Uczenie się strachu wzmocnione stresem, solidny model zespołu stresu pourazowego u gryzoni
13 października 2018
Tutaj opisujemy szczegółową metodologię wymaganą do przeprowadzenia eksperymentów z uczeniem się strachu wzmocnionego stresem (SEFL), przedklinicznego modelu zespołu stresu pourazowego, zarówno u szczurów, jak i myszy. Model wykorzystuje aspekty warunkowania i zamrażania strachu Pawłowa jako wskaźnik zwiększonego strachu u gryzoni.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki behawioralnej, takie jak to, jak lepiej zrozumieć mechanizmy biologiczne leżące u podstaw PTSD. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest solidna, niezawodna, ilościowa i może być wykonywana na wielu gatunkach. Zacznij od ustawienia jednego zestawu komór warunkowania strachu, aby służyły jako kontekst A, a drugiego zestawu komór warunkowania strachu, aby służyły jako kontekst B. Umieść każdą komorę warunkowania strachu w kabinie tłumiącej dźwięk, aby zapobiec wtargnięciu hałasu z zewnątrz.
Następnie umieść podłogi z siatki w każdej komorze kondycjonującej strach, aby dostarczyć wstrząsy stopy, używając innego wzoru siatki dla każdego kontekstu, aby rozróżnić teksturę podłogi między kontekstami. Następnie umieść czarne trójkątne wstawki z pleksi w kontekście B, aby rozróżnić wewnętrzny układ tych dwóch kontekstów. Wytrzyj ściany i drzwi komory i spryskaj patelnie pod podłogą rusztu rozcieńczonym roztworem czyszczącym.
Po oczyszczeniu podłogi siatki podłącz generator wstrząsów i scrambler zdolny do dostarczenia wstrząsu o amplitudzie 1 miliamper lub niższej do każdej podłogi siatki w celu dostarczenia wstrząsów stopowych. Na koniec użyj multimetru, aby przetestować prąd dostarczany przez generator wstrząsów, umieszczając każdą sondę na innym pręcie podłogi siatki i potwierdzając, że wytwarzana jest pożądana amplituda wstrząsu. Pierwszego dnia skonfiguruj kontekst A z podłogami z siatki i światłem widzialnym.
Upewnij się, że multimetr jest przymocowany do różnych prętów, aby potwierdzić żądaną amplitudę wstrząsu. Transportuj zwierzęta z wiwarium do pomieszczenia eksperymentalnego w ich domowych klatkach umieszczonych na wózku i umieszczaj je pojedynczo w czterech komorach kondycjonowania strachu. W eksperymentach na myszach użyj generatora wstrząsów i scramblerów, aby dostarczyć 10 jednosekundowych wstrząsów o natężeniu jednego miliampera na stopę, losowo prezentowanych przez 60 minut przez siatkowe podłogi komór zawierających osoby uwarunkowane traumą.
W przypadku eksperymentów na szczurach użyj generatora wstrząsów i scramblerów, aby dostarczyć 15 jednosekundowych wstrząsów o natężeniu jednego miliampera na stopę, losowo prezentowanych przez 90 minut przez pręty siatki komór zawierających osoby uwarunkowane traumą. Po 90 minutach w przypadku szczurów lub 60 minutach w przypadku eksperymentów na myszach, wszystkie zwierzęta powinny wrócić do swoich domowych klatek i niezwłocznie wrócić do wiwarium. Drugiego dnia skonfiguruj kontekst A i przetransportuj zwierzęta do pokoju doświadczalnego, tak jak to miało miejsce pierwszego dnia.
Umieść zwierzęta w kontekście A na osiem minut, bez szoku, i nagraj wideo zachowanie podczas całej sesji. Po ośmiu minutach wszystkie zwierzęta powinny wrócić do swoich domowych klatek i niezwłocznie wrócić do wiwarium. Trzeciego dnia skonfiguruj kontekst B z innym zestawem podłóg z siatki niż te użyte w kontekście A oraz czarnymi trójkątnymi lub białymi zakrzywionymi wkładkami z pleksiglasu.
