Name: Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metodę sztywnego osadzania małych próbek biologicznych w żywicy akrylowej do mikro-CT. Technika umożliwia długotrwałe przechowywanie i wielokrotne obrazowanie zebrafish, Drosophila i Daphnia bez utraty cech anatomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Rolandowi Myersowi za uprzejme dostarczenie oryginalnych protokołów TEM. Ponadto chcielibyśmy podziękować dr Johnowi Colbourne'owi za dostarczenie próbki Daphnia, dr Santhosh Girirajan za dostarczenie próbki Drosophila oraz dr Fadii Kamal za dostarczenie zarodka myszy. Badacze potwierdzają wsparcie finansowe ze strony NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research oraz z funduszy pilotażowych z PSU Huck Institutes of the Life Sciences i Institute for CyberScience.

Wszystkie procedury na żywych zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Pensylwanii.
1. Dzień 1: Fiksacja
<ol>
	<li>Aby poprawić utrwalenie i zmniejszyć objętość treści jelitowej, młode ryby należy głodzić przez co najmniej 24 godziny w przypadku okazu 10 mm lub dłużej w przypadku większych okazów (np. 72 godziny w przypadku okazu 14 mm).</li>
	<li>Wstępnie schłodzić 10% neutralną buforowaną formalinę (NBF) i 2x Tricaine-S (MS-222, 400 mg/L) na lodzie do 4 °C.</li>
	<li>Podwój objętość wody dla ryb dzięki schłodzonemu 2x MS-222 do szybkiej i humanitarnej eutanazji.</li>
	<li>Odczekaj 30 s (larwy) do 60 s (młode osobniki), po tym jak ryby przestaną się poruszać.</li>
	<li>Zanurz rybę w schłodzonym 10% NBF na 10 minut.</li>
	<li>Umieść rybę w schłodzonym 10% roztworze NBF przez noc w płaskodennych pojemnikach w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Wymagane są pojemniki z płaskim dnem, aby zminimalizować zginanie próbki. Objętość utrwalacza i roztworów we wszystkich kolejnych etapach powinna być co najmniej 20-krotnie większa od objętości próbki, chyba że określono inaczej. W przypadku 1-5 larw danio pręgowanego zalecana objętość roztworu wynosi co najmniej 1 ml. Niewystarczające utrwalenie skutkuje słabym utrwaleniem, a nadmiar objętości odczynnika nie wpływa negatywnie na wynik opisanej procedury. Aby całkowicie utrwalić większe ryby, rozetnij brzuch, zaczynając nieco przed porem odbytu. Używaj minimalnej penetracji nożyczek lub noża i stosuj delikatną siłę z dala od ryby podczas cięcia, aby zminimalizować uszkodzenia narządów wewnętrznych. Protokoły fiksacji zostały opisane przez innych31,32,33.</li>
</ol>
2. Dzień 2: Odwodnienie i barwienie
<ol>
	<li>Przepłukać utrwalone próbki 3 razy w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) o pH 7,4 przez 10 minut.</li>
	<li>Zanurz próbki w 35% alkoholu etylowym (EtOH) na 20 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając. 
	UWAGA: Do wszystkich delikatnych etapów mieszania należy użyć wytrząsarki stołowej i ustawić ją tak, aby uzyskać efekt mieszania, ostrożnie unikając uderzania i ocierania próbki o powierzchnie pojemnika.</li>
	<li>Zanurz próbki w 50% EtOH na 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Rozpuść kwas fosfowolframowy (PTA) w proszku w wodzie, aby przygotować 1% m/v roztwór podstawowy.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1% roztwór podstawowy PTA w stosunku 3:7 w 100% EtOH, aby uzyskać 0,3% roztwór barwiący PTA.</li>
	<li>Próbki należy barwić przez noc w 0,3% roztworze PTA w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
</ol>
3. Dzień 3: Infiltracja
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę 100% EtOH i żywicy akrylowej LR White w proporcji 1:1 i odstawić na bok.</li>
	<li>Płukać 3 razy w 70% EtOH przez 10 min.</li>
	<li>Zanurz próbki w 90% EtOH na 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Zanurz próbki w 95% EtOH na 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Zanurz próbki dwukrotnie w 100% EtOH na 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Zanurz próbki w mieszaninie żywicy akrylowej 1:1 EtOH i LR White na noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
</ol>
4. Dzień 4: Osadzanie
<ol>
	<li>Zanurz próbki w 100% białej żywicy LR na 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Zastąp żywicę w kroku 4.1 świeżą żywicą 100% LR White i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Zmontuj urządzenie do osadzania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Wytnij rurki poliamidowe o odpowiedniej średnicy i długości. 
	UWAGA: Zalecane są rurki o średnicy wewnętrznej co najmniej 0.1 mm większej niż średnica próbki. W przypadku typowych próbek do każdej próbki stosuje się standardową długość rurki wynoszącą 30 mm. W razie potrzeby wydłużone próbki można pomieścić za pomocą dłuższych rurek.
	<ol>
		<li>Przymocuj mikropipetę P1000 do szerokiego końca adaptera do osadzania i włóż rurkę poliimidową do wąskiego końca (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Jeśli adapter osadzania nie jest dostępny, przejdź do kroku 4.3.3. W przeciwnym razie przejdź do kroku 4.4.</li>
		<li>Odetnij koniec końcówki mikropipety prosto w poprzek, tak aby rurka poliimidowa dobrze przylegała. Naciąć na 44 mm od szerokiego końca żółtej końcówki mikropipety o pojemności 200 μl w przypadku rurki 0,0403" i w odległości 59 mm od spodu niebieskiej końcówki o pojemności 1 ml w przypadku rurki 0,105". Przytnij w razie potrzeby.</li>
		<li>Przymocuj odciętą końcówkę mikropipety do mikropipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś próbki do małej łodzi wagowej lub miski na roztwór w kształcie litery V i całkowicie zanurz próbki w 100% żywicy LR White.</li>
	<li>Za pomocą aparatu do zatapiania opisanego w kroku 4.3 skierować rurkę na szeroki koniec nieruchomej próbki (lub w kierunku głowy w przypadku próbek zwierzęcych) i powoli pipetować próbkę do rurki. Umieść próbkę na środku rurki i upewnij się, że rurka powyżej i poniżej próbki jest wypełniona żywicą.
	<ol>
		<li>Odpipetować próbkę do rurki w taki sposób, aby próbka poruszała się w naturalnym kierunku do przodu. 
		UWAGA: Powolne pipetowanie pozwala uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza i uszkodzeń próbek spowodowanych ścieraniem krawędzi rurki. Ruch do tyłu do rurki może łatwo uszkodzić kończyny (kończyny, skrzydła, płetwy itp.). Zaleca się, aby w aparacie do zatapiania nie doszło do przelania się żywicy, aby później powietrze nie dostało się do rurki podczas wyjmowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast uszczelnij otwarty koniec miękką glinką modelarską na bazie oleju.
	<ol>
		<li>Spłaszcz glinę w arkusz o grubości 1 mm.</li>
		<li>Ustabilizuj rurkę między palcem wskazującym i środkowym.</li>
		<li>Powoli dociśnij glinę do końca rurki kciukiem.</li>
		<li>Usuń nadmiar gliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć urządzenie do osadzania z mikropipety.</li>
	<li>Wyciągnij rurkę, delikatnie obracając i uszczelnij drugi koniec gliną.
	<ol>
		<li>Przyłóż palec do uszczelnionego końca, aby zapobiec wyrzuceniu gliny.</li>
		<li>Powoli wepchnij nieuszczelniony koniec rurki w glinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić rurkę poziomo i polimeryzować żywicę przez 24 godziny w temperaturze 65 °C. 
	UWAGA: Umieszczenie poziome pozwala uniknąć ruchu próbki podczas polimeryzacji. Jeśli niewielka ilość powietrza została uwięziona w kroku 4.8, koniec z pęcherzykiem powietrza może być lekko podniesiony, aby zapobiec przemieszczaniu się pęcherzyków powietrza w kierunku próbki. Co ważne, zbyt duże uniesienie podczas polimeryzacji może spowodować, że próbka opadnie w kierunku dolnego końca z powodu grawitacji. Prawidłowo osadzona próbka jest porównywana z próbką z pęcherzykiem powietrza, czego należy unikać, ponieważ załamanie światła od granicy faz powietrze/żywica może pogorszyć jakość obrazu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
5. Dzień 5: Kolekcja
<ol>
	<li>Pobrać próbki do pobrania obrazu pod koniec dnia 5. 
	UWAGA: Usunięcie rurki poliimidowej jest możliwe, ale nie jest konieczne do obrazowania. Obrazowanie mikrotomografią komputerową w oparciu o synchrotron dla próbki danio pręgowanego wykonano na linii badawczej 2-BM w Advanced Photon Source (APS) w Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA). Dla danio pręgowanego barwionego PTA określono optymalny zakres energii promieniowania rentgenowskiego wynoszący 5-30 keV, a do obrazowania wykorzystano energię promieniowania rentgenowskiego wynoszącą 13,8 keV. Uzyskano 1501 projekcji przy natężeniu 13,8 keV w zakresie 180 stopni (1 projekcja co 0,12 stopnia) za pomocą kamery o wymiarach 2048 na 2048 pikseli. Dodatkowo uzyskano również dwa obrazy płaskiego pola (jeden na początku i jeden na końcu akwizycji) oraz jeden obraz ciemnego pola. Korekcje płaskiego i ciemnego pola, redukcja artefaktów pierścieniowych i rekonstrukcja obrazu zostały wykonane przy użyciu zestawu narzędzi TomoPy o otwartym kodzie źródłowym34. Próbki Daphnia i Drosophila barwione PTA zostały zobrazowane pod mikroskopem rentgenowskim12,35. Konkretne ustawienia mikro-CT są zależne od przedmiotu i jakości plamy. Na przykład próbka Drosophila została zeskanowana przy 40 kVp, 74 mA i 15 s z rozdzielczością wokseli 3,10 × 3,10 × 3,10μm3.</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organism+cellular+pathology%3A+a+systems+approach+to+phenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics.</a> Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).</li>
