Name: Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj izolację pierwotnych hepatocytów myszy do analizy nowo powstających białek wątrobowych metodą nieradioaktywnego znakowania. Technika umożliwia badanie metabolizmu energetycznego wątroby w chorobach metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Joonbae Seo i Vivian Hwa za ich wkład naukowy i dyskusję. Prace te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) (R01DK107530). T.N. był wspierany przez PRESTO z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii. Część tego badania została wsparta grantem z NIH (P30DK078392) dla Digestive Disease Research Core Center w Cincinnati.

Ten protokół zawiera użycie myszy laboratoryjnych. Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez komitety ds. opieki nad zwierzętami Centrum Medycznego Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.
1. Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy
<ol>
	<li>Przygotowania przed izolacją
	<ol>
		<li>Przygotować 450 ml buforu gradientu gęstości 40%, jak opisano w Tabeli 1 i utrzymywać w temperaturze 4 °C (15 ml/mysz).</li>
		<li>Przygotować 500 ml pożywki Williamsa zgodnie z opisem w Tabeli 1 i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 500 ml DMEM zgodnie z opisem w Tabeli 1 i trzymać na lodzie (30 ml / mysz).</li>
		<li>Przygotować 500 ml buforu HBSS (-) zgodnie z opisem w Tabeli 1 i przechowywać w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej (40 ml/mysz).</li>
		<li>Przygotować 500 ml buforu HBSS (+) z 0,3 mg/ml kolagenazy typu X, jak opisano w Tabeli 1, z 30-minutową inkubacją w temperaturze 42 °C w łaźni wodnej (40 ml/mysz).</li>
		<li>Ustawić pompę perfuzyjną, umieszczając rurkę do podawania dożylnego (IV) w poprzek pedału nożnego zatrzasku i sprawdzając przepływ roztworu płuczącego bez pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Rozgrzać grzałkę rurową w temperaturze 42 °C.</li>
		<li>Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie i perfuzja
	<ol>
		<li>Wyczyść obszary robocze i pompę.</li>
		<li>Wypłucz rurkę dożylną podłączoną do pompy, dokładnie przepuszczając 70% etanolu przez 10 minut.</li>
		<li>Usuń resztki etanolu z rurki dożylnej podłączonej do pompy, całkowicie spłukując DDW przez 10 minut.</li>
		<li>Przetrzyj nożyczki i kleszcze 70% etanolem.</li>
		<li>Umieść mysz w plastikowym pojemniku z siatkowym dnem i z 2 ml gazy nasączonej izofluranem pod siatką, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu.</li>
		<li>Ocenia głębokość znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca</li>).
		<li>Wyjmij mysz, gdy osiągnie żądaną głębokość znieczulenia. 
		UWAGA: Czas indukcji znieczulenia nie powinien przekraczać 1 minuty.</li>
		<li>Skonstruuj stożek nosowy za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml z wkładką nasączoną izofluranem o pojemności 1 ml wciśniętą do końca probówki.</li>
		<li>Kontroluj głębokość znieczulenia, zbliżając lub oddalając stożek nosa od nozdrzy myszy.</li>
		<li>Umieść mysz na platformie roboczej brzuszną stroną skierowaną do góry.</li>
		<li>Rozpyl 70% etanolu na okolice brzucha myszy, a następnie otwórz jamę brzuszną, wykonując duże poprzeczne nacięcie skóry właściwej i otrzewnej za pomocą ostrych nożyczek i kleszczy zębatych.</li>
		<li>Następnie wykonaj pionowe cięcie warstw brzusznych, aż wszystkie narządy jamy brzusznej zostaną całkowicie odsłonięte, używając ostrych nożyczek i kleszczy zębatych.</li>
		<li>Przesuwaj jelito cienkie i grube w kierunku lewej strony myszy za pomocą autoklawowanej końcówki bawełnianej, aż wątroba, żyła wrotna i żyła główna dolna (IVC) zostaną wyraźnie odsłonięte.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik 24 G do IVC tuż przy rozwidleniu prawej żyły nerkowej, ostrożnie, bez podawania rąk, aby uniknąć uszkodzenia IVC i krwawienia. 
