Name: TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę tChIP-Seq do analizy modyfikacji histonów specyficznych dla typu komórki w neuronach myszy. Ta technika pozwala izolować chromatynę i badać epigenetyczną regulację genomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Iwasaki za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#26113005 dla S.N. i JP17H05679 dla S.I.); stypendium dla młodych naukowców (A) (JP17H04998 do S.I.) z Ministerstwa Edukacji, Nauki, Sportu i Kultury Japonii (MEXT); oraz Pionierskie Projekty "Ewolucja Komórkowa" i wszystkie projekty RIKEN "Choroba i Epigenom" od RIKEN (do S.N. i S.I.).

Wszystkie metody opisane tutaj zostały zatwierdzone przez dział bezpieczeństwa RIKEN (H27-EP071) i przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.
1. Sekcja tkanek
<ol>
	<li>Rozetnij interesujące Cię tkanki na małe kawałki (około <3 mm2) za pomocą cienkich nożyczek sprężynowych. 
	Uwaga: Większe fragmenty tkanek potrzebują więcej czasu na zamrożenie, a mniejsze fragmenty przenoszą większe objętości buforu, co może mieć wpływ na wyniki.</li>
	<li>Dodaj wypreparowane fragmenty tkanek do czystego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem i zbierz je do probówek o pojemności 2 ml (1 sztuka na probówkę) wypełnionych ciekłym azotem. 
	Uwaga: Do tego kroku zalecane są rurki z powierzchnią hydrofilową.</li>
	<li>Umieścić probówki w temperaturze -80 °C na > 5 minut z otwartą nakrętką, aby odparować pozostały ciekły azot. 
	Uwaga: Po zamknięciu nakrętki fragmenty tkanek można przechowywać w temperaturze -80 °C przez miesiąc przed użyciem.</li>
</ol>
2. Utrwalenie komórek
Uwaga: Do tego kroku użyliśmy poręcznego młynka kriogenicznego. Można zastosować alternatywną aparaturę.
<ol>
	<li>Umieść probówki o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka o niskim stopniu wiązania zawierające próbki tkanek na metalowym stojaku na lód schłodzonym w ciekłym azocie.</li>
	<li>Umieść metalową kulę w probówce o pojemności 1,5 ml i schłodź ciekłym azotem. Umieść go na metalowym stojaku na lód.</li>
	<li>Otwórz probówkę o pojemności 2 ml i umieść w niej schłodzoną metalową kulkę. Zamknij nakrętkę, umieść probówki o pojemności 2 ml w uchwycie probówki poręcznego młynka kriogenicznego i natychmiast zanurz zmontowany uchwyt probówki w ciekłym azocie na 1 minutę.</li>
	<li>Włóż uchwyt zamrożonej probówki do zewnętrznej kasety poręcznego młynka kriogenicznego i energicznie potrząsaj 60 razy przez 30 s.</li>
	<li>Zdemontować uchwyt probówki, wyjąć metalową kulkę i umieścić probówkę o pojemności 2 ml w chłodziarce do pobierania próbek wstępnie schłodzonej w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Umieścić schładzalnik próbki w temperaturze -20 °C na 15 minut, aby zapobiec zamarznięciu utrwalacza w następnym etapie.</li>
	<li>Przynieś chłodziarkę do próbek na stół, otwórz pokrywę probówki i natychmiast wlej do niej 900 μl 1% formaldehydu. Po kilkukrotnym pipetowaniu przenieść zawiesinę do nowej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 900 μl 1% formaldehydu i utrwalać na 10 minut, delikatnie obracając, w inkubatorze ustawionym na temperaturę 23 °C. 
	UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny i szkodliwy.</li>
	<li>Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodać 100 μl 2,5 M glicyny do każdej probówki i odwirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwa razy (w sumie 3 prania). 
	Uwaga: Utrwalone próbki można błyskawicznie zamrażać ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do lizy 1 (50 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (pH 8,0), 10% m/v glicerolu, 0,5% m/v NP-40, 0,25% w/v Triton X-100 i 0,1x koktajlu inhibitora proteazy) do osadu, odpipetować kilkakrotnie i obracać przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Lysis Buffer 1 należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu do lizy 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA i 0,1x koktajl inhibitorów proteazy) do osadu, wiruj i obracaj przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Lysis Buffer 2 należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 800 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) z 1x koktajlem inhibitorów proteazy do osadu i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 500 μl buforu RIPA z 1x koktajlem inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 1 ml buforu RIPA z 1x koktajlem inhibitorów proteazy. Natychmiast przejdź do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Ścinanie chromatyny
<ol>
	<li>Przenieś lizat do probówki sonikatora, a następnie umieść probówkę na ultrasonografie.</li>
	<li>Ścinać chromatynę z następującymi ustawieniami: temperatura: 4 °C; szczytowa moc padająca: 175 W; współczynnik wypełnienia: 10%; cykle/seria: 200; i czas: 2,400 s.</li>
	<li>Przenieść próbkę do probówki o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. 
