Name: Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 + (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania anizotropowych sztucznych komórek prezentujących antygen z polimeru PLGA do aktywacji limfocytów T CD8+. Technika umożliwia niezależną kontrolę rozmiaru i kształtu cząstek dla zastosowań w immunoterapii nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EBA (DGE-1746891) i KRR (DGE-1232825) dziękują programowi NSF Graduate Research Fellowship za wsparcie. RAM dziękuje National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) oraz Achievement Rewards for College Scientists Fellowship za wsparcie. Autorzy dziękują NIH (R01EB016721 i R01CA195503), Research to Prevent Blindness James and Carole Free Catalyst Award oraz JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy za wsparcie.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Wytwarzanie sferycznych cząstek PLGA o przestrajalnych rozmiarach
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów do syntezy cząstek
	<ol>
		<li>Przygotować 5% w/w roztwór alkoholu poliwinylowego (PVA).
		<ol>
			<li>Dodać 500 ml wody dejonizowanej (DI) do kolby Erlenmeyera z mieszadłem magnetycznym i umieścić na mieszadle z płytą grzejną przy 500 obr./min i monitorować temperaturę termometrem. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.</li>
			<li>Gdy temperatura wody osiągnie około 70 °C, z czasem dodawaj łącznie 25 g PVA w małych partiach, czekając, aż PVA się rozpuści, zanim dodasz więcej.</li>
			<li>Gdy całe PVA się rozpuszczą (zwykle 30-60 minut), pozwól roztworowi ostygnąć i przefiltruj sterylnie. Przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować roztwór do odlewania folii składający się z 10% w/w PVA i 2% w/w glicerolu.
		<ol>
			<li>Dodać 500 ml wody demineralizowanej do kolby Erlenmeyera z mieszadłem magnetycznym. Dodać 8 ml glicerolu o temperaturze pokojowej i wymieszać przez rozcieranie.</li>
			<li>Umieścić kolbę na mieszadle z płytą grzejną z prędkością 500 obr./min i monitorować temperaturę za pomocą termometru. Przykryj kolbę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.</li>
			<li>Gdy temperatura roztworu osiągnie około 70 °C, z czasem dodawać łącznie 50 g PVA w małych partiach, czekając, aż PVA się rozpuści przed dodaniem więcej.</li>
			<li>Gdy całe PVA zostanie rozpuszczone (zwykle 60 minut), pozwól roztworowi ostygnąć i sterylnie przefiltruj za pomocą systemu filtrów próżniowych w butelce o wielkości porów 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze pokojowej do wykorzystania w przyszłości.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj 50 ml 1% w/w roztworu PVA. Dodać 40 ml wody demineralizowanej i 10 ml 5% roztworu PVA (sporządzonego w 1.1.1) do zlewki o pojemności 100-150 ml.</li>
		<li>Przygotuj 100 ml 0,5% w/w roztworu PVA. Dodaj 90 ml wody DI i 10 ml 5% roztworu PVA do zlewki o pojemności 150-250 ml.</li>
		<li>Dodać mieszadło magnetyczne do 0,5% roztworu PVA i umieścić w okapie chemicznym na płycie mieszającej w temperaturze pokojowej 500 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza mikrocząstek
	<ol>
		<li>Odważyć 100 mg kwasu poli(mlekowo-koglikolowego) (PLGA) do fiolki scyntylacyjnej i rozpuścić w 5 ml dichlorometanu (DCM). Wir, aby rozpuścić PLGA.</li>
		<li>Umieścić homogenizator w 50 ml 1% roztworu PVA tak, aby homogenizator znajdował się jak najbliżej dna zlewki, nie dotykając jej. Włącz homogenizator i ustaw żądaną prędkość - 3 200 obr./min dla cząstek o średnicy 5 μm, 5 000 obr./min dla 3 μm, 15 000 obr./min dla 1 μm (zwiększenie prędkości homogenizacji zmniejsza rozmiar cząstek). Po osiągnięciu żądanej prędkości dodaj roztwór PLGA do zlewki i homogenizuj przez 1 minutę.</li>
		<li>Po homogenizacji wlać 1% roztwór mikrocząstek PVA, PLGA do 100 ml 0,5% roztworu PVA na płytce mieszającej i mieszać przez co najmniej 4 godziny w celu odparowania rozpuszczalnika w kapturze chemicznym.</li>
		<li>Umyj cząstki 3 razy w wodzie DI.
