Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii aminowej. Na przykład, jaka jest rola właściwości fizycznych cząstek w interakcjach i aktywacji komórek odpornościowych biomateriału. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia niezależną kontrolę wielkości i kształtu cząstek biomimetycznych.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii raka, ponieważ jest to gotowa terapia cząsteczkowa, która może powodować odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem komórek in vivo. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w aminoterapię raka, może być również stosowana do innych systemów. Takich jak choroba zakaźna lub cukrzyca typu pierwszego.

W przypadku syntezy mikrocząstek należy rozpocząć od odważenia 100 miligramów kwasu poli(mlekowo-ko-glikolowego) lub PLGA do fiolki scyntylacyjnej i rozpuszczenia PLGA w pięciu mililitrach dichlorometanu przez wirowanie. Umieść homogenizator w zlewce zawierającej 50 mililitrów 1% roztworu polialkoholu winylowego lub PVA, tak aby homogenizator znajdował się jak najbliżej dna zlewki, nie dotykając jej. Włącz homogenizator do odpowiedniej prędkości i dodaj roztwór PLGA do zlewki na jedną minutę homogenizacji.

Pod koniec homogenizacji wlać roztwór mikrocząstek polialkoholu winylowego PLGA do zlewki zawierającej 100 mililitrów 5% roztworu PVA na płytce mieszającej w kapturze chemicznym i mieszać roztwór przez co najmniej cztery godziny. Gdy rozpuszczalnik odparuje, wlej roztwór cząstek do 50-mililitrowych stożkowych probówek i zbierz cząstki przez odwirowanie. Zastąp supernatant w każdej probówce 20 mililitrami zdejonizowanej wody i ponownie zawiesić cząstki przez wirowanie.

Następnie zwiększ końcową objętość w każdej probówce do 50 mililitrów świeżą wodą dejonizowaną i umyj cząstki jeszcze dwa razy, jak pokazano. W przypadku syntezy nanocząstek rozpuść 200 miligramów PLGA w pięciu mililitrach dichlorometanu i umieść sondę soniczną w zlewce zawierającej 50 mililitrów 1% roztworu PVA na lodzie, nie dotykając dna zlewki. Rozpocznij sonikację przy 12 watach i natychmiast dodaj roztwór PLGA do zlewki na dwuminutową sonikację, aby wytworzyć nanocząstki o średnicy około 200 nanometrów.

Po sonikacji wlać 1% roztwór nanocząstek PLGA z polialkoholem winylowym do zlewki zawierającej 100 mililitrów 5 roztworu PVA na płytce mieszającej na cztery godziny odparowania rozpuszczalnika w dygestorium chemicznym. Gdy cały rozpuszczalnik zostanie odparowany, wlej roztwór cząstek do 50-mililitrowych stożkowych probówek w celu odwirowania w celu usunięcia wszelkich mikrocząstek i usunięcia supernatantów. Następnie przenieś nanocząstki do probówek wirówek o dużej prędkości na trzy płukania w wodzie dejonizowanej, jak pokazano.

W przypadku wytwarzania cząstek polimerowych, po ostatnim praniu, ponownie zawiesić cząstki w około jednym mililitrze świeżej wody zdejonizowanej i dodać do cząstek roztwór do odlewania folii do końcowego stężenia 2,5 miligrama na mililitr cząstek. Przenieś zawiesinę cząstek w 10-mililitrowych podwielokrotnościach na prostokątne szalki Petriego o wymiarach 75 na 50 milimetrów w celu jednowymiarowego rozciągnięcia. Lub w 15-mililitrowych porcjach na szalkach Petriego o wymiarach 100 na 100 milimetrów kwadratowych do dwuwymiarowego rozciągania.

Po wysuszeniu przez noc w kapturze chemicznym za pomocą pęsety usuń folie i przytnij krawędzie nożyczkami. W przypadku rozciągania 1D umieść dwie krótkie krawędzie jednej folii między dwoma kawałkami gumy neoprenowej w celu zamontowania na aluminiowych blokach jednej osi automatycznego urządzenia do rozciągania cienkich warstw. Następnie za pomocą klucza imbusowego przykręć metalowe uchwyty do gumy, aby utrzymać folię na miejscu.

