li>Obliczyć skorygowaną absorbancję: skorygowana absorbancja = A570- A620.</li>
		<li>Obliczyć żywotność komórek w następujący sposób: żywotność komórek = 100 x (średnia skorygowana absorbancja próbki / kontrolna średnia skorygowana absorbancja).</li>
		<li>Obliczyć wartości wpływające na frakcję (Fa), stosując następujące równanie: 1 - (średnia skorygowana absorbancja próbki / kontrolna średnia skorygowana absorbancja).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oprogramowanie do symulacji analitycznej interakcji leków do badań pojedynczych i skojarzonych
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie symulacyjne, aby otworzyć okno startowe.</li>
		<li>Kliknij przycisk Nowy eksperyment, aby otworzyć okno główne.</li>
		<li>Wpisz nazwę eksperymentu w oknie Nazwa. 
		UWAGA: Datę można dodać w oknie Data.</li>
		<li>Kliknij przycisk Nowy pojedynczy lek.</li>
		<li>Wpisz imię i nazwisko w oknie Imię i nazwisko.</li>
		<li>Wpisz skrót w oknie Skrót.</li>
		<li>Wpisz jednostkę stężenia leku w oknie Jednostki.</li>
		<li>Wprowadź wartość dawki i Fa w punkcie danych 1, naciśnij Enter.</li>
		<li>Powtarzaj ten krok, aż zostaną wprowadzone wszystkie punkty danych.</li>
		<li>Kliknij przycisk Gotowe.</li>
		<li>Wykonaj te same czynności, aby wprowadzić mAb Data Points. 
		UWAGA: Użyj tej samej jednostki stężenia, która jest używana przez lek.</li>
		<li>Kliknij przycisk New Drug Combo (Nowa kombinacja leków).</li>
		<li>Wybierz Lek i mAb.</li>
		<li>Wybierz Stały stosunek i kliknij OK.</li>
		<li>Wpisz imię i nazwisko w oknie Imię i nazwisko.</li>
		<li>Wpisz skrót w oknie Skrót.</li>
		<li>Wpisz stosunek leku/mAb w polu Stosunek okna.</li>
		<li>Wprowadź punkt danych 1 Dawka i naciśnij Enter. 
		UWAGA: Program automatycznie obliczy dawki mAb i Combo.</li>
		<li>Wprowadź wartość punktu danych 1 Fa i naciśnij Enter.</li>
		<li>Powtarzaj ten krok, aż zostaną wprowadzone wszystkie punkty danych.</li>
		<li>Kliknij przycisk Gotowe, a następnie kliknij przycisk Generuj raport.</li>
		<li>Wybierz lek i mAb, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Wybierz opcję Combo, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Wybierz pozycję Nagłówek, Tabela ciągłej integracji i Tabela podsumowania. Następnie kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Wpisz nazwę pliku analizy i kliknij przycisk ZAPISZ, aby wygenerować raport. 
		UWAGA: Po kliknięciu przycisku OK raport zostanie automatycznie otwarty w domyślnej przeglądarce internetowej komputera.</li>
		<li>Aby wydrukować raport, wybierz opcję Drukuj z menu plików przeglądarki internetowej. Raport zawiera sekcję tabeli podsumowującej, która zawiera tytuł, datę, nazwę pliku, notatkę opisową, parametry (m, Dm i r), ED50 dla każdego leku stosowanego w monoterapii lub w skojarzeniu oraz tabelę CI dla każdej kombinacji w ED50, ED75, ED90 i ED95. 
		UWAGA: Wartość CI <1 oznacza synergizm, wartość CI =1 oznacza addytywność, a wartość CI >1 oznacza antagonizm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generacja ludzkich ksenoprzeszczepów nerwiaka zarodkowego u nieotyłych myszy gamma z cukrzycą NOD (myszy NSG)
UWAGA: Wyklucz wszelkie zanieczyszczenia kultury komórkowej. Ponieważ matryca błony podstawnej tworzy żel o temperaturze powyżej 5 °C, wszystkie kultury lub podłoża mające kontakt z odczynnikiem do matrycy błony podstawnej powinny być wstępnie schłodzone/lodowate. Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie podczas całego procesu.
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórek IMR5
	<ol>
		<li>Przed użyciem rozmrozić odczynnik do matrycy błony podstawnej przez noc, zanurzając fiolkę w lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W dniu 0 zbierz wyhodowane komórki IMR5, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant. Umyj komórki 2x 15 ml lodowatego PBS i przygotuj zawiesinę komórek 5 x 107 komórek/ml w lodowatym PBS. 
		UWAGA: W razie potrzeby przenieś zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Zakręcić fiolkę z matrycą błony podstawnej. 
		UWAGA: Odczynnik matrycy błony podstawnej należy rozmrozić i zdyspergować.</li>
		<li>Dodać jedną objętość odczynnika do macierzy błony podstawnej i wymieszać ją pipetując, aby uzyskać zawiesinę komórek o wymiarach 2,5 x 107 komórek/ml.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie myszy 
	UWAGA: Myszy powinny mieć od sześciu do siedmiu tygodni.
	<ol>
		<li>Utrzymuj myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów.</li>
		<li>Odczekaj trzy- do pięciu dni okres aklimatyzacji po przybyciu myszy.</li>
		<li>W dniu inokulacji należy ogolić bok, w którym zostanie wykonane wstrzyknięcie (patrz krok 2.3.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie iniekcji do komórek nowotworowych 
	UWAGA: Utrzymuj lodowate zawiesinę komórek macierzy błony podstawnej w aseptyki przez cały czas trwania zabiegu.
	<ol>
		<li>Wymieszać komórki i ostrożnie pobrać zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 21 G.</li>
		<li>Sprawdzić, czy w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar inokulacji myszy roztworem antyseptycznym.</li>
		<li>Delikatnie ścisnąć skórę myszy na boku między palcami, w miejscu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Wbić igłę dokładnie w fałd skórny. Nie należy umieszczać igły głęboko w tkance, aby zapewnić wstrzyknięcie podskórne.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl zawiesiny komórek IMR5 (tj. 2,5 x 106 komórek) podskórnie w dolną prawą flankę myszy.</li>
		<li>Obrócić strzykawkę, aby zapobiec wyciekowi i wyjąć igłę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie zmian masy ciała i wzrostu guza
	<ol>
		<li>Zmierz długość (A) i szerokość (B) guza za pomocą suwmiarki.</li>
		<li>Oblicz objętość guza za pomocą wzoru (A x B2) x 0,5.</li>
		<li>Rozpocznij terapię, gdy guzy osiągną średnią objętość ~50 - 60 mm3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Podawanie leków i przeciwciał u myszy
<ol>
	<li>Dożylne podawanie mAb 8B6
	<ol>
