Name: Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu 13 dni. Ta technika umożliwia badanie toksyczności germinalnej i integralności genomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Shiomi Yawata i Chie Owa za pomoc techniczną podczas początkowych studiów. Badanie to było wspierane przez granty NIEHS / NIH R01 ES023316 i R21ES024861 dla TS oraz przez grant Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) dla JHH.

<ol><li>Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+primordial+germ+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).</li>
<li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375(2012).</li>
<li>De Felici, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-85729-826-3_2">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li>
<li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li>
<li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li>
<li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li>
<li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li>
<li>Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li>
<li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li>
<li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li>
<li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).</li>
<li>Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li>
<li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li>
<li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li>
<li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li>
<li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li>
<li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erasure+of+DNA+methylation%2C+genomic+imprints%2C+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li>
<li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niezawodna produkcja hPGCLC przy użyciu opisanego tutaj protokołu została potwierdzona na trzech niezależnych klonach ludzkich iPSC z prawidłowym diploidalnym kariotypem10. Te klony iPSC pochodziły z tej samej ludzkiej hodowli komórek fibroblastów skóry skóry u noworodków10. Zostaną one dostarczone przez autorów tego artykułu badaczom na żądanie i na podstawie odpowiedniej umowy o transfer materiałów oraz ustaleń dotyczących wysyłki zamrożonych żywych komórek ludzkich. Obecnie nie wiadomo, czy normalny kariotyp jest wymagany do silnej produkcji hPGCLC przy użyciu naszego protokołu, czy tych zgłoszonych przez inne laboratoria.
Ostatnie badania wykazały, że produkcja hPGCLC z hiPSCs11 lub ESCs14 przy użyciu protokołu opisanego przez grupę Saitou z Uniwersytetu w Kioto8 jest zależna od ekspresji EOMESODERMINY, czynnika transkrypcyjnego T-box wymaganego do indukcji SOX17. Wydaje się, że SOX17 funkcjonuje jako główna linia determinująca czynnik transkrypcyjny w różnicowaniu linii zarodkowej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych6. EOMESODERMIN jest kodowany przez gen EOMES , a nokaut CRISPR/Cas9 EOMES spowodował prawie całkowity brak indukcji SOX17 w warunku11 wytwarzającym hPGCLC, a ekspresja innych genów przebiegała zgodnie z tym samym wzorcem komórek nokautujących SOX17. Nadekspresja EOMESODERMINY z indukowalnego wektora w komórkach nokautujących EOMES-null podczas hodowli indukcyjnej hPGCLC skutecznie uratowała solidną produkcję hPGCLC, a także indukcję genów linii zarodkowej, w tym SOX17. W przeciwieństwie do tego, indukowana nadekspresja SOX17 również uratowała solidną produkcję PGCLC, ale bez indukowania EOMES. Tak więc EOMESODERMIN jest krytycznym induktorem SOX17 i wydaje się, że jest to najważniejsza rola EOMESODERMIN w indukcji hPGCLC z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Nasz protokół indukuje SOX17 whiPSCs 10, ale jego zależność od indukcji EOMESODERMINE czeka na ustalenie.
Protokół ten przekształca ludzkie iPSC o pierwotnej pluripotencji utrzymywane w pożywce mTeSR1 w niezależną od ERK naiwną pluripotencję przez 96 godzin w pożywce 4i6, która jest zmodyfikowaną naiwną pożywką dla ludzkich komórek macierzystych (NHSM)5. Nasze próby wygenerowania hPGCLC, zaczynając od tych samych ludzkich klonów iPSC, ale utrzymywanych w innych dostępnych na rynku pożywkach hodowlanych iPSC dla ludzi przed hodowlą w pożywce przeprogramowującej 4i, skutkowały różnym stopniem niższych plonów hPGCLC. Chociaż to, czy długoterminowa adaptacja w innych pożywkach poprawia produkcję hPGCLC, czy nie, zostanie określone w przyszłych badaniach, obserwacja ta sugeruje, że dokładny stan primed pluripotencji ludzkich iPSC przed przeprogramowaniem 4i znacząco wpływa na tworzenie EB w pożywce 4i i różnicowanie EB w pożywce hPGCLC.
Produkcja hPGCLC z hiPSC zgodnie z naszym protokołem jest solidna i wysoce powtarzalna, częściowo dzięki zastosowaniu płytek mikrodołkowych, które umożliwiają wydajną produkcję dużej liczby EB (~8 000 EB na partię) o jednolitej wielkości (3 000 hiPSC na EB). Liczba EB łatwo wytworzonych w jednej partii eksperymentu przy użyciu naszego protokołu może być znacznie większa niż metod wykorzystujących zwykłe studzienki do hodowli komórkowych z dnem U. Produkcja dużej liczby EB o jednakowej wielkości, równomiernie naszpikowanych hPGCLC, może zapewnić wyjątkowe możliwości wysokoprzepustowych badań chemicznych w celu identyfikacji aktywatorów lub inhibitorów o małej masie cząsteczkowej wpływających na specyfikację PGC lub ich cechy biologiczne, takie jak przeprogramowanie epigenetyczne. Takie EB mogą być również przydatne do oceny toksykologicznej dużej liczby substancji toksycznych dla komórek rozrodczych, w tym nie tylko zanieczyszczeń środowiska, ale także leków przepisanych klinicznie, takich jak chemioterapeutyki.
