Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii ludzkiej linii rozrodczej, takie jak to, w jaki sposób powstają lub naprawiane są uszkodzenia w genomie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że ludzkie pierwotne komórki rozrodcze można wytworzyć w ciągu dwóch tygodni z przygotowanych komórek iPS o pluripotencji z genetycznym podłożem predysponującym do choroby. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zapobiegania upośledzeniu genomu w ludzkich komórkach linii rozrodczej, ponieważ nasz model hodowli komórkowej może pomóc nam zmniejszyć toksyczność leku terapeutycznego dla linii zarodkowej.

Aby rozpocząć od wytworzenia ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych lub ludzkich PGCLC, należy przygotować płytki pokryte białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej i zawiesinę komórkową ludzkich iPSC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować jednokomórkową zawiesinę ludzkich iPSC o zaszczepionej pluripotencji w pożywce mTeSR1 zawierającej inhibitor kinazy Rho Y-27632. Ostrożnie dostosuj gęstość komórek do 100 000 komórek na mililitr.

Zaszczepić dwa mililitry zawiesiny komórkowej przygotowanych ludzkich iPSC w każdym dołku sześciodołkowych płytek pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, upewniając się, że komórki są równomiernie rozmieszczone, potrząsając płytkami w pionie i poziomie. Inkubować płytki w inkubatorze CO2 składającym się z trzech gazów w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bardzo ważne jest, aby zaszczepić dokładnie 200 000 komórek w każdym dołku sześciodołkowej płytki.

Dokładne liczenie komórek ma kluczowe znaczenie. Po zakończeniu przejściowej konwersji do naiwnej pluripotencji komórki powinny wyglądać na nadmiernie zlewające się, co jest normalne. Dokładny czas zmiany pożywki jest ważny dla osiągnięcia wysokich wartości PGCLC u ludzi i odtwarzalności eksperymentalnej.

Gęstość hodowli 4i hiPSC jest wysoka w tych warunkach i oczekuje się, że komórka stanie się zlewająca się w ciągu 48 do 72 godzin po inokulacji. 24 godziny po inokulacji zmień pożywkę na dwa mililitry na studzienkę pożywki mTeSR1 bez Y27632. Rozpocznij konwersję ludzkich iPSC w stanie pluripotencji do naiwnych pluripotencjalnych komórek macierzystych 4i, podgrzewając 50 mililitrów kompletnej pożywki 4i w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po 48 i 72 godzinach od inokulacji wyjąć płytki z inkubatora i zmienić pożywkę na 2 mililitry na studzienkę po 4i kompletnej pożywki. Odwirować pokrytą detergentem płytkę mikrodołkową o masie 1 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Sprawdź studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.

Przepłukać studzienki zgodnie z opisem w protokole tekstowym i powtórzyć wirowanie. Dodać 4i kompletną pożywkę do przepłukanych studzienek. Odwirować płytkę o stężeniu 1 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie sprawdzić studzienki.

Aby zaszczepić ludzkie iPSC 4i w płytce mikrodołka, należy przygotować zawiesinę ludzkich komórek iPSC zgodnie z opisem w protokole. Przefiltruj tę zawiesinę komórek przez sitko o wielkości porów 40 mikrometrów, aby usunąć agregaty komórkowe. Umyj sitko jednym mililitrem wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża 4i trzy razy, aby zebrać wszystkie komórki z sitka i policzyć komórki za pomocą licznika kultur.

Następnie rozcieńczyć tę jednokomórkową zawiesinę naiwnych ludzkich iPSC 4i do 27 do 32,4 miliona komórek w 9 mililitrach, wstępnie podgrzanym, kompletnym pożywce 4i zawierającej Y27632. Wyjąć z inkubatora trójgazowego wcześniej przygotowaną płytkę mikrodołkową zawierającą 1 mililitr kompletnej pożywki 4i na studzienkę. Zaszczepij 1 mililitr naiwnej ludzkiej zawiesiny iPSC 4i do każdej studzienki, aby osiągnąć stężenie od 3,0 do 3,6 miliona komórek na studzienkę.

Delikatnie odpipetować, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Odwirować płytkę o masie 100 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę w inkubatorze CO2 składającym się z trzech gazów, uważając, aby nie naruszyć komórek granulowanych w mikrostudzienkach i inkubuj przez 24 do 30 godzin, ponieważ inkubacja przez noc jest niewystarczająca do wytworzenia ciasnych ciał zarodkowych lub EB.

Podgrzej 5 mililitrów ludzkiego podłoża podstawowego PGCLC i 20 mililitrów ludzkiego kompletnego podłoża PGCLC przez co najmniej pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza Ostrożnie umieść sitko komórkowe o wielkości porów 40 mikrometrów do góry nogami na 50-mililitrowej stożkowej rurce polipropylenowej. Aby odłączyć EB od mikrostudzienek, delikatnie odpipetuj każdą studzienkę płytki. Aby usunąć komórki, które nie są włączone do EB, przefiltruj zawartość wszystkich studzienek przez sitko do komórek.