		<li>Ostrożnie napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 25 G roztworem mAb.</li>
		<li>Umieść mysz pod lampą grzewczą na 10 minut, aby rozszerzyć żyłę ogonową.</li>
		<li>Unieruchomić mysz w unieruchomieniu gryzoni.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar inokulacji myszy roztworem antyseptycznym.</li>
		<li>Wprowadzić igłę równolegle do żyły ogonowej, wnikając 2 - 4 mm w światło, trzymając skos igły skierowany do góry (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
		<li>Wstrzyknąć dożylnie 100 μl roztworu przeciwciał (dożylnie).</li>
		<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia należy delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec krwawieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dootrzewnowe podawanie topotekanu
	<ol>
		<li>Pobrać roztwór leku do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o pojemności 25 g.</li>
		<li>Trzymaj mysz w pozycji leżącej, z jej tylnym końcem lekko uniesionym.</li>
		<li>Zdezynfekuj obszar inokulacji myszy roztworem antyseptycznym.</li>
		<li>Zlokalizuj linię środkową brzucha myszy i mentalnie podziel brzuch na ćwiartki. Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia w prawym lub lewym dolnym kwadrancie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Wbić igłę do brzucha (na głębokość 5 mm) pod kątem ~10°, w prawej lub lewej dolnej ćwiartce.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl roztworu leku dootrzewnowo (i.p.).</li>
		<li>Zdezynfekować miejsce inokulacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+basis%2C+experimental+design%2C+and+computerized+simulation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.</a> Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).</li>
<li>Bayat Mokhtari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+in+combating+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Combination therapy in combating cancer.</a> Oncotarget. 8 (23), 38022-38043 (2017).</li>
<li>Zahreddine, H., Borden, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+insights+into+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and insights into drug resistance in cancer.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 28(2013).</li>
<li>Martin, T. P., Baguley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re%3A+%22Postoperative+validation+of+bone-anchored+implants+in+the+single-sided+deafness+population.%22+Snapp+et+al.+Otol+Neurotol+2012%3A+33%3B291-6%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Re: "Postoperative validation of bone-anchored implants in the single-sided deafness population." Snapp et al. Otol Neurotol 2012: 33;291-6.</a> Otol Neurotol. 34 (4), 777-778 (2013).</li>
<li>Choi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+lung+cancer+cells+by+altered+dimerization+of+HSP27%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sensitization of lung cancer cells by altered dimerization of HSP27.</a> Oncotarget. 8 (62), 105372-105382 (2017).</li>
<li>Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies%3A+versatile+platforms+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 317-327 (2010).</li>
<li>Mellor, J. D., Brown, M. P., Irving, H. R., Zalcberg, J. R., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+the+role+of+Fc+gamma+receptor+polymorphisms+in+the+response+to+monoclonal+antibodies+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">A critical review of the role of Fc gamma receptor polymorphisms in the response to monoclonal antibodies in cancer.</a> Journal of Hematology & Oncology. 6, 1(2013).</li>
<li>Kowalczyk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GD2-specific+14G2a+monoclonal+antibody+induces+apoptosis+and+enhances+cytotoxicity+of+chemotherapeutic+drugs+in+IMR-32+human+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells.</a> Cancer Letters. 281 (2), 171-182 (2009).</li>
<li>Retter, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+proapoptotic+antiganglioside+GM2+monoclonal+antibody+and+evaluation+of+its+therapeutic+effect+on+melanoma+and+small+cell+lung+carcinoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a proapoptotic antiganglioside GM2 monoclonal antibody and evaluation of its therapeutic effect on melanoma and small cell lung carcinoma xenografts.</a> Cancer Research. 65 (14), 6425-6434 (2005).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induction+of+human+lung+cancer+cell+line+in+multicellular+heterospheroids+with+humanized+antiganglioside+GM2+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induction of human lung cancer cell line in multicellular heterospheroids with humanized antiganglioside GM2 monoclonal antibody.</a> Cancer Research. 59 (20), 5323-5330 (1999).</li>
<li>Cochonneau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+induced+by+O-acetyl-GD2-specific+monoclonal+antibody+8B6+inhibits+tumor+growth+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis induced by O-acetyl-GD2-specific monoclonal antibody 8B6 inhibits tumor growth in vitro and in vivo.</a> Cancer Letters. 333 (2), 194-204 (2013).</li>
<li>Chou, T. C., Martin, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChou%2C+TC+%22CompuSyn+for+drug+combinations%3A+PC+software+and+user%E2%80%99s+guide%3A+a+computer+program+for+quantitation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combinations%2C+and+the+determination+of+IC50+and+ED50+and+LD50+values%22">CompuSyn for drug combinations: PC software and user’s guide: a computer program for quantitation of synergism and antagonism in drug combinations, and the determination of IC50 and ED50 and LD50 values</a>. , ComboSyn Inc. Paramus, NJ. (2005).</li>
<li>Alvarez-Rueda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+to+O-acetyl-GD2+ganglioside+and+not+to+GD2+shows+potent+anti-tumor+activity+without+peripheral+nervous+system+cross-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody to O-acetyl-GD2 ganglioside and not to GD2 shows potent anti-tumor activity without peripheral nervous system cross-reactivity.</a> PLoS One. 6 (9), e25220(2011).</li>