Do krytycznych czynników solidnej i powtarzalnej produkcji hPGCLC przy użyciu przedstawionego protokołu należą: (i) wykorzystanie zdrowych hiPSC utrzymywanych w mTeSR1 na białku macierzy zewnątrzkomórkowej, (ii) inokulacja dokładnej liczby komórek, jak określono i ścisłe przestrzeganie czasu zmiany pożywki i subhodowli, (iii) wybór dużej partii ludzkiego rekombinowanego BMP4, oraz (iv) zminimalizowanie fizycznych uszkodzeń EB podczas hodowli bujania. Z naszego doświadczenia wynika, że najlepsza partia odczynnika BMP4 działała przy stężeniu 100 ng/ml, podczas gdy inne partie odczynników BMP4 wymagały dawek 2X lub większych. Z drugiej strony, wydajność produkcji hPGCLC przy użyciu najlepszej partii BMP4 raczej zmniejszała się przy wyższych dawkach BMP4 (np . 200 ng/ml). Zalecamy przetestowanie kilku różnych partii rekombinowanych ludzkich odczynników BMP4 uzyskanych od wielu dostawców pod kątem ich skuteczności we wspieraniu wytwarzania hPGCLC i zabezpieczenia dużej ilości najlepszej partii.
Unikalną cechą naszego protokołu hPGCLC jest to, że hPGCLC są zlokalizowane na najbardziej zewnętrznej warstwie powierzchniowej EBs10 (rysunek 8), podczas gdy inne protokoły mogą generować hPGCLC w środku agregatów komórkowych 6,8. Ciała embrionalne mają tendencję do tworzenia wielu odrębnych warstw, takich jak powierzchnia, powłoka zewnętrzna, powłoka wewnętrzna i rdzeń, a centralne regiony rdzenia są często nekrotyczne z powodu ograniczonego dopływu składników odżywczych, tlenu, a także czynników wzrostu sprzyjających przetrwaniu dostarczanych z pożywki hodowlanej przez dyfuzję20. Lokalizacja hPGCLC na powierzchni EB bez możliwych ograniczeń ze względu na ograniczoną dyfuzję w kierunku centrum EB może być korzystna dla bezpośredniej, kontrolowanej w czasie i dawce ekspozycji hPGCLC na leki lub substancje toksyczne w badaniach farmakologicznych lub toksykologicznych.
Podczas gdy mysie PGCLC wykazują silną demetylację DNA w całym genomie, obejmującą przynajmniej częściowo imprinting regionów kontrolnych 7,19,20, stopień globalnej demetylacji gDNA w hPGCLC wydaje się słabszy niż w mysich PGCLCS lub PGCs 6,7. Profile transkryptomalne sugerują, że hPGCLC mogą przypominać wcześniejsze stadium embrionalnych PGC niż mysie PGCLC10. Doniesiono, że przedłużona hodowla EB w warunkach produkcji hPGCLC powodowała zwiększony stopień demetylacji gDNA7; jednak to, czy wydłużony okres hodowli hPGCLC w EB lub w izolowanych komórkach może osiągnąć bardziej zaawansowane etapy różnicowania linii zarodkowej, musi zostać określone w przyszłych badaniach.

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są wspólnymi prekursorami wszystkich komórek rozrodczych u obu płci. Większość naszej wiedzy na temat rozwoju PGC w zarodkach ssaków została uzyskana dzięki badaniom laboratoryjnym na myszach1,2. W 6,0-6,5 dniu embrionalnym zarodków myszy w epiblastach znajduje się 6 lub podobna niewielka liczba prekursorów PGC, z których indukowana jest populacja założycielska ~40 PGC w sposób zależny od białek morfogenetycznych kości Bmp2 i Bmp4 wydzielanych z sąsiednich komórek. Najwcześniejsze ludzkie PGC zidentyfikowane do tej pory w zarodkach znajdowały się na endodermalnej ścianie woreczka żółtkowego mniej więcej pod koniec trzeciego tygodnia ciąży3. Ponieważ jest to to samo miejsce, w którym migrujące PGC są obserwowane w zarodkach myszy, jest prawdopodobne, że obserwowane ludzkie PGC znajdowały się na ścieżce migracji, ale nie populacja założycielska. Brakuje jednak badań śledzących wcześniejsze stadia PGC lub prekursorów PGC w ludzkich embrionach.
Dostęp do ludzkich embrionalnych PGC jest trudny zarówno ze względu na przeszkody techniczne, jak i etyczne. Aby pokonać te przeszkody, niedawno stworzono modele hodowli komórkowych podobnych do PGC z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Pluripotencja to komórkowa zdolność do różnicowania się w linię zarodkową i trzy embrionalne listki zarodkowe4. Podczas gdy ludzkie PSC utrzymywane w pożywce mTeSR1 (gotowa do użycia, dostępna na rynku pożywka opracowana do utrzymywania ludzkich PSC w stanie pierwotnej pluripotencji) na szalkach pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej mają pluripotencję w stanie pierwotnym4, w 2013 r. laboratorium Jacoba Hanny wykazało, że przygotowane komórki pluripotencji mogą zostać przekształcone w naiwny stan pluripotencji poprzez wystawienie na działanie naiwnego ludzkiego podłoża z komórek macierzystych (NHSM) zawierającego substancję chemiczną inhibitory kinaz białkowych ERK1/2, GSK3, JNK, ROCK, PKC i p38 MAPK oraz czynniki wzrostu LIF, TGF, bFGF5. W 2015 r. grupa badawcza kierowana przez Hannę i Azima Surani dokonała pierwszej solidnej produkcji ludzkich komórek podobnych do PGC (hPGCLC) z PSCs6. Później kilka innych laboratoriów, w tym nasze, zgłosiło generowanie hPGCLC z PSC przy użyciu nieco innych protokołów7,8,9,10. Nasze badanie dostarczyło dowodów na to, że hPGCLC wygenerowane przy użyciu różnych protokołów (które są podsumowane w tabeli S1 naszego wcześniej opublikowanego badania10) są transkryptomicznie podobne do siebie10. Dostępne dowody potwierdzają podobieństwo ludzkich PGCLC do ludzkich embrionalnych PGC we wczesnym stadium przed globalnym wymaz<ywaniem epigenetycznym sup class="xref">7 i/lub migracją chemotaktyczną10.