		UWAGA: Jeśli podczas wprowadzania cewnika do kroplówki dojdzie do krwawienia, należy spróbować wprowadzić nowy cewnik do żyły wrogiej.</li>
		<li>Wyjmij igłę cewnika i kontroluj położenie kaniuli, aby uniknąć wydostania się z IVC, a następnie połącz kaniulę 24 G z rurką perfuzyjną za pomocą łącznika. 
		UWAGA: Unikaj obecności pęcherzyków powietrza przed rozpoczęciem perfuzji.</li>
		<li>Rozpocznij perfuzję wątroby ciepłym HBSS (-) o szybkości przepływu 4 ml/min i szybko odetnij żyłę śledzionową, aby odprowadzić krew wewnętrzną za pomocą nożyczek. 
		UWAGA: Jeśli kaniulacja się powiedzie, wątroba zacznie blednąć z powodu wstecznej dystrybucji buforu z IVC do żył wątrobowych. Żyła wrotna jest utworzona przez połączenie żył śledziony i żył krezkowych górnych; Dlatego przecięcie żyły śledziony jest całkiem bezpieczne, ponieważ jest ona duża i dystalna od wątroby.</li>
		<li>Kontynuować perfuzję z 35 ml ciepłego HBSS (-). 
		UWAGA: Wątroba stanie się blada, jeśli perfuzja jest odpowiednia, a mysz nadal żyje pod narkozą na tym etapie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie i ekstrakcja
	<ol>
		<li>Perfone wątrobę myszy ciepłymi 35 ml HBSS (+), w tym kolagenazy typu X, przy szybkości przepływu 4 ml / min.</li>
		<li>Co kilka minut zaciskaj żyłę śledzionową za pomocą kleszczy przez ~10 s, aby cała objętość HBSS (+) mogła dyfundować do wszystkich anatomicznych części wątroby. 
		UWAGA: Wątroba zaczyna puchnąć po zaciśnięciu żyły śledziony z powodu przekrwienia bufora.</li>
		<li>Wlać 5 ml przygotowanego ciepłego HBSS (+) z kolagenazą typu X do 100 mm szalki Petriego pod koniec procesu perfuzji.</li>
		<li>Przed zatrzymaniem pompy odetnij perfundowaną wątrobę od reszty ciała, aby uniknąć cofania się krwi do wątroby, usuń pęcherzyk żółciowy kleszczami, a następnie delikatnie przetrzyj wątrobę ręcznikiem papierowym, aby usunąć krew.</li>
		<li>Przenieść wątrobę na szalkę Petriego, która zawiera 5 ml przygotowanego ciepłego HBSS (+) i delikatnie wyjąć kapsułkę wątrobową za pomocą kleszczyków z prostą końcówką. 
		UWAGA: Torebka wątroby to cienka warstwa tkanki łącznej otaczająca wątrobę.</li>
		<li>Tkankę miąższową należy dokładnie rozprowadzić za pomocą kleszczy. Dodaj 15 ml zimnego DMEM na szalkę Petriego. 
