Name: Hodowle wątroby na chipie pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę hodowli "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera do badania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B. Technika umożliwia długoterminowe utrzymanie tkanki wątrobowej w fizjologicznym mikrośrodowisku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu Starter od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (637304), Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z) oraz przez CN Bio Innovations.

<ol><li>Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Culture+Models+for+the+Investigation+of+Hepatitis+B+and+D+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection.</a> Viruses. 8 (9), (2016).</li>
<li>Elaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+underlying+the+dedifferentiation+process+of+isolated+hepatocytes+and+their+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.</a> Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).</li>
<li>Konig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+bile+acid+transporter+and+hepatitis+B+virus+receptor+Na%2B%2Ftaurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes.</a> Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+preclinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Allweiss, L., Dandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+cccDNA+in+HBV+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Role of cccDNA in HBV Maintenance.</a> Viruses. 9 (6), (2017).</li>
<li>Guo, J. T., Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+hepatitis+B+virus+cccDNA%3A+Implications+for+the+development+of+cccDNA-targeting+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics.</a> Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).</li>
<li>Lucifora, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+antiviral+properties+of+TLR+ligands+against+HBV+replication+in+immune-competent+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5390(2018).</li>
<li>Hosel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+Activates+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription+3+Supporting+Hepatocyte+Survival+and+Virus+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).</li>
<li>Mazza, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+human+liver+scaffolds+for+functional+tissue+engineering+by+high+shear+stress+oscillation-decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 5534(2017).</li>
<li>Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+promote+survival%2C+proliferation%2C+and+maintenance+of+differentiation+of+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).</li>
<li>Hwa, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells+survive+without+exogenous+VEGF+in+3D+perfused+co-cultures+with+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes.</a> The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).</li>
<li>Khetani, S. R., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+culture+of+human+liver+cells+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microscale culture of human liver cells for drug development.</a> Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).</li>
<li>March, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+coculture+of+primary+human+hepatocytes+and+supportive+cells+for+the+study+of+hepatotropic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Tong, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constrained+spheroids+for+prolonged+hepatocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture.</a> Biomaterials. 80, 106-120 (2016).</li>
<li>Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176555/">Engineering liver.</a> Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).</li>
<li>Domansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+multiwell+plate+for+3D+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering.</a> Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyzwania związane z utrzymaniem długoterminowych kultur PHH doprowadziły do opracowania kilku modeli hodowli o zwiększonej funkcjonalności i trwałości, z których każdy ma różne zalety i wady. Obecnie powszechnie uznaje się, że statyczne hodowle 2D PHH naśladują pewne aspekty biologii hepatocytów przez bardzo ograniczony czas. Tak więc mikrowzorcowe kokultury12,13, kultury sferoidalne14,15 i trójwymiarowe hodowle wątroby na chipie 16,17 szybko zastępują te bardziej podstawowe systemy. Zwłaszcza podczas badania chorób zakaźnych, które współewoluowały ze swoim gospodarzem w celu wykorzystania określonych mikrośrodowisk, wymóg zapewnienia środowiska fizjologicznego jest podszyty często trudnym charakterem hodowli chorób zakaźnych tropikalnych u ludzi, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C, HBV i malarii.
Najważniejszym krokiem w przeprowadzaniu hodowli 3D wątroby na chipie jest jakość początkowo pozyskanych pierwotnych typów komórek. Komórki te powinny być badane pod kątem ich zdolności do przylegania i należy używać wyłącznie partii PHH na płytkach, aby zapewnić pomyślne tworzenie tkanek i generowanie hodowli. Mimo że można stosować świeżo wyizolowane PHH, ich kriokonserwacja jest zwykle skomplikowana i wymaga specjalnych zamrażarek o kontrolowanej szybkości.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych statycznych hodowli 2D, podłoże genetyczne gospodarza jest znikome pod względem podatności na zakażenie HBV, a wszyscy dotychczas przebadani dawcy hepatocytów są w stanie stwierdzić zakażenie HBV4.