		<ol>
			<li>Wlać roztwór cząstek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przy 3000 x g przez 5 minut. Wylej supernatant i dodaj około 20 ml wody DI.</li>
			<li>Ponownie zawieszaj cząstki przez wirowanie. Po ponownym zawieszeniu napełnij probówki stożkowe do 50 ml wodą DI.</li>
			<li>Umyj ponownie w ten sam sposób jeszcze dwa razy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza nanocząstek
	<ol>
		<li>Odważyć 200 mg PLGA do fiolki scyntylacyjnej i rozpuścić w 5 ml DCM. Wir, aby rozpuścić PLGA.</li>
		<li>Umieścić zlewkę z 50 ml 1% roztworu PVA w pojemniku wypełnionym lodem. Umieść sondę sonitotora w zlewce jak najbliżej dna, nie dotykając jej. Rozpocznij sonikację i natychmiast dodaj roztwór PLGA do zlewki. Sonikować z mocą 12 W przez 2 minuty, aby wytworzyć nanocząstki o przybliżonej średnicy 200 nm.</li>
		<li>Po sonikacji wlej 1% roztwór nanocząstek PVA, PLGA do 100 ml 0,5% roztworu PVA na płytce mieszającej i mieszaj przez co najmniej 4 godziny w celu odparowania rozpuszczalnika w kapturze chemicznym.</li>
		<li>Wlać roztwór cząstek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 000 x g przez 5 minut w celu usunięcia mikrocząstek. Usunąć sklarowany osad i przelać do probówek wirówkowych o dużej prędkości.</li>
		<li>Umyj cząsteczki 3 razy wodą DI. Wirować przy 40 000 x g przez 15 minut. Wylać supernatant i ponownie zawiesić w wodzie DI przez wirowanie. Umyj ponownie w ten sam sposób jeszcze dwa razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytwarzanie cząstek polimerowych o przestrajalnym kształcie
<ol>
	<li>Po trzykrotnym umyciu cząstek PLGA należy je ponownie zawiesić w około 1 ml wody DI. Dodać roztwór do odlewania filmu do cząstek, aby uzyskać końcowe stężenie cząstek 2,5 mg/ml.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę cząstek w podwielokrotnościach o pojemności 10 ml na prostokątne szalki Petriego o wymiarach 75 x 50 mm w celu jednowymiarowego rozciągania lub w podwielokrotnościach o wymiarach 15 ml na kwadratowe szalki Petriego o wymiarach 100 x 100 mm w celu rozciągnięcia dwuwymiarowego. Usuń bąbelki za pomocą pipety lub odsuwając bąbelki na bok i pozostaw folie do wyschnięcia przez noc w kapturze chemicznym.</li>
	<li>Po wyschnięciu folii usuń folie z plastikowych naczyń pęsetą i odetnij krawędzie folii nożyczkami. Zachowaj krawędzie w stożkowej tubie o pojemności 50 ml, aby można je było wykorzystać jako kuliste cząstki.
	<ol>
		<li>Załaduj folię na automatyczne urządzenie do rozciągania cienkiej folii, montując folię na aluminiowych blokach. W celu rozciągnięcia 1D, zamontuj folię na aluminiowych blokach jednej osi noszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), umieszczając dwie krótkie krawędzie folii pomiędzy dwoma kawałkami gumy neoprenowej. Za pomocą klucza imbusowego przykręć metalowe uchwyty do gumy, aby utrzymać folię na miejscu. W przypadku rozciągania 2D zamontuj wszystkie cztery krawędzie na czterech aluminiowych blokach, aby rozciągnąć się na obu osiach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Zmierz i zapisz długość folii pomiędzy blokami aluminiowymi na jednej osi w przypadku rozciągania 1D lub w obu osiach w przypadku rozciągania 2D. Oblicz odległość wymaganą do rozciągnięcia folii w jednym lub dwóch kierunkach w oparciu o żądane zagięcie-rozciągnięcie.</li>
		<li>Umieść urządzenie do rozciągania z folią w piekarniku w temperaturze 90 °C i doprowadź folię do temperatury przez 10 minut. Umieść dużą zlewkę w piekarniku z niewielką ilością wody.</li>
		<li>Folia stretch.</li>
		<li>Po zakończeniu rozciągania wyjmij urządzenie do rozciągania z piekarnika i pozwól folii ostygnąć do temperatury pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>W przypadku rozciągania 1D wytnij folię z urządzenia do rozciągania na krawędziach. W przypadku rozciągania 2D wytnij i zapisz środkowy kwadrat folii, który jest równomiernie rozciągnięty w obu osiach. Umieść folie w stożkowych tubach po 2 folie w tubie i wyrzuć resztę folii.</li>
		<li>Dodaj około 25 ml wody DI do każdej stożkowej probówki i wiruj, aż filmy się rozpuszczą.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu folii przemyj cząsteczki 3 razy wodą DI.
		<ol>
			<li>W przypadku mikrocząstek napełnij stożkowe probówki do 50 ml i odwiruj przy 3000 x g przez 5 minut, wylej supernatant, dodaj około 20 ml wody DI i wiruj, aby ponownie zawiesić cząstki.</li>
			<li>W przypadku nanocząstek przenieś cząstki do probówek wirówek o dużej prędkości i wiruj przy 40 000 x g przez 15 minut, wylej supernatant, dodaj około 20 ml wody DI i wiruj w celu ponownego zawieszenia cząstek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po trzecim praniu ponownie zanurz cząsteczki w około 1 ml wody demineralizowanej. Zapisz masę probówki do mikrowirówki i dodaj cząstki do probówki. Zamrozić cząstki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 1 godzinę lub błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Po zamrożeniu liofilizuj cząsteczki przez noc.</li>
		<li>Po liofilizacji zważyć cząstki w probówce mikrowirówki i odjąć zarejestrowaną masę pustej probówki, aby określić masę liofilizowanych cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Koniugacja białek powierzchniowych w celu stworzenia sztucznych komórek prezentujących antygen
<ol>
	<li>Przygotować bufor kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES). Sporządzić 0,1 M roztwór MES w wodzie i dostosować pH do 6,0 przez miareczkowanie 1M wodorotlenkiem sodu (NaOH).</li>
	<li>Zawiesić liofilizowane mikro/nanocząstki PLGA/PBAE w stężeniu 20 μg/ml w buforze MES przez wirowanie. Napełnij probówkę z mikrowirówki z polipropylenu 900 μl buforu MES i dodaj do niej 100 μl roztworu cząstek.</li>
	<li>Przygotuj roztwór EDC/NHS. Rozpuścić 40 mg 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 48 mg N-hydroksysulfokscynimidu (NHS) w 1 ml buforu MES.</li>
	<li>Dodaj 100 μl roztworu EDC/NHS do cząstek i zwiruj, aby wymieszać.</li>