W razie potrzeby użyj światła podczerwonego lub bliskiej podczerwieni, aby oświetlić komory i sprawdź amplitudę wstrząsu za pomocą multimetru. Wytrzyj komory i spryskaj patelnie pod podłogą kratki roztworem, który nie został użyty w kontekście A. Następnie przetransportuj zwierzęta z wiwarium do pokoju doświadczalnego w czarnej plastikowej wannie i umieść je pojedynczo w komorach kondycjonujących strach. Po 180-sekundowym okresie podstawowym należy dostarczyć wszystkim zwierzętom pojedynczy wstrząs o wartości jednej sekundy i miliampera stopy w przypadku szczurów lub pojedynczy wstrząs o długości jednej milimiliampera stopy u myszy.
Następnie usuń wszystkie zwierzęta 30 sekund po podaniu wstrząsowym i natychmiast wróć do wiwarium. W czwartym dniu procedury skonfiguruj kontekst B, tak jak w dniu trzecim. Transportuj zwierzęta z wiwarium do pomieszczenia doświadczalnego tym samym transportem, co w trzecim dniu.
Umieść zwierzęta w kontekście B na osiem minut bez podawania wstrząsów i nagrywaj wideo zamrażanie przez całą sesję. Na koniec usuń wszystkie zwierzęta po ośmiu minutach i natychmiast wróć do wiwarium. Wyniki wskazują, że zwierzęta w stanie traumy wykazywały znacznie wyższy poziom zamrożenia w kontekście A w porównaniu z grupą kontrolną bez traumy, co wskazuje na nabycie strachu w kontekście traumy.
Zarówno zwierzęta, u których doszło do urazu, jak i u zwierząt, u których nie stwierdzono urazu, wykazywały minimalne poziomy zamrożenia, które nie różniły się od siebie. Co więcej, zwierzęta z traumą wykazywały niższą reaktywność na wstrząs w porównaniu z grupą kontrolną bez urazu, a zwierzęta z traumą wykazywały większe zamrożenie w porównaniu z grupą kontrolną bez urazu, co wskazuje, że narażenie na stresor traumatyczny zwiększało strach bezpośrednio po łagodnym stresorze. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak labirynt podwyższony plus, otwarte pole i jasno-ciemne pudełko, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak trauma wpływa na fenotypy podobne do lęku.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodologię przeprowadzania eksperymentów nad uczeniem się strachu wzmocnionym stresem (SEFL), będącym modelem przedklinicznym do badania zespołu stresu pourazowego (PTSD) u gryzoni. Podejście to integruje pawłowowskie warunkowanie strachu i ocenia reakcje strachu poprzez analizę zachowań zamierania (freezing).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia behawioralna
- Psychobiologia
- Modele zwierzęce PTSD
Wprowadzenie
- SEFL jest modelem wykorzystywanym do badania mechanizmów leżących u podłoża PTSD.
- Metoda ta ma zastosowanie zarówno u szczurów, jak i u myszy.
- Wykorzystuje ona uznane paradygmaty warunkowania lękowego.
- Zrozumienie reakcji lękowych może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- W celu wyjaśnienia mechanizmów biologicznych związanych z PTSD.
- W celu zapewnienia wiarygodnych ram badania uczenia się lęku.
- W celu pogłębienia zrozumienia reakcji behawioralnych u gryzoni.
Zastosowane metody
- Przygotowanie komór warunkowania lękowego dla różnych kontekstów.
- Zastosowanie kabin wygłuszających w celu zminimalizowania zakłóceń hałasu.
- Implementacja podłóg z prętów do podawania wstrząsów stóp.
- Modyfikacja układu komór w celu rozróżnienia poszczególnych kontekstów.
Główne wyniki
- Metoda ta wykazuje wysoką odporność i niezawodność w pomiarze reakcji lękowych.
- Możliwe jest pozyskanie danych ilościowych dla wielu gatunków.
- W warunkach kontrolowanych można efektywnie modelować wzmocnione uczenie się lęku.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów PTSD.
Wnioski
- SEFL stanowi cenne narzędzie do badania PTSD w warunkach przedklinicznych.
- Metodykę tę można dostosować do różnych projektów eksperymentalnych.