Mimo, że wirus HBV pochodzący od pacjenta powoduje infekcje kultur 3D, konieczne jest stosowanie HBV wytrąconego przez PEG i oczyszczonego sacharozą za pomocą poduszki za każdym razem, gdy używa się indukowalnych linii komórkowych wytwarzających HBV do wytwarzania inokulacji wirusa. Supernatanty do hodowli komórkowych stosowane bezpośrednio do hodowli 3D wątroby na chipie, czy to z powodu obecności czynników hamujących, czy też z powodu niezgodności obecnych czynników wzrostu z hepatocytami, nie powodują łatwo infekcji. Dodatkowo, przy wyborze inokulacji wirusowej pochodzącej od pacjenta, należy stosować tylko surowicę, ponieważ osocze nieuchronnie koaguluje i zatyka krążenie mikroprzepływowe platformy hodowlanej.
Niezależnie od zastosowanego inokulum wirusowego, zapewnienie żywotności i różnicowania komórek, a także całkowite usunięcie początkowego inokulum HBV, jest kluczem do udanych długoterminowych badań nad infekcjami. Najwygodniejszym sposobem na to jest pobieranie próbek kultur po usunięciu inokulum wirusa, a także pomiar poziomu albuminy w surowicy ludzkiej przez cały okres hodowli. Warto zauważyć, że podobnie jak w przypadku wszystkich innych opisanych platform, zakażenie HBV, raz ustalone, nie rozprzestrzenia się łatwo na niezakażone komórki. Mechanizm leżący u podstaw tego zjawiska pozostaje nieuchwytny, ponieważ zakażenie HBV in vivo łatwo infekuje większość hepatocytów w wątrobie.
W odniesieniu do kokultur komórek PHH i Kupffera zaleca się wykonanie testów partii komórek Kupffera w celu oceny wydzielania IL6 i TNFα w odpowiedzi na stymulację LPS, ponieważ nie wszyscy dostępni na rynku dawcy komórek Kupffera mają jednakową reaktywność.
Co ważne, w przypadku wszystkich terapii farmakologicznych lub początkowego zakażenia kultur wirusem HBV, przy obliczaniu stężeń leku lub inokulum należy wziąć pod uwagę całkowitą objętość studzienki (1,4 ml), a także kanału mikroprzepływowego (0,2 ml). W celu zapewnienia dokładnego dozowania wykonuje się jeden etap przemywania pożywką zawierającą HBV lub leki w celu zalania kanału mikroprzepływowego.
Zastosowana platforma wykorzystuje 600 000 PHH na studzienkę, co zapewnia wielowarstwowe hepatocyty w rusztowaniach. Mimo że liczba komórek może być różna, wybrane stężenie komórek zapewnia optymalne rezultaty. Format płytowy mieści łącznie 12 rusztowań, które można rozbudować do 36 rusztowań. Jednak ze względu na wymagania mikroprzepływowe, skalowanie do większej liczby odwiertów nie jest do tej pory możliwe.
Dzięki tym metodom hodowle mogą być utrzymywane z optymalną wydajnością komórek przez co najmniej 40 dni, co jak dotąd daje bezprecedensowe możliwości oceny nowych kandydatów na leki, a także badania złożonych interakcji między różnymi populacjami komórek wątroby podczas zakażenia HBV.

Badanie HBV zostało skomplikowane ze względu na słabą podatność systemów hodowlanych, wymagającą od kilkuset do tysięcy kopii genomu HBV na komórkę do zainicjowania infekcji1. Co więcej, pierwotne ludzkie hepatocyty są na ogół wyjątkowo delikatne i szybko się deróżnicują podczas konwencjonalnych hodowli2. Wynika to głównie z faktu, że płaskie i twarde powierzchnie z tworzywa sztucznego nie naśladują naturalnego środowiska zewnątrzkomórkowego znajdującego się w wątrobie oraz ogólnego braku natlenienia kultur przy braku krążenia mikroprzepływowego. Konwencjonalne statyczne hodowle hepatocytów na płytkach pokrytych kolagenem szybko się różnicują i tracą podatność na zakażenie HBV3. Tutaj opisujemy konfigurację i infekcję PHH hodowanego w 3D kulturach wątroby na chipie, które są znacznie lepsze od konwencjonalnych statycznych kultur PHH 2D na płytkach pokrytych kolagenem ze względu na ich rozszerzone kompetencje metaboliczne i funkcjonalne, ułatwiając długoterminowe hodowle trwające co najmniej 40 dni4. W tym systemie PHH są wysiewane na rusztowaniach pokrytych kolagenem, które są stale perfundowane pożywką wzrostową w celu dostarczania tlenu i składników odżywczych do komórek. Mimo że alternatywne systemy hodowli PHH oparte na złożonych kokulturach mysich fibroblastów lub wzroście 3D sferoidów zostały zatwierdzone i są podatne na zakażenie HBV przy użyciu wielokrotności infekcji 500 równoważników genomu (GE) HBV na komórkę, hodowle 3D wątroby na chipie pozostają jedynym systemem modelowym in vitro podatnym na 0,05 GE HBV na komórkę4. Jest to dodatkowo poparte koniecznością stosowania wysokich stężeń dimetylosulfotlenku (DMSO) i glikolu polietylenowego (PEG) w celu wykrycia zakażenia HBV w tych hodowlach, co jest zbędne w przypadku infekcji 3D systemów hodowli wątroby na chipie4. Jedną z głównych cech charakterystycznych zakażenia HBV jest pula cccDNA, która działa jako szablon transkrypcyjny dla wszystkich wirionów wytwarzanych de novo5,6. Mimo że cccDNA można wykryć w konwencjonalnych hodowlach hepatocytów7,8, nie jest jasne, czy regulacja cccDNA i wszelkie podejścia terapeutyczne mające na celu jego eliminację znajdują odzwierciedlenie w częściowo lub całkowicie zdedyferencjowanych hepatocytach. Wykazaliśmy, że cccDNA jest funkcjonalnie formowane w hodowlach 3D wątroby na chipie, reaguje na bodźce fizjologiczne i może być celowane poprzez zakłócanie dostępu maszynerii transkrypcyjnej do genomu cccDNA 4.