<li>Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+imaging%2C+gene+function%2C+and+the+zebrafish+phenome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).</li>
<li>Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+phase-contrast+tomography+for+high-spatial-resolution+zebrafish+muscle+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging.</a> Scientific Reports. 5, 16625(2015).</li>
<li>Bruneel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+zebrafish+dentition%3A+from+traditional+approaches+to+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies.</a> Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Silvent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+skeleton+development%3A+High+resolution+micro-CT+and+FIB-SEM+block+surface+serial+imaging+for+phenotype+identification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification.</a> PLoS One. 12 (12), e0177731(2017).</li>
<li>Hur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT-based+phenomics+in+the+zebrafish+skeleton+reveals+virtues+of+deep+phenotyping+in+a+distributed+organ+system%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system.</a> eLife. 6, e26014(2017).</li>
<li>J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+of+a+hypercholesterolemic+female+zebrafish+by+using+synchrotron+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT.</a> Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).</li>
<li>Hasamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+extract+suppresses+adiposity+and+affects+the+expression+of+lipid+metabolism+genes+in+diet-induced+obese+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish.</a> Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73(2012).</li>
<li>Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+fat+accumulation+in+zebrafish+is+induced+by+a+diet+rich+in+fat+and+reduced+by+supplementation+with+green+tea+extract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract.</a> PLoS One. 10 (3), e0120142(2015).</li>
<li>Dyer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+mesoscale+neuroanatomy+using+X-ray+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography.</a> eNeuro. 4 (5), (2017).</li>
<li>Busse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+histology+enabled+through+cytoplasm-specific+X-ray+stain+for+microscopic+and+nanoscopic+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).</li>
<li>Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+examination+of+human+bone%3A+from+biopsies+towards+the+entire+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Inst+Super+Sanita%22%5BJournal%5D)">Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ.</a> Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).</li>
<li>Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+of+the+human+lung%3A+imaging+of+alveoli+and+virtual+endoscopy+of+an+alveolar+duct+in+a+normal+lung+and+in+a+lung+with+centrilobular+emphysema+-+initial+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations.</a> Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+A+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9, 11(2009).</li>
<li>Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exploratory+study+of+contrast+agents+for+soft+tissue+visualization+by+means+of+high+resolution+X-ray+computed+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging.</a> Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).</li>
<li>Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+enhancement+with+uranyl+acetate+allows+quantitative+analysis+of+the+articular+cartilage+by+microCT%3A+Application+to+mandibular+condyles+in+the+BTX+rat+model+of+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Micro%22%5BJournal%5D)">Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse.</a> Micro. 97, 35-40 (2017).</li>
<li>Tang, S. Y., Vashishth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+in+vitro+technique+for+the+three-dimensional+quantification+of+microdamage+in+trabecular%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular.</a> Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).</li>
<li>Elliott, J. C., Dover, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography.</a> Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping).</a> PLoS Genetics. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+short-exposure+small-animal+laboratory+x-ray+phase-contrast+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography.</a> Scientific Reports. 6, 39074(2016).</li>
<li>Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+x-ray+micro-computed+tomography%3A+a+user+guideline+for+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples.</a> GigaScience. 5, 1011(2017).</li>
<li>Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stabilization+of+tissue+for+embryo+phenotyping+using+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining.</a> PLoS One. 8 (12), e84321(2013).</li>
<li>Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+pipeline+for+anatomical+phenotyping+of+mouse+embryos+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT.</a> Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).</li>
<li>Hsu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microCT+imaging+of+mouse+development+from+early+post-implantation+to+early+postnatal+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages.</a> Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).</li>
<li>Hayat, M. A., Giaquinta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fixation+and+embedding+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid fixation and embedding for electron microscopy.</a> Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).</li>
<li>Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+correlative+approach+for+combining+microCT%2C+light+and+transmission+electron+microscopy+in+a+single+3D+scenario%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario.</a> Frontiers in Zoology. 10, 44(2013).</li>
<li>Bushong, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microscopy+as+an+approach+to+increasing+accuracy+and+efficiency+of+serial+block-face+imaging+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens.</a> Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).</li>
<li>Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-embedded+tissue+arrays+for+histologic+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis.</a> Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Copper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fixation+and+embedding+techniques+for+optimized+histological+preparation+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).</li>
<li>Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoPy%3A+a+framework+for+the+analysis+of+synchrotron+tomographic+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data.</a> J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).</li>
<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/D51E7CBC17A920747A14E277DD8E6395/S1551929513000060a.pdf/div-class-title-the-ascent-of-3d-x-ray-microscopy-in-the-laboratory-div.pdf">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).</li>
<li>Thomas, G. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+molecular+and+systems+biology+analysis+of+pleiotropic+vertebrate+phenotypes+%28Doctoral+%29%22">A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation)</a>. , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).</li>
<li>Walton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterisation+of+unstained+and+intact+tissue+micro-architecture+by+X-ray+computed+micro-+and+nano-+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography.</a> Scientific Reports. 5, 10074(2015).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują, że nie występują konflikty interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół sztywnego unieruchomienia utrwalonych i barwionych próbek w skali milimetrowej (o średnicy od 0,5 do 2,5 mm) do obrazowania mikro-CT. Biorąc pod uwagę szybki postęp technologii mikro-CT w odniesieniu do rozdzielczości i szybkości, metoda trwałego przechowywania próbki z możliwością ponownego obrazowania jest wysoce pożądana. Tradycyjnie, gęsta żywica do zatapiania jest powszechnie stosowana w mikroskopii elektronowej w celu zapewnienia wsparcia strukturalnego do cięcia ultracienkich odcinków i zminimalizowania uszkodzeń próbki. Nasza metoda dostosowała jego zastosowanie do sztywnego unieruchomienia podczas obrazowania nieniszczącego. Aby zminimalizować artefakty obrazowania wynikające z obecności nadmiaru żywicy, zastosowaliśmy przezroczyste rurki poliimidowe rentgenowskie do tworzenia okrągłych próbek bez krawędzi i ograniczania objętości żywicy wokół próbki.