Delikatnie przemyć EB zatrzymane na membranie sitka komórkowego 1 mililitrem wstępnie podgrzanego ludzkiego podłoża podstawowego PGCLC i powtórzyć płukanie pięć razy. Umieść świeżą stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów na sitku do komórek, tak aby sitko do komórek było teraz umieszczone prawą stroną do góry w nowej probówce. Szybko odwróć sitko komórkowe za pomocą nowej rurki, która umieści EB poniżej membrany sitka komórkowego.

Dodaj 18 mililitrów wstępnie podgrzanej ludzkiej kompletnej pożywki PGCLC do membrany sitka komórkowego, aby zebrać EB w stożkowej probówce. Następnie należy umieścić 3 mililitry zawiesiny EB na studzienki w dołku sześciodołkowej płytki o niskim mocowaniu. Umieść płytkę na kołysce wahadłowej w inkubatorze trójgazowym i ostrożnie ustaw prędkość kołysania na około 20 obrotów na minutę.

W dniach od siódmego do trzynastego eksperymentu należy codziennie przygotowywać świeżo 20 mililitrów kompletnej pożywki dla ludzi PGCLC. Zdejmij płytkę z wahacza, co spowoduje, że EB opadną na dno studzienek. Usuń stare podłoże bez suszenia EBs, tak aby w każdej studzience pozostało około 0,2 mililitra starego podłoża.

Dodaj 3 mililitry na studzienkę świeżej pożywki PGCLC dla ludzi, po codziennym usuwaniu starej pożywki. Aby zidentyfikować ludzkie PGCLC jako komórki OCT4-dodatnie, zbierz EB do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskim poziomie wiązania. Pozwól EB opaść na dno w temperaturze pokojowej i wyrzuć pożywkę.

Opłucz EBs lodowatym środkiem 1X PBS. Po usunięciu PBS inkubować EB w 1 mililitrze lodowatego zimnego 1% objętościowo azydku sodu w PBS na lodzie przez pięć minut. Pozwól EB opaść na dno w temperaturze pokojowej.

Po odrzuceniu supernatantu przepłukać EB lodowatym PBS. Rozmrozić 200 mikrolitrów białka macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie. Dodać białko do probówki zawierającej EBs.

Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na około 10 minut, aż żel zestali się, a EB zostaną osadzone. Aby utrwalić EBs, dodaj 1 mililitr 4% formaldehydu w PBS do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut z delikatnym kołysaniem. Następnie wyrzuć formaldehyd i raz spłucz EB lodowatym PBS.

Dodaj 1 mililitr 70% etanolu. Przechowuj w 70% etanolu w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia lub przystąp do przetwarzania za pomocą standardowego protokołu FFPE. Gęstość komórek i równomierne rozmieszczenie komórek w każdym dołku mają kluczowe znaczenie.

Ludzkie IPSC w 2 mililitrach Y27632 uzupełnionej pożywki na dołek płytki sześciodołkowej osiągają 20 do 30% konfluencji po 24 godzinach. Po dodatkowej 24-godzinnej hodowli w pożywce mTeSR1, pod nieobecność Y27632, komórki agregowały się i tworzyły kolonie, zajmujące około 30% obszaru wzrostu. Po 24 godzinach hodowli w pożywce przeprogramowującej 4i, komórki osiągnęły konfluencję.

Po dodatkowych 24 godzinach hodowli w pożywce 4i komórki stały się gęściej upakowane. Po 24-godzinnej inkubacji w mikrostudzienkach w pożywce przeprogramowującej 4i, komórki utworzyły EB, których okrągły kontur był widoczny po 24 do 30 godzinach od inokulacji. EB trzymane w ludzkim podłożu PGCLC, w warunkach kołysania nieprzylegających, zachowywały swój kulisty kształt bez agregacji po 24 godzinach.

Po 192 godzinach EB były większe, zachowując tę samą morfologię. Po 5 dniach komórki wyłoniły się jako komórki wykazujące ekspresję OCT4 na powierzchni EBs, zwiększając ich liczbę po 8 dniach. Komórki z jednokomórkowej zawiesiny ludzkich PGCLC zostały wzbogacone jako komórki CD38-dodatnie przez FACS.

Komórki, które nie wykazują ekspresji CD38, były kontrolą negatywną. Aby uniknąć zanieczyszczenia, komórki FACS bramki CD38-dodatnie i CD38-ujemne zostały oddzielone szerokim marginesem. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby przestrzegać dokładnego zliczania komórek i czasu zmiany pożywki.

Pominięcie zmiany pożywki nawet na jeden dzień lub zmniejszenie objętości tej pożywki na dowolnym etapie może spowodować masową śmierć komórki. Szybkość kołysania się kultur embrionalnych ciał zarodkowych musi być starannie zoptymalizowana.