Reakcje gospodarza na zakażenie HBV w 3D wątroby na chipie naśladują te obserwowane u pacjentów zakażonych HBV, umożliwiając identyfikację biomarkerów infekcji, jak również sukces terapeutyczny. Jedną z unikalnych cech hodowli wątroby na chipie jest możliwość oceny długoterminowych odpowiedzi gospodarza między PHH a innymi komórkami niemiąższowymi w wątrobie, w tym komórkami Kupffera4, komórkami gwiaździstymi9 i sinusoidalnymi komórkami śródbłonka wątroby10,11. Daje to wyjątkową możliwość oceny interakcji komórka/komórka w złożonym mikrośrodowisku 3D.
Dodatkowo, przedłużony okres hodowli tej platformy ułatwia ocenę sekwencyjnych terapii lekowych i ich wpływu na trwałość HBV, co nie jest możliwe przy użyciu konwencjonalnych systemów hodowli hepatocytów.
Ten protokół opisuje, jak generowane są hodowle 3D wątroby na chipie, zarówno dla monokultur PHH, jak i dla kokultur PHH z komórkami Kupffera. Ponadto opisujemy wytwarzanie oczyszczonego wirusa HBV w badaniach nad niską liczbą zakażeń, a także późniejszą analizę odpowiedzi gospodarza i wirusa.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do rozmrażania hepatocytów</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe suplementy do rozmrażania i powlekania hepatocytów</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe suplementy podtrzymujące hepatocyty</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, pochodząca z USA, inaktywowana termicznie, sterylnie filtrowana, odpowiednia do hodowli komórkowych</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen ze skóry cielęcia</td><td>Merck</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu bezwodny</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy, 99,999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (ludzka)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Fisher&nbsp; Albumina surowicy bydlęcej, frakcja V, poddana szokowi cieplnemu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, bez UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd z Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Zestawy/Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna membrana</td><td>CN Bio innowacje</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Płytka do hodowli komórek perfuzyjnych</td><td>CN Bio innowacje</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa płytki hodowlanej LiverChip</td><td>CN Bio innowacje</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna okrągła bibuła filtracyjna</td><td>Innowacje CN Bio</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Rusztowanie do mocowania komórek</td><td>CN Bioinnowacje</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień ustalający</td><td>CN Bio innowacje</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny tłok</td><td>Innowacje CN Bio</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw krwi i tkanek Dneasy</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Test Human Magnetic Luminex</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA Roztwór substratu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Mini zestaw akcesoriów do wirusowego RNA</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>zawierający nośnik RNA</td></tr><tr><td>5-warstwowa kolba do hodowli komórkowych Millicell HY, T-1000, sterylna</td><td>Millipore (Merck)</td><td></td><td></td>PFHYS1008</tr><tr><td>384-dołkowa optyczna płytka reakcyjna MicroAmp z technologiami Barcode</td><td>Life</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Technologie MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste, niesterylne 96-dołkowe płytki immunologiczne z płaskim dnem</td> Taśma uszczelniająca <td>ThermoFisher Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>do płytek 96-dołkowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Sterylne jednorazowe filtry do butelek o szybkim przepływie z membraną PES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Szkiełka mikroskopowe ze szlifowanymi krawędziami, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tube, cienkościenne, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Primary cells / Linie komórkowe</ silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ludzkie hepatocyty