Optymalny wynik procedury zatapiania zależy od starannego wykonania kilku krytycznych kroków i zwrócenia uwagi na integralność próbki podczas całej procedury. Rzeczywiście, uszkodzenie próbki spowoduje pogorszenie końcowego obrazu, niezależnie od powodzenia wykonania obrazowania. Ponieważ schładzanie przyczynia się do zmniejszenia reakcji bólowych, a nieutrwalona tkanka ulega szybszej degradacji w wyższych temperaturach, używamy wstępnie schłodzonych odczynników. Duże próbki mogą wymagać cięcia, aby umożliwić wejście utrwalacza do wnętrza próbki, tak aby narządy wewnętrzne, takie jak wątroba, trzustka i jelita, były całkowicie unieruchomione. Nieutrwalone tkanki pogarszają się i tracą integralność strukturalną, niszcząc strukturę biologiczną. Kolejnym kluczowym krokiem jest utrzymanie próbki w jej naturalnym ustawieniu. Dlatego opowiadamy się za stosowaniem pojemników z płaskim dnem, których używamy podczas całego zabiegu i są szczególnie ważne podczas utrwalania. Należy unikać mocowania w rurkach polipropylenowych lub rurkach stożkowych, które zwykle mają dno w kształcie litery V, ponieważ mogą one powodować zginanie wydłużonych próbek, co zniekształca naturalną morfologię próbki. Ponadto, aby zminimalizować użycie żywicy, wewnętrzna średnica rurki poliimidowej jest tylko nieznacznie większa niż szerokość próbki. Gięcie próbki może również spowodować jej uszkodzenie w momencie jej wejścia do rurki. Zaleca się również przenoszenie próbki do rurki w naturalny sposób do przodu, aby uniknąć uszkodzenia kończyn. Prawidłowe odwodnienie to kolejny krytyczny krok. Osiąga się to poprzez małe przyrosty rosnących stężeń EtOH, aby powoli zastępować wodę EtOH, który jest bardziej mieszalny z żywicą. Duże wzrosty stężenia EtOH są związane z kurczeniem się tkanek i można je złagodzić poprzez dodatkowe przyrosty inkubacji EtOH, aby przejście było bardziej stopniowe. Na koniec, aby zminimalizować ruch próbki lub kieszeni powietrznych, jeśli takie występują, próbki umieszcza się poziomo podczas polimeryzacji żywicy (koniec dnia 4). Kieszenie powietrzne lub uszczelniacz obok próbki powodują artefakty optyczne przy obrazowaniu rentgenowskim związanym z dyfrakcją krawędzi, obniżając jakość obrazu.
Jeśli chodzi o możliwe modyfikacje protokołu, zamiast LR White acrylic i PTA można zastosować inne żywice osadzające i bejce metalowe. Embed812, żywica epoksydowa powszechnie stosowana w mikroskopii elektronowej, jest bardzo lepka, trudniejsza do przenoszenia, może powodować zniekształcenia próbek i wiąże się z wyższym tłem niż żywice metakrylanu akrylowego lub glikolowego. Podczas gdy JB4 Plus, metakrylan glikolu, jest mniej lepki niż EMbed812 i ma niższe tło, w pobliżu próbki często pojawiają się losowe tworzenie się kieszeni powietrznych. Jak wspomniano, kieszenie powietrzne pogarszają jakość obrazu i są szczególnie problematyczne w przypadku cennych próbek. Warto zauważyć, że Technovit 7100, kolejny metakrylan glikolu, zakłóca barwienie PTA, co skutkuje słabym kontrastem na końcowym obrazie. Dla porównania, akryl LR White ma lepkość podobną do wody, niskie tło i nie przeszkadza w barwieniu PTA. W naszych rękach skuteczność zatopienia w LR White bez uszkodzenia próbki i pęcherzyków powietrza wynosi ponad 95%. Z tych powodów zalecamy jego stosowanie jako żywicy do zatapiania w mikrotomografii komputerowej tkanek. Jeśli chodzi o barwienie, wyniki różnych barwień metali, takich jak tetratlenek osmu, jod i PTA w obrazowaniu mikro-CT, zostały porównane i omówione w innym miejscu 15,16,17 i wykraczają poza zakres tego manuskryptu.
Wielkość próby jest głównym ograniczeniem dla naszego obecnego protokołu. Ponieważ do przenoszenia próbek do rurki stosujemy ssanie, możliwość zobaczenia próbki ma kluczowe znaczenie dla orientacji i upewnienia się, że rzeczywiście znajduje się ona w rurce. W rezultacie, próbki submilimetrowe, takie jak niesporczaki (tj. niedźwiedzie wodne) są niezwykle trudne do osadzenia, ponieważ wymagają użycia mikroskopu do wizualizacji. Po zastosowaniu ssania mikroskopijne próbki łatwo gubią się z płaszczyzny ogniskowej i stają się trudne do ponownego odkrycia, co utrudnia określenie, czy przeszły zbyt daleko przez dołączony koniec rurki. Większe próbki, takie jak zarodki myszy (3 - 10 mm) mogą być osadzane z niewielkimi modyfikacjami protokołu osadzania (ryc. 4D). W szczególności rurki poliimidowe zostały wypełnione w 1/3 płynną żywicą, która została spolimeryzowana przed zatopieniem. Utrwaloną i barwioną próbkę umieszczono na wierzchu wstępnie spolimeryzowanej żywicy. Rurka została następnie całkowicie wypełniona niespolimeryzowaną żywicą, a następnie nastąpiła druga polimeryzacja.
Znaczenie naszego protokołu osadzania jest wielorakie. Sztywno unieruchomione próbki całych zwierząt lub tkanek są pożądane z następujących powodów: (1) tworzenie długoterminowych repozytoriów próbek, które są trudne do wygenerowania lub przygotowania; 2) ponowne pozyskanie danych; (3) umożliwienie obrazowania seryjnego przy użyciu wielu metod obrazowania; oraz (4) zapewnienie standardów kalibracji i rozwoju technologii. Próbki przygotowane za pomocą naszej procedury zatapiania są zamknięte w stałej żywicy, która jest odporna na uszkodzenia i dlatego może być łatwo przechowywana, być może w nieskończoność. Długotrwałe przechowywanie jest szczególnie przydatne w przypadku rzadkich lub pracochłonnie generowanych okazów, takich jak te związane z projektami fenomowymi. Ponadto, w przypadku utraty danych cyfrowych, dane mogą zostać wygenerowane z oryginalnej próbki. Możliwość ponownego obrazowania przez długi okres czasu potencjalnie pozwala na badanie tej samej próbki za pomocą bardziej zaawansowanych metod obrazowania w przyszłości. Ponieważ próbki są fizycznie stabilne między instancjami obrazowania, obrazy są pozyskiwane z tej samej próbki w tej samej orientacji, co ułatwia rejestrację między wcześniejszymi i późniejszymi zestawami danych. Na przykład obraz o niskiej rozdzielczości może umożliwiać segmentację tkanek tylko u larwy danio pręgowanego. Ta sama larwa może być później ponownie zobrazowana w wyższej rozdzielczości, co pozwoli na bardziej szczegółowe analizy obliczeniowe w rozdzielczości komórkowej. Ta zdolność do bezpośredniego porównywania zarejestrowanych skanów sugeruje, że próbki osadzone w żywicy mogą być potencjalnym standardem dla rozwoju technologii mikro-CT. Skutki wszelkich zmian w metodzie obrazowania można ocenić poprzez obrazowanie tej samej próbki, tak aby wszystkie zmienne na etapie przygotowania próbki były kontrolowane. Na koniec do kalibracji przyrządu można użyć próbki wzorcowej zatopionej w żywicy w celu sprawdzenia spójności obrazowania.
Nasza poprzednia praca badająca histologię zmutowanych i chorych ryb wykazała, że rozdzielczość komórkowa pozwala na wykrycie subtelnych nieprawidłowości w strukturze tkanki, które są pomijane w ogólnym badaniu przy użyciu mikroskopu preparacyjnego36 lub mikroskopu stereoskopowego o małej mocy. Chcemy rozszerzyć nasze analizy wysokorozdzielcze na próbki ludzkie. Larwy danio pręgowanego, które stanowią główny przedmiot naszych prac rozwojowych, są podobne do ludzkich biopsji igłowych pod względem kruchości, niejednorodności tkanek komórkowych i międzykomórkowych, wielkości (średnica 1-3 mm) i wydłużonego kształtu. Opierając się na naszym rozległym doświadczeniu z danio pręgowanym i innych pracach pokazujących, że mikrotomografia komputerowa z powodzeniem barwi i skanuje ludzkie tkanki, choć w niższej rozdzielczości37, oczekujemy, że nasze podejścia wniosą wartość dodaną do obrazowania i analizy biopsji igłowych. Oszacowaliśmy, że skompletowanie zestawu wystarczającego na jedno przygotowanie do 20 próbek tego samego schorzenia może być potencjalnie mniejsze niż 30 USD. Próbki przygotowane naszą metodą zatapiania są odporne na uszkodzenia fizyczne, a przez to łatwe w transporcie. Niski koszt i łatwość transportu sugerują możliwość pobierania próbek z całego świata, szczególnie z obszarów, w których obrazowanie w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikrotomografii komputerowej nie jest łatwo dostępne. Naszą wizją jest, aby pliki cyfrowe o wysokiej rozdzielczości z biopsji igłowych (od 0,1 do kilku terabajtów) umożliwiły stworzenie cyfrowego atlasu tkanek ludzkich, a jednocześnie pozwoliły naukowcom udoskonalić i ulepszyć obecne potoki analityczne w celu lokalizacji i ilościowej charakterystyki architektury komórkowej i tkankowej w pełnym kontekście 3D skanowanych tkanek.