	<li>Inkubować probówkę na falowniku w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Wiruj mikrocząstki o wielkości 5 000 x g przez 5 minut lub nanocząstki o wielkości 17 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml PBS poprzez wirowanie (mikrocząstki) lub sonikację przy 2-3 W przez 5 sekund (nanocząstki).</li>
	<li>W przypadku mikrocząstek dodaj 8 μg pożądanego białka sygnałowego 1 i 10 μg anty-mysiego CD28 (klon 37.51) do cząstek. W przypadku nanocząstek dodaj 16 μg sygnału 1 i 20 μg anty-mysiego CD28. Dodaj PBS, aby zwiększyć objętość w probówce do 1,1 ml.</li>
	<li>Inkubować probówkę na falowniku w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia umyj cząstki. Wiruj mikrocząstki o wielkości 5 000 x g przez 5 minut lub nanocząstki o wielkości 17 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić cząstki w 1 ml sterylnego PBS poprzez wirowanie (mikrocząstki) lub sonikację przy 2-3 W przez 5 sekund (nanocząstki). Powtórz dwa razy.</li>
	<li>Zawiesić cząstki o pożądanym stężeniu w pożywce hodowlanej do natychmiastowego użycia. W przypadku długotrwałego przechowywania należy ponownie zawiesić cząstki w stężeniu 10 mg/ml w 100 mM roztworze sacharozy. Zamrażać, liofilizować i przechowywać cząstki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Charakterystyka i ocena aAPC
<ol>
	<li>Charakterystyka wielkości i kształtu aAPC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
	<ol>
		<li>Scharakteryzuj rozmiar i kształt mikrocząstek, obrazując cząstki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). W przypadku obrazowania SEM rozprowadź liofilizowane cząstki na taśmie węglowej przyklejonej do aluminiowej pinezki i napyl powłokę złoto-palladową.</li>
		<li>Analizuj rozmiar i proporcje cząstek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
		<li>Aby określić wielkość cząstek, ustaw skalę za pomocą podziałki i zmierz średnicę cząstek. Powtórz tę czynność dla około 100 cząstek, aby określić średnią średnicę cząstek i wygenerować histogram rozmiarów cząstek.</li>
		<li>Aby określić współczynnik proporcji, zmierz odległość w poprzek długiej i krótkiej osi cząstek i podziel długą oś przez krótką oś. Powtórz te czynności dla około 50 cząstek każdego kształtu, aby określić średni współczynnik proporcji cząstek dla każdego kształtu i wygenerować histogramy.</li>
		<li>Scharakteryzuj rozmiar i kształt nanocząstek, obrazując cząstki za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Analizuj rozmiar i proporcje nanocząstek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, jak opisano w 5.1.2. Alternatywnie można zmierzyć rozmiar sferycznych nanocząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) lub analizy śledzenia nanocząstek (NTA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wydajność koniugacji białek
	<ol>
		<li>Przygotować aAPC zgodnie z metodami 1-3, ale w kroku 3.7 użyć znakowanego fluorescencyjnie białka sygnału 1 i anty-mysiego CD28. Po koniugacji i umyciu ponownie zawiesić aAPC w 1 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml aAPC.</li>
		<li>Przygotuj wzorce białkowe w czarnej polistyrenowej 96-dołkowej mikropłytce. Dodać 5 μg znakowanego fluorescencyjnie białka sygnałowego 1 do PBS w pierwszym dołku płytki i wykonać 10 rozcieńczeń 1:2 w PBS w poprzek rzędu płytki. Pozostaw ostatnią studzienkę pustą. Powtórz ten krok, aby wygenerować kolejny zestaw wzorców z fluorescencyjnie znakowanym anty-CD28.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl roztworu aAPC do powtórzonych studzienek z mikropłytką z czarnego polistyrenu w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Odczytaj fluorescencję na czytniku płytek fluorescencyjnych na odpowiednich długościach fal. Użyj odczytów fluorescencji z wzorców białek, aby wygenerować krzywe wzorcowe dla każdego przeciwciała fluorescencyjnego. Korzystając z krzywej wzorcowej, oblicz stężenia sygnału 1 i anty-CD28 w każdym dołku próbki, a następnie oblicz ilość białka powierzchniowego i wydajność koniugacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, <silna klasa = "xfig"> Rysunek 5A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena aAPC do stymulacji in vitro limfocytów T CD8+
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę B' (pożywka RPMI uzupełniona L-glutaminą, 10% FBS, 1% nieistotny roztwór aminokwasów, 1% pirogronian sodu, 1% roztwór witaminy MEM, 92 μM β-merkaptoetanol, 10 ng/ml cyprofloksacyny i 30 U/ml IL-2.</li>
		<li>Poświęć mysz Black 6 poprzez ekspozycję na dwutlenek węgla.</li>
		<li>Zbierz śledzionę od myszy zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem16. Zbierz śledzionę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 10-15 ml PBS. Za pomocą tłuczka przetrzyj śledzionę przez sitko o pojemności 70 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Podczas zacierania umyj sitko 40 ml PBS.</li>
		<li>Wiruj splenocyty o masie 300 x g przez 5 minut. Odlej supernatant i ponownie zawieś splenocyty w 4 ml buforu Ack Lysing Buffer w celu lizy czerwonych krwinek. Pozostaw probówkę w spokoju przez 1 minutę, a następnie dodaj PBS, aby zwiększyć objętość w probówce do 20 ml.</li>
		<li>Wiruj komórki w masie 300 x g przez 5 minut. Odlać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Obracać komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w żądanej objętości bufora do separacji komórek. Wyizolować limfocyty T CD8 + z zawiesiny pojedynczej komórki za pomocą zestawu do izolacji limfocytów T CD8 + o ujemnej selekcji, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Po separacji magnetycznej wirować limfocyty T CD8 + przy 300 x g przez pięć minut i usunąć bufor separacji komórek. Ponownie zawieś komórki w 1 ml PBS i policz komórki. Oznacz ogniwa estrem karboksyfluoresceiny sukcynylu (CFSE) zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Inkubować 8,333 limfocytów T CD8 + i 0,0833 mg (lub pożądaną dawkę) aAPC w 150 μl B' pożywki w każdym dołku 96-dołkowej płytki poddanej kulturze tkankowej w kształcie litery U.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 dni. Po 3-4 dniach odświeżyć pożywkę, dodając 75 μl świeżej pożywki do każdej studzienki.</li>