Badania embrionalnych PGC myszy, mysich PGCLC i ludzkich PGCLC (ale z bardzo ograniczonym dostępem do ludzkich PGC) wykazały, że mechanizmy molekularne specyfikacji PGC różnią się znacznie między mysim a ludzkim 1,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Na przykład Prdm14 odgrywa kluczową rolę w specyfikacji PGC u embrionów myszy, ale jego rola w specyfikacji PGC u ludzi wydaje się ograniczona1,15. W przeciwieństwie do tego, indukcja SOX17 przez EOMESODERMIN jest niezbędna dla specyfikacji PGC6,11,14, podczas gdy te czynniki transkrypcyjne wydają się zbędne dla specyfikacji PGC myszy15. Te wstępne osiągnięcia badań z wykorzystaniem hPGCLC silnie wspierają znaczenie tego modelu hodowli komórkowej jako substytutu ludzkich embrionalnych PGC.
Ostatnio opublikowane badania, obejmujące dogłębną ocenę sekwencjonowania analizy liczby kopii genomowego DNA w naszym laboratorium, wykazały, że długotrwałe utrzymywanie PSC w stanie naiwnej pluripotencji znacznie zwiększa ryzyko niestabilności chromosomalnej i anomalii strukturalnych. Zjawisko to zaobserwowano zarówno w przypadku PSC mouse18, jak i human19. Oryginalny protokół produkcji hPGCLC opisany przez Hanna/Surani został opracowany dla ludzkich PSC utrzymywanych w pożywce 4i o naiwnej pluripotencji przez co najmniej 2 tygodnie6. Aby zachować prawidłowy diploidalny kariotyp ludzkich PSC i PGCLC, opracowaliśmy zmodyfikowany protokół, w którym ludzkie PSC są wystawione na działanie pożywki 4i tylko przez 72 godziny10, który jest przedstawiony w tym artykule. Ludzkie komórki iPS (hiPSC) są utrzymywane w stanie pluripotencji pierwotnej. Bezpośrednio przed utworzeniem EB komórki są inkubowane w naiwnym pożywce przeprogramowującej 4i (zmodyfikowanej pożywce NHSM) przez 48 godzin. Komórki są następnie dysocjowane i pakowane w mikrodołki, tworząc EB przez dodatkowe 24 godziny w pożywce 4i. EB są utrzymywane w pożywce indukcyjnej hPGCLC zawierającej wysokie stężenie rekombinowanego ludzkiego BMP4 w warunkach kołysania dla hodowli bez przyłączenia przez okres do 8 dni, aby uzyskać maksymalną wydajność hPGCLC. Po 8-dniowej hodowli EB hPGCLC można wyizolować ze zdysocjowanych komórek EB za pomocą FACS jako komórki CD38 + z wydajnością do ~ 40% w sortowalnej zawiesinie pojedynczej komórki sortowanej przez FACS. Podczas gdy inne opublikowane metody7,8,9, w tym oryginalny protokół przed naszymi modyfikacjami6, zazwyczaj generują hPGCLC w spontanicznie utworzonych agregatach komórkowych bez określonej lokalizacji, hPGCLC wytwarzane przez nasz protokół są obserwowane na powierzchni ciał embrionalnych (EB).

<table><tbody><tr><td>Primed pluripotencja hiPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Aliquot Matrigel w objętości wskazanej przez producenta (około 200 &mu; L). Używaj zimnych rurek. Przechowywać w temperaturze -80 stopni; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21041-025</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Rozpuszcza się poprzez dodanie 5X Suplementu do podłoża podstawowego. Odtworzone podłoże może być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C przez do 4 tygodnie bez wpływu na wydajność hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon</td><td>1683</td><td>Rozcieńczyć 5 mg Y27632 (MW 320,26) z 312,2 &mu; L wody do przygotowania 50 mM roztworu podstawowego Y27632. Sterylizować przez filtrację (0,22 &mu; m). Podwielokrotność 20 &mu; L/tuba x 15 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07930</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innowacyjne technologie komórkowe</td><td>AT104-500</td><td>Enzym dysocjacji komórek; podwielokrotność 40 ml / probówkę x 12 probówek i przechowywać w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>4i kultura hiPSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286101</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum KnockOut</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Porcja 40 ml/probówkę x 12 probówek i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882-100MG</td><td>Dodaj 0,1 ml lodowatego kwasu octowego do 10 ml wody. Sterylizować przez filtrację (0,22 um). Rozcieńczyć 100 mg liofilizowanego proszku insuliny zimnym 10 ml zakwaszonej wody, aby uzyskać 10 mg/ml roztworu podstawowego. Porcja 650 &mu; L/tuba x 15 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>ludzki LIF</td><td>PeproTech</td><td>300-05</td><td>Repuszcza 250 &mu; g ludzki LIF z 250 &mu; L woda. Dodaj 750 &mu; L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do 250 &mu; g/ml ludzkiego roztworu podstawowego LIF. Aktywność właściwa tego produktu wynosi >10 000 jednostek/&mu;g. Porcja 40 ul/tuba x 25 probówek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>ludzki FGF2</td><td>R& D Systems</td><td>4114-TC</td><td>Rozpuść 1 mg ludzkiego FGF2 z 5 ml PBS(-) w celu uzyskania 200 &mu; g/ml ludzkiego roztworu podstawowego FGF2. Podwielokrotność 100 &mu; L/tuba x 50 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>ludzki TGF-&beta; 1</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>Reconstitite 50 &mu; g z 50 &mu; L 10 mM kwasu cytrynowego (pH 3,0). Dodaj 150 &mu; L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do 250 &mu; g/ml ludzkiego TGF-&beta; 1 roztwór podstawowy. Podwielokrotność 4 &mu; L/tuba x 50 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>4i podłoże podstawowe</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać podłoże podstawowe 4i. 500 ml KnockOut DMEM 100 ml zamiennika surowicy KnockOut 6 ml penicyliny-streptomycyny-glutaminy (100x) 6 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (100x) 650 &mikro; L 10 mg/ml Insulina z trzustki bydlęcej 40 &mikro; L z 250 i mikro; g/ml ludzkiego LIF 20 i mikro; l z 200 i mikro; g/ml FGF2 4 i mikro; l z 250 i mikro; g/ml ludzkiego TGF-&beta; 1 Podwielokrotności 40 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>Rozpuść 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) z 1791 &mu; L DMSO do przygotowania 30 mM CHIR99021 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 &mu; L/tuba x 35 tubek i przechowywać w temperaturze -20 & deg;C.