Fenotypy to obserwowalne cechy organizmu, które reprezentują konsekwencje unikalnych interakcji między jego genetycznym tłem a środowiskiem. Cechy te mogą obejmować właściwości behawioralne, biochemiczne, morfologiczne, rozwojowe i/lub fizjologiczne. Co ważne, różnice w cechach między organizmami typu dzikiego a mutantami genetycznymi mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów i funkcji genów dotkniętych chorobą. Jeśli chodzi o morfologię, histopatologia jest złotym standardem w ocenie fenotypów na poziomie komórkowym, ale cierpi z powodu artefaktów mechanicznych i nie pozwala na dokładną ilościową analizę objętościową1. Nasze laboratorium jest zmotywowane do pokonywania barier w zastosowaniu mocy diagnostycznej histologii do pełnych objętości tkanek w rozdzielczości submikronowej.
Przegląd dostępnych technologii sugeruje, że obrazowanie za pomocą rentgenowskiej mikrotomografii komputerowej (micro-CT) może zapewnić idealne możliwości potrzebne do trójwymiarowej (3D) histologii całego zwierzęcia w skali milimetrowej. Micro-CT umożliwia nieniszczącą, izotropową wizualizację 3D oraz możliwość przeprowadzania ilościowej analizy architektury tkanek 1,2. W ostatnich latach obrazowanie 3D niebarwionego i barwionego metalem danio pręgowanego za pomocą mikro-CT zyskało coraz większą popularność i jest wykorzystywane do analizy wolumetrycznej kilku tkanek, w tym mięśni, zębów, kości i tkanki tłuszczowej3,4,5,6,7,8,9,10. Inne organizmy modelowe i próbki tkanek są również podatne na obrazowanie mikro-CT. Na przykład, wprowadzono potok do ilościowego określania gęstej mezoskalowej neuroanatomii mózgów myszy zobrazowanych za pomocą synchrotronowego mikro-CT11. Podobnie, wykazano, że protokół barwienia oparty na eozynie jest odpowiedni do obrazowania mikrotomografii komputerowej tkanek miękkich całych narządów myszy12. Analiza morfometryczna niebarwionych ludzkich kręgów L3 oraz wizualizacja srebrzystych płuc ludzkich za pomocą mikrotomografii komputerowej wykazały użyteczność tej technologii w przypadku próbek ludzkich13,14.
Aby urzeczywistnić wielką obietnicę mikro-CT do kompletnego morfologicznego fenotypowania nienaruszonych małych zwierząt i próbek tkanek, należy pokonać szereg przeszkód związanych z przepustowością, rozdzielczością, polem widzenia, kompleksowym barwieniem komórek i długoterminową ochroną. Chociaż każdy z tych aspektów jest niezwykle ważny, niniejszy manuskrypt skupia się na optymalizacji procedur osadzania, z dodatkowymi uwagami na temat utrwalania i barwienia próbki. Barwienie metalami ciężkimi jest przydatne, ponieważ nieodłączny kontrast między różnymi tkankami miękkimi w obrazach mikro-CT jest niski. Zbadano wpływ różnych barwników metalicznych, takich jak tetratlenek osmu, jod, kwas fosfowolframowy (PTA) i chrom gallocyjaninowy, w celu zwiększenia kontrastu w obrazowaniu mikro-CT15,16,17. Octan uranylu był również stosowany jako środek kontrastowy do obrazowania mikro-tomografii komputerowej kości i chrząstek18,19. PTA stosowany w naszym protokole prowadzi do konsekwentnego barwienia prawie wszystkich tkanek i komórek w całych próbkach danio pręgowanego, uzyskując obrazy, które są potencjalnie zgodne z badaniami histologicznymi na pełnych objętościach tkanki.
Podczas akwizycji obrazu mikro-CT, wykonywana jest projekcja dwuwymiarowa (2D), podczas której próbka jest obracana o ułamek stopnia i powtarzana, aż próbka zakończy obrót o 180° lub 360°, generując serię tysięcy projekcji 2D używanych do rekonstrukcji objętości 3D20. W tym procesie każde zaburzenie próbki spowoduje, że odpowiednie projekcje 2D nie będą wyrównane, co spowoduje słabą rekonstrukcję objętości 3D. Unieruchomienie próbki jest sposobem na rozwiązanie tego problemu, a niektóre obecne strategie obejmują zanurzenie próbki w alkoholu lub zatopienie w agarozie w rurkach polipropylenowych lub końcówkach do mikropipet3,5,15,16,21,22. Metody zanurzania w cieczach nie są idealne, ponieważ ruch próbki podczas akwizycji obrazu może wystąpić między zestawami obrazowania, co skutkuje przesuniętymi rekonstrukcjami objętości 3D23. Ponadto dobrze wiadomo, że stabilność fizyczna próbek tkanek przechowywanych w płynie jest niska w skalach czasowych od miesięcy do lat, w wyniku niestabilności chemicznej i ścierania powierzchni związanego z przemieszczaniem się punktów styku między próbką a ścianką pojemnika (osobiste obserwacje z nieruchomymi próbkami tkanek zwierzęcych i ludzkich).
Aby zmniejszyć możliwość przemieszczania się próbki podczas obrazowania, próbki mogą być osadzone w agarozie24,25,26, ale ta praktyka wiąże się z ryzykiem dyfuzji plamy do agarozy, zmniejszając tym samym kontrast obrazu26. Ponadto preparaty płynne lub agarozowe są podatne na uszkodzenia fizyczne i z czasem ulegają degradacji, co sprawia, że nie nadają się do długotrwałego przechowywania próbek. Doszliśmy do wniosku, że potencjalnie skuteczna i prosta metoda immobilizacji próbki może zostać zaadaptowana do tej stosowanej w próbkach mikroskopii elektronowej. Żywice polimeryzowane, takie jak EPON 812 (wycofana i zastąpiona przez EMbed 812) są powszechnie stosowane w celu zapewnienia twardości wymaganej do generowania ultracienkich przekrojów do mikroskopii elektronowej27,28. Rzeczywiście, kilka badań porównawczych między obrazowaniem rentgenowskim a mikroskopią elektronową wykazało, że próbki osadzone w żywicy można obrazować za pomocą mikroskopii rentgenowskiej29,30. Jednak niektóre ze standardowych praktyk mikroskopii elektronowej nie przekładają się bezpośrednio na obrazowanie mikro-CT. Na przykład obrazowanie mikro-tomografią komputerową próbek z kwadratowymi krawędziami żywicy typowych bloków żywicy i próbek wyciętych z tych bloków wiąże się z artefaktami dyfrakcji krawędzi, które mogą zakłócać obrazowanie. Wygładzanie krawędzi żywicy, choć możliwe, jest pracochłonne i czasochłonne.
Podczas gdy w mikroskopii elektronowej stosowane są różne rodzaje żywic do osadzania tworzyw sztucznych, wysokie tło związane z twardszymi żywicami, takimi jak Embed 812, skłoniło nas do przetestowania innych. Wybraliśmy LR White ze względu na jego niską lepkość, niski skurcz, niską skłonność do tworzenia się pęcherzyków podczas polimeryzacji oraz niższe tło. Aby stworzyć próbki bez krawędzi i zminimalizować ilość żywicy otaczającej próbkę, opracowaliśmy protokoły pobierania próbek w ciekłej żywicy do rurek poliimidowych przed polimeryzacją. Poliimid został wybrany ze względu na jego wysoką stabilność termiczną i wysoką przepuszczalność promieniowania rentgenowskiego, dzięki czemu wyjmowanie rurki nie jest konieczne do obrazowania. Na koniec zaprojektowaliśmy niestandardowy adapter do mikropipet do naszej techniki zatapiania próbek, aby niezawodnie utrzymać rurkę i zapobiec zanieczyszczeniu mikropipet. Adapter można wydrukować w 3D z pliku obrazu CAD. Podsumowując, celem przedstawionych tutaj metod przygotowania próbek jest uproszczenie osadzania małych próbek, uzyskanie zwiększonego kontrastu barwienia, sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania nienaruszonych próbek w skali milimetrowej.