		<li>Po 3 dniach inkubacji przeanalizuj komórki znakowane CFSE na cytometrze przepływowym, aby ocenić proliferację. Każdy pik na histogramie CFSE cytometrii przepływowej reprezentuje pokolenie komórek spowodowane rozcieńczeniem CFSE przy każdym kolejnym podziale komórki.</li>
		<li>Po 7 dniach użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek w każdym dołku. Przed zliczeniem wybarwić martwe komórki roztworem błękitu trypanowego. Wyklucz martwe komórki z końcowej liczby komórek. Znormalizuj końcowe stężenie komórek do początkowego stężenia, aby obliczyć krotność (<silna klasa="xfig">Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+efficient+cancer+immunotherapy%3A+Advances+in+developing+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells.</a> Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).</li>
<li>Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+tetramer-based+artificial+antigen-presenting+cells+for+stimulation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells.</a> Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).</li>
<li>Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+antigen-specific+T+cells+by+artificial+cell+constructs+having+immobilized+multimeric+peptide-class+I+complexes+and+recombinant+B7-Fc+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+field-induced+T+cell+receptor+clustering+by+nanoparticles+enhances+T+cell+activation+and+stimulates+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity.</a> ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).</li>
<li>Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+antigen-presenting+cell+with+paracrine+delivery+of+IL-2+impacts+the+magnitude+and+direction+of+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+release+of+IL-2+and+anti-CTLA-4+enhances+the+ability+of+artificial+polymer+antigen-presenting+cells+to+expand+antigen-specific+T+cells+and+inhibit+tumor+growth+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).</li>
<li>Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+contact+requirements+for+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).</li>
<li>Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+ex+vivo+T-cell+expansion+based+on+biodegradable+polymeric+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells.</a> Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).</li>
<li>Fifis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+immunogenicity%3A+therapeutic+and+protective+properties+of+nano-vaccines+against+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors.</a> The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoellipsoidal+artificial+antigen+presenting+cells+for+antigen+specific+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation.</a> Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).</li>
<li>Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape%3A+a+new+design+parameter+for+micro-+and+nanoscale+drug+delivery+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers.</a> Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).</li>
<li>Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+multidimensional+thin+film+stretching+device+for+the+generation+of+anisotropic+polymeric+micro-+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).</li>
<li>Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00657391">Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles.</a> Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).</li>
<li>Shum, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+fabrication+of+non-spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).</li>
<li>Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+preparation+of+nanoparticle-coated+chitosan+microspheres+in+a+co-axial+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+multifunctional+Janus+particles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).</li>
<li>Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+protein-based%2C+rod-shaped+particles+from+spherical+templates+using+layer-by-layer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly.</a> Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).</li>
<li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striped%2C+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li>
<li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2011/sc/c0sc00596g">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li>
<li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse%2C+shape-specific+nanobiomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten szczegółowo opisuje wszechstronną metodę precyzyjnego generowania anizotropowych cząstek polimerowych. Opisana tutaj technika rozciągania cienkich warstw jest skalowalna, wysoce powtarzalna i niedroga. Alternatywne techniki generowania cząstek anizotropowych mają wiele ograniczeń, w tym wysokie koszty, niską przepustowość i ograniczoną wielkość cząstek. Podejście polegające na rozciąganiu cienkich warstw jest również korzystne, ponieważ cząstki są modyfikowane tak, aby po syntezie były anizotropowe, a w rezu...

Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) okazały się obiecujące jako czynniki immunomodulujące, ponieważ mogą generować silną odpowiedź limfocytów T specyficzną dla antygenu. Istotne dla tych platform jest ich zdolność do skutecznego prezentowania kluczowych sygnałów do aktywacji limfocytów T. Acellular aAPC są atrakcyjną alternatywą dla aAPC opartego na komórkach, ponieważ są łatwiejsze i mniej kosztowne w produkcji, napotykają mniej wyzwań podczas zwiększania skali i translacji oraz zmniejszają ryzyko związane z terapiami komórkowymi. Acellular aAPC pozwala również na wysoki stopień kontroli nad parametrami prezentacji sygnału i właściwościami fizycznymi powierzchni, która będzie łączyć się z limfocytami T1.
