Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej
17 października 2018
Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.
Metoda ta umożliwi generowanie trójwymiarowych obrazów histologicznych z małych próbek w skali milimetrowej, w tym małych organizmów modelowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że osadzone próbki są bardzo stabilne, co umożliwia przechowywanie próbek przez długi czas i wielokrotne ich obrazowanie, na przykład przy użyciu różnych metod obrazowania na przestrzeni lat. Wyniki tej metody będą bardzo przydatne w wysokoprzepustowych zjawiskach modelowych systemów, toksykologii, a potencjalnie nawet w diagnostyce tkanek ludzkich.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ próbki są stosunkowo małe i trudne do orientacji lub manewrowania. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ należy zwrócić uwagę, aby uniknąć uszkodzenia próbki. W przypadku młodych lub starszych zebry należy je głodzić przez co najmniej 24 godziny, aby zmniejszyć objętość treści jelitowej przed utrwaleniem.
Przenieś 10% neutralny bufor formaliny lub NBF i 2x Tricaine-S wstępnie schłodzony do czterech stopni Celsjusza na lód. Podwój objętość wody dla ryb dzięki schłodzonemu 2x MS-222 do szybkiej i humanitarnej eutanazji. Sześćdziesiąt sekund po tym, jak ryby przestaną się poruszać, po humanitarnej eutanazji, umieść rybę w schłodzonym 10% roztworze NBF w płaskich szklanych fiolkach o temperaturze pokojowej i utrwal je na noc.
Drugiego dnia opłucz utrwalone próbki ryb trzy razy w 1x PBS pH 7,4 przez 10 minut każda. Po umyciu zanurzyć próbki w 35% etanolu i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie powtórz ten krok z 50% etanolem.
Próbki inkubować w świeżo przygotowanym 0,3% roztworze kwasu fosfatungsenowego lub PTA przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając w celu ich zabarwienia. Rozpocznij trzeci dzień od przygotowania mieszaniny 100% etanolu i białej żywicy akrylowej LR jeden do jednego, objętość po objętości. Przepłukać próbki trzykrotnie w 70% etanolu przez 10 minut każda, a następnie inkubować próbki w 90% etanolu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie mieszając.
Powtórzyć inkubację w tych samych warunkach, ale 95% etanolu, a następnie jeszcze dwa razy ze 100% etanolem. Na koniec zanurz próbki w mieszaninie etanolu i białej żywicy akrylowej LR jeden do jednego i inkubuj w temperaturze pokojowej przez noc z delikatnym mieszaniem. Czwartego dnia wyjmij mieszaninę z fiolki i dodaj 100% białą żywicę LR, aby zanurzyć próbki.
Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Po dwóch godzinach zastąp żywicę świeżą białą żywicą 100% LR i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Do montażu urządzenia do zatapiania należy użyć rurki polietylenowej MI o średnicy co najmniej 0,1 milimetra większej niż średnica próbki i przyciąć ją do standardowej długości 30 milimetrów.
Następnie przymocuj głowicę mikrorurki P1000 do białego końca adaptera do osadzania i włóż rurkę z poli MI do jej wąskiego końca. Po inkubacji próbek przez godzinę w 100% białej żywicy LR, przenieś je do małej łodzi wagowej i całkowicie zanurz w białej żywicy 100% LR. Skierować rurkę aparatu do osadzania na szeroki koniec utrwalonej próbki lub w stronę głowicy i powoli pipetować próbkę do rurki.
Umieść próbkę na środku rurki, upewniając się, że rurka powyżej i poniżej próbki jest wypełniona żywicą. Zaraz potem, aby uszczelnić otwarty koniec rurki, spłaszcz kawałek miękkiej plasteliny na bazie oleju w arkusz o grubości około jednego milimetra i ustabilizuj rurkę między palcem wskazującym i środkowym. Następnie powoli dociśnij glinę do końca rurki kciukiem i usuń nadmiar gliny.