</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>Rekonuść 5 mg PD0325901 (MW 482.19) z 1037 &mu; L DMSO do przygotowania 10 mM PD0325901 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 &mu; L/tuba x 20 probówek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Axon</td><td>1358</td><td>Rozpuść 10 mg BIRB796 (MW 527.66) z 948 &mu; L DMSO do przygotowania 20 mM BIRB796 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 &mu; L/tuba x 18 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>SP600125</td><td>Tocris</td><td>1496</td><td>Rozpuść 10 mg SP600125 (MW220.23) z 908 &mu; L DMSO do przygotowania 50 mM SP600125 roztworu podstawowego. Podwielokrotność 50 &mu; L/tuba x 18 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27845</td><td>Płytka Microwell</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Rozpuść 5 g Pluronic F-127 w 100 ml wody, aby uzyskać 5% (w/v) roztwór podstawowy Pluronic F127. Sterylizować przez filtrację (0,22 um). Aliqout 50 ml / probówkę x 2 probówki i przechowywać w r.t.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>hPGCLC kultura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow' s MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>hPGCLC podłoże podstawowe</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj następujące odczynniki, aby uzyskać podłoże podstawowe hPGCLC. 500 ml Glasgow" s MEM 75 ml zamiennika surowicy KnockOut 6 ml roztworu aminokwasów endogennych MEM (100x) 6 ml 100 mM pirogronianu sodu 6 ml penicyliny-streptomycyny (x100) Porcje 40 ml/probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Rozcieńczony 350 &mu; L 2-merkaptoetanol (14,3 M) w 9,65 ml PBS (-) do otrzymania 500 mM roztworu podstawowego 2-merkaptoetanolu. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Rozpuść 400 mg kwasu L-askorbinowego w 20 ml wody, aby uzyskać 20 mg/ml roztworu podstawowego kwasu L-askorbinowego. Sterylizować przez filtrację (0,22 um). Podwielokrotność 500 &mu; L/tuba x 40 tubek i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki BMP4</td><td>R& Systemy D</td><td>314-BP</td><td>Rozpuszczają 1 mg rekombinowanego ludzkiego BMP4 z 10 ml 4 mM HCl w ilości 100 & mu; g/ml rekombinowanego ludzkiego roztworu podstawowego BMP4. Podwielokrotność 250 &mu; L/tuba x 40 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Ludzki SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>Repuszcza 250 &mu; g ludzki SCF z 500 &mu; L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do wytworzenia 500 &mu; g/ml ludzkiego roztworu podstawowego SCF. Podwielokrotność 35 &mu; L/tuba x 14 tubek i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Ludzki EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>Rozpuść 1 mg ludzkiego EGF w 1 ml 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-), aby uzyskać 1 mg / ml ludzkiego roztworu podstawowego EGF. Aliqot 100 &mu; L/rura x 10 rurek. Rozcieńczyć 100 &mu; L 1 mg/ml ludzkiego roztworu podstawowego EGF o stężeniu 300 &mu; L 0,1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS (-) do 250 &mu; g/ml roztworu podstawowego humanEGF. Podwielokrotność 20 &mu; L/rura x 20 rurek. Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Wielkość porów = 40 &mu;m.</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa polipropylenowa 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Niska płyta mocująca</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Vari-Mix Platform Rocker</td><td>Thermofisher</td><td>M79735Q</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td> Barwienie immunohistochemiczne </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLOXALL Roztwór blokujący</td><td>VECTOR</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>Normal Surowica końska Odczynnik ImmPRESS Anty-Kozioł IgG</td><td>VECTOR</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>OCT-3/4 Przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-8629</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT WEKTOR DAB</td><td></td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Thermofisher</td><td>SP15-100</td><td>Średni montażowy</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Izolujący hPGCLC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji ciała zarodkowego</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-348</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD38 sprzężone z APC</td><td>abcam</td><td>ab134399</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są wspólnymi prekursorami wszystkich komórek linii rozrodczej. W embrionach myszy populacja założycielska ~ 40 PGC jest indukowana z pluripotencjalnych komórek epiblastów przez zaaranżowaną ekspozycję na cytokiny, w tym białko morfogenetyczne kości 4 (Bmp4). W embrionach ludzkich najwcześniejsze PGC zostały zidentyfikowane na ścianie śródskórnej woreczka żółtkowego pod koniec 3. tygodnia ciąży, ale niewiele wiadomo na temat procesu specyfikacji PGC u ludzi i ich wczesnego rozwoju. Aby obejść techniczne i etyczne bariery związane z badaniem ludzkich embrionalnych PGC, niedawno stworzono modele hodowli komórek zastępczych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. W tym miejscu opisujemy 13-dniowy protokół solidnej produkcji ludzkich komórek podobnych do PGC (hPGCLC). Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) utrzymywane w stanie pierwotnej pluripotencji są inkubowane w naiwnym pożywce przeprogramowującej 4i przez 48 godzin, dysocjowane na pojedyncze komórki i pakowane w mikrostudzienkach. Długotrwałe utrzymywanie się hiPSC w pierwotnym stanie pluripotencji powoduje znaczne aberracje chromosomowe i należy tego unikać. hiPSC w mikrostudzienkach są utrzymywane przez dodatkowe 24 godziny w pożywce 4i w celu wytworzenia ciał zarodkowych (EB), które są następnie hodowane w naczyniach z tworzywa sztucznego o niskiej przyczepności w warunkach kołysania w pożywce indukcyjnej hPGCLC zawierającej wysokie stężenie rekombinowanego ludzkiego BMP4. EB są dalej hodowane przez okres do 8 dni w stanie kołyszącym, nieprzylegającym, aby uzyskać maksymalne plony hPGCLC. Za pomocą immunohistochemii hPGCLC są łatwo wykrywane jako komórki silnie eksprymujące OCT4 w prawie wszystkich EB wyłącznie na ich powierzchni. Gdy EB są enzymatycznie dysocjowane i poddawane wzbogacaniu FACS, hPGCLC można zbierać jako komórki CD38+ z wydajnością do 40-45%.