<li>Faraj, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+chemotherapy+can+be+augmented+by+immunotargeting+O-acetyl-GD2+tumor-associated+ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma chemotherapy can be augmented by immunotargeting O-acetyl-GD2 tumor-associated ganglioside.</a> Oncoimmunology. 7 (1), e1373232(2017).</li>
<li>Ishikawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+functional+human+blood+and+immune+systems+in+NOD%2FSCID%2FIL2+receptor+%7Bgamma%7D+chain%28null%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice.</a> Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).</li>
<li>Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+condition+scoring%3A+a+rapid+and+accurate+method+for+assessing+health+status+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice.</a> Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).</li>
<li>Teicher, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+in+vitro+and+in+vivo+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assays for in vitro and in vivo synergy.</a> Methods in Molecular Medicine. 85, 297-321 (2003).</li>
<li>White, D. B., Slocum, H. K., Brun, Y., Wrzosek, C., Greco, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+nonlinear+mixture+response+surface+paradigm+for+the+study+of+synergism%3A+a+three+drug+example%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A new nonlinear mixture response surface paradigm for the study of synergism: a three drug example.</a> Current Drug Metabolism. 4 (5), 399-409 (2003).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Huyck, L., Ampe, C., Van Troys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+XTT+cell+proliferation+assay+applied+to+cell+layers+embedded+in+three-dimensional+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">The XTT cell proliferation assay applied to cell layers embedded in three-dimensional matrix.</a> Assay and Drug Development Technologies. 10 (4), 382-392 (2012).</li>
<li>Thompson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+topotecan+in+combination+with+vincristine+for+treatment+of+pediatric+solid+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Synergy of topotecan in combination with vincristine for treatment of pediatric solid tumor xenografts.</a> Clinical Cancer Research. 5 (11), 3617-3631 (1999).</li>
<li>Tan, M., Fang, H. B., Tian, G. L., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+design+and+sample+size+determination+for+testing+synergism+in+drug+combination+studies+based+on+uniform+measures%5BTitle%5D)+AND+%22Statistic+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental design and sample size determination for testing synergism in drug combination studies based on uniform measures.</a> Statistic in Medicine. 22 (13), 2091-2100 (2003).</li>
<li>Tang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+EPHB6%2C+EFNB2%2C+and+EFNB3+expressions+in+human+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Implications of EPHB6, EFNB2, and EFNB3 expressions in human neuroblastoma.</a> Proceding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10936-10941 (2000).</li>
<li>Mehta, R. R., Graves, J. M., Hart, G. D., Shilkaitis, A., Das Gupta, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+metastasis+of+human+breast+carcinomas+with+Matrigel+in+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Growth and metastasis of human breast carcinomas with Matrigel in athymic mice.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 25 (1), 65-71 (1993).</li>
<li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67 (6), 816-820 (1996).</li>
<li>Feng, C., Tang, S., Wang, J., Liu, Y., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topotecan+plus+cyclophosphamide+as+maintenance+chemotherapy+for+children+with+high-risk+neuroblastoma+in+complete+remission%3A+short-term+curative+effects+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Topotecan plus cyclophosphamide as maintenance chemotherapy for children with high-risk neuroblastoma in complete remission: short-term curative effects and toxicity.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 33 (8), 1107-1110 (2013).</li>
<li>Cheung, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside+GD2+specific+monoclonal+antibody+3F8%3A+a+phase+I+study+in+patients+with+neuroblastoma+and+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clininical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ganglioside GD2 specific monoclonal antibody 3F8: a phase I study in patients with neuroblastoma and malignant melanoma.</a> Journal of Clininical Oncology. 5 (9), 1430-1440 (1987).</li>
<li>Nair, A. B., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Clinical+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">A simple practice guide for dose conversion between animals and human.</a> Journal of Basic Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li>
<li>Dayde, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+burden+influences+exposure+and+response+to+rituximab%3A+pharmacokinetic-pharmacodynamic+modeling+using+a+syngeneic+bioluminescent+murine+model+expressing+human+CD20%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tumor burden influences exposure and response to rituximab: pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human CD20.</a> Blood. 113 (16), 3765-3772 (2009).</li>
<li>Racki, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD-scid+IL2rgamma%28null%29+mouse+model+of+human+skin+transplantation+and+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection.</a> Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).</li>
<li>Sherif, A., Winerdal, M., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Responses+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Muscle+Invasive+Bladder+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bladder+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune Responses to Neoadjuvant Chemotherapy in Muscle Invasive Bladder Cancer.</a> Bladder Cancer. 4 (1), 1-7 (2018).</li>
</ol>