	Uwaga: Próbka może być błyskawicznie zamrażana w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Kontrola jakości DNA (odwrotne sieciowanie)
<ol>
	<li>Wymieszać 20 μl lizatu i 180 μl buforu elucyjnego ChIP (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) i 1% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS)) w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C w termocyklerze przez 6 godzin przy otwartej pokrywie termocyklera. Pokrywę termocyklera należy trzymać otwartą, aby uniknąć nadmiernej denaturacji. 
	Uwaga: Bufor elucyjny ChIP należy przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej przed użyciem. Ta inkubacja może zostać przedłużona do nocy.</li>
	<li>Dodać 1 μl 10 mg/ml RNazy A, odwirować i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 6,5 μl 15 mg/ml proteinazy K, odwirować i inkubować w temperaturze 55 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Przenieś reakcję do probówki o niskim poziomie wiązania DNA, dodaj 4 μl glikogenu 5 mg/ml i odwiruj. Następnie dodać 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) i wirować przez 5 minut w temperaturze 18 000 x g.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Dodać 200 μl buforu Tris-EDTA-NaCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) i 200 mM NaCl) do pozostałego roztworu fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego i wirować przez 5 minut przy 18 000 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant i wymieszać z pierwszym supernatantem.</li>
	<li>Dodać 900 μl lodowatego etanolu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -20 °C. 
	Uwaga: Inkubację tę można przedłużyć do 4-6 godzin.</li>
	<li>Wirować przez 30 minut przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant. Dodać 1 ml lodowatego 75% etanolu do granulatu i wirować przez 30 minut w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C. Powtórz ten krok (w sumie dwa prania).</li>
	<li>Supernatant należy dokładnie wyrzucić i suszyć na powietrzu przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 50 μl buforu Tris-EDTA (TE) i rozpuścić DNA, inkubując je w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub w temperaturze 4 °C przez noc. Unikaj wirowania i pipetowania. Zachowaj to DNA jako "dane wejściowe" i użyj go do przygotowania biblioteki, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru zgodnie z instrukcją producenta (patrz Tabela Materiałów) i sprawdź rozkład wielkości za pomocą maszyny do elektroforezy mikroprzepływowej (patrz reprezentatywne dane pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Do tego testu użyj 10 ng lub mniej DNA. 
	Uwaga: Fragmenty 100–500 par zasad (bp) powinny stanowić 50% lub więcej DNA.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie powinowactwa przez przeciwciało anty-FLAG
Uwaga: Dla neuronów tChIP-Seq, tkanki mózgowe od 8 myszy są zazwyczaj używane do jednej próbki tChIP-Seq do przygotowania 2 ng oczyszczonego DNA przez tandemowe oczyszczanie immunologiczne (patrz Krok 7.1). W naszych rękach 0,1 ng DNA nadal zapewniało wysokiej jakości biblioteki DNA dla ChIP-Seq (Kadota, niepublikowane). Tak więc, w teorii, pojedyncza mysz może wystarczyć do wykonania neuronu tChIP-Seq. Wymagana ilość powinna być zoptymalizowana pod kątem interesującego typu tkanki i komórki. Do kontroli negatywnej eksperymentu z oczyszczaniem imumuno, należy przygotować i użyć lizatu tkanki mózgowej od myszy bez ekspresji H2B-FLAG.