Zastosowana tutaj płytka mikrootworkowa jest w formacie 24 dołków i posiada 8 dołków zawierających arkusze mikrootworkowe, z których każdy umożliwia formowanie do 1 20 ciał osmoidalnych (EB). Z około 24 milionów naiwnych komórek pluripotencyjnych 4i płytka ta zazwyczaj generuje ~8 0 EB składających się z ~3 0 komórek na jedno EB. Podczas hodowli nieadherentnej EB przy stałym kołysaniu liczba nienaruszonych EB stopniowo spada z powodu spontanicznego samozniszczenia, a do 13. dnia protokołu przeżywa ~3 0 EB. Większość tych przeżywających EB posiada na swojej powierzchni 50–20 hPGCLC (oszacowano za pomocą detekcji immunohistochemicznej komórek OCT4+ w seriach przekrojów EB; patrz Rysunek 8), co daje łącznie ~10 00 hPGCLC OCT4+. Trawienie enzymatyczne EB do pojedynczych komórek jest procesem stosunkowo nieefektywnym, co redukuje uzysk hPGCLC CD38+ wzbogaconych metodą FACS do 9 00 – 47 00 komórek. W naszych badaniach średnia z sześciu niezależnych, ale następujących po sobie serii eksperymentów wyniosła 14 038 ± 5 731 (średnia ± SEM). Ponieważ komórki EB CD38-ujemne wykazują ekspresję mRNA OCT4 (qPCR) lub białka (immunohistochemia) tylko w stopniu bardzo słabym lub wcale, wszystkie komórki EB silnie wykazujące ekspresję białka OCT4 są praktycznie równoważne całej populacji hPGCLC CD38+.
Kluczowym parametrem niniejszego protokołu jest gęstość komórek. Po zaszczepieniu 2,0 x 105 ludzkich iPSC w dołku płytki hodowlanej 6-dołkowej pokrytej białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej (powierzchnia wzrostu 9,60 cm2 na dołek) w 2 mL pożywki uzupełnionej o Y27632 (2.2.9), komórki osiągną około 20-30% konfluencji 24 godziny po zaszczepieniu (Rysunek 1). Po dodatkowych 24 godzinach hodowli w pożywce mTeSR1 bez dodatku Y7632 komórki agregują i tworzą kolonie, zajmując ~30% powierzchni wzrostu (Rysunek 2). Następnie komórki są hodowane w pożywce do reprogramowania 4i (2.3.2). Po 24 godzinach hodowli w pożywce 4i komórki stają się konfluentne (Rysunek 3). Kolejne 24 godziny hodowli w pożywce 4i sprawiają, że komórki są gęsto upakowane (Rysunek 4). Dokładny czas wymiany pożywki (co 24 godziny +/- 4 godziny) oraz gęstość komórek są krytyczne dla pomyślnego tworzenia ciał embrioidalnych (EB) i ludzkich progenitorów komórek linii zarodkowej (hPGCLC).
Po 48-godzinnej hodowli w medium 4i komórki są dysocjowane i zaszczepiane na płytkę z mikrowyciekami, która posiada dołki o rozmiarze 40 µm (2.4). Chociaż ta dostępna w handlu płytka z mikrowyciekami jest pokryta przez producenta warstwą ograniczającą adhezję, zaleca się ponowne pokrycie jej detergentem (2.4.3) w celu zmniejszenia ryzyka niepożądanej adhezji komórek. Zastosowanie mikrowycieków o rozmiarze 80 µm skutkowało zmniejszoną wydajnością hPGCLC, co sugeruje znaczenie rozmiaru EB dla prawidłowo ukierunkowanego różnicowania. Komórki zaszczepione w medium 4i utworzą EB w mikrowyciekach po 24–30 godzinach, co można zaobserwować przy użyciu standardowego odwróconego mikroskopu fazowo-kontrastowego (Rysunek 5). Okrągły kontur EB staje się wyraźnie widoczny w 24. godzinie inkubacji i później. Nie zaleca się zbierania EB we wcześniejszym czasie (np. 16 godzin po zaszczepieniu), zanim ich okrągły kontur stanie się wyraźnie widoczny, ponieważ takie EB są bardzo podatne na uszkodzenia mechaniczne i łatwo ulegają rozpadowi. Należy zauważyć, że znaczne ilości naiwnych hiPSC NIE zostają włączone do EB, co jest zjawiskiem normalnym. Komórki te zostaną wypłukane przed rozpoczęciem hodowli EB w ruchu kołyszącym na powierzchni o niskiej adhezji (2.5.2). Należy również odnotować, że w naszym protokole EB są tworzone w naiwnym medium pluripotencyjnym 4i, a nie w medium hPGCLC. Wstępne formowanie stałych EB w medium 4i przed ekspozycją na medium hPGCLC jest istotne dla dystrybucji hPGCLC na powierzchni EB.