S.Fa., J.F. i S.B. są wyznaczeni jako wynalazcy oczekujących patentów obejmujących kliniczne zastosowanie przeciwciał terapeutycznych anty-O-acetylo-GD2.

Aby przewidzieć wpływ interakcji między lekami, można zastosować trzy metody: metodologię izobogromu17, nieliniowy model mieszaniny18 oraz indeks kombinacji1. Kombinowana analiza indeksowa jest najczęściej stosowana, ponieważ jej zastosowanie jest uproszczone dzięki dostępności przyjaznego dla użytkownika programu komputerowego. W tym celu najpierw scharakteryzowaliśmy odpowiedź dawka-skutek każdego środka stosowanego samodzielnie lub w połączeniu, w...

Konwencjonalne podejście w leczeniu wielu różnych typów nowotworów opierało się na monoterapii. Choć metoda ta jest wciąż stosowana w wielu przypadkach, napotkała ona szereg przeszkód, co doprowadziło do wyboru terapii skojarzonych2. W szczególności komórki nowotworowe są bardziej podatne na rozwój oporności podczas leczenia pojedynczym lekiem poprzez indukcję alternatywnych mechanizmów przetrwania3, co prowadzi do niepowodzenia terapeutycznego u pacjentów4. Ponadto w monoterapii leki są zazwyczaj podawane w wysokich dawkach. Sytuacja ta często skutkuje wystąpieniem silnych, zależnych od dawki działań niepożądanych, które mogą być nie do zniesienia i zmuszać lekarzy do przerwania leczenia2. Z tych powodów obecnie preferuje się łączenie cząsteczek przeciwnowotworowych nad monoterapią.
Idealne kombinacje leków to takie, które działają synergistycznie przeciwko komórkom nowotworowym, nie zwiększając jednocześnie toksyczności wobec komórek prawidłowych. Synergizm odnosi się do oddziaływania dwóch lub więcej leków, które wywołuje efekt terapeutyczny większy niż suma efektów każdego z leków działających osobno. Takie interakcje mogą prowadzić do zwiększenia klinicznej skuteczności terapeutycznej2. Ograniczają one oporność na leczenie, zwiększają skuteczność i mogą również zmniejszać toksyczność2. W rzeczywistości dawka każdego leku może zostać zmniejszona w celu zredukowania działań niepożądanych poprzez celowanie w różne szlaki sygnałowe. Ponadto jedna z cząsteczek może pełnić rolę czynnika uwrażliwiającego komórki nowotworowe. Działanie drugiego leku może zostać wzmocnione w komórkach uwrażliwionych, co pozwala na zastosowanie mniejszych dawek5.
Terapia skojarzona może obejmować dwa lub więcej leków chemioterapeutycznych i/lub leków biologicznych, takich jak przeciwciała monoklonalne6. Przeciwciała te specyficznie celują w komórki wykazujące ekspresję interesującego antygenu powierzchniowego i są zdolne do niszczenia komórek nowotworowych poprzez szlaki immunologiczne, w tym cytotoksyczność zależną od przeciwciał (ADCC), z udziałem efektorowych komórek układu odpornościowego7, oraz cytotoksyczność zależną od dopełniacza (CDC)6. Mogą one również działać via nieimmunologiczny mechanizm zapśredniczony przez apoptozę8,9,10,11. W takim przypadku indukcja procesu programowanej śmierci komórki może uwrażliwić komórki nowotworowe, osłabić ich funkcje i sprawić, że towarzyszący lek chemioterapeutyczny będzie bardziej skuteczny przy niższej dawce. W związku z tym proapoptotyczne przeciwciała monoklonalne są dobrymi kandydatami do projektowania schematów skojarzonych z lekami przeciwnowotworowymi.
Opisano różne modele matematyczne służące do oceny synergizmu leków; jednym z nich jest metoda indeksu kombinacji1. Metoda ta opiera się na zasadzie efektu medianowego opracowanej przez Chou1. Równanie efektu medianowego koreluje dawkę leku z efektem leku w następujący sposób.
<img alt="Wzór na dyfuzję D=Dm[Fa/(1-Fa)]^(1/m), badania edukacyjne." src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">
Tutaj D to dawka leku; Dm to dawka efektu medianowego; Fa to frakcja poddana działaniu dawki; m to wykładnik określający kształt wykresu zależność dawka-efekt1. Dawka efektu medianowego jest wykorzystywana do obliczenia dawki Dx leku, która hamuje lub zabija „x” procent komórek. Następnie oblicza się wartość CI, aby ocenić efekt addytywny kombinacji leków, w następujący sposób1.
<img alt="Równanie CI dla analizy interakcji leków; wykorzystuje wzór CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2." src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
Wartość CI równa 1 wskazuje na efekt addytywny, wartość CI &lt;1 wskazuje na efekt synergistyczny, natomiast wartość CI &gt;1 wskazuje na antagonizm1. Zastosowanie tej metody jest dodatkowo ułatwione dzięki dostępności programu komputerowego CompuSyn, który automatycznie określa synergizm i antagonizm dla wszystkich symulowanych dawek lub poziomów efektu12.