		UWAGA: Pożywka stanie się mętna z powodu komórek miąższowych, jeśli wątroba jest dobrze trawiona.</li>
		<li>Delikatnie potrząśnij rozdartą wątrobą, aby uwolnić pozostałe komórki miąższowe do pożywki i dodaj kolejne 15 ml zimnego DMEM do szalki Petriego, aby uzyskać resztę komórek.</li>
		<li>Przenieść DMEM z rozpuszczoną wątrobą przez sitko do komórek 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>oczyszczanie
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek o sile 60 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 10 ml DMEM.</li>
		<li>Dodać zawieszony osad jako cienką warstwę na wierzchu bufora gradientu gęstości 40% i odwirować przy 800 x g przez 10 minut bez hamulca w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant, w tym górną warstwę (DMEM) i środkową warstwę (martwe lub niemiąższowe), ale nie dolną warstwę (Osad: pierwszorzędowe hepatocyty miąższowe).</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki pierwotne za pomocą 2-3 ml pożywki Williama E i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia martwych komórek na ściance probówki.</li>
		<li>Dodać 7-8 ml pożywki William's E, delikatnie wymieszać i odwirować w temperaturze 800 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację próżniową, a następnie ponownie zawiesić osad z 10, 20 lub 30 ml pożywki E Williama (w zależności od wielkości osadu).</li>
		<li>Policz komórki przy użyciu automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Wysiewać pożywkę E Williama, przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny, a następnie zastąpić podłoże 10% pożywką FBS DMEM z Anti-Anti w celu usunięcia martwych lub nieprzyłączonych komórek i do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Następnego dnia pierwotne hepatocyty myszy są gotowe do użytku eksperymentalnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test reakcji ligacji chemoselektywnej do wykrywania powstającej syntezy białek
<ol>
	<li>Znakowanie metaboliczne
	<ol>
		<li>(Obróbka wstępna) Przemyć pierwotne hepatocyty dwukrotnie ciepłym PBS w temperaturze 37 °C i dodać pożywkę DMEM wolną od metioniny przez 30 minut, aby wyczerpać cytoplazmatyczne rezerwy metioniny. 
		UWAGA: L-azydohomoalanina, jest aminokwasem i analogiem metioniny, zawiera ugrupowanie azydo, które może być włączone do białek podczas biosyntezy białek komórkowych, tak że zubożenie cytoplazmatycznej metioniny zwiększy karmienie i włączenie L-azydohomoalaniny do nowo zsyntetyzowanych białek hodowanych pierwotnych hepatocytów.</li>
		<li>(Leczenie) Przemyć pierwotne hepatocyty dwukrotnie ciepłym PBS w temperaturze 37 °C i dodać pożywkę DMEM bez metioniny z 25 μM AHA (L-azydohomoalaniną) przez 4–6 godzin.</li>
		<li>Dodaj dowolną specyficzną substancję chemiczną (np. 10 μM rotenon) do pożywki przez 4-6 godzin w obecności AHA w celu zbadania jej wpływu na powstające poziomy ekspresji białka.</li>
		<li>Po inkubacji usunąć pożywkę przez aspirację próżniową i trzykrotnie przemyć hepatocyty pierwotne zimnym PBS.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu do lizy do płytki i inkubować przez 15-30 minut na lodzie, następnie przechylić płytkę i pobrać cały lizat komórkowy do probówki o pojemności 1,7 ml. 
		UWAGA: Należy zauważyć, że lizat komórkowy jest bardzo lepki podczas zbierania komórek.</li>
		<li>Poddaj sonikację lizatu komórkowego na lodzie przez 5 s trzykrotnie za pomocą sonografu sondowego do rozpuszczania białek i dyspersji DNA.</li>
		<li>Wirować lizat komórkowy przez 5 minut, odwirować lizat komórkowy przy 21,130 x g przez 10 minut w temperaturze 4 o°C, a następnie przenieść klarowny supernatant do nowej probówki. Zmierz stężenie białka dwukrotnie. 
		UWAGA: Na tym etapie próbki białka mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez dwa tygodnie, jeśli nie zostaną natychmiast wykorzystane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie powstającego białka modyfikowanego azydem
	<ol>
		<li>Przygotować składniki (A+B), dodając 60 μl składnika (A) do składnika (B). 
		UWAGA: Roztwór zmienia kolor na jasnoróżowy po dodaniu składnika (A) do (B).</li>
		<li>Przygotować (D) i (E) zgodnie z protokołem.</li>
		<li>Weź 20–40 μg lizatu komórkowego i dodaj 50 μl 2x bufor reakcyjny (składnik A+B), a następnie dostosuj objętość do 80 μl, dodając DDW i wiruj przez 5 s.</li>
		<li>Dodać 5 μl CuSO4 (składnik C) i wirować przez 5 s.</li>
		<li>Dodać 5 μl buforu reakcyjnego dodatek 1 (świeżo przygotowany składnik D), następnie wirować przez 5 s i odczekać 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 10 μl odtworzonego buforu reakcyjnego dodatku 2 (składnik E), następnie wirować przez 5 s i obracać próbki przez 20 minut w temperaturze 4 °C za pomocą maszyny wieloobrotowej. 