<table><tbody><tr><td>10X Neutralna buforowana formalina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosfotunstyczny</td><td>VWR</td><td>MK282402</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS-222)</td> <td>Western Chemical</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>LR Mikroskopia elektronowa biała</td><td>Sciences</td><td>14380</td><td></td></tr><tr><td>Rurki poliimidowe (ID 0,04")</td><td>Nordson Medical</td><td>141-0065</td><td>Dokładne rurki poliimidowe opisane w manuskrypcie nie są już dostępne. Bliski mecz jest podany tutaj. Rurki o niestandardowej średnicy mogą być produkowane na życzenie.</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 Proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Miękka plastelina modelarska na bazie oleju</td><td>Sculpey</td><td>S302 001</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta P1000</td><td>Fiolki szklane Gilson</td><td>F123502</td><td></td></tr><tr><td>VWR</td><td></td><td>66015-042</td><td></td></tr><tr><td>Umywalka w kształcie litery V</td><td>VWR</td><td>89094-676</td><td></td></tr><tr><td>Łodzie wagowe</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L żółta końcówka do mikropipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-500</td><td></td></tr><tr><td>1 ml niebieska końcówka do mikropipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-163</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka stołowa</td><td>Thermolyne</td><td>M71735</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Fotometria</td> Mikroskop rentgenowski <td>CoolSNAP HQ2 CCD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td></td></tr></tbody></table>

sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3d za pomocą mikrotomografii komputerowej

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Przez ponad sto lat, badanie histologiczne tkanek było złotym standardem w diagnostyce medycznej, ponieważ histologia pozwala zidentyfikować i scharakteryzować wszystkie typy komórek w każdej tkance. Nasze laboratorium aktywnie pracuje nad postępem technologicznym w rentgenowskiej mikrotomografii komputerowej (mikro-CT), która wniesie diagnostyczną moc histologii do badania pełnych objętości tkanek w rozdzielczości komórkowej (tj. Metoda rentgenowskiej tomografii komputerowej). W tym celu wprowadziliśmy ukierunkowane ulepszenia w procesie przygotowywania próbek. Jedną z kluczowych optymalizacji, na której skupia się niniejsza praca, jest prosta metoda sztywnego osadzania utrwalonych i barwionych próbek w skali milimetrowej. Wiele z opublikowanych metod immobilizacji próbek i korelacyjnego obrazowania mikro-CT polega na umieszczeniu próbek w parafinie, wosku, agarozie lub płynach, takich jak alkohol. Nasze podejście rozszerza tę pracę o niestandardowe procedury i projekt trójwymiarowego urządzenia do drukowania do osadzania próbek w żywicy akrylowej bezpośrednio w rurkach poliimidowych, które są stosunkowo przezroczyste dla promieni rentgenowskich. W niniejszym dokumencie opisano procedury przygotowania próbek dla próbek o średnicy od 0,5 do 10 mm, które byłyby odpowiednie dla całych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego lub innych próbek zwierząt i tkanek o podobnych wymiarach. Jako dowód słuszności koncepcji umieściliśmy okazy z Danio, Drosophila, Daphnia i embrionu myszy; Pokazano reprezentatywne obrazy z trójwymiarowych skanów dla trzech z tych próbek. Co ważne, nasza metodologia prowadzi do wielu korzyści, w tym sztywnego unieruchomienia, długoterminowego zachowania pracochłonnie wytworzonych zasobów oraz możliwości ponownego badania próbek.