Nasz zespół opracował przeciwciało monoklonalne (mAb) 8B6 specyficzne dla antygenu neuroblastoma gangliozydy O-acetyl-GD2 (OAcGD2)13, a następnie wykazał, że mAb to jest w stanie indukować śmierć komórek o charakterze apoptozy11. Aby zbadać, czy mAb 8B6 może uwrażliwić komórki neuroblastoma na środek przeciwnowotworowy topotekan, zaadaptowaliśmy wspomnianą wyżej metodę opracowaną przez Chou1. Najpierw wyznaczamy wartości dawki efektywnej 50 (ED50) dla mAb 8B6 oraz topotekanu. Następnie komórki neuroblastoma poddaje się działaniu obu związków w stosunkach ekwiwalentnych w oparciu o wartości ED50, aby wyznaczyć wartości CI przy użyciu wspomnianego wcześniej oprogramowania symulacyjnego. Metoda ta pozwala nam wykazać synergizm między mAb 8B6 a topotekanem in vitro. W dalszej części opisujemy protokół służący do dalszej oceny skuteczności i bezpieczeństwa tego schematu skojarzonego in vivo. Protokół ten można z łatwością zastosować w celu wyboru skutecznych i bezpiecznych kombinacji przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych i środków chemioterapeutycznych w badaniach przedklinicznych. Schematyczna prezentacja tego badania została przedstawiona na Rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek (MTT)</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CompuSyn</td><td>Combosyn</td><td></td><td>można pobrać bezpłatnie ze strony http://www.combosyn.com</td></tr><tr><td>Golarka elektryczna</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>10% inaktywowana termicznie surowica cielęca płodu w RPMI 1640</td></tr><tr><td>Firefox&nbsp;</td><td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox można pobrać za darmo ze strony http://www.mozilla.org/en-US/firefox/</td></tr> <tr><td>Heat lamp</td><td>Verre& Kwarc</td><td>4003/1R</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego IMR-5</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5 jest klonem ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego IMR32 5459762. Komórki IMR-5 zostały hojnie dostarczone przez Dr. Santos Susin (U.872, Paryż, Francja)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>2 mM w roztworze do lizy RPMI 1640</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>University of Nantes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>Igła 21G 1 & frac12; &nbsp;</td>Igła <td>do 304432</td><td></td> <td>BD Microlance</td></tr><tr><td>25G 1</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>Myszy NSG</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-dołkowe mikropłytki</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 0,05% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>PC, który działa Windows 7</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Windows 7 można kupić pod adresem http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w RPMI 1640</td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>Odstraszacz gryzoni</td><td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Topotecan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Wzmocnienie wrogich przeciwciał monoklonalnych (mAb) przez chemioterapeutyki stanowi cenną strategię projektowania skutecznej i bezpieczniejszej terapii przeciwko rakowi. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji racjonalnej kombinacji na etapie przedklinicznym. Po pierwsze, opisujemy test oparty na komórkach w celu oceny synergii między przeciwnowotworowym mAb a lekami cytotoksycznymi, który wykorzystuje równanie indeksu kombinacji Chou i Talalay1. Obejmuje to pomiar wrażliwości komórek nowotworowych na leki i przeciwciała za pomocą testu MTT, a następnie zautomatyzowaną analizę komputerową w celu obliczenia wartości indeksu kombinacji (CI). Wartości CI wynoszące <1 wskazują na synergizm między badanymi mAb a czynnikami cytotoksycznymi1. Aby potwierdzić wyniki badań in vitro in vivo, opisujemy metodę oceny skuteczności schematu skojarzonego w modelu guza ksenoprzeszczepu. W tym modelu skojarzony schemat znacznie opóźnia wzrost guza, co skutkuje znacznym wydłużeniem przeżycia w porównaniu z kontrolami z pojedynczym środkiem. Co ważne, eksperymenty in vivo wykazały, że schemat skojarzony jest dobrze tolerowany. Protokół ten umożliwia skuteczną ocenę kombinacji leków przeciwnowotworowych w modelach przedklinicznych oraz identyfikację racjonalnej kombinacji do oceny w badaniach klinicznych.