aAPC musi podsumować co najmniej dwa sygnały niezbędne do aktywacji limfocytów T. Sygnał 1 zapewnia rozpoznawanie antygenu i występuje, gdy receptor limfocytów T (TCR) rozpoznaje i angażuje się z MHC klasy I lub II zawierającym pokrewny antygen, czego kulminacją jest sygnalizacja przez kompleks TCR. Aby ominąć wymóg swoistości antygenu, systemy aAPC często zawierają agonistyczne przeciwciało monoklonalne przeciwko receptorowi CD3, które niespecyficznie stymuluje kompleks TCR. Rekombinowane formy MHC, w szczególności multimery MHC, zostały również użyte na powierzchni aAPC w celu zapewnienia swoistości antygenowej2,3. Sygnał 2 to sygnał kostymulacyjny, który kieruje aktywnością limfocytów T. Aby zapewnić kostymulację niezbędną do aktywacji limfocytów T, receptor CD28 jest na ogół stymulowany za pomocą agonistycznego przeciwciała prezentowanego na powierzchni aAPC, chociaż inne receptory kostymulujące, takie jak 4-1BB, zostały skutecznie ukierunkowane4. Białka sygnału 1 i 2 są zwykle unieruchomione na powierzchni sztywnych cząstek w celu syntezy aAPC. Historycznie rzecz biorąc, aAPC były wytwarzane z różnych materiałów, w tym polistyrenu4,5 i żelaza dextran6. Nowsze systemy wykorzystują biodegradowalne polimery, takie jak poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PLGA) do generowania aAPC, który można łatwo sprzęgnąć z białkami sygnałowymi, nadaje się do bezpośredniego podawania in vivo i może ułatwiać przedłużone uwalnianie zamkniętych w kapsułkach cytokin lub rozpuszczalnych czynników w celu zwiększenia aktywacji limfocytów T7,8.
Oprócz obecności niezbędnych białek sygnałowych, zaangażowanie receptorów na wystarczająco dużej powierzchni podczas interakcji komórek aAPC/T jest niezbędne do aktywacji limfocytów T. W związku z tym parametry fizyczne aAPC, takie jak rozmiar i kształt, drastycznie zmieniają ich dostępną powierzchnię kontaktową i wpływają na ich zdolność do stymulacji limfocytów T. Wykazano, że aAPC o rozmiarach mikronów jest bardziej skuteczny w stymulowaniu limfocytów T niż ich odpowiedniki w nanoskali9,10. Jednak nano-aAPC może mieć lepszą biodystrybucję i lepszy drenaż do węzłów chłonnych, co może zwiększyć ich wydajność in vivo w porównaniu z micro-aAPC11. Kształt jest kolejną zmienną będącą przedmiotem zainteresowania w systemach aAPC opartych na cząstkach. Ostatnio wykazano, że anizotropowe aAPC są bardziej skuteczne niż cząstki izotropowe w stymulowaniu limfocytów T, głównie ze względu na zwiększoną interakcję z komórkami docelowymi w połączeniu ze zmniejszonym niespecyficznym wychwytem komórek. Komórki preferencyjnie wiążą się z długą osią elipsoidalnych cząstek, a większy promień krzywizny i bardziej płaska powierzchnia pozwalają na większy kontakt między aAPC a limfocytem T12. Długa oś elipsoidalnych cząstek również zniechęca do fagocytozy, co skutkuje wydłużeniem czasu krążenia w porównaniu z cząstkami sferycznymi po podaniu in vivo12,13. Ze względu na te zalety, cząstki elipsoidalne pośredniczą w większej ekspansji limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro i in vivo w porównaniu z cząstkami sferycznymi, efekt obserwowany zarówno w mikroskali, jak i w nanoskali12,13. Istnieją różne strategie wytwarzania cząstek anizotropowych, ale rozciąganie cienkowarstwowe jest prostą, powszechnie akceptowaną metodą używaną do generowania szeregu różnych kształtów cząstek14. Po syntezie cząstki są odlewane w folie i rozciągane w jednym lub dwóch wymiarach w temperaturze wyższej od temperatury zeszklenia materiału cząstkowego. Film jest następnie rozpuszczany w celu odzyskania cząstek. Pomimo rosnącego zainteresowania cząstkami anizotropowymi, obecne podejścia do wytwarzania aAPC na bazie cząstek są w większości ograniczone do układów izotropowych, a metody zmiany kształtu cząstek mogą być trudne do wdrożenia, niekompatybilne z niektórymi strategiami syntezy aAPC oraz nieprecyzyjne i powtarzalne15. Nasza technika rozciągania cienkowarstwowego może być wykonywana ręcznie lub w sposób zautomatyzowany w celu szybkiego wygenerowania cząstek anizotropowych syntetyzowanych z różnych biodegradowalnych polimerów, rozciągniętych do pożądanego współczynnika proporcji w jednym lub dwóch wymiarach15.