		UWAGA: Roztwór zmienia kolor na jasnopomarańczowy po dodaniu składnika (E). Próbki należy chronić przed światłem podczas obracania.</li>
		<li>Dodaj 300 μl metanolu i wiruj przez 5 s, dodaj 75 μl chloroformu i wiruj przez 5 s, następnie dodaj 200 μl DDW i wiruj przez 5 s.</li>
		<li>Odwirować próbki w temperaturze 21,130 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut, następnie odrzucić wodny supernatant i pozostawić osad.</li>
		<li>Dodaj 250 μl metanolu do probówki, wiruj i ponownie wiruj przez 5 minut w temperaturze 21 130 x g.</li>
		<li>Odrzucić supernatant, a następnie przykryć próbki niestrzępiącą się chusteczką i pozostawić granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza PAGE i western blotting
	<ol>
		<li>Rozpuścić granulat w 20 μl buforu ładującego bez β-merkaptoetanolu, wirować przez 10 minut, podgrzewać w temperaturze 70 °C za pomocą bloku grzewczego przez 10 minut. Następnie załaduj próbki do 10% żelu SDS (1,5 mm) w celu wykrycia tetrametylorodaminy (TAMRA).</li>
		<li>Wykrywanie sygnału AHA za pomocą skanera laserowego o zmiennym trybie pracy w celu precyzyjnego określenia ilościowego powstających białek.</li>
		<li>Myj żel z DDW przez 15 minut.</li>
		<li>Następnie zabarwić 10% żel SDS szybkim i czułym odczynnikiem Coomassie-dye przez 15–60 minut, aby wykryć całkowite białka jako kontrolę.</li>
		<li>Odbarwiaj żel za pomocą DDW przez 1-2 godziny i uzyskaj obraz za pomocą obrazowania fluorescencyjnego UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy zaznaczają, że nie mają konfliktu interesów.

Chociaż zaproponowano kilka nieśmiertelnych linii komórek wątroby i wykorzystano je do badania funkcji wątroby 49,50,51,52, komórkom tym na ogół brakuje ważnych i podstawowych funkcji normalnych hepatocytów, takich jak ekspresja albuminy (ryc. 3). W związku z tym powszechnie uznaje się, że wykorzystanie pierwotnych hepatocytów jest cenną opcją do badania fizjologii...

Białko jest ważnym elementem odżywczym i około 50% suchej masy ludzkiego ciała składa się z białek, które mają kilka biologicznych cech i funkcji1. W związku z tym synteza białek jest jednym z najbardziej energochłonnych zdarzeń, a zmiana metabolizmu białek jest silnie związana z rozwojem chorób, w tym chorób metabolicznych2,3,4. W wątrobie biosynteza białek odpowiada za około 20–30% całkowitego zużycia energii5,6. Ponadto białka funkcjonują nie tylko jako pasywne lub budulcowe wątroby, ale także jako aktywne czynniki pośredniczące w sygnałach wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo w celu regulacji metabolizmu ogólnoustrojowego7. Na przykład, obniżony poziom albuminy surowicy, która jest syntetyzowana i wydzielana przez wątrobę i najobficiej występujące białko w osoczu8, zwiększa ryzyko rozwoju cukrzycy typu 29,10,11, podczas gdy wyższe stężenie albuminy surowicy chroni przed rozwojem zespołu metabolicznego12. Ponadto zaburzenie lub zaburzenie działania wydzielniczych lub błonowych białek wątrobowych, które modulują homeostazę cholesterolu, w tym lipoprotein, LDLR i LRP1, może prowadzić do rozwoju insulinooporności, hiperlipidemii lub miażdżycy13. Dlatego identyfikacja molekularnych mechanizmów patofizjologicznych, które są zaangażowane w zaburzenia metabolizmu białek w wątrobie i związane z tym powikłania metaboliczne, może być przydatna do odkrywania nowych podejść farmakologicznych do opóźniania początku lub leczenia chorób metabolicznych, takich jak insulinooporność, cukrzyca i niealkoholowe stłuszczenie wątroby.