Reprezentatywne wyniki i rysunki zostały zaadaptowane za zgodą z wcześniej opublikowaną pracą14.
Przeciwciało monoklonalne Anti-OAcGD2 mAb 8B6 synergistycznie nasila hamujący wpływ topotekanu na wzrost linii komórkowej neuroblastoma:
Aby ustalić stężenia leku i przeciwciała do oceny synergizmu między topotekanem a mAb 8B6, w pie...

Ten protokół opisuje, jak ocenić synergizm między przeciwciałem przeciwnowotworowym a lekami przeciwnowotworowymi w modelach przedklinicznych za pomocą równania indeksu kombinacji Chou i Talalay.

Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Immunoterapia w połączeniu z chemioterapią stanowi innowacyjne podejście do opracowania skutecznej terapii nowotworów. Głównym celem jest osiągnięcie synergicznych efektów terapeutycznych, zmniejszenie dawki i toksyczności oraz zminimalizowanie lub opóźnienie indukcji oporności na leki. Jednak ze względów praktycznych i etycznych nie jest możliwe określenie synergizmu u pacjentów. W związku z tym przed bezpośrednim skojarzonym badaniem klinicznym należy przeprowadzić badania skojarzone z prenikaptorem, in vitro lub na zwierzętach, aby uzyskać uzasadnienie dla badań klinicznych. Prosta, solidna metoda ilościowego oznaczania synergii między lekami opiera się na równaniu indeksu kombinacji opracowanym przez Shouana Talale'a, jak pokazano w tym filmie. Korzystając z tej metody i jej komputerowej symulacji, udowadniamy tutaj synergizm między przeciwciałem monoklonalnym 8B6, które jest specyficzne dla antygenu nerwiaka zarodkowego gangliozydu O-acetyl-GD2 i lekiem chemioterapeutycznym Topotekan na komórkach nerwiaka zarodkowego. Krótko mówiąc, po określeniu wartości dawki skutecznej 50 każdego związku w ludzkiej linii komórkowej IMO, 5 nerwiaka zarodkowego, komórki te zaintubowano z równymi proporcjami dwóch związków, a wartości indeksu kombinacji obliczono za pomocą zautomatyzowanej symulacji komputerowej. Następnie potwierdziliśmy te wyniki in Vivo, w IMO, modelu ksenograficznym 5 guzów. Wyhodowaliśmy komórki IMR-5 w kolbie T75, obserwowaliśmy je pod mikroskopem, aby sprawdzić konfluencję komórek. Pożywkę z komórek asperacji z kolby przemyć 5 ml PBS. Dodać 3 ml 0,05% roztworu EDTA/PBS. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze na 3 minuty. Zbadaj hodowlę komórkową pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek. Dodać 10 ml kompletnej pożywki komórkowej do kolby i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez pięć minut przy 300 g. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Ponownie zawieś komórki w kompletnym pożywce wzrostowej. Dostosuj objętość pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 100 000 komórek / ml. Wysiej 84 dołki, 96-dołkową płytkę hodowlaną z 10 000 komórek każda, co daje 100 mikrolitrów zawiesiny komórek. Inkubować komórki przez 18 godzin w inkubatorze komórek. Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne w 500 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej, aby otrzymać roztwór roboczy przeciwciała o stężeniu przeciwciała monoklonalnego 240 mikrogramów na ml. Wykonać 5 podwójnych urojeń seryjnych, jak wskazano w protokole. Rozcieńczyć lek w 500 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej, aby uzyskać roztwór roboczy leku o końcowym stężeniu 120 nanomolowych. Wykonaj 5, dwukrotne urojenia szeregowe, jak wskazano w protokole. Rozcieńczyć w ten sam sposób, w jaki lek plus roztwory aniciał monoklonalnych. Aby uzyskać końcowe stężenie, przenieś 50 mikrolitrów każdego roztworu leku do odpowiednich studzienek, jak pokazano na tym schemacie eksperymentalnym. Inkubować komórki przez 72 godziny w inkubatorze. Dodaj 10 mikrolitrów roztworu odczynnika MTT do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 4 godziny. Dodać 