<ol>
	<li>Odpipetować 200 μl kulek magnetycznych sprzężonych z owczą immunoglobuliną przeciw mysim G (IgG) do probówki o niskim poziomie wiązania białka.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzuć supernatant, dodaj 1 ml lodowatego PBS i odwiruj. Powtórz ten krok (w sumie dwa prania).</li>
	<li>Dodać 20 μl 1 mg/ml przeciwciała anty-FLAG i obracać przez 5 godzin w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Ta inkubacja może zostać przedłużona do nocy.</li>
	<li>Umyj koraliki zgodnie z krokiem 5.2. Umieść koraliki w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki w 1110 μl buforu RIPA, a następnie dodać 900 μl 10x odczynnika blokującego, 180 μl 50x roztworu Denhardta, 10 μl 100x koktajlu inhibitorów proteazy i 6,8 ml lizatu przygotowanego w Kroku 3. Podziel tę mieszaninę na 5 probówek o niskim poziomie wiązania białek. Obracać przez 6 godzin w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Ta inkubacja może zostać przedłużona do nocy.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml buforu RIPA i delikatnie wymieszać. Powtórz ten krok 5 razy (w sumie 6 prań). Połącz wszystkie kulki w jednej probówce o niskim poziomie wiązania białka.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu elucyjnego ChIP i obracać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Należy sprawdzić jakość DNA zgodnie z opisem w kroku 4.11 (patrz reprezentatywne dane pokazane na rysunkach 2B i C). Natychmiast przejdź do następnego kroku.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie powinowactwa za pomocą przeciwciała anty-H3K4me3 i odwrotne sieciowanie
Uwaga: Następujące Kroki przygotowania koralików (6.1–6.4) powinny być wykonane przed Krokiem 5.7.
<ol>
	<li>Odpipetować 40 μl kulek magnetycznych sprzężonych z anty-mysią IgG owiec do probówki o niskim poziomie wiązania 2 ml białka.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzuć supernatant, dodaj 1 ml lodowatego PBS i delikatnie wymieszaj. Powtórz ten krok (w sumie dwa prania).</li>
	<li>Dodać 4 μl 1 mg/ml przeciwciała anty-H3K4me3 i obracać przez 6 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj koraliki zgodnie z krokiem 6.2. Umieść kulki w probówce o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki w 1558 μl buforu RIPA, a następnie dodać 200 μl 10x odczynnika blokującego, 40 μl 50x roztworu Denhardta, 2 μl 100x koktajlu inhibitora proteazy i 200 μl eluatu przygotowanego w kroku 5.7. Obracać przez noc w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: SDS w buforze elucyjnym ChIP został rozcieńczony więcej niż 10 razy w tej inkubacji.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i odczekaj 1 minutę, aż supernatant stanie się przezroczysty. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml buforu RIPA i delikatnie wymieszać. Powtórz ten krok 4 razy (w sumie 5 prań). Po ostatnim praniu przenieś kulki do probówki o niskim poziomie wiązania DNA i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu elucyjnego ChIP i obracać przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś eluat do nowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. 
	Uwaga: Eluat można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokiem 4, aby usunąć sieciowanie DNA. Ponownie zawiesić oczyszczone DNA w 20 μl buforu TE.</li>
	<li>Sprawdź jakość DNA zgodnie z opisem w kroku 4.11 (patrz reprezentatywne dane pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 2D). (Opcjonalnie) Przeprowadź analizę wzbogacenia metodą ilościowego PCR, jak opisano wcześniej2. Należy zaobserwować dziesięciokrotne lub większe wzbogacenie.</li>
</ol>
7. Budowa biblioteki
<ol>
	<li>Dla każdego wejścia i próbki DNA ChIP należy obliczyć proporcję DNA w regionie 100–500 pz, korzystając z funkcji analizy rozmazu w oprogramowaniu do elektroforezy mikroprzepływowej. Oszacuj objętość próbki wymaganą do uzyskania 2 ng DNA o masie 100–500 pz. Użyj 20 ng DNA w zakresie 100–500 pz jako próbki "wejściowej".</li>
	<li>Pobrać pipetować próbki DNA do 8-paskowych probówek PCR i dodaćH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 μl. (Opcjonalnie) Jeśli objętość DNA przekracza 10 μl, należy proporcjonalnie zwiększyć skalę następującej reakcji naprawy końcowej i wyboru wielkości.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową do naprawy końcowej (patrz tabela materiałów). Dodać 4 μl głównej mieszanki końcowej naprawy do DNA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Dodać 36 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 i 0,6x objętość (30 μl) kulek magnetycznych do odwracalnego immobilizacji w fazie stałej (SPRI) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać 1,2 razy większą objętość (60 μl) kulek magnetycznych SPRI i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.</li>
	<li>Umyj koraliki dwukrotnie 200 μl 80% EtOH, trzymając rurkę nadal na magnesie.</li>
	<li>Krótko odwiruj probówkę, aby zebrać resztki EtOH na dnie i umieść je z powrotem na magnesie. Dokładnie usunąć resztki EtOH.</li>
	<li>Pozostaw pokrywkę probówki otwartą na 1-2 minuty, aby umożliwić odparowanie EtOH.</li>
	<li>Zamknij pokrywę i trzymaj probówkę na lodzie. 