Ciałka embrionalne (EB) hodowane w medium hPGCLC w warunkach hodowli nieprzylegającej z zastosowaniem kołysania zachowują swój sferyczny kształt bez agregacji lub fuzji (Rycina 6 oraz Rycina 7). Zbyt słabe kołysanie spowoduje agregację i fuzję EB, natomiast zbyt intensywne warunki doprowadzą do ich rozpadu. Ludzkie pierwotne komórki linii zarodkowej (PGCLC) pojawiają się jako komórki wykazujące ekspresję OCT4 na powierzchni EB już po 5 dniach hodowli w medium hPGCLC, a ich liczba wzrasta do 8. dnia hodowli (Rycina 8). Dalsza inkubacja EB może prowadzić do ich rozpadu oraz utraty ludzkich PGCLC. Ludzkie PGCLC mogą być wzbogacane z enzymatycznie dysocjowanych komórek EB po 5–8 dniach hodowli w medium hPGCLC za pomocą metody FACS jako komórki CD38+ (Rycina 9).
<img alt="Hodowla komórkowa pod mikroskopem; komórki tkanki wątroby; analiza mikroskopowa w badaniu histologicznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Hodowla ludzkich iPSC w medium uzupełnionym o Y27632 24 godziny po inokulacji. Gęstość komórek wynosi około 20–30% konfluencji. W obecności inhibitora ROCK Y27632 komórki wykazują tendencję do dobrego rozprzestrzeniania się z długimi, kolczastymi wydłużeniami. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Hodowla komórkowa pod mikroskopem, wzrost komórkowy, obraz mikroskopowy, badania, analiza biologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Hodowla ludzkich iPSC 48 godzin po inokulacji. Komórki agregują, tworząc kolonie zajmujące około 30% powierzchni wzrostu. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu do hodowli komórkowych; badanie wzrostu i morfologii komórek w monowarstwie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Hodowla ludzkich iPSC inkubowana w pożywce do reprogramowania 4i przez 24 godziny. Komórki osiągają pełną konfluencję. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy przedstawiający statyczną hodowlę komórek białaczki do badań i analizy nowotworów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Hodowla ludzkich iPSC inkubowana w pożywce do reprogramowania 4i przez 48 godzin. Komórki konfluencyjne są gęsto upakowane. Pasek skali = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy wzoru jaj nicieni; rozwój embrionalny, wizualizacja struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Ciałka embryoidalne (EB) z ludzkich iPSC utworzone w mikrosodkach po 24-godzinnej inkubacji w medium do reprogramowania 4i. Okrągły zarys ciał inkluzyjnych (EB) staje się widoczny od 24 do 30 godzin po inokulacji. Po potwierdzeniu zarysu pod mikroskopem fazokontrastowym ciałka EB są gotowe do przeniesienia do warunków hodowli z kołysaniem. Pasek skali = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy skupisk komórek; układ mikroskopowy; biologia komórki; dołączono skalę." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ciałka embroidalne (EB) z ludzkich iPSC inkubowane przez 24 godziny w medium hPGCLC. EB w przeważającej mierze zachowują swój kulisty kształt. Pasek skali = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Klastry hodowli komórkowych pod mikroskopem; badanie wzrostu komórkowego; obraz z badań biomedycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Ludzkie ciałka embryoidalne (EB) pochodzące z iPSC inkubowane przez 192 godziny w pośrodku hPGCLC. Ciałka zarodkowe (EB) są powiększone w porównaniu do ich wyglądu po 24 godzinach hodowli, jednak nadal w przeważającej mierze zachowują sferyczny kształt, bez agregacji lub fuzji. Pasek skali = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikrografia histologiczna komórek, barwione przekroje tkanek ukazujące morfologię komórek do analizy biologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Ludzkie hPGCLC wykazujące ekspresję OCT4 są zlokalizowane na powierzchni ciałek embrionopodobnych (EB) pochodzących z hiPSC, inkubowanych przez 192 godziny w medium hPGCLC. Ciałka zarodkowe (EB) zatopiono w białku macierzy zewnątrzkomórkowej i poddano obróbce w celu przygotowania preparatów FFPE do barwienia immunohistochemicznego na obecność OCT4 (substrat DAB). Pasek skali = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej wykazujące ekspresję CD38; próbka niebarwiona w porównaniu z próbką barwioną przeciwciałami anty-CD38, dane dotyczące autofluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rycina 9: Ludzkie PGCLC są wzbogacane z enzymatycznie dysocjowanych komórek EB za pomocą FACS jako CD38+ komórki Po inkubacji w medium hPGCLC przez 5–8 dni ciałka embrionalne (EB) można rozdzielić poprzez trawienie enzymatyczne w celu przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek. hPGCLC można wzbogacić jako CD38+ komórki za pomocą FACS (czerwone kropki). Należy również zebrać komórki EB, które nie wykazują ekspresji CD38 (niebieskie kropki), jako kontrolę negatywną. Bramki FACS dla komórek CD38-dodatnich i CD38-ujemnych powinny być rozdzielone szerokim marginesem (zielone kropki), aby uniknąć zanieczyszczenia każdego typu komórek. Górny i dolny panel przedstawiają odpowiednio profile FACS bez i z zastosowaniem barwienia przeciwciałem anty-CD38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są powszechnymi prekursorami zarówno plemników, jak i jaj. Ludzkie embrionalne PGC są określane z pluripotencjalnych komórek epiblastów poprzez interakcje cytokin. Tutaj opisujemy 13-dniowy protokół indukcji komórek ludzkich transkryptomalnie przypominających PGC na powierzchni ciał zarodkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją.