Opierając się na naszej poprzedniej pracy, opracowaliśmy podejście oparte na biodegradowalnych cząstkach w połączeniu ze skalowalną technologią rozciągania cienkowarstwowego, aby szybko wygenerować aAPC o regulowanym rozmiarze i kształcie w ustandaryzowany sposób do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo. Nasza strategia koniugacji białek może być wykorzystana do sprzężenia dowolnych białek będących przedmiotem zainteresowania z grupami karboksylowymi na powierzchni cząstek o pożądanej gęstości, co zapewnia temu systemowi aAPC wysoki stopień elastyczności. Opisano również metody charakteryzowania wielkości, morfologii i zawartości białka powierzchniowego aAPC oraz oceny ich funkcjonalności in vitro. Protokół ten można łatwo dostosować do namnażania komórek odpornościowych ex vivo lub in vivo do różnych zastosowań immunoterapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Poli(alkohol winylowy), MW 25000, 88% hydrolizowany</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02975-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Termometr cyfrowy</td><td>Fluke</td><td>N/A</td><td>Nazwa modelu: Zanurzeniowa sonda temperatury Fluke 52 II</td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>N/A</td><td>Nazwa modelu: Cyfrowa płyta grzejna Fluke 80PK 22</td></tr><tr><td>i Mieszadło</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H3760-HS</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło wielopunktowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50093538</td><td></td></tr><tr><td>Resomer RG 504 H, Poli(D,L-laktyd-ko-glikolid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719900</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Homogenizator Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IKA</td><td>&nbsp; </td><td></td>0003725001</tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics & Materiały, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Numer modelu: VC 505</td></tr><tr><td>Obudowa dźwiękochłonna Sonicator</td><td>Sonics & Materiały, Inc.</td><td>Nie dotyczy Numer</td><td>części: 630-0427</td></tr><tr><td>Sonda Sonicator</td><td>Sonics & Materiały, Inc.</td><td>Nie dotyczy Numer</td><td>części: 630-0220</td></tr><tr><td>Mikrokońcówka Sonicator</td><td>Sonics & Materiały, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Numer części: 630-0423</td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Numer modelu: J-20XP (wycofany z produkcji), alternatywny model: J-26XP</td></tr><tr><td>Wirnik wirówki szybkoobrotowej</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td>Numer modelu: JA-17</td></tr><tr><td>Wysokoobrotowe probówki wirówkowe z poliwęglanu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 mL, nakrętka</td></tr><tr><td>Prostokątny jednorazowy Petri talerz</td><td>VWR International</td><td>25384-322</td><td>75 x 50 x 10 mm</td></tr><tr><td>Kwadratowa jednorazowa szalka Petriego</td><td>VWR International</td><td>10799-140</td><td>100 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>LEAF&nbsp; Oczyszczony anty-mysz CD3 i epsilon; Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>InVivoMab anty-mysie CD28, klon 37.51</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N&prime;-etylokarbodimidu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa N-hydroksysulfosukcynimidu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-mysie CD3</td><td>Biolegend</td><td>100212</td><td></td></tr><tr><td>APC przeciwciało anty-mysie CD28</td><td>Biolegend</td><td>102109</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96 Well Solid Mikropłytka polistyrenowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3915</td><td>płaskim dnem, czarnym polistyrenem</td></tr><tr><td>Probówki białkowe LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (+ L-glutamina)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana</td></tr><tr><td>cyprofloksacyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2 (bez nośnika)</td><td>Biolegend</td><td>589102</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM Witamina Roztwór (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11120052</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+&nbsp; Zestaw do izolacji komórek T, mysz</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE</td><td>Kolumny ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multistand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Accuri C6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Czytnik mikropłytek z wieloma detekcjami</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Bufor do biegania</td><td>Miltenyi BIotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363548</td><td>Sterylne, 70 &mikro; m Siatka nylonowa</td></tr><tr><td>ACK Bufor Lysing</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (Black 6) Mysz</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Mężczyzna, co najmniej 7 tygodni</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych z dnem w kształcie litery U</td><td>VWR</td><td>353227</td><td>Sterylne, 96-dołkowe płytki polistyrenowe poddane hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Zasilacz 40 V DC</td><td>Probotix</td><td>LPSK-4010</td><td></td></tr><tr><td>PTFE Mouser z drutu powlekanego</td><td></td><td>602-5858-100-01</td><td>Dotyczy to szpuli o długości 100 stóp, ale równoważny drut będzie działał</td></tr><tr><td>Sterownik silnika krokowego</td><td>Probotix</td><td>MondoStep5.6</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw złączy IDC</td><td>Probotix</td><td>IDCM-10-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokontroler</td><td>Probotix</td><td>PBX-RF</td><td></td></tr><tr><td>4A Bezpieczniki</td><td>Radio Shack</td><td>2701026</td><td>Równoważne bezpieczniki również będą działać</td></tr><tr><td>DB25 męski na męski</td><td>Probotix</td><td>DB25-6</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>kablowe USB-A do USB-B</td><td>2094915</td><td>Równoważny również będzie działał</td></tr><tr><td>8-pinowe złącza Amphenol Męska i żeńska</td><td>mysz</td><td>654-97-3100A-20-7P i 654-97-3106A20-7S</td><td></td></tr><tr><td>Silnik krokowy</td><td>Probotix</td><td>HT23-420-8</td><td></td></tr><tr><td>Śruba pociągowa prawostronna</td><td>Roton</td><td>60722</td><td></td></tr><tr><td>Śruba pociągowa lewoskrętna</td><td>Roton</td><td>60723</td><td></td></tr><tr><td></td><td>McMaster Carr</td><td>92196A151</td><td></td></tr><tr><td>Guma neoprenowa</td><td>McMaster Carr</td><td>8698K51</td><td></td></tr><tr><td>Prawostronna nakrętka ołowiana z kołnierzem</td><td>Roton</td><td>91962</td><td></td></tr><tr><td>Lewostronna kołnierzowa nakrętka ołowiana</td><td>Roton</td><td>91963</td><td></td></tr><tr><td>Komputer sterujący Linux</td><td>Probotix</td><td>LCNC-PC</td><td>Każdy komputer o pasującej specyfikacji i systemie operacyjnym Linux będzie działał</td></tr><tr><td>System filtrów próżniowych butelkowych Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS431097</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów t cd8 +

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) są obiecującą platformą do modulacji immunologicznej ze względu na ich silną zdolność do stymulowania limfocytów T. Substraty bezkomórkowe mają kluczowe zalety w porównaniu z aAPC opartym na komórkach, w tym precyzyjną kontrolę parametrów prezentacji sygnału i właściwości fizycznych powierzchni aAPC w celu modulowania jej interakcji z limfocytami T. Wykazano, że aAPC zbudowany z cząstek anizotropowych, w szczególności cząstek elipsoidalnych, jest bardziej skuteczny niż ich kuliste odpowiedniki w stymulowaniu limfocytów T ze względu na zwiększone wiązanie i większą powierzchnię dostępną do kontaktu z limfocytami T, a także zmniejszony wychwyt niespecyficzny i ulepszone właściwości farmakokinetyczne. Pomimo zwiększonego zainteresowania cząstkami anizotropowymi, nawet powszechnie akceptowane metody generowania cząstek anizotropowych, takie jak rozciąganie cienkowarstwowe, mogą być trudne do wdrożenia i powtarzalnego stosowania.