	Uwaga: Teraz uzyskałeś DNA o wybranej wielkości 100–500 pz na koralikach. Więcej szczegółów na temat wyboru podwójnego rozmiaru można znaleźć na stronie producenta (www.beckman.com).</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową A-tailing (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Zawiesić kulki (z etapu 7.10) w 10 μl mieszanki wzorcowej z ogonków A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Dodać 1,8 razy większą objętość (18 μl) roztworu glikolu polietylenowego (PEG)/NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj kroki 7.7-7.11, aby oczyścić DNA.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę buforową do podwiązywania (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odpipetować 8 μl buforu do ligacji, wymieszać z kulkami (z kroku 7.14), dodać 1 μl adaptera 1 μM i ponownie zawiesić kulki. Użyj 1 μL adaptera 5 μM dla próbki wejściowej. Rozważ użycie różnych adapterów dla każdej próbki do multipleksowania.</li>
	<li>Dodać 1 μl ligazy DNA i inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Dodać 1,0 razy więcej (10 μl) roztworu PEG/NaCl, ponownie zawiesić kulki i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj kroki 7.7-7.10, aby oczyścić DNA.</li>
	<li>Odpipetować 25 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do probówki i ponownie zawiesić kulki.</li>
	<li>Dodać 1,0x objętość (25 μl) roztworu PEG/NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj kroki 7.7-7.10, aby oczyścić DNA.</li>
	<li>Odpipetować 11 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do probówki i ponownie zawiesić kulki.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowej 8-paskowej probówki do PCR.</li>
	<li>Przygotuj główną mieszankę PCR w czasie rzeczywistym (szczegółowe informacje można znaleźć w Materiałach).</li>
	<li>Odpipetować 8,5 μl głównej mieszanki PCR w czasie rzeczywistym na 384-dołkowej ilościowej płytce PCR (qPCR) i dodać 1,5 μl zligowanego DNA z adapterem (od kroku 7.26).</li>
	<li>Odpipetować 10 μl każdego wzorca fluorescencyjnego w pustych studzienkach.</li>
	<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym z następującym programem: (98 °C przez 45 s) x 1 cykl, (98 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s) x 20 cykli i (72 °C przez 60 s) x 1 cykl.</li>
	<li>Określ liczbę cykli PCR potrzebnych do osiągnięcia intensywności fluorescencji wzorca fluorescencyjnego 2.</li>
	<li>Przygotować główną mieszankę PCR (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odpipetować 11,5 μl wzorcowego wzorca PCR wymieszać z pozostałym DNA ligowanym adapterowo (z kroku 7.26) i przeprowadzić PCR zgodnie z krokiem 7.30 z cyklami PCR określonymi w kroku 7.31.</li>
	<li>Dodać 1,0x objętość (20 μl) roztworu PEG/NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj kroki 7.7-7.10, aby oczyścić DNA.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do probówki i ponownie zawiesić kulki.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant stanie się przezroczysty.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowej probówki o niskim poziomie wiązania 1,5 ml-DNA.</li>
	<li>Sprawdź jakość biblioteki zgodnie z opisem w kroku 4.11 (patrz reprezentatywne dane pokazane na rys. 2E i F). Należy użyć 1 μl próbki DNA z biblioteki. (Opcjonalnie) Przeprowadź analizę wzbogacenia za pomocą qPCR, jak opisano wcześniej 2. Należy zaobserwować dziesięciokrotne lub większe wzbogacenie.</li>
</ol>
8. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Sekwencjonowanie bibliotek w sekwencerze nowej generacji (patrz reprezentatywne dane pokazane w Rysunek 3). 
	Uwaga: Głębokość sekwencji wystarczająca do analizy danych będzie się różnić w zależności od wielkości genomu organizmu3. W przypadku człowieka i myszy zalecamy uzyskanie co najmniej 20-40 milionów odczytów single-end. W zależności od wydajności odczytów, multipleksowanie może być opłacalne.</li>
</ol>

<ol><li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).</li>
<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
<li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li>
<li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+remodeling+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+library+preparation+for+next-generation+sequencing+analysis+of+genome-wide+epigenetic+and+transcriptional+landscapes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Hornstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-free+ribosome+profiling+of+cell+type-specific+translation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.</a> Genome Biology. 17 (1), 149(2016).</li>
<li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem neuronów mózgu myszy, w których ekspresja H2B znakowanego FLAG jest indukowana przez wstrzyknięcie tamoksyfenu. Promotory używane do ekspresji H2B, wyjściowe materiały tkankowe i ilość tkanek są kluczowymi parametrami dla udanego tChIP-Seq. W związku z tym optymalizację tych czynników należy rozważyć dla każdego typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
Krytycznym krokiem wśród procedur stosowanych w tym protokole jest ścinanie DNA w celu ...