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii ludzkiej linii rozrodczej, takie jak to, w jaki sposób powstają lub naprawiane są uszkodzenia w genomie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że ludzkie pierwotne komórki rozrodcze można wytworzyć w ciągu dwóch tygodni z przygotowanych komórek iPS o pluripotencji z genetycznym podłożem predysponującym do choroby. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zapobiegania upośledzeniu genomu w ludzkich komórkach linii rozrodczej, ponieważ nasz model hodowli komórkowej może pomóc nam zmniejszyć toksyczność leku terapeutycznego dla linii zarodkowej.Aby rozpocząć od wytworzenia ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych lub ludzkich PGCLC, należy przygotować płytki pokryte białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej i zawiesinę komórkową ludzkich iPSC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować jednokomórkową zawiesinę ludzkich iPSC o zaszczepionej pluripotencji w pożywce mTeSR1 zawierającej inhibitor kinazy Rho Y-27632. Ostrożnie dostosuj gęstość komórek do 100 000 komórek na mililitr.Zaszczepić dwa mililitry zawiesiny komórkowej przygotowanych ludzkich iPSC w każdym dołku sześciodołkowych płytek pokrytych białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, upewniając się, że komórki są równomiernie rozmieszczone, potrząsając płytkami w pionie i poziomie. Inkubować płytki w inkubatorze CO2 składającym się z trzech gazów w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bardzo ważne jest, aby zaszczepić dokładnie 200 000 komórek w każdym dołku sześciodołkowej płytki.Dokładne liczenie komórek ma kluczowe znaczenie. Po zakończeniu przejściowej konwersji do naiwnej pluripotencji komórki powinny wyglądać na nadmiernie zlewające się, co jest normalne. Dokładny czas zmiany pożywki jest ważny dla osiągnięcia wysokich wartości PGCLC u ludzi i odtwarzalności eksperymentalnej.Gęstość hodowli 4i hiPSC jest wysoka w tych warunkach i oczekuje się, że komórka stanie się zlewająca się w ciągu 48 do 72 godzin po inokulacji. 24 godziny po inokulacji zmień pożywkę na dwa mililitry na studzienkę pożywki mTeSR1 bez Y27632. Rozpocznij konwersję ludzkich iPSC w stanie pluripotencji do naiwnych pluripotencjalnych komórek macierzystych 4i, podgrzewając 50 mililitrów kompletnej pożywki 4i w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po 48 i 72 godzinach od inokulacji wyjąć płytki z inkubatora i zmienić pożywkę na 2 mililitry na studzienkę po 4i kompletnej pożywki. Odwirować pokrytą detergentem płytkę mikrodołkową o masie 1 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Sprawdź studzienki za pomocą odwróconego mikroskopu, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.Przepłukać studzienki zgodnie z opisem w protokole tekstowym i powtórzyć wirowanie. Dodać 4i kompletną pożywkę do przepłukanych studzienek. Odwirować płytkę o stężeniu 1 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie sprawdzić studzienki.Aby zaszczepić ludzkie iPSC 4i w płytce mikrodołka, należy przygotować zawiesinę ludzkich komórek iPSC zgodnie z opisem w protokole. Przefiltruj tę zawiesinę komórek przez sitko o wielkości porów 40 mikrometrów, aby usunąć agregaty komórkowe. Umyj sitko jednym mililitrem wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża 4i trzy razy, aby zebrać wszystkie komórki z sitka i policzyć komórki za pomocą licznika kultur.Następnie rozcieńczyć tę jednokomórkową zawiesinę naiwnych ludzkich iPSC 4i do 27 do 32,4 miliona komórek w 9 mililitrach, wstępnie podgrzanym, kompletnym pożywce 4i zawierającej Y27632. Wyjąć z inkubatora trójgazowego wcześniej przygotowaną płytkę mikrodołkową zawierającą 1 mililitr kompletnej pożywki 4i na studzienkę. Zaszczepij 1 mililitr naiwnej ludzkiej zawiesiny iPSC 4i do każdej studzienki, aby osiągnąć stężenie od 3,0 do 3,6 miliona komórek na studzienkę.Delikatnie odpipetować, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Odwirować płytkę o masie 100 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść płytkę w inkubatorze CO2 składającym się z trzech gazów, uważając, aby nie naruszyć komórek granulowanych w mikrostudzienkach i inkubuj przez 24 do 30 godzin, ponieważ inkubacja przez noc jest niewystarczająca do wytworzenia ciasnych ciał zarodkowych lub EB.Podgrzej 5 mililitrów ludzkiego podłoża podstawowego PGCLC i 20 mililitrów ludzkiego kompletnego podłoża PGCLC przez co najmniej pięć minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza Ostrożnie umieść sitko komórkowe o wielkości porów 40 mikrometrów do góry nogami na 50-mililitrowej stożkowej rurce polipropylenowej. Aby odłączyć EB od mikrostudzienek, delikatnie odpipetuj każdą studzienkę płytki. Aby usunąć komórki, które nie są włączone do EB, przefiltruj zawartość wszystkich studzienek przez sitko do komórek.Delikatnie przemyć EB zatrzymane na membranie sitka komórkowego 1 mililitrem wstępnie podgrzanego ludzkiego podłoża podstawowego PGCLC i powtórzyć płukanie pięć razy. Umieść świeżą stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów na sitku do komórek, tak aby sitko do komórek było teraz umieszczone prawą stroną do góry w nowej probówce. Szybko odwróć sitko komórkowe za pomocą nowej rurki, która umieści EB poniżej membrany sitka komórkowego.Dodaj 18 mililitrów wstępnie podgrzanej ludzkiej kompletnej pożywki PGCLC do membrany sitka komórkowego, aby zebrać EB w stożkowej probówce. Następnie należy umieścić 3 mililitry zawiesiny EB na studzienki w dołku sześciodołkowej płytki o niskim mocowaniu. Umieść płytkę na kołysce wahadłowej w