Synteza białek jest ściśle związana ze statusem energii komórkowej (np. wytworzenie jednego wiązania peptydowego podczas etapu wydłużania syntezy białek wymaga 4 wiązań fosfodiestrowych14) i jest regulowana przez szlaki molekularne, które wykrywają między- i wewnątrzkomórkową dostępność składników odżywczych15,16. Kinaza białkowa aktywowana AMP (AMPK) jest jednym z wewnątrzkomórkowych czujników energii, które utrzymują homeostazę energetyczną17. Gdy AMPK jest aktywowany, gdy poziom energii komórkowej staje się niższy, AMPK i jego docelowe substraty działają w celu stymulowania szlaków katabolicznych i hamowania procesów anabolicznych, w tym syntezy białek18,19. W regulacji syntezy białek pośredniczy fosforylacja wielu czynników translacyjnych i białek rybosomalnych20. Warto zauważyć, że ssaczy cel kompleksu rapamycyny 1 (mTORC1), głównego czynnika napędzającego syntezę białek, jest jednym z głównych celów AMPK21. Aktywacja szlaku mTORC1 zwiększa wzrost i proliferację komórek poprzez stymulację translacji białek i autofagii20,21. Dlatego logiczne jest, że aktywacja AMPK może hamować syntezę białek za pośrednictwem mTORC122. Rzeczywiście, aktywacja AMPK przeciwdziała i bezpośrednio fosforyluje mTORC1 na resztę treoniny 2446 (Thr2446), prowadząc do jej inaktywacji23 i zahamowania biosyntezy białek24. Co więcej, AMPK może pośrednio hamować funkcję mTORC1 poprzez fosforylację i aktywację kompleksu stwardnienia guzowatego 2 (TSC2) 25, który jest regulatorem kaskady sygnalizacyjnej mTORC1. Krótko mówiąc, rozregulowanie tych szlaków w wątrobie jest często związane z rozwojem chorób metabolicznych i dlatego istnieje pilna potrzeba ustanowienia skutecznych narzędzi eksperymentalnych w celu zbadania roli tych szlaków w regulacji metabolizmu energii i białek w hepatocytach.
Istnieje większe podobieństwo między funkcjonalnymi właściwościami izolowanych pierwotnych hepatocytów i hepatocytów in vivo niż w przypadku in vitro linii komórkowych pochodzących z wątroby26,27,28. Wykazano, że pierwotne ludzkie hepatocyty mają 77% podobieństwo do biopsji wątroby, podczas gdy komórki HepG2, które są dobrze zróżnicowanymi komórkami raka wątroby i są szeroko stosowane do badania funkcji wątroby, wykazują mniej niż 48% w kontekście profili ekspresji genów29. Dlatego wykorzystanie pierwotnych hepatocytów, a nie unieśmiertelnionych komórek hodowlanych, ma kluczowe znaczenie w badaniu funkcji i fizjologii wątroby, a dostępnych jest kilka protokołów izolacji i hodowli pierwotnych hepatocytów, zwłaszcza od szczurów30,31. Podczas gdy hepatocyty szczurów są przydatne przy stosunkowo wyższej wydajności komórek, hepatocyty myszy mają większy potencjał w wielu aspektach naukowych ze względu na szeroką dostępność myszy modyfikowanych genetycznie. Istnieje jednak kilka wyzwań technicznych związanych z izolacją zdrowych i licznych hepatocytów pierwotnych od myszy w celu oceny komórkowej i molekularnej: po pierwsze, wprowadzenie kaniuli w celu perfuzji wątroby za pomocą odczynników buforowych jest bardzo trudne do wykonania ze względu na małą i cienką żyłę wrotną