płytkowe, kwalifikowane przez transporter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>Kriokonserwowane ludzkie komórki Kupffera</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19 linia komórkowa</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny> </td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</td></tr><tr><td>Startery/Sondy/Wzorce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> DNA <tr><td>reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'Sonda</td></tr> <tr><td>DNA HBV</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA podkład do przodu</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr>starter <td>odwrotny</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>podkład do przodu</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>podkład odwrotny</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Profesor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antygen rdzeniowy wirusa zapalenia wątroby typu B frakcja IgG (poliklonalny)</td><td>DAKO</td><td>wycofany</td><td>Partia 10102505</td></tr><tr><td>Przeciwciało albuminy ludzkiej, A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-129A Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>z adsorbowaną krzyżowo ludzką albuminą, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową wtórną, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Naukowy</td><td>#&nbsp; A-11072</td><td>Lot 1431810</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Pompa próżniowa</td><td>CN Bio innowacje</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip Pneumatyczne połączenie</td><td>CN Bio innowacje</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>Platforma LiverChip Innowacje</td><td>CN Bio</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>Stacja dokująca do mycia płyt LiverChip</td><td>Innowacje</td><td></td><td></td>CN Bio</tr><tr><td>Autoklawowalne kleszcze metalowe</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Przemysł naukowy</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 Medyczne ssanie Wysoka próżnia i wysokim</td><td>przepływie MGE na całym świecie</td><td>&nbsp; Inkubator SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800 SERIES</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany precyzyjny moment obrotowy</td><td></td><td></td><td>Innowacje CN Bio</td></tr><tr><td>Ręczny moment</td><td>obrotowy Innowacje CN Bio Sprężarka</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>LiverChip Innowacje</td><td></td><td></td>CN Bio</tr><tr><td>Luminex LX-200 Instrument z xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczny blok separatora magnetycznego Millipore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek FluoStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Precyzyjne wkrętarki elektryczne</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER Zasilacz</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Sprzęt pneumatyczny</td><td>wycofany z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 System PCR w czasie rzeczywistym z 384-dołkowym blokiem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu b

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Pomimo wyjątkowej zakaźności wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) in vivo, gdzie tylko trzy genomy wirusa mogą prowadzić do przewlekłości eksperymentalnie zakażonych szympansów, większość modeli in vitro wymaga od kilkuset do tysięcy genomów wirusowych na komórkę, aby zainicjować przejściową infekcję. Dodatkowo, statyczne hodowle 2D pierwotnych ludzkich hepatocytów (PHH) pozwalają na krótkoterminowe badania ze względu na ich szybkie odróżnicowanie. W tym miejscu opisujemy 3D hodowle wątroby na chipie PHH, zarówno w monokulturach, jak i w kokulturach z innymi komórkami niemiąższowymi rezydującymi w wątrobie. Zapewniają one znaczną poprawę w badaniu długotrwałych zakażeń HBV z fizjologiczną odpowiedzią komórek gospodarza. Oprócz ułatwienia badań skuteczności leków, analiz toksykologicznych i badań nad patogenezą, te systemy hodowli mikroprzepływowych umożliwiają ocenę terapii leczniczych zakażenia HBV mających na celu eliminację kowalencyjnie zamkniętego, kolistego (ccc)DNA. Przedstawiona metoda opisuje budowę monokultur PHH i kokultur komórkowych PHH/Kupffera, ich zakażenie oczyszczonym HBV oraz analizę odpowiedzi gospodarza. Metoda ta ma szczególne zastosowanie w ocenie długoterminowych skutków zakażenia HBV, kombinacji leczenia i patogenezy.

Opisujemy prostą i wszechstronną platformę do długoterminowej hodowli pierwotnych ludzkich komórek Kupffera i/lub hepatocytów oraz ich zakażania HBV. Pierwotne ludzkie komórki są wysiewane na powlekone kolagenem rusztowania polistyrenowe w obrębie