inkubatorze trójgazowym i ostrożnie ustaw prędkość kołysania na około 20 obrotów na minutę.W dniach od siódmego do trzynastego eksperymentu należy codziennie przygotowywać świeżo 20 mililitrów kompletnej pożywki dla ludzi PGCLC. Zdejmij płytkę z wahacza, co spowoduje, że EB opadną na dno studzienek. Usuń stare podłoże bez suszenia EBs, tak aby w każdej studzience pozostało około 0,2 mililitra starego podłoża.Dodaj 3 mililitry na studzienkę świeżej pożywki PGCLC dla ludzi, po codziennym usuwaniu starej pożywki. Aby zidentyfikować ludzkie PGCLC jako komórki OCT4-dodatnie, zbierz EB do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej o niskim poziomie wiązania. Pozwól EB opaść na dno w temperaturze pokojowej i wyrzuć pożywkę.Opłucz EBs lodowatym środkiem 1X PBS. Po usunięciu PBS inkubować EB w 1 mililitrze lodowatego zimnego 1% objętościowo azydku sodu w PBS na lodzie przez pięć minut. Pozwól EB opaść na dno w temperaturze pokojowej.Po odrzuceniu supernatantu przepłukać EB lodowatym PBS. Rozmrozić 200 mikrolitrów białka macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie. Dodać białko do probówki zawierającej EBs.Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na około 10 minut, aż żel zestali się, a EB zostaną osadzone. Aby utrwalić EBs, dodaj 1 mililitr 4% formaldehydu w PBS do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut z delikatnym kołysaniem. Następnie wyrzuć formaldehyd i raz spłucz EB lodowatym PBS.Dodaj 1 mililitr 70% etanolu. Przechowuj w 70% etanolu w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia lub przystąp do przetwarzania za pomocą standardowego protokołu FFPE. Gęstość komórek i równomierne rozmieszczenie komórek w każdym dołku mają kluczowe znaczenie.Ludzkie IPSC w 2 mililitrach Y27632 uzupełnionej pożywki na dołek płytki sześciodołkowej osiągają 20 do 30% konfluencji po 24 godzinach. Po dodatkowej 24-godzinnej hodowli w pożywce mTeSR1, pod nieobecność Y27632, komórki agregowały się i tworzyły kolonie, zajmujące około 30% obszaru wzrostu. Po 24 godzinach hodowli w pożywce przeprogramowującej 4i, komórki osiągnęły konfluencję.Po dodatkowych 24 godzinach hodowli w pożywce 4i komórki stały się gęściej upakowane. Po 24-godzinnej inkubacji w mikrostudzienkach w pożywce przeprogramowującej 4i, komórki utworzyły EB, których okrągły kontur był widoczny po 24 do 30 godzinach od inokulacji. EB trzymane w ludzkim podłożu PGCLC, w warunkach kołysania nieprzylegających, zachowywały swój kulisty kształt bez agregacji po 24 godzinach.Po 192 godzinach EB były większe, zachowując tę samą morfologię. Po 5 dniach komórki wyłoniły się jako komórki wykazujące ekspresję OCT4 na powierzchni EBs, zwiększając ich liczbę po 8 dniach. Komórki z jednokomórkowej zawiesiny ludzkich PGCLC zostały wzbogacone jako komórki CD38-dodatnie przez FACS.Komórki, które nie wykazują ekspresji CD38, były kontrolą negatywną. Aby uniknąć zanieczyszczenia, komórki FACS bramki CD38-dodatnie i CD38-ujemne zostały oddzielone szerokim marginesem. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby przestrzegać dokładnego zliczania komórek i czasu zmiany pożywki.Pominięcie zmiany pożywki nawet na jeden dzień lub zmniejszenie objętości tej pożywki na dowolnym etapie może spowodować masową śmierć komórki. Szybkość kołysania się kultur embrionalnych ciał zarodkowych musi być starannie zoptymalizowana.

generation-human-primordial-germ-cell-like-cells-at-surface-embryoid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Ten film pokazuje proces różnicowania ciał embrionalnych (EB) w agregaty neuroepiteliczne i ich późniejszego podziału na komórki neuronalne i glejowe. Metoda ta pozwala na efektywne generowanie komórek neuronalnych i glejowych in vitro, które służą jako systemy testowe do badania toksyczności, a także oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność.

Generowanie neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych ciał embrionalnych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film pokazuje transformację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w sferyczne organoidy mózgu. Stosując specyficzne inhibitory, hPSC są kierowane do różnicowania się w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Następnie wprowadzane są specjalne czynniki wzrostu, które sprzyjają samoorganizacji i proliferacji kolonii, co ostatecznie prowadzi do powstania sferycznych organoidów mózgowych.

Generowanie sferoid z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Przedstawiamy protokół do wydajnej, masowej i szybkiej chemicznej rewersji konwencjonalnych linii komórek ludzkich o uprzywilejowanej linii pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) w epigenomicznie stabilny naiwny stan pluripotentny przypominający epiblast preimplantacyjny. Metoda ta powoduje zmniejszenie ekspresji genów o uprzywilejowanej linii i znaczną poprawę kierowanej różnicowania wieloliniowego w szerokim zakresie konwencjonalnych linii hPSC.

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

Celem tego raportu jest opisanie protokołów pozyskiwania nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) przy użyciu różnych rozmiarów ciał embrionalnych.

Otrzymywanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) za pomocą różnych rozmiarów ciał zarodkowych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Poznaj metodę wytwarzania ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu 13 dni. Ta technika umożliwia badanie toksyczności germinalnej i integralności genomowej.

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Przeglądaj więcej filmów