100 mikrolitrów roztworu lycyny do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 4 godziny w wilgotnej komorze. Usuń absorbenty o długości fali 570 i 620 nanometrów za pomocą spektrofotometru. Oblicz żywotność komórki w następujący sposób. Oblicz wartości ułamków, na które ma wpływ, korzystając z poniższego równania. Uruchom oprogramowanie symulacyjne, kliknij przycisk nowego eksperymentu, aby wyświetlić okno główne. Wpisz nazwę eksperymentu. Kliknij nowy pojedynczy lek. Wpisz nazwę. Wpisz skrót. Wpisz jednostkę stężenia leku. Wprowadź dane 1 dawki i wartości FA. Naciśnij Enter.Powtarzaj ten krok, aż zostaną wprowadzone wszystkie punkty danych. Kliknij przycisk Zakończono.Wykonaj te same kroki, aby wprowadzić punkty danych przeciwciał monoklonalnych. Kliknij opcję New Drug Combo.Select drug (Kombinacja leków) i przeciwciał monoklonalnych. Wybierz opcję Stały stosunek.Kliknij przycisk OK. Wpisz nazwę. Wpisz skrót. Wpisz stosunek przeciwciał monoklonalnych leku. Wprowadź dane 1 dawka. Naciśnij Enter.Program automatycznie obliczy dawki przeciwciała monoklonalnego 8B6 i combo. Wprowadź wartość 1 FA dla danych. Naciśnij Enter.Powtarzaj ten krok, aż zostaną wprowadzone wszystkie punkty danych. Kliknij przycisk Zakończono.Następnie kliknij przycisk Generuj raport.Wybierz lek i przeciwciało monoklonalne, a następnie kliknij przycisk OK. Wybierz opcję Kombinacja, a następnie kliknij przycisk OK. Wybierz opcję Nagłówek, Tabela CI i Tabela podsumowania, a następnie kliknij przycisk OK. Wpisz nazwę pliku i analizę, a następnie kliknij przycisk Zapisz, aby wygenerować raport. Raport zostanie automatycznie otwarty w domyślnej przeglądarce internetowej. Raport zawiera sekcję tabeli podsumowującej, która zawiera tytuł, datę, ostateczną nazwę, notę opisową, parametry m, Dm i r, skuteczną dawkę 50 dla każdego leku stosowanego w monoterapii lub w skojarzeniu oraz tabelę indeksu skojarzonego dla każdej kombinacji przy skutecznej dawce 50, 75, 90 i 95. Wartość indeksu kombinacji mniejsza niż 1 wskazuje na synergizm. Wartość równa jeden oznacza addytywność. Wartość większa niż 1 wskazuje na antagonizm. Rozmrozić matrycę błony podstawnej przez noc, zanurzając fiolkę w lodzie w lodówce o temperaturze 4 stopni C przed użyciem. Wszystkie posiewy, zużycie lub media mające kontakt z metryką membrany podstawnej powinny być wstępnie schłodzone. Zbierz kulturę IMR5. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Umyj komórki dwukrotnie 15 ml lodowatego PBS. Przygotuj zawiesinę komórkową na 5 milionów komórek na ml w lodowatym PBS. Przenieść zawiesinę komórek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Obrotowa fiolka z matrycą z membraną podstawną. Dodać 1 objętość odczynnika macierzy błony podstawnej, wymieszanego przez pipetowanie w celu uzyskania zawiesiny komórek 2,5 miliona komórek na ml. Zawiesinę komórkową należy utrzymywać na lodzie. Ogolić bok miejsca, w którym zostanie wykonane wstrzyknięcie. Wymieszać komórki i ostrożnie pobrać zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o masie 21 g. Sprawdź, czy w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Zdezynfekuj obszar inokulacji myszy roztworem antyseptycznym. Delikatnie ścisnąć skórę myszy na boku między palcami w miejscu wstrzyknięcia. Wbić igłę dokładnie w fałd skórny. Nie należy umieszczać igły głęboko w tkance, aby zapewnić wstrzyknięcie podskórne. Wstrzyknąć podskórnie 100 mikrolitrów zawiesiny komórek IMR5. Obrócić strzykawkę, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się płynu i wyjąć igłę. Monitoruj myszy pod kątem masy ciała i wzrostu guza. Zmierz długość i szerokość guza za pomocą kalibru. Oblicz objętość guza za pomocą tego wzoru. Rozpocznij terapię, gdy guzy osiągną średnią objętość od 50 do 60 mm