myszy lub żyłę główną dolną; po drugie, dłuższy czas manipulacji komórkami podczas izolacji może spowodować zmniejszenie liczby i jakości komórek; Po trzecie, nieenzymatyczne metody mechanicznego rozdzielania mogą powodować poważne uszkodzenia i powodować niską wydajność żywotnych izolowanych hepatocytów pierwotnych32,33. W latach osiemdziesiątych XX wieku wprowadzono technikę perfuzji kolagenazy do izolowania hepatocytów z wątroby zwierząt34. Metoda ta opiera się na perfuzji kolagenazy w wątrobie35,36,37, infuzja wątroby roztworem chelatora wapnia38,39, trawienie enzymatyczne i mechaniczna dysocjacja miąższu wątroby35. W pierwszym etapie wątroba myszy jest perfundowana wolnym buforem wapnia [Ca2+] zawierającym chelator [Ca2+] (kwas etylenodiaminotetraoctowy, EDTA). W drugim etapie wątroba myszy jest perfundowana buforem zawierającym kolagenazę w celu hydrolizy interakcji między macierzą komórkową a zewnątrzkomórkową. W przeciwieństwie do buforu użytego w kroku pierwszym, obecność jonów [Ca2+] w buforze drugiego etapu jest wymagana do efektywnej aktywności kolagenazy, po czym strawiona wątroba musi być dalej delikatnie i mechanicznie oddzielona za pomocą kleszczy między torebką wątrobową a tkanką miąższową. Na koniec tkanka łączna jest usuwana przez filtrowanie, a następnie odwirowanie oddziela żywotne hepatocyty zarówno od komórek niemiąższowych, jak i od nieożywionych hepatocytów za pomocą bufora gradientu gęstości40,41,42. W niniejszym badaniu pokazujemy zmodyfikowaną dwuetapową technikę perfuzji kolagenazy w celu wyizolowania pierwotnych hepatocytów z wątroby myszy w celu analizy syntezy białek.
Radioznakowanie białek jest powszechnie używane do ilościowego określania poziomów ekspresji, szybkości obrotu i określania biologicznej dystrybucji białek43 ze względu na wysoką czułość wykrywania radioaktywności44. Jednak użycie izotopów promieniotwórczych wymaga ściśle kontrolowanych warunków i procedur badawczych45. Opracowano alternatywne metody nieradioaktywne, które zyskują coraz większą popularność. Reakcja chemoselektywnej ligacji z metodą wykrywania białka tetrametylorodaminy (TAMRA) jest jedną z nich i opiera się na chemoselektywnej reakcji między grupami azydkowymi i alkinowymi46, które można wykorzystać do analizy zdarzeń komórkowych, takich jak wykrywanie powstającej syntezy białek i podklas glikoprotein zmodyfikowanych grupą azydkową. W celu powstającej syntezy białek, L-azydohomoalanina (L-AHA, aminokwas modyfikowany azydkiem) może być metabolicznie włączona do białek i wykryta za pomocą metody wykrywania białek TAMRA47. Stosując ten test w pierwotnych hepatocytach myszy, pokazujemy, że powstające tempo syntezy białek jest ściśle związane z dostępnością ATP z aktywacji mitochondriów i AMPK (<silna klasa = "xfig">Figura 1).
Podsumowując, wykorzystanie pierwotnych hepatocytów myszy jest kluczowe dla badania metabolizmu białek i energii, a ilościowe określenie powstającej syntezy białek jest cenne dla uzyskania wglądu w fizjologiczną rolę szlaków istotnych dla rozwoju i leczenia chorób związanych z hepatocytami.