Opisany powyżej protokół szczegółowo przedstawia procedurę przygotowania próbek całych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego do obrazowania mikro-CT. Co istotne, metodę tę można łatwo dostosować do innych rodzajów próbek (np.., Muszka owocówka, Daphnia, Arabidopsis, organy mysie). Czas inkubacji w poszczególnych etapach jest odpowiedni dla larw Danio pręgowanego oraz próbek o podobnej wielkości; większe próbki mogą wymagać dłuższej inkubacji. Aby ułatwić etapy zatapiania próbek, zaprojektowaliśmy adapter mocowany do mikropipety o objętości 1 ml, który można dostosować do różnych rozmiarów rurek polimidowych (Rycina 1). Ten niestandardowy adapter został wydrukowany w technologii 3D na podstawie pliku CAD powiązanego z niniejszym rękopisem, który jest dostępny do pobrania pod adresem http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/. Ponieważ nie wszyscy czytelnicy mogą mieć dostęp do drukarki 3D, w protokole (Krok 4.3) opisano montaż domowej aparatury do zatapiania z wykorzystaniem końcywek do mikropipet. Przedstawiono prawidłowo zatopioną larwę danio pręgowanego w porównaniu z okazem zawierającym pęcherzyk powietrza (Rysunek 2), co prawdopodobnie pogorszy jakość obrazu. Aby zademonstrować wszechstronność procedury zatapiania, przedstawiamy preparaty pochodzące z różnych organizmów modelowych (tj.., Danio, Muszka owocówka, Daphnia, embrion myszy), które przeszły przez proces przygotowania próbek (Rysunek 3). Zrekonstruowane wolumeny 3D całych Danio, Daphniai Muszka owocówka przedstawiono preparaty obrazowane za pomocą mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) (Rycina 4). Co istotne, jak wykazano w ramach Danio próbka, okazy te można przechowywać przez dłuższy czas i wykorzystywać wielokrotnie w kolejnych sesjach obrazowania (Rysunek 5).
<img alt="Konfiguracja kuwety spektroskopowej; schemat, zdjęcie, etapy montażu; badania optyczne, analiza absorpcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Aparatura do zatapiania. (A) Zaprojektowano adapter, aby ułatwić zatapianie przy użyciu powszechnie stosowanych narzędzi laboratoryjnych. (B) Ilustracja przekroju poprzecznego adaptera. (C) Aparatura do zatapiania po włożeniu rurki polimidowej w punkcie adaptera (a) i przymocowaniu mikropipety w punkcie adaptera (c). Segment adaptera (b) to komora przelewowa zaprojektowana w celu pomieszczenia nadmiaru żywicy i ochrony mikropipety przed zanieczyszczeniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, kanały mikroprzepływowe pokazujące wzorce przepływu; stosowane w analizie dynamiki płynów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Prawidłowo zatopione preparaty są pozbawione pęcherzyków powietrza. (A) Zatopiona larwa danio pręgowanego w 3. dobie po zapłodnieniu (dpf) bez pęcherzyka powietrza. (B) Zatopiona larwa danio pręgowanego 3 dpf z pęcherzykiem powietrza. Powietrze uwięzione podczas procesu zatapiania może przemieścić się w stronę preparatu, jeśli próbka nie zostanie umieszczona poziomo podczas polimeryzacji. Paski skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Danio prążkowany, muszka owocówka i embrion myszy na zdjęciach mikroskopowych, prezentujące biologię rozwoju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Nasz protokół umożliwia zatopienie w żywicy szerokiej gamy preparatów. (A) Larwa danio prążkowanego w 7 dpf. (B) Dorosła Drosophila. (C) Dorosła Daphnia. (D) Embrion myszy. Większe próbki, takie jak embrion myszy, wymagają kilku modyfikacji protokołu. W skrócie, rurkę polimidową wypełniono żywicą do 1/3 jej długości i spolimeryzowano przed zatopieniem preparatu. Utrwalony i barwiony preparat umieszczono na powierzchni wstępnie spolimeryzowanej żywicy. Następnie rurkę wypełniono niespolimeryzowaną żywicą, po czym przeprowadzono drugą polimeryzację. Rurka polimidowa została usunięta przed wykonaniem zdjęć, aby umożliwić lepszą wizualizację preparatu na tym rysunku. Usunięcie rurki nie jest konieczne do poprawnego pozyskania obrazów za pomocą mikro-CT. Paski skali: obrazy preparatów, 5 mm; powiększone wstawki, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie 3D Drosophila w mikroskali; rekonstrukcja danych wizualnych, renderingi wolumetryczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Trójwymiarowe renderingi zatopionych próbek. (A) Zrekonstruowana larwa danio pręgowanego w 3 dpf przy rozdzielczości wokseli 0.743 × 0.743 × 0.743 µm3. (B) Zrekonstruowana dorosła Daphnia (rozdzielczość wokseli 3 × 3 × 3 µm3). (C) Zrekonstruowana dorosła Drosophila (rozdzielczość wokseli 3.1 × 3.1 × 3.1 µm3). Cyfrowe przekroje mogą być generowane pod dowolnym kątem, jak pokazano w lewej kolumnie. Po prawej stronie przedstawiono renderingi powierzchni, wykonane przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Żywica do zatapiania jest widoczna na wszystkich skanach poza samą próbką (oznaczona symbolem *), ale nie zakłóca obrazu samej próbki. Larwa danio pręgowanego była obrazowana w Argonne National Laboratory przy użyciu Advanced Photon Source, który opiera się na synchrotronie. Próbki Daphnia lub Drosophila były obrazowane za pomocą komercyjnego mikroskopu rentgenowskiego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza porównawcza MRI, rycina przedstawia obrazy A i B, wykres intensywności D oraz wykres SNR E." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Próbki zatopione zgodnie z naszym protokołem mogą zostać ponownie zobrazowane za pomocą mikro-CT. Ta sama larwa danio pręgowanego w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) została zobrazowana w (A) 2011 i (B) 2013 roku; obrazy przedstawiono jako projekcje średniej intensywności w widoku strzałkowym. Porównanie obrazów z poprzednich skanów po przechowywaniu wykazuje zachowanie cech anatomicznych. (C) Przedstawiono powiększenie mięśnia z obu skanów, gdzie wyznaczone linie wskazują odpowiadające sobie obszary wykorzystane do (D) generowania profilu intensywności. Profile intensywności znormalizowane do odpowiadających im średnich wzdłuż obu linii wykazują przestrzennie zgodne lokalne piki w obu skanach. (E) Średnie wartości intensywności dla wybranych obszarów na obrazach A i B należących do tła (Bg, fioletowy), jąder neuronów (N, zielony), białej istoty (W, niebieski) oraz mięśnia (M, pomarańczowy) podzielono przez średnią dla tła (biały) i wykorzystano do wyznaczenia stosunku sygnału do szumu (SNR), który jest zgodny pomiędzy skanami. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Metoda ta umożliwi generowanie trójwymiarowych obrazów histologicznych z małych próbek w skali milimetrowej, w tym małych organizmów modelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że osadzone próbki są bardzo stabilne, co umożliwia przechowywanie próbek przez długi czas i wielokrotne ich obrazowanie, na przykład przy użyciu różnych metod obrazowania na przestrzeni lat. Wyniki tej metody będą bardzo przydatne w wysokoprzepustowych zjawiskach modelowych systemów, toksykologii, a potencjalnie nawet w diagnostyce tkanek ludzkich.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ próbki są stosunkowo małe i trudne do orientacji lub manewrowania. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ należy zwrócić uwagę, aby uniknąć uszkodzenia próbki. W przypadku młodych lub starszych zebry należy je głodzić przez co najmniej 24 godziny, aby zmniejszyć objętość treści jelitowej przed utrwaleniem.Przenieś 10% neutralny bufor formaliny lub NBF i 2x Tricaine-S wstępnie schłodzony do czterech stopni Celsjusza na lód. Podwój objętość wody dla ryb dzięki schłodzonemu 2x MS-222 do szybkiej i humanitarnej eutanazji. Sześćdziesiąt sekund po tym, jak ryby przestaną się poruszać, po humanitarnej eutanazji, umieść rybę w schłodzonym 10% roztworze NBF w płaskich szklanych fiolkach o temperaturze pokojowej i utrwal je na noc.Drugiego dnia opłucz utrwalone próbki ryb trzy razy w 1x PBS pH 7,4 przez 10 minut każda. Po umyciu zanurzyć próbki w 35% etanolu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie powtórz ten krok z 50% etanolem.Próbki inkubować w świeżo przygotowanym 0,3% roztworze kwasu fosfatungsenowego lub PTA przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając w celu ich zabarwienia. Rozpocznij trzeci dzień od przygotowania mieszaniny 100% etanolu i białej żywicy akrylowej LR jeden do jednego, objętość po objętości. Przepłukać próbki trzykrotnie w 70% etanolu przez 10 minut każda, a następnie inkubować próbki w 90% etanolu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie mieszając.Powtórzyć inkubację w tych samych warunkach, ale 95% etanolu, a następnie jeszcze dwa razy ze 100% etanolem. Na koniec zanurz próbki w mieszaninie etanolu i białej żywicy akrylowej LR jeden do jednego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc z delikatnym mieszaniem. Czwartego dnia wyjmij mieszaninę z fiolki i dodaj 100% białą żywicę LR, aby zanurzyć próbki.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Po dwóch godzinach zastąp żywicę świeżą białą żywicą 100% LR i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Do montażu urządzenia do zatapiania należy użyć rurki polietylenowej MI o średnicy co najmniej 0,1 milimetra większej niż średnica próbki i przyciąć ją do standardowej długości 30 milimetrów.Następnie przymocuj głowicę mikrorurki P1000 do białego końca adaptera do osadzania i włóż rurkę z poli MI do jej wąskiego końca. Po inkubacji próbek przez godzinę w 100% białej żywicy LR, przenieś je do małej łodzi wagowej i całkowicie zanurz w białej żywicy 100% LR. Skierować rurkę aparatu do osadzania na szeroki koniec utrwalonej próbki lub w stronę głowicy i powoli pipetować próbkę do rurki.Umieść próbkę na środku rurki, upewniając się, że rurka powyżej i poniżej próbki jest wypełniona żywicą. Zaraz potem, aby uszczelnić otwarty koniec rurki, spłaszcz kawałek miękkiej plasteliny na bazie oleju w arkusz o grubości około jednego milimetra i ustabilizuj rurkę między palcem wskazującym i środkowym. Następnie powoli dociśnij glinę do końca rurki kciukiem i usuń nadmiar gliny.Wyjmij urządzenie do osadzania z głowicy mikrorury. Wyciągnij rurkę, delikatnie obracając. Przytrzymując palec przy uszczelnionym końcu, aby zapobiec wyrzuceniu gliny, uszczelnij drugi koniec, powoli wciskając nieuszczelniony koniec rurki w glinę.Umieść rurkę poziomo na stojaku na probówki i pozwól żywicy polimeryzować przez 24 godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza w piekarniku. Pod koniec następnego dnia należy pobrać próbki do pobrania obrazu. Pomyślnie osadzona larwa danio pręgowanego nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.Jeśli powietrze zostanie uwięzione podczas procesu zatapiania, może przesunąć się w kierunku próbki, jeśli próbka nie zostanie umieszczona poziomo podczas polimeryzacji, co może pogorszyć jakość obrazu. Protokół ten okazał się skuteczny w osadzaniu różnych organizmów modelowych. Takich jak danio pręgowany, Drosophila, rozwielitki i zarodek myszy.Udane osadzenie można pokazać za pomocą zrekonstruowanych renderingów 3D, zobrazowanych za pomocą mikrotomografii komputerowej dla danio pręgowanego, rozwielitki i Drosophila. Zatapianie żywicy można zobaczyć we wszystkich skanach poza próbką, ale nie zakłóca ona samej próbki. Okazy te mogą być przechowywane przez dłuższy czas i ponownie wykorzystywane do wielu sesji obrazowania, jak pokazano na przykładzie larw danio pręgowanego sfotografowanych w 2011 roku.A potem znowu w 2013 roku. Cechy anatomiczne są zachowane po przechowywaniu, co widać na zbliżeniach mięśni z obu skanów. Co więcej, profile intensywności znormalizowane do odpowiadających im średnich wzdłuż linii segmentowych pokazują przestrzennie pasujące lokalne szczyty w obu skanach.Średnie wartości intensywności dla wybranych regionów w obu skanach zostały podzielone przez średnią dla tła i wykorzystane do wygenerowania stosunku sygnału do szumu, który dobrze korespondował między skanami. Podczas próbowania tej metody ważne jest, aby pracować delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia próbki i pracować ostrożnie, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak histologia lub mikroskopia elektronowa, w celu zbadania wzorców ekspresji białek lub osiągnięcia wyższej rozdzielczości obszarów zainteresowania w 2D.Mamy nadzieję, że ta publikacja pomoże Państwu uzyskać dostęp do mocy mikrotomografii tkankowej o wysokiej rozdzielczości.