- W przyszłych badaniach można oprzeć się na tych wynikach, aby badać opcje terapeutyczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Uczenie się lęku wzmocnione stresem (SEFL) stanowi solidny model przedkliniczny do badania mechanizmów rozregulowania lęku, istotnych dla walidacji celów terapeutycznych w PTSD. Model ten umożliwia ilościową ocenę indukowanego traumą uczulenia na uczenie się lęku, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w wczesnych etapach odkrywania leków. Poprzez odtworzenie długotrwałej hiperмнеzji lękowej po ostrym stresie, SEFL pomaga w ocenie stopnia zaangażowania celu oraz modulacji szlaków w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących dysregulacji obwodów strachu oraz neuroplastyczności indukowanej stresem.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów zaangażowanych w konsolidację i wygaszanie pamięci strachu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę modulacji celu w odpowiedziach strachu uwrażliwionych przez traumę, co dostarcza informacji pomocnych w wyborze wiodących kandydatów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość testu: Ustanawia zstandaryzowane, powtarzalne protokoły warunkowania lękowego z mierzalnymi odczytami zachowania zamierania.
- Użyteczność międzygatunkowa: Kompatybilny z modelami szczurzymi i mysimi, co umożliwia skalowanie translacyjne oraz walidację celów w różnych gatunkach.
- Rozróżnianie kontekstu: Wykorzystuje odmienne sygnały środowiskowe (podłogi kratowe, wkładki kontekstowe) w celu wyizolowania generalizacji lęku specyficznego dla traumy, co zwiększa swoistość testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje fenotypy istotne dla PTSD, w tym długotrwałe uwrażliwienie na strach oraz upośledzone wygaszanie lęku.
- Ciągłość mechanistyczna: Łączy walidację celu w fazie odkryć z przedkliniczną oceną modulatorów obwodów strachu.
- Podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza ilościowych wskaźników zamierania (freezing), które pozwalają określić kryteria kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) w oparciu o zaangażowanie celu i odwrócenie deficytów behawioralnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
SEFL wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, poprzez optymalizację wiodących związków, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, w szczególności w odniesieniu do celów w OUN modulujących reakcje na strach i stres.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia opartą na hipotezach analizę ścieżek pamięci lękowej i systemów odpowiedzi stresowej przy użyciu kontrolowanej ekspozycji na traumę.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych, mierzalnych wyników warunkowania lękowego, odpowiednich do przesiewania bibliotek związków i kampanii walidacji celów terapeutycznych.
- Analityka: Generuje wiarygodne pomiary procentowego zamarcia (freezing), umożliwiające statystyczne porównanie grup traumatyzowanych i kontrolnych w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość procesu od identyfikacji celu do walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie hiperмнеzji lękowej istotnej dla PTSD.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Stanowi skalowalną, międzygatunkową platformę behawioralną, którą można zastosować w wielu obszarach terapeutycznych obejmujących zaburzenia lękowe, lęk i zaburzenia związane ze stresem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez modelowanie indukowanej urazem sensytyzacji na lęk, istotnej dla patofizjologii PTSD.
- Wartość operacyjna: Dostarcza solidnych, powtarzalnych i mierzalnych punktów końcowych behawioralnych w różnych laboratoriach i ośrodkach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich w walidacji celów dzięki fenotypowaniu istotnemu dla danej choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w obrębie OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o skuteczność w odwracaniu wzmocnionego stresem uczenia się lęku.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki behawioralnej, paradygmatów warunkowania lękowego oraz obsługi gryzoni.
- Zależne od komór do warunkowania lękowego, systemów podawania wstrząsów, wygłuszonych obudów oraz infrastruktury do śledzenia wideo.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów urazów i testów w celu zapewnienia powtarzalności wyników pomiędzy różnymi operatorami i ośrodkami.
- Wiąże się z koniecznością adaptacji parametrów wstrząsów, czasu trwania oraz dyskryminacji kontekstowej w zależności od gatunku (szczury i myszy).
- Ogranicza się do pomiaru wyuczonych reakcji lękowych; wymagane są uzupełniające analizy w celu oceny szerszych fenotypów związanych z lękiem, afektem lub stresem.