<table><tbody><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glikolu etylenowego-bis(&beta;-aminoetylo)-tetraoctowego</td><td>AmericanBio</td><td>AB00505-00025</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x) bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat chlorku wapnia (CaCl2.2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor gradientu gęstości</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) o niskiej glukozie, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon</td><td></td> <td>płodu bydlęcegoSH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x)</td> <td>Gibco</td><td>1897141</td><td></td></tr><tr><td>Williams medium E, bez glutaminy</td><td>Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Suplement dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu X</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-17864</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna</td><td>Cole-Parmer</td><td>Zestaw administracyjny Masterflex L/S</td><td></td></tr><tr><td>Equipment IV</td><td>EXELINT</td><td>29081</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>REVSCI</td><td>RS-PB-200</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Grzejnik rurowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Lab, Inc</td><td>0-39613</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>PHOENIX</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowany Końcówki bawełniane</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Szalka Petriego</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Złącze (męski pierścień blokujący Luer)</td> <td>Instrument Cole-Parmer</td><td>EW-4551807</td><td></td></tr><tr><td>Cewniki 24 G</td><td>TERUMO</td><td>Surflo 24Gx3/4'100</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; m Filtr (SITKA KOMÓRKOWE)</td><td>VWR</td><td>10199-658</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe ze stożkowym dnem</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL probówki wirówkowe ze stożkowym dnem</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Chemoselektywna reakcja ligacji ZESTAW DO WYKRYWANIA ANALIZY BIAŁEK, TAMRA ALKYNE</td><td>Invitrogen</td><td>C33370</td><td></td></tr><tr><td>AHA (L-azydohomoalanina)</td><td>Invitrogen</td><td>C10102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (bez metioniny)</td> <td>Gibco</td><td>21013024</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek L-cystyny</td><td>SIGMA</td><td>C2526</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmli</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr> Koktajl inhibitorów <tr><td>proteazy</td><td>SIGMA</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór SDS (20%)</td><td>BioRad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (1M)</td><td>Amerykański Bioanalityczny</td><td>AB14044-01000</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy</td><td>SIGMA</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pomiaru stężenia białka (albumina surowicy Bovin-BSA)</td><td>BioRad</td><td>500-0207</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy blok ciepła</td><td>VWR</td><td>12621-092</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Multi-Rotator</td><td>Grant-bio</td><td>Sprzęt</td> <td>PTR-60</td></tr><tr><td>Sonikator ultradźwiękowy</td><td>Cole-Parmer</td><td>GE130PB</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Standardowy wytrzymały mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>97043-566</td><td>Wyposażenie</td></tr><tr><td>Skaner laserowy o zmiennym trybie</td> GE <td>Healthcare Life Science</td><td>FLA 9500</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Odczynnik barwnikowy Coomassie-Thermo</td><td>Scientific</td><td>24594</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt Aparat do blottingu Western Sprzęt</td> do <td>1658004</td><td></td><td>BioRad</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Sprzęt BioRad</td><td>TC20</td><td>System</td></tr><tr><td>FluorChem R</td> białko <td>simple-Equipment</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Przeciwciało p-Ampka (T172)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2535</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Total-AMPK</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5832</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało albuminowe</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4929</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało beta aktyny</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-130656</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki i kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej l-azydohomoalaniny

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocyty są komórkami miąższowymi wątroby i realizują wiele funkcji metabolicznych, w tym syntezę i wydzielanie białek niezbędnych dla homeostazy energetycznej systemu. Hepatocyty pierwotne wyizolowane z mysiej wątroby stanowią cenne narzędzie biologiczne do zrozumienia właściwości funkcjonalnych lub zmian zachodzących w wątrobie. W niniejszym artykule opisano metodę izolacji i hodowli pierwotnych hepatocytów myszy poprzez wykonanie dwuetapowej techniki perfuzji kolagenazy i omówiono ich wykorzystanie do badania metabolizmu białek. Wątroba dorosłej myszy jest sekwencyjnie perfundowana glikolem etylenowym i kwasem tetraoctowym (EGTA) i kolagenazą, a następnie izoluje hepatocyty za pomocą buforu gradientu gęstości. Te izolowane hepatocyty są żywotne na płytkach hodowlanych i zachowują większość cech obdarzonych hepatocytami. Te hepatocyty mogą być wykorzystywane do oceny metabolizmu białek, w tym powstającej syntezy białek z odczynnikami nieradioaktywnymi. Pokazujemy, że izolowane hepatocyty są łatwo kontrolowane i charakteryzują się wyższą jakością i stabilnością objętościową syntezy białek związanej z metabolizmem energetycznym dzięki wykorzystaniu chemoselektywnej reakcji ligacji z metodą wykrywania białka tetrametylorodaminy (TAMRA) i analizami western blot. Dlatego metoda ta jest cenna dla badania powstającej syntezy białek wątrobowych związanych z homeostazą energetyczną. Poniższy protokół przedstawia materiały i metody izolacji wysokiej jakości pierwotnych hepatocytów myszy i wykrywania powstającej syntezy białek.