W tym celu opisujemy protokół szybkiego, ustandaryzowanego wytwarzania biodegradowalnych anizotropowych cząsteczek opartych na cząstkach aAPC o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji sygnału do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo, wraz z metodami charakteryzowania ich wielkości, morfologii i zawartości białek powierzchniowych oraz oceny ich funkcjonalności. Takie podejście do wytwarzania anizotropowego aAPC jest skalowalne i powtarzalne, co czyni je idealnym do generowania aAPC dla "gotowych" immunoterapii.

Schemat zautomatyzowanego urządzenia do dwuwymiarowego (2D) rozciągania cienkich warstw przedstawiono na Rysunku 1. Schemat i opis urządzenia do jednowymiarowego (1D) rozciągania cienkich warstw podano w pracy Ho i wsp.17 Rozciągacz został wykonany z części aluminiowych przy użyciu standardowych technik frezowania i obróbki skrawaniem. Podobnie jak w przypadku rozciągacza 1D, rozciągacz 2D składa się z metalowych uchwytów i prowadnic. ...

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii aminowej. Na przykład, jaka jest rola właściwości fizycznych cząstek w interakcjach i aktywacji komórek odpornościowych biomateriału. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia niezależną kontrolę wielkości i kształtu cząstek biomimetycznych.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii raka, ponieważ jest to gotowa terapia cząsteczkowa, która może powodować odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem komórek in vivo. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w aminoterapię raka, może być również stosowana do innych systemów. Takich jak choroba zakaźna lub cukrzyca typu pierwszego.W przypadku syntezy mikrocząstek należy rozpocząć od odważenia 100 miligramów kwasu poli(mlekowo-ko-glikolowego) lub PLGA do fiolki scyntylacyjnej i rozpuszczenia PLGA w pięciu mililitrach dichlorometanu przez wirowanie. Umieść homogenizator w zlewce zawierającej 50 mililitrów 1% roztworu polialkoholu winylowego lub PVA, tak aby homogenizator znajdował się jak najbliżej dna zlewki, nie dotykając jej. Włącz homogenizator do odpowiedniej prędkości i dodaj roztwór PLGA do zlewki na jedną minutę homogenizacji.Pod koniec homogenizacji wlać roztwór mikrocząstek polialkoholu winylowego PLGA do zlewki zawierającej 100 mililitrów 5% roztworu PVA na płytce mieszającej w kapturze chemicznym i mieszać roztwór przez co najmniej cztery godziny. Gdy rozpuszczalnik odparuje, wlej roztwór cząstek do 50-mililitrowych stożkowych probówek i zbierz cząstki przez odwirowanie. Zastąp supernatant w każdej probówce 20 mililitrami zdejonizowanej wody i ponownie zawiesić cząstki przez wirowanie.Następnie zwiększ końcową objętość w każdej probówce do 50 mililitrów świeżą wodą dejonizowaną i umyj cząstki jeszcze dwa razy, jak pokazano. W przypadku syntezy nanocząstek rozpuść 200 miligramów PLGA w pięciu mililitrach dichlorometanu i umieść sondę soniczną w zlewce zawierającej 50 mililitrów 1% roztworu PVA na lodzie, nie dotykając dna zlewki. Rozpocznij sonikację przy 12 watach i natychmiast dodaj roztwór PLGA do zlewki na dwuminutową sonikację, aby wytworzyć nanocząstki o średnicy około 200 nanometrów.Po sonikacji wlać 1% roztwór nanocząstek PLGA z polialkoholem winylowym do zlewki zawierającej 100 mililitrów 5 roztworu PVA na płytce mieszającej na cztery godziny odparowania rozpuszczalnika w dygestorium chemicznym. Gdy cały rozpuszczalnik zostanie odparowany, wlej roztwór cząstek do 50-mililitrowych stożkowych probówek w celu odwirowania w celu usunięcia wszelkich mikrocząstek i usunięcia supernatantów. Następnie przenieś nanocząstki do probówek wirówek o dużej prędkości na trzy płukania w wodzie dejonizowanej, jak pokazano.W przypadku wytwarzania cząstek polimerowych, po ostatnim praniu, ponownie zawiesić cząstki w około jednym mililitrze świeżej wody zdejonizowanej i dodać do cząstek roztwór do odlewania folii do końcowego stężenia 2,5 miligrama na mililitr cząstek. Przenieś zawiesinę cząstek w 10-mililitrowych podwielokrotnościach na prostokątne szalki Petriego o wymiarach 75 na 50 milimetrów w celu jednowymiarowego rozciągnięcia. Lub w 15-mililitrowych porcjach na szalkach Petriego o wymiarach 100 na 100 milimetrów kwadratowych do dwuwymiarowego rozciągania.Po wysuszeniu przez noc w kapturze chemicznym za pomocą pęsety usuń folie i przytnij krawędzie nożyczkami. W przypadku rozciągania 1D umieść dwie krótkie krawędzie jednej folii między dwoma kawałkami gumy neoprenowej w celu zamontowania na aluminiowych blokach jednej osi automatycznego urządzenia do rozciągania cienkich warstw. Następnie za pomocą klucza imbusowego przykręć metalowe uchwyty do gumy, aby utrzymać folię na miejscu.W przypadku rozciągania 2D zamontuj wszystkie cztery krawędzie na czterech aluminiowych blokach, aby rozciągnąć folię w obu osiach, zmierz i zapisz długość folii między blokami aluminiowymi na jednej osi dla jednego rozciągania D lub na obu osiach dla rozciągania 2D i oblicz odległość wymaganą do rozciągnięcia folii w jednym lub dwóch kierunkach w