Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w różnych dziedzinach badań nad chorobami metabolicznymi dotyczące molekularnych zmian energii wątroby i biosyntezy białek w otyłości, niealkoholowym stłuszczeniu wątroby i cukrzycy typu drugiego. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że ułatwia ona izolację funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy i wykrywanie powstających białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap perfuzji jest trudny do nauczenia się ze względu na małe i cienkie naczynia krwionośne myszy.

W celu perfuzji wątroby ostrożnie wprowadź cewnik o rozmiarze 24 do żyły głównej dolnej lub IVC tuż przy rozwidleniu z prawą żyłą nerkową. Wyjmij igłę cewnika, utrzymując pozycję kaniuli w IVC i połącz kaniulę o rozmiarze 24 z rurką perfuzyjną za pomocą łącznika. Rozpocznij perfuzję wątroby ciepłym HBSS minus przy stałym natężeniu przepływu czterech mililitrów, szybko przecinając żyłę śledzionową, aby odprowadzić krew wewnętrzną.

Po 10 minutach należy wykonać perfuzję wątroby myszy za pomocą 35 mililitrów HBSS plus uzupełnionego kolagenazą typu X z szybkością przepływu czterech mililitrów na minutę, zaciskając żyłę śledziony na około 10 sekund co kilka minut, aby ułatwić rozprowadzenie perfuzatu w wątrobie. Gdy cała kolagenaza zostanie perfundowana, przenieś wątrobę na tkankę laboratoryjną przed zatrzymaniem pompy, aby uniknąć cofania się krwi do wątroby. Użyj kleszczy, aby usunąć woreczek żółciowy i delikatnie przetrzyj wątrobę świeżą tkanką laboratoryjną, aby usunąć krew.

Umieść wątrobę na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej pięć mililitrów świeżego, ciepłego HBSS plus uzupełnionego kolagenazą i użyj kleszczyków z zabłąkaną końcówką, aby delikatnie usunąć kapsułkę wątrobową. Użyj kleszczy, aby ostrożnie rozproszyć tkankę miąższową i dodaj 15 mililitrów zimnego DMEM do szalki Petriego. Delikatnie potrząśnij rozdartą wątrobą, aby uwolnić pozostałe komórki miąższowe do pożywki i dodaj kolejne 15 mililitrów zimnego DMEM do naczynia, aby uzyskać resztę komórek.

Następnie przefiltruj zawiesinę tkanek przez sitko o wielkości 100 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów na lodzie. Aby wyizolować pierwotne hepatocyty myszy, zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego DMEM. Ostrożnie ułóż komórki na buforze gradientu gęstości 40% w celu separacji gradientu gęstości, odrzucając komórki z górnej i środkowej warstwy po odwirowaniu.

Ponownie zawiesić pierwotną osadę hepatocytów miąższowych za pomocą dwóch do trzech mililitrów William's Medium E, aby uniknąć zbierania martwych komórek ze ścianki probówki i przenieść komórki do nowej 50-mililitrowej probówki. Wymieszaj komórki z dodatkowymi siedmioma do ośmiu mililitrami pożywki William's E Medium przed odwirowaniem i ponownie zawieś osad w 10, 20 lub 30 mililitrach świeżego William's Medium E, w zależności od wielkości osadu. Po policzeniu wysiewaj sześć razy 10 do piątych komórek do każdej studzienki sześciodołkowej płytki na dwie do trzech godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i anty-anti, aby usunąć martwe i nieprzyłączone komórki i zwrócić komórki do inkubatora na noc. W przypadku znakowania powstających białek modyfikowanych azydkami dodaj od 20 do 40 mikrogramów lizatu komórkowego do 50 mikrolitrów buforu reakcyjnego 2X. Doprowadź objętość do 80 mikrolitrów destylowaną wodą dejonizowaną i wiruj roztwór białka przez pięć sekund.

Dodaj pięć mikrolitrów siarczanu miedzi do komórek na kolejny pięciosekundowy wir, a następnie pięć mikrolitrów pierwszego dodatku buforowego do reakcji z pięciosekundowym wirowaniem. Po trzyminutowej inkubacji dodać 10 mikrolitrów odtworzonego dodatku buforowego reakcyjnego dwa do komórek na kolejny pięciosekundowy wir i obracać próbkę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na maszynie wieloobrotowej chronionej przed światłem. Pod koniec rotacji dodaj 300 mikrolitrów metanolu do lizatu, a następnie 75 mikrolitrów chloroformu i 200 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody.

Zebrać znakowane białko przez odwirowanie i dodać 250 mikrolitrów świeżego metanolu do granulki. Po wirowaniu ponownie odwirować lizat i przykryć goły osad niestrzępiącą się chusteczką na 15 minut w temperaturze pokojowej. Do analizy PAGE rozpuścić wysuszony osad w 20 mikrolitrach buforu ładującego bez beta-merkaptoetanolu i wirować osad przez 10 minut.

Następnie podgrzej białko w bloku grzewczym o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut i załaduj próbkę do 10% żelu dodecylosiarczanu sodu w celu wykrycia tetrametylorodaminy. Następnie użyj skanera laserowego o zmiennym trybie do precyzyjnego oznaczania ilościowego powstających białek znakowanych AHA. Histologicznie, żywe i przyczepione hepatocyty pierwotne wydają się zazwyczaj wielokątne lub sześciokątne z wyraźnie zarysowaną błoniastą granicą po 24 godzinach hodowli.

Aby potwierdzić, czy izolowane komórki są hepatocytami pierwotnymi, w tym eksperymencie porównano poziomy ekspresji białka albuminy w fibroblastach embrionalnych myszy, linii komórkowej wątrobiaka myszy, izolowanych pierwotnych hepatocytach myszy i wątrobach myszy. Ekspresję białka albuminy wykryto w pierwotnych hepatocytach myszy i wątrobie myszy, ale nie można jej było wykryć ani w fibroblastach embrionalnych myszy, ani w komórkach linii komórkowej wątrobaka. Pierwotne leczenie hepatocytów 10 mikromolowym rotenonem przez cztery do sześciu godzin wykazało silną indukcję wątrobowej kinazy białkowej aktywowanej przez AMP, co wykryto na podstawie zwiększonych poziomów fosforylacji na wątrobowej kinazie białkowej aktywowanej AMP T172, podobnych do obserwowanych in vivo.

Rzeczywiście, pięć godzin leczenia 10 mikromolowym rotenonem miało głęboki hamujący wpływ na powstającą syntezę białek w traktowanych pierwotnych hepatocytach w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi, jak wykazano w teście chemoselektywnej reakcji ligacji. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o wcześniejszym przygotowaniu wszystkich wymaganych odczynników i pożywek. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się patofizjologią metaboliczną wątroby do zbadania molekularnego mechanizmu regulacji białek energetycznych w otyłości i cukrzycy typu drugiego w izolowanych pierwotnych hepatocytach myszy.