rigid-embedding-fixed-stained-whole-millimeter-scale-specimens-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Prezentujemy podejście do rejestracji obrazów do trójwymiarowej (3D) histologicznej rekonstrukcji objętości, które ułatwia badanie zmian zachodzących w narządzie na poziomie makrostruktur składających się z komórek. Korzystając z tego podejścia, zbadaliśmy zmiany 3D między gruczołami sutkowymi typu dzikiego i Igfbp7-null.

Rekonstrukcja trójwymiarowej objętości histologicznej i jej zastosowanie do badania mysich gruczołów sutkowych

Ten protokół jest ukierunkowany na konkretne komórki w tkance do obrazowania w rozdzielczości nanoskali za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Duża liczba seryjnych odcinków materiału biologicznego zatopionego w żywicy jest najpierw obrazowana w mikroskopie świetlnym w celu identyfikacji celu, a następnie w sposób hierarchiczny w SEM.

Multimodalne hierarchiczne obrazowanie odcinków szeregowych w celu znalezienia określonych celów komórkowych w dużych objętościach

Przedstawiono protokół do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkanek za pomocą metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego, przeznaczonej do rentgenowskiej tomografii komputerowej.

Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę sztywnego osadzania małych próbek biologicznych w żywicy akrylowej do mikro-CT. Technika umożliwia długotrwałe przechowywanie i wielokrotne obrazowanie zebrafish, Drosophila i Daphnia bez utraty cech anatomicznych.

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej (Wideo) | JoVE Journal

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

Przeglądaj więcej filmów