Tkanki zwierząt składają się z różnych typów komórek. Regulacja genów w każdej komórce określa typ komórki. Modyfikacje chromatyny - metylacja DNA i modyfikacja histonów - leżą u podstaw specyficzności ekspresji genów dla typu komórki. W związku z tym pomiar regulacji epigenetycznej w każdym typie komórki był pożądany, ale było to wyzwanie techniczne.
Aby zbadać epigenetykę w określonym typie komórki, niedawno opracowano tandemowe sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny (tChIP-Seq) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)1. W tChIP znakowane epitopami rdzeń histonowy H2B ulega ekspresji z promotora specyficznego dla typu komórki. Ta cecha pozwala na wyizolowanie chromatyny z komórek będących przedmiotem zainteresowania, chociaż materiał zaczyna się od mieszaniny różnych typów komórek. Po ChIP-Seq - oczyszczaniu chromatyny za pomocą zmodyfikowanego znacznika histonowego i głębokim sekwencjonowaniu wyizolowanego DNA nowej generacji - możemy monitorować status epigenetyczny docelowego typu komórki w sposób obejmujący cały genom.
Korzystając z tej techniki, niedawno badaliśmy specyficzną dla neuronów trimetylację białka histonu H3 przy znacznikach lizyny 4 (H3K4me3). W tym badaniu opracowaliśmy mysz typu knock-in, w której białko H2B znakowane C-końcowo FLAG ulegało ekspresji po rekombinacji za pośrednictwem Cre (Rosa26CAG floxed-pA H2B-FLAG). Krzyżując się z myszą posiadającą gen Cre-retikulum endoplazmatycznego (ER) pod kontrolą promotora CamK2a, uzyskana linia myszy indukowała H2B-FLAG w aktywnych neuronach po wstrzyknięciu tamoksyfenu (Camk2a H2B-FLAG)1. Zaczynając od mózgu ustalonej linii myszy, przeprowadziliśmy tChIP-Seq z przeciwciałem anty-H3K4me3. Ponieważ znaczniki H3K4me3 często odpowiadają regionom promotorowym, możemy odkryć setki mRNA specyficznie wyrażanych w neuronach1.
Tutaj opisujemy typową metodę tChIP-Seq, która obejmuje etapy od sekcji tkanek do budowy biblioteki (Rysunek 1). Ostatecznym celem tego protokołu jest podzielenie się naszymi najlepszymi praktykami dotyczącymi wydajności tChIP-Seq i przyszłego zastosowania tej metody do innych typów komórek i modyfikacji histonów.

<table><tbody><tr><td>Probówka białkowa LoBind, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>No&nbsp; 0030108132</td><td>Do lizy komórek</td></tr><tr><td>Białkowa probówka LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108116</td><td>Do przygotowania ChIP i biblioteki</td></tr><tr><td>Probówka DNA LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108051</td><td>Do przygotowania ChIP i biblioteki</td></tr><tr><td>8-paskowa probówka do PCR</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>Do przygotowania ChIP i biblioteki</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>Poręczny młynek kriogeniczny do wytwarzania proszku komórkowego do utrwalania</td></tr><tr><td>Metalowa kula</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>Akcesorium SK Mill</td></tr><tr><td>2 ml rurka ze stali nierdzewnej</td><td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>Opcja dla ogniwa liza</td></tr><tr><td>2 ml uchwyt na probówkę ze stali nierdzewnej</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>Opcja do lizy komórek</td></tr><tr><td>16% formaldehydu (w/v), bez metanolu</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>Do utrwalania komórek. Przygotuj 1% roztwór przed użyciem.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>Przygotuj 2,5 M zapas</td></tr><tr><td>D-PBS (-)(1x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>Do mycia lizatu i oczyszczonego DNA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>Do buforu do lizy 1. Przygotować 1 M, pH 7,5 bulionu.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, klasa biologii molekularnej</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>Do buforu do lizy 1, buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, klasa biologii molekularnej</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>Do buforu do lizy 1, buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>Do buforu do lizy 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>Do buforu do lizy 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, klasa biologii molekularnej</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>Do buforu do lizy 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>Do buforu do lizy 2, buforu elucyjnego ChIP i buforu Tris-EDTA-NaCl. Przygotować 1 M, wywar o pH 8,0.