Wyjmij urządzenie do osadzania z głowicy mikrorury. Wyciągnij rurkę, delikatnie obracając. Przytrzymując palec przy uszczelnionym końcu, aby zapobiec wyrzuceniu gliny, uszczelnij drugi koniec, powoli wciskając nieuszczelniony koniec rurki w glinę.
Umieść rurkę poziomo na stojaku na probówki i pozwól żywicy polimeryzować przez 24 godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza w piekarniku. Pod koniec następnego dnia należy pobrać próbki do pobrania obrazu. Pomyślnie osadzona larwa danio pręgowanego nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza.
Jeśli powietrze zostanie uwięzione podczas procesu zatapiania, może przesunąć się w kierunku próbki, jeśli próbka nie zostanie umieszczona poziomo podczas polimeryzacji, co może pogorszyć jakość obrazu. Protokół ten okazał się skuteczny w osadzaniu różnych organizmów modelowych. Takich jak danio pręgowany, Drosophila, rozwielitki i zarodek myszy.
Udane osadzenie można pokazać za pomocą zrekonstruowanych renderingów 3D, zobrazowanych za pomocą mikrotomografii komputerowej dla danio pręgowanego, rozwielitki i Drosophila. Zatapianie żywicy można zobaczyć we wszystkich skanach poza próbką, ale nie zakłóca ona samej próbki. Okazy te mogą być przechowywane przez dłuższy czas i ponownie wykorzystywane do wielu sesji obrazowania, jak pokazano na przykładzie larw danio pręgowanego sfotografowanych w 2011 roku.
A potem znowu w 2013 roku. Cechy anatomiczne są zachowane po przechowywaniu, co widać na zbliżeniach mięśni z obu skanów. Co więcej, profile intensywności znormalizowane do odpowiadających im średnich wzdłuż linii segmentowych pokazują przestrzennie pasujące lokalne szczyty w obu skanach.
Średnie wartości intensywności dla wybranych regionów w obu skanach zostały podzielone przez średnią dla tła i wykorzystane do wygenerowania stosunku sygnału do szumu, który dobrze korespondował między skanami. Podczas próbowania tej metody ważne jest, aby pracować delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia próbki i pracować ostrożnie, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak histologia lub mikroskopia elektronowa, w celu zbadania wzorców ekspresji białek lub osiągnięcia wyższej rozdzielczości obszarów zainteresowania w 2D.
Mamy nadzieję, że ta publikacja pomoże Państwu uzyskać dostęp do mocy mikrotomografii tkankowej o wysokiej rozdzielczości.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę zatapiania próbek o rozmiarach milimetrowych, ze szczególnym uwzględnieniem zastosowania żywicy akrylowej i rurek poliamidowych. Technika ta umożliwia długoterminowe przechowywanie oraz wielokrotne sesje obrazowania, co ułatwia badanie architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Histologia
Wstęp
- Techniki zatapiania są kluczowe dla zachowania małych próbek biologicznych.
- Stabilność zatopionych próbek umożliwia długotrwałe przechowywanie i wielokrotne obrazowanie.
- Obrazowanie mikro-CT dostarcza szczegółowych trójwymiarowych obrazów histologicznych.
- Typowe wyzwania obejmują orientację próbki oraz unikanie uszkodzeń podczas przygotowania.
Cel badania
- Opracowanie protokołów zatapiania małych preparatów w celu przeprowadzenia obrazowania.
- Zwiększenie stabilności i użyteczności próbek w czasie.
- Wykazanie skuteczności metody na różnych organizmach modelowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie preparatów z wykorzystaniem formaliny w buforze neutralnym oraz Tricaine-S.
- Zatopienie próbek w białej żywicy akrylowej LR z użyciem rurek polimidowych.
- Polimeryzacja żywicy w kontrolowanych temperaturach.
- Obrazowanie mikro-CT w celu trójwymiarowej rekonstrukcji próbek.
Główne wyniki
- Pomyślne zatopienie w medium próbek zebrafish, Drosophila oraz Daphnia.
- Uzyskanie wysokiej jakości obrazów bez pęcherzyków powietrza wpływających na próbki.
- Zachowanie cech anatomicznych próbek podczas długotrwałego przechowywania.
- Metoda umożliwia wielokrotne sesje obrazowania z powtarzalnymi wynikami.
Wnioski
- Opracowana metoda zatapiania jest skuteczna w przypadku małych próbek biologicznych.
- Długoterminowe przechowywanie i możliwość ponownego wykorzystania próbek zwiększają możliwości badawcze.
- Niniejszy protokół może ułatwić dalsze badania w zakresie histologii i mikroskopii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Histologia 3D bez konieczności wykonywania przekrojów za pomocą mikro-CT, możliwa dzięki sztywnemu zatopieniu utrwalonych i barwionych preparatów w skali milimetrowej, odpowiada na krytyczną potrzebę wysokorozdzielczej, wolumetrycznej analizy tkanek we wczesnych etapach odkryć oraz w badaniach przedklinicznych. Podejście to zachowuje integralność anatomiczną i umożliwia powtarzalne, ilościowe obrazowanie, co wspiera rzetelny screening fenotypowy oraz ograniczanie ryzyka w badaniach mechanistycznych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną i efektywność wykorzystania zasobów w ramach potoków badawczych systemów modelowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia kompleksową analizę trójwymiarowej architektury tkanki w celu walidacji funkcjonalnych celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zachowanie cech komórkowych i subkomórkowych do wielokrotnych analiz.
- Ułatwia prowadzenie badań opartych na hipotezach w organizmach modelowych istotnych dla szlaków chorobowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia stabilne, wielokrotnie wykorzystywalne próbki do wysokoprzepustowego screeningu fenotypowego oraz procesów toksykologicznych.
- Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki obrazowania do standaryzacji testów.
- Umożliwia kompatybilność obrazowania międzyplatformowego, wspierając elastyczność analiz w dalszych etapach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zachowuje wierność anatomiczną dla badań podłużnych oraz spójność w zakresie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając wieloletnią reanalizę próbek.
- Ogranicza zmienność biologiczną oraz ryzyko w ocenie modeli przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda zatapiania i obrazowania integruje etapy wczesnego odkrywania, przesiewania fenotypowego oraz walidacji modeli przedklinicznych, zapewniając wielokrotnego użytku platformę do analizy tkanek w 3D.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotezy zerowej oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie wielokrotnego, ilościowego obrazowania 3D utrwalonych preparatów.
- Przesiewanie: Dostarcza stabilne próbki gotowe do analizy, umożliwiając skalowalną ocenę fenotypową i toksykologiczną.
- Analityka: Zapewnia ilościowe profile intensywności oraz pomiary stosunku sygnału do szumu w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Pozwala na przechowywanie próbek przez wiele lat w celu prowadzenia międzybadawczych analiz biomarkerów i analiz anatomicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy długoterminowy, zestandaryzowany zasób do obrazowania wielomodalnego i badań retrospektywnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na tkankach.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, zwiększa powtarzalność i umożliwia skalowalne procesy obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez zachowanie cennych próbek do wielokrotnych analiz.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów w fazie odkrywczej i przedklinicznej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie obrazowania mikro-CT oraz precyzyjnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć ich uszkodzenia i wprowadzenia pęcherzyków powietrza.
- Wymaga dostępu do materiałów do zatapiania, rurek polimidowych oraz infrastruktury do polimeryzacji z kontrolą temperatury.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej orientacji próbek i jakości obrazowania.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do wielu małych organizmów modelowych i typów tkanek w ramach określonych ograniczeń rozmiarowych.
- Kluczowe jest ścisłe przestrzeganie kroków protokołu, aby zachować integralność próbek i wierność obrazowania.