oparciu o żądane rozciąganie zagięcia. Następnie umieść urządzenie do rozciągania folii w piekarniku w temperaturze 90 stopni Celsjusza obok większej zlewki z niewielką ilością wody, aby doprowadzić folię do temperatury w ciągu 10 minut. Po zakończeniu rozciągania pozwól folii ostygnąć do temperatury pokojowej przez 20 minut.W przypadku rozciągania 1D wytnij folię z urządzenia do rozciągania na krawędziach. W przypadku rozciągania 2D wytnij i zapisz środkowy kwadrat folii, który jest równomiernie rozciągnięty w obu osiach. Umieść folie w 50-mililitrowych stożkowych probówkach z nie więcej niż dwiema foliami na probówkę i dodaj około 25 mililitrów dejonizowanej wody do każdej probówki w celu wirowania.Gdy folie się rozpuszczą, umyj cząstki trzykrotnie w wodzie dejonizowanej, jak pokazano. Ponowne zawieszenie cząstek w około jednym mililitrze świeżej wody dejonizowanej na probówkę po ostatnim praniu. Następnie zamroź cząstki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę lub liofilizację przez noc.Następnego ranka ponownie zawiesić liofilizowane mikro lub nanocząstki w ilości 20 miligramów na mililitr w świeżo przygotowanym buforze MES z wirowaniem. Dodać 100 mikrolitrów roztworu cząstek do polipropylenowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 900 mikrolitrów buforu MES i dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu EDC NHS. Wymieszaj cząstki przez wirowanie i inkubuj cząstki na falowniku w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Pod koniec inkubacji zebrać cząstki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki mikrocząstek w jednym mililitrze PBS poprzez wirowanie lub ponowne zawieszenie nanocząstek w jednym mililitrze PBS przez pięć sekund sonikacji przy dwóch do trzech watach. Następnie dodaj osiem mikrogramów odpowiedniego białka sygnałowego i 10 mikrogramów przeciwciała anty mysiego CD28 do mikrocząstek lub 16 mikrogramów jednego białka sygnałowego i 20 mikrogramów anty mysiego CD28 do nanocząstek. Doprowadź końcową objętość w każdej probówce do 1,1 mililitra za pomocą PBS i inkubuj cząstki przez noc na falowniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj cząstki trzy razy w wodzie dejonizowanej, jak pokazano. Te nanocząstki i mikrocząstki PLGA zsyntetyzowano przy użyciu technik pojedynczej emulsji, jak pokazano i zobrazowano za pomocą transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Po homogenizacji mikrocząstki wykazywały średnią średnicę około trzech mikrometrów.Kuliste mikrocząstki miały współczynnik proporcji około jeden, podczas gdy rozciągnięte 1D cząstki elipsoidalne miały większy współczynnik kształtu około trzech i pół, a rozciągnięte spłaszczone cząstki elipsoidalne 2D miały współczynnik proporcji około 1,2, w przybliżeniu utrzymując współczynnik kształtu jeden. Wyniki wydajności koniugacji ujawniają podobne ilości białka na powierzchni sferycznych i elipsoidalnych mikrokomórek prezentujących antygen (AAPC i nano-AAPC), co pokazuje, że sprzężenie białek podczas syntezy AAPC zachodzi w sposób zależny od stężenia. Stwierdzono, że prolate elipsoidalne AAPC indukują wyższe poziomy proliferacji limfocytów T w dawkach poniżej nasycenia niż sferyczne AAPC z najlepszą separacją osiągniętą przy dawce 01 miligrama.Po siedmiu dniach ręczne liczenie limfocytów T wykazało, że prolatowane elipsoidalne AAPC skuteczniej stymulują limfocyty T w porównaniu z ich sferycznymi odpowiednikami w skali mikro i nano w sposób zależny od dawki. Po tej procedurze AAPC może być podawany in vivo w celu oceny ich skuteczności terapeutycznej i farmakokinetyki. Po opracowaniu technika ta pomogła utorować drogę naukowcom zajmującym się immunoinżynierią do zbadania wpływu anizotropii na skuteczność AAPC.

fabrication-anisotropic-polymeric-artificial-antigen-presenting-cells

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje metodę dedukowania fotoaktywowanego kompleksu zgodności tkankowej peptydowego za pomocą promieniowania UV. Proces degeneracji odsłania natywną sekwencję peptydową, umożliwiając precyzyjną aktywację limfocytów T.

Ocena kontrolowanej aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu MHC

Przedstawiono wytyczne dotyczące generowania zabójczych komórek prezentujących sztuczny antygen, KaAPC, skutecznego narzędzia do in vitro wyczerpywania ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu oraz alternatywnego rozwiązania dla immunoterapii komórkowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych za pośrednictwem limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu bez narażania pozostałego układu odpornościowego.

Zabójcze sztuczne komórki prezentujące antygen (KaAPC) do skutecznego zubożania in vitro ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Poznaj metodę wytwarzania anizotropowych sztucznych komórek prezentujących antygen z polimeru PLGA do aktywacji limfocytów T CD8+. Technika umożliwia niezależną kontrolę rozmiaru i kształtu cząstek dla zastosowań w immunoterapii nowotworów.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Przeglądaj więcej filmów