potentiation-anticancer-antibody-efficacy-antineoplastic-drugs

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Synergiczne kombinacje leków są trudne i czasochłonne do empirycznego zidentyfikowania. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji i walidacji synergicznych małych cząsteczek.

Wysokoprzepustowa identyfikacja synergicznych kombinacji leków metodą Overlap2

W tym protokole opisujemy, jak dokonywać pomiarów interakcji leków opartych na addytywności Loewego dla par i trójdrożnych kombinacji leków.

Metoda diagonalna do pomiaru synergii między dowolną liczbą leków

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Duże badania genetyczne w organizmach modelowych doprowadziły do identyfikacji negatywnych interakcji genetycznych. W tym miejscu opisujemy proces integracji danych z wykorzystaniem danych z badań genetycznych w organizmach modelowych w celu wyznaczenia kombinacji leków ukierunkowanych na syntetyczne śmiertelne interakcje w raku.

Przepływ pracy integracji danych w celu identyfikacji kombinacji leków ukierunkowanych na syntetyczne interakcje śmiertelne

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół dla testu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał za pośrednictwem komórek (ADCC) przy użyciu zestawu do testów biologicznych ADCC. Metoda ta stanowi cenne narzędzie do wyjaśnienia mechanizmu ADCC i oceny potencjału terapeutycznego przeciwciał w immunoterapii nowotworów.

Ocena zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej w komórkach nowotworowych za pomocą testu biologicznego reporterowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciał komórkowych

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Dowiedz się oceniać synergizm między przeciwciałem przeciwnowotworowym a lekami przeciwnowotworowymi w modelach przedklinicznych przy użyciu równania indeksu kombinacji Chou-Talalay. Ta metoda pozwala ilościowo określić interakcje lekowe.

Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji (Wideo) | JoVE Journal

Zwiększenie skuteczności przeciwciał przeciwnowotworowych przez leki przeciwnowotworowe: wykrywanie synergizmu przeciwciało-lek za pomocą równania indeksu kombinacji

Przeglądaj więcej filmów