TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki
January 23rd, 2019
Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak to, w jakim stopniu modyfikacje chromatyczne są regulowane w sposób specyficzny dla typu komórki wraz z genomami. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wyizolować chromatynę z docelowych komórek, a następnie podążać za typowym cygańskim strumieniem. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w specyficzny dla neuronów trimincil, lizyn 4, opisoncilly.
Może być również stosowany do innych modyfikacji histonów, innych typów komórek, a następnie innych organizmów modelowych. Procedurę zademonstruje Mari Mito, technik z mojego laboratorium. Na początek użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby rozciąć interesującą Cię tkankę na małe kawałki.
Dodaj fragmenty tkanek do czystego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem. Następnie przenieś fragmenty tkanek do dwóch mililitrowych probówek wypełnionych ciekłym azotem. Przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez pięć minut z otwartą nakrętką, aby odparować ciekły azot.
Umieścić probówki zawierające próbki tkanek na schłodzonym metalowym stojaku na lód. Następnie umieść metalową kulę w 1,5-mililitrowej probówce i schłodź ją ciekłym azotem. Umieścić schłodzoną metalową kulę w jednej z probówek na próbki.
Zamknij nakrętkę i umieść rurkę w uchwycie probówki młynka kriogenicznego. Natychmiast zanurz zmontowany uchwyt probówki w ciekłym azocie na jedną minutę. Włóż uchwyt zamrożonej probówki do zewnętrznej kasety młynka kriogenicznego.
I potrząsaj nim energicznie przez 30 sekund, 60 razy. Następnie zdemontuj młynek kriogeniczny, usuń metalową kulę. Następnie umieść probówkę w wstępnie schłodzonej chłodziarce do pobierania próbek.
Przechowuj lodówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 900 mikrolitrów 1% formaldehydu do probówki i odpipetuj do wymieszania. Przenieś zawiesinę do nowej dwumililitrowej probówki z 900 mikrolitrami 1% formaldehydu.
Następnie utrwal zawiesinę na 10 minut, delikatnie obracając w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodaj do probówki 100 mikrolitrów glicyny molowej o stężeniu 2,5 molowym. I wirować przy 3000 razy większej grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie wyrzuć super supernatant. Dodaj jeden mililitr PBS do probówki i wiruj, aby wymieszać. Wirować w temperaturze 3000 razy większej niż grawitacja przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy jeden do granulki i odpipetuj do wymieszania. Odwirować probówkę przez pięć minut przy trzykrotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant.
Dodaj jeden mililitr buforu do lizy, dwa do granulki i wiruj do wymieszania. Następnie odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 3000-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 800 mikrolitrów buforu do badania radioimmunoprecypitacji z koktajlem inhibitorów proteazy do osadu i pipety do wymieszania.
Odwirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 3000 razy większej niż grawitacja w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie do granulatu dodaj 500 mikrolitrów buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 3000-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant.
Dodaj jeden mililitr buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy. Natychmiast po dodaniu buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy, należy przenieść lizat do probówki sonikatora. I umieść rurkę na ultrasonografie.
Korzystając z ustawień opisanych w protokole tekstowym, ścinaj chromatynę. Następnie przenieś próbkę do 1,5-mililitrowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. I odwirowywać go przez pięć minut przy 20 000 razy większej grawitacji w czterech stopniach Celsjusza.
Pobrać supernatant z próbki i przenieść go do nowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. W protokole tym wprowadzono i zademonstrowano sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny tandemowej. Podczas zabiegu jakość DNA była badana na wielu etapach.
Bezpośrednio po sonikacji ścięte DNA zostało wyizolowane i przetestowane za pomocą elektroforezy mikroprzepływowej. Po zastosowaniu przeciwciała anty-FLAG i przeciwciała anty-H3K3me3 do przeprowadzenia oczyszczania powinowactwa, jakość DNA została ponownie sprawdzona. Swoistość immunologicznego oczyszczania DNA na H2B-FLAG potwierdzono ujemnymi próbkami kontrolnymi.
Gdzie wykryto znikome ilości DNA. W dalszej części protokołu zweryfikowano jakość biblioteki sekwencjonowania. Skuteczność ChIP i T-ChIP została udowodniona poprzez analizę wzbogacenia przy użyciu starterów ukierunkowanych na region promotorowy genu GAPDH.
Uzyskano reprezentatywne redystrybucje wzdłuż trzech genów neuronów. Zaobserwowano wzbogacenie odczytów na pięciu pierwszych końcach genów przez neuron T-ChIP seek w całym mózgu. Po ustabilizowaniu się, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie epigenetyki do zbadania modyfikacji histonów specyficznych dla typu komórki ogólnie w neuronach u myszy.
Nie zapominaj, że praca z formaldehydem może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie gumowej odzieży i okularów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół dla tandemowego sekwencjonowania immunoprecypitacyjnego chromatyny (tChIP-Seq), podkreślając jego przydatność w analizie modyfikacji histonów specyficznych dla typu komórki w genomie. Izolując chromatynę z docelowych komórek, ta metoda pozwala badaczom na badanie regulacji epigenetycznej i wzbogacenie wiedzy o modyfikacjach histonów specyficznych dla neuronów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Epigenetyka
- Analiza modyfikacji histonów
- Specyficzność dla typu komórki
Tło
- Znaczenie modyfikacji chromatyny w funkcji komórkowej
- Potencjał dla zrozumienia rozwoju i funkcji neuronów
- Potrzeba precyzyjnych metod do badania modyfikacji histonów
Stosowane metody
- Tandemowe sekwencjonowanie immunoprecypitacyjne chromatyny (tChIP-Seq)
- Komórki neuronów mysich jako model biologiczny
- Oczyszczanie powinowactwowe i elektroforeza dla weryfikacji jakości DNA
Główne wyniki
- Potwierdzono wzbogacenie modyfikacji histonów specyficznych dla komórek neuronowych
- Dowodzona specyficzność immunoprecypitacyjnego oczyszczania za pomocą kontroli negatywnych
- Szczegółowe obserwacje modyfikacji histonów wzdłuż genów neuronowych
Wnioski
- To badanie dostarcza cennego protokołu do badania modyfikacji histonów w sposób specyficzny dla typu komórki.
- Podkreśla znaczenie tChIP-Seq w rozwoju badań w dziedzinie epigenetyki, szczególnie w zrozumieniu biologii neuronów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific epigenome profiling addresses a critical gap in target validation by enabling precise interrogation of histone modifications in defined cellular populations. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissues. tChIP-Seq supports mechanistic de-risking in early discovery by linking epigenetic states to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through cell-type-specific chromatin state mapping.
- Operational Value: Provides biological de-risking by isolating epigenetic signals from target cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled chromatin isolation.
- Scalability: Enables platform reuse across histone modifications and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance from discovery through preclinical validation via neuron-specific epigenome profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by linking histone modification patterns to functional gene expression.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through epigenomic readouts in target cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing epigenomic resolution in purified cell types.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through cell-type-specific chromatin analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates enrichment measurements and sequencing readouts that enable condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via neuron-specific epigenome profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for epigenetic profiling across projects and histone marks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of chromatin isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Needs cryogenic grinding, sonication, and immunoprecipitation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chromatin preparation and antibody validation.
- Involves adaptation considerations across model systems and histone modification targets.
- Includes practical limitations such as tissue accessibility and formaldehyde handling hazards.