W przypadku rozciągania 2D zamontuj wszystkie cztery krawędzie na czterech aluminiowych blokach, aby rozciągnąć folię w obu osiach, zmierz i zapisz długość folii między blokami aluminiowymi na jednej osi dla jednego rozciągania D lub na obu osiach dla rozciągania 2D i oblicz odległość wymaganą do rozciągnięcia folii w jednym lub dwóch kierunkach w oparciu o żądane rozciąganie zagięcia. Następnie umieść urządzenie do rozciągania folii w piekarniku w temperaturze 90 stopni Celsjusza obok większej zlewki z niewielką ilością wody, aby doprowadzić folię do temperatury w ciągu 10 minut. Po zakończeniu rozciągania pozwól folii ostygnąć do temperatury pokojowej przez 20 minut.

W przypadku rozciągania 1D wytnij folię z urządzenia do rozciągania na krawędziach. W przypadku rozciągania 2D wytnij i zapisz środkowy kwadrat folii, który jest równomiernie rozciągnięty w obu osiach. Umieść folie w 50-mililitrowych stożkowych probówkach z nie więcej niż dwiema foliami na probówkę i dodaj około 25 mililitrów dejonizowanej wody do każdej probówki w celu wirowania.

Gdy folie się rozpuszczą, umyj cząstki trzykrotnie w wodzie dejonizowanej, jak pokazano. Ponowne zawieszenie cząstek w około jednym mililitrze świeżej wody dejonizowanej na probówkę po ostatnim praniu. Następnie zamroź cząstki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę lub liofilizację przez noc.

Następnego ranka ponownie zawiesić liofilizowane mikro lub nanocząstki w ilości 20 miligramów na mililitr w świeżo przygotowanym buforze MES z wirowaniem. Dodać 100 mikrolitrów roztworu cząstek do polipropylenowej mikroprobówki wirówkowej zawierającej 900 mikrolitrów buforu MES i dodać 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu EDC NHS. Wymieszaj cząstki przez wirowanie i inkubuj cząstki na falowniku w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji zebrać cząstki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki mikrocząstek w jednym mililitrze PBS poprzez wirowanie lub ponowne zawieszenie nanocząstek w jednym mililitrze PBS przez pięć sekund sonikacji przy dwóch do trzech watach. Następnie dodaj osiem mikrogramów odpowiedniego białka sygnałowego i 10 mikrogramów przeciwciała anty mysiego CD28 do mikrocząstek lub 16 mikrogramów jednego białka sygnałowego i 20 mikrogramów anty mysiego CD28 do nanocząstek. Doprowadź końcową objętość w każdej probówce do 1,1 mililitra za pomocą PBS i inkubuj cząstki przez noc na falowniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia umyj cząstki trzy razy w wodzie dejonizowanej, jak pokazano. Te nanocząstki i mikrocząstki PLGA zsyntetyzowano przy użyciu technik pojedynczej emulsji, jak pokazano i zobrazowano za pomocą transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej. Po homogenizacji mikrocząstki wykazywały średnią średnicę około trzech mikrometrów.

Kuliste mikrocząstki miały współczynnik proporcji około jeden, podczas gdy rozciągnięte 1D cząstki elipsoidalne miały większy współczynnik kształtu około trzech i pół, a rozciągnięte spłaszczone cząstki elipsoidalne 2D miały współczynnik proporcji około 1,2, w przybliżeniu utrzymując współczynnik kształtu jeden. Wyniki wydajności koniugacji ujawniają podobne ilości białka na powierzchni sferycznych i elipsoidalnych mikrokomórek prezentujących antygen (AAPC i nano-AAPC), co pokazuje, że sprzężenie białek podczas syntezy AAPC zachodzi w sposób zależny od stężenia. Stwierdzono, że prolate elipsoidalne AAPC indukują wyższe poziomy proliferacji limfocytów T w dawkach poniżej nasycenia niż sferyczne AAPC z najlepszą separacją osiągniętą przy dawce 01 miligrama.

Po siedmiu dniach ręczne liczenie limfocytów T wykazało, że prolatowane elipsoidalne AAPC skuteczniej stymulują limfocyty T w porównaniu z ich sferycznymi odpowiednikami w skali mikro i nano w sposób zależny od dawki. Po tej procedurze AAPC może być podawany in vivo w celu oceny ich skuteczności terapeutycznej i farmakokinetyki. Po opracowaniu technika ta pomogła utorować drogę naukowcom zajmującym się immunoinżynierią do zbadania wpływu anizotropii na skuteczność AAPC.