</td></tr><tr><td>0,1 M EGTA pH neutralne</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>Do koktajlu inhibitorów proteazy Lysis Buffer 2</td></tr><tr><td>(100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>Do blokowania degradacji białka</td></tr><tr><td>Bufor RIPA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Do lizy i mycia</td></tr><tr><td>komórek milliTUBE 1 mL AFA Fiber</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>Probówka Sonicator. Akcesorium do skoncentrowanego ultrasonografu</td></tr><tr><td>Skoncentrowany ultrasonograf</td><td>Covaris</td><td>S220 lub E220</td><td>Aby strawić DNA do odpowiedniej wielkości dla ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>Do buforu elucyjnego ChIP</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>Do oczyszczania DNA z lizatu</td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001</td><td>Do oczyszczania DNA z lizatu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>Przygotować 70% roztwór</td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało anty-FLAG M2 wytwarzane u myszy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>W celu oczyszczenia chromatyny ulegającej ekspresji w komórkach będących przedmiotem zainteresowania</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>Może być stosowany do anty-FLAG IP i anty-H3K4me3 IP</td></tr><tr><td>Anty-tri-metylowy histon H3 (K4), mysie przeciwciało monoklonalne</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>301-34811</td><td>Każde inne przeciwciało, które działa do analizy ChIP, będzie działać</td></tr><tr><td>10x Odczynnik blokujący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Do blokowania podczas oczyszczania powinowactwa</td></tr><tr><td>Denhardt' s roztwór</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>Do blokowania podczas oczyszczania powinowactwa</td></tr><tr><td>Glikogen (5 mg / ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>Do oczyszczania DNA z lizatu</td></tr><tr><td>Fluorometr Qubit 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>Do oznaczania ilościowego izolowanego DNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Do ilościowego oznaczania izolowanego DNA</td></tr><tr><td>Probówka 0,5 ml</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>Do oznaczania ilościowego za pomocą Qubit</td></tr><tr><td>Fenol / chloroform / alkohol izoamylowy (25:24:1)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>Do oczyszczania DNA z lizatu</td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Koraliki magnetyczne SPRI do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>Metalowy stojak na lód</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>Aby utrzymać zamrożony</td></tr> <tr><td>lizat komórkowyChłodziarka do próbek</td><td>New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>Pomaga naprawiać komórki przy minimalnych uszkodzeniach</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>Do sprawdzania jakości izolowanych fragmentów DNA. Można użyć innego analizatora fragmentów.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100 Expert Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td><td>dostarczany z zestawem Bioanalyzer</td></tr><tr><td>DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Aby sprawdzić jakość wyizolowanych fragmentów DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki KAPA LTP</td><td>Roche</td><td>07961898001</td><td>Dostarczany z 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase i roztworem PEG/NaCl</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA Barcodes</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>Adapter do przygotowania biblioteki. Dostarczany z adapterami kodów kreskowych DNA i mieszanką podkładów.