Izolacja pierwotnych hepatocytów mysich daje wydajność wynoszącą około 20 x 106 łącznie komórek/mysz. Histologicznie żywe i przytwierdzone pierwotne hepatocyty mają kształt wieloboczny lub typowy sześciokąt z wyraźnie zarysowaną granicą błonową po 24 h inkubacji (Rysunek 2).
Aby potwierdzić, czy wyizolowane komórki są pierwotnymi hepatocytami, porównaliśmy poziomy ekspresji białka albumin...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w różnych dziedzinach badań nad chorobami metabolicznymi dotyczące molekularnych zmian energii wątroby i biosyntezy białek w otyłości, niealkoholowym stłuszczeniu wątroby i cukrzycy typu drugiego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona izolację funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy i wykrywanie powstających białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap perfuzji jest trudny do nauczenia się ze względu na małe i cienkie naczynia krwionośne myszy.W celu perfuzji wątroby ostrożnie wprowadź cewnik o rozmiarze 24 do żyły głównej dolnej lub IVC tuż przy rozwidleniu z prawą żyłą nerkową. Wyjmij igłę cewnika, utrzymując pozycję kaniuli w IVC i połącz kaniulę o rozmiarze 24 z rurką perfuzyjną za pomocą łącznika. Rozpocznij perfuzję wątroby ciepłym HBSS minus przy stałym natężeniu przepływu czterech mililitrów, szybko przecinając żyłę śledzionową, aby odprowadzić krew wewnętrzną.Po 10 minutach należy wykonać perfuzję wątroby myszy za pomocą 35 mililitrów HBSS plus uzupełnionego kolagenazą typu X z szybkością przepływu cztere

isolation-primary-mouse-hepatocytes-for-nascent-protein-synthesis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Celem tego protokołu jest uzyskanie wysokiej żywotności i wysokiej wydajności hepatocytów i komórek śródbłonka sinusoidalnego z wątroby. Osiąga się to poprzez perfuzję wątroby roztworem kolagenazy typu IV przez żyłę wrotną, a następnie wirowanie różnicowe w celu uzyskania hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka.

Oczyszczanie hepatocytów i sinusoidalnych komórek śródbłonka z perfuzji wątroby myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić znakowanie białek specyficznych dla typu komórki za pomocą azydonorleucyny (ANL) przy użyciu linii myszy wyrażającej zmutowaną syntetazę tRNA L274G-metioniny (MetRS*) oraz niezbędne kroki do izolacji białek specyficznych dla znakowanego typu komórki. Przedstawiamy dwie możliwe drogi podawania ANL żywym myszom poprzez (1) picie wody i (2) wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Oczyszczanie i identyfikacja białek specyficznych dla typu komórki ze złożonych tkanek przy użyciu zmutowanej linii myszy syntetazy tRNA metioniny

Poznaj izolację pierwotnych hepatocytów myszy do analizy nowo powstających białek wątrobowych metodą nieradioaktywnego znakowania. Technika umożliwia badanie metabolizmu energetycznego wątroby w chorobach metabolicznych.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Przeglądaj więcej filmów