Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

Metoda ta umożliwi generowanie trójwymiarowych obrazów histologicznych z małych próbek w skali milimetrowej, w tym małych organizmów modelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że osadzone próbki są bardzo stabilne, co umożliwia przechowywanie próbek przez długi czas i wielokrotne ich obrazowanie, na przykład przy użyciu różnych metod obrazowania na przestrzeni lat. Wyniki tej metody będą bardzo przydatne w wysokoprzepustowych zjawiskach modelowych systemów, toksykologii, a potencjalnie nawet w diagnostyce tkanek ludzkich.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ próbki są stosunkowo małe i trudne do orientacji lub manewrowania. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ należy zwrócić uwagę, aby uniknąć uszkodzenia próbki. W przypadku młodych lub starszych zebry należy je głodzić przez co najmniej 24 godziny, aby zmniejszyć objętość treści jelitowej przed utrwaleniem.

Przenieś 10% neutralny bufor formaliny lub NBF i 2x Tricaine-S wstępnie schłodzony do czterech stopni Celsjusza na lód. Podwój objętość wody dla ryb dzięki schłodzonemu 2x MS-222 do szybkiej i humanitarnej eutanazji. Sześćdziesiąt sekund po tym, jak ryby przestaną się poruszać, po humanitarnej eutanazji, umieść rybę w schłodzonym 10% roztworze NBF w płaskich szklanych fiolkach o temperaturze pokojowej i utrwal je na noc.

Drugiego dnia opłucz utrwalone próbki ryb trzy razy w 1x PBS pH 7,4 przez 10 minut każda. Po umyciu zanurzyć próbki w 35% etanolu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie powtórz ten krok z 50% etanolem.

Próbki inkubować w świeżo przygotowanym 0,3% roztworze kwasu fosfatungsenowego lub PTA przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając w celu ich zabarwienia. Rozpocznij trzeci dzień od przygotowania mieszaniny 100% etanolu i białej żywicy akrylowej LR jeden do jednego, objętość po objętości. Przepłukać próbki trzykrotnie w 70% etanolu przez 10 minut każda, a następnie inkubować próbki w 90% etanolu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie mieszając.

Powtórzyć inkubację w tych samych warunkach, ale 95% etanolu, a następnie jeszcze dwa razy ze 100% etanolem. Na koniec zanurz próbki w mieszaninie etanolu i białej żywicy akrylowej LR jeden do jednego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc z delikatnym mieszaniem. Czwartego dnia wyjmij mieszaninę z fiolki i dodaj 100% białą żywicę LR, aby zanurzyć próbki.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Po dwóch godzinach zastąp żywicę świeżą białą żywicą 100% LR i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Do montażu urządzenia do zatapiania należy użyć rurki polietylenowej MI o średnicy co najmniej 0,1 milimetra większej niż średnica próbki i przyciąć ją do standardowej długości 30 milimetrów.

Następnie przymocuj głowicę mikrorurki P1000 do białego końca adaptera do osadzania i włóż rurkę z poli MI do jej wąskiego końca. Po inkubacji próbek przez godzinę w 100% białej żywicy LR, przenieś je do małej łodzi wagowej i całkowicie zanurz w białej żywicy 100% LR. Skierować rurkę aparatu do osadzania na szeroki koniec utrwalonej próbki lub w stronę głowicy i powoli pipetować próbkę do rurki.

Umieść próbkę na środku rurki, upewniając się, że rurka powyżej i poniżej próbki jest wypełniona żywicą. Zaraz potem, aby uszczelnić otwarty koniec rurki, spłaszcz kawałek miękkiej plasteliny na bazie oleju w arkusz o grubości około jednego milimetra i ustabilizuj rurkę między palcem wskazującym i środkowym. Następnie powoli dociśnij glinę do końca rurki kciukiem i usuń nadmiar gliny.

Wyjmij urządzenie do osadzania z głowicy mikrorury. Wyciągnij rurkę, delikatnie obracając. Przytrzymując palec przy uszczelnionym końcu, aby zapobiec wyrzuceniu gliny, uszczelnij drugi koniec, powoli wciskając nieuszczelniony koniec rurki w glinę.

Umieść rurkę poziomo na stojaku na probówki i pozwól żywicy polimeryzować przez 24 godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza w piekarniku. Pod koniec następnego dnia należy pobrać próbki do pobrania obrazu. Pomyślnie osadzona larwa danio pręgowanego nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Jeśli powietrze zostanie uwięzione podczas procesu zatapiania, może przesunąć się w kierunku próbki, jeśli próbka nie zostanie umieszczona poziomo podczas polimeryzacji, co może pogorszyć jakość obrazu. Protokół ten okazał się skuteczny w osadzaniu różnych organizmów modelowych. Takich jak danio pręgowany, Drosophila, rozwielitki i zarodek myszy.

Udane osadzenie można pokazać za pomocą zrekonstruowanych renderingów 3D, zobrazowanych za pomocą mikrotomografii komputerowej dla danio pręgowanego, rozwielitki i Drosophila. Zatapianie żywicy można zobaczyć we wszystkich skanach poza próbką, ale nie zakłóca ona samej próbki. Okazy te mogą być przechowywane przez dłuższy czas i ponownie wykorzystywane do wielu sesji obrazowania, jak pokazano na przykładzie larw danio pręgowanego sfotografowanych w 2011 roku.

A potem znowu w 2013 roku. Cechy anatomiczne są zachowane po przechowywaniu, co widać na zbliżeniach mięśni z obu skanów. Co więcej, profile intensywności znormalizowane do odpowiadających im średnich wzdłuż linii segmentowych pokazują przestrzennie pasujące lokalne szczyty w obu skanach.

Średnie wartości intensywności dla wybranych regionów w obu skanach zostały podzielone przez średnią dla tła i wykorzystane do wygenerowania stosunku sygnału do szumu, który dobrze korespondował między skanami. Podczas próbowania tej metody ważne jest, aby pracować delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia próbki i pracować ostrożnie, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak histologia lub mikroskopia elektronowa, w celu zbadania wzorców ekspresji białek lub osiągnięcia wyższej rozdzielczości obszarów zainteresowania w 2D.

Mamy nadzieję, że ta publikacja pomoże Państwu uzyskać dostęp do mocy mikrotomografii tkankowej o wysokiej rozdzielczości.