</td></tr><tr><td>Zestaw do wzmacniania biblioteki w czasie rzeczywistym KAPA</td><td></td> Roche <td>07959028001</td><td>dostarczany z 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix i wzorcami fluorescencyjnymi</td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>Do przygotowania biblioteki. Dodatkowo enzym ten może być wymagany w zestawie do amplifikacji biblioteki w czasie rzeczywistym KAPA</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5 do elucji</td></tr><tr><td>DNA 386-dołkowa płytka qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex System do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td><td>Do ilościowego oznaczania</td></tr><tr><td>optycznej folii samoprzylepnej DNA MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>Do uszczelniania płyt</td></tr><tr><td>Mieszanka</td><td></td><td></td> główna naprawy końcowej <td>Połącz 1,4 i mikro; L z 10x bufor naprawy końca KAPA, 1 i mikro; L mieszanki enzymów naprawy końców KAPA oraz 1,6 i mikro; L z H2O</td></tr><tr><td>A-taling master mix</td><td></td><td></td><td>Kombajn 1 i mikro; L bufora ogonowego KAPA A, 0,6 i mikro; L enzymu ogoniastego KAPA A oraz 8,4 i mikro; L H2O</td></tr><tr>Mieszanka <td></td><td></td><td>buforowa do ligacji</td><td>Połącz 2 i mikro; L buforu ligacyjnego KAPA i 6 &mikro; L z H2O</td></tr><tr><td>Mistrzowska mieszanka</td><td></td><td></td> PCR w czasie rzeczywistym <td>Połącz 5 i mikro; L z 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0,35 i mikro; L mieszanki starterów PCR (10 &mikro; M każdy z przedniego startera AATGATACGGCGACCGAG i odwrotnego startera CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) oraz 3.15 &micro; L z H2O</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td></td><td></td><td>Połącz 10 i mikro; L z 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 i mikro; L PCR Primer Mix oraz 0,6 i mikro; L of H2O</td></tr><tr><td>Integrative Genomics Viewer</td><td>Broad Institute</td><td>IGV_2.3.88</td><td>Przeglądarka genomu do wizualizacji danych sekwencjonowania</td></tr><tr><td>Olginukleotyd DNA: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Starter do amplifikacji regionu promotorowego</td></tr><tr><td>olginukleotydu GAPDH DNA: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>Starter do amplifikacji regionu promotora GAPDH</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex</td><td>Taq Takara</td><td>RR420L</td><td>Do ilościowego określenia DNA odpowiadającego regionowi promotora GADPH</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Dice</td><td>Takara</td><td>TP870</td><td>Do ilościowego określenia DNA odpowiadającego regionowi promotora GADPH</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Regulacja epigenetyczna odgrywa kluczową rolę w ekspresji genów. Od czasu odkrycia modyfikacji histonów w latach 60. XX wieku, ich funkcje fizjologiczne i patologiczne są szeroko badane. Rzeczywiście, pojawienie się głębokiego sekwencjonowania nowej generacji i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) za pomocą specyficznych przeciwciał modyfikujących histony zrewolucjonizowało nasze spojrzenie na regulację epigenetyczną w całym genomie. I odwrotnie, tkanki zazwyczaj składają się z różnych typów komórek, a ich złożona mieszanina stanowi wyzwanie analityczne w badaniu epigenomu w określonym typie komórki. Aby zająć się stanem chromatyny specyficznym dla typu komórki w sposób obejmujący cały genom, niedawno opracowaliśmy sekwencjonowanie immunoprecypitacyjne chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), które opiera się na selektywnym oczyszczaniu chromatyny przez znakowane białka histonowe rdzenia z typów komórek będących przedmiotem zainteresowania, a następnie ChIP-Seq. Celem tego protokołu jest wprowadzenie najlepszych praktyk tChIP-Seq. Technika ta zapewnia wszechstronne narzędzie do badania epigenomu specyficznego dla tkanek w różnych modyfikacjach histonów i organizmach modelowych.

W niniejszej pracy opisujemy sekcję tkanek, fiksację, lizę komórek, tandemowe oczyszczanie chromatyny oraz przygotowanie biblioteki DNA dla sekwencjonerów nowej generacji. W trakcie procedur można testować jakość DNA, która jest kluczowa dla sukcesu sekwencjonowania, na wielu etapach (Rysunek 2). Ponieważ pojedynczy nukleosom jest zazwyczaj otoczony przez 147 bp DNA 4, pofragmentowane DNA nie powinno być krótsze niż ta wartość. Bezpośr...

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak to, w jakim stopniu modyfikacje chromatyczne są regulowane w sposób specyficzny dla typu komórki wraz z genomami. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wyizolować chromatynę z docelowych komórek, a następnie podążać za typowym cygańskim strumieniem. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w specyficzny dla neuronów trimincil, lizyn 4, opisoncilly.Może być również stosowany do innych modyfikacji histonów, innych typów komórek, a następnie innych organizmów modelowych. Procedurę zademonstruje Mari Mito, technik z mojego laboratorium. Na początek użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby rozciąć interesującą Cię tkankę na małe kawałki.Dodaj fragmenty tkanek do czystego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem. Następnie przenieś fragmenty tkanek do dwóch mililitrowych probówek wypełnionych ciekłym azotem. Przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez pięć minut z otwartą nakrętką, aby odparować ciekły azot.Umieścić probówki zawierające próbki tkanek na schłodzonym metalowym stojaku na lód. Następnie umieść metalową kulę w 1,5-mililitrowej probówce i schłodź ją ciekłym azotem. Umieścić schłodzoną metalową kulę w jednej z probówek na próbki.Zamknij nakrętkę i umieść rurkę w uchwycie probówki młynka kriogenicznego. Natychmiast zanurz zmontowany uchwyt probówki w ciekłym azocie na jedną minutę. Włóż uchwyt zamrożonej probówki do zewnętrznej kasety młynka kriogenicznego.I potrząsaj nim energicznie przez 30 sekund, 60 razy. Następnie zdemontuj młynek kriogeniczny, usuń metalową kulę. Następnie umieść probówkę w wstępnie schłodzonej chłodziarce do pobierania próbek.Przechowuj lodówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 900 mikrolitrów 1% formaldehydu do probówki i odpipetuj do wymieszania. Przenieś zawiesinę do nowej dwumililitrowej probówki z 900 mikrolitrami 1% formaldehydu.Następnie utrwal zawiesinę na 10 minut, delikatnie obracając w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodaj do probówki 100 mikrolitrów glicyny molowej o stężeniu 2,5 molowym. I wirować przy 3000 razy większej grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć super supernatant. Dodaj jeden mililitr PBS do probówki i wiruj, aby wymieszać. Wirować w temperaturze 3000 razy większej niż grawitacja przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy jeden do granulki i odpipetuj do wymieszania. Odwirować probówkę przez pięć minut przy trzykrotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant.Dodaj jeden mililitr buforu do lizy, dwa do granulki i wiruj do wymieszania. Następnie odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 3000-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 800 mikrolitrów buforu do badania radioimmunoprecypitacji z koktajlem inhibitorów proteazy do osadu i pipety do wymieszania.Odwirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 3000 razy większej niż grawitacja w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie do granulatu dodaj 500 mikrolitrów buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 3000-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant.Dodaj jeden mililitr buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy. Natychmiast po dodaniu buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy, należy przenieść lizat do probówki sonikatora. I umieść rurkę na ultrasonografie.Korzystając z ustawień opisanych w protokole tekstowym, ścinaj chromatynę. Następnie przenieś próbkę do 1,5-mililitrowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. I odwirowywać go przez pięć minut przy 20 000 razy większej grawitacji w czterech stopniach Celsjusza.Pobrać supernatant z próbki i przenieść go do nowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. W protokole tym wprowadzono i zademonstrowano sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny tandemowej. Podczas zabiegu jakość DNA była badana na wielu etapach.Bezpośrednio po sonikacji ścięte DNA zostało wyizolowane i przetestowane za pomocą elektroforezy mikroprzepływowej. Po zastosowaniu przeciwciała anty-FLAG i przeciwciała anty-H3K3me3 do przeprowadzenia oczyszczania powinowactwa, jakość DNA została ponownie sprawdzona. Swoistość immunologicznego oczyszczania DNA na H2B-FLAG potwierdzono ujemnymi próbkami kontrolnymi.Gdzie wykryto znikome ilości DNA. W dalszej części protokołu zweryfikowano jakość biblioteki sekwencjonowania. Skuteczność ChIP i T-ChIP została udowodniona poprzez analizę wzbogacenia przy użyciu starterów ukierunkowanych na region promotorowy genu GAPDH.Uzyskano reprezentatywne redystrybucje wzdłuż trzech genów neuronów. Zaobserwowano wzbogacenie odczytów na pięciu pierwszych końcach genów przez neuron T-ChIP seek w całym mózgu. Po ustabilizowaniu się, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie epigenetyki do zbadania modyfikacji histonów specyficznych dla typu komórki ogólnie w neuronach u myszy.Nie zapominaj, że praca z formaldehydem może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie gumowej odzieży i okularów.

tchip-seq-cell-type-specific-epigenome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Metody mapowania interakcji białko-DNA in vivo stają się kluczowe dla każdego aspektu badań genomicznych, ale są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. W artykule przedstawiono dostępny na rynku zrobotyzowany system obsługi cieczy, który automatyzuje immunoprecypitację chromatyny w celu mapowania in vivo interakcji białko-DNA z ograniczoną liczbą komórek.

Automatyzacja eksperymentów ChIP-seq w celu wygenerowania profili epigenetycznych na 10 000 komórek HeLa

Precyzyjna regulacja transkrypcji genów leży u podstaw decyzji o losie komórki embrionalnej. W niniejszym artykule opisujemy testy immunoprecypitacji chromatyny stosowane do badania epigenetycznej regulacji zarówno różnicowania komórek macierzystych w sercu, jak i rozwoju serca zarodków myszy.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę tChIP-Seq do analizy modyfikacji histonów specyficznych dla typu komórki w neuronach myszy. Ta technika pozwala izolować chromatynę i badać epigenetyczną regulację genomu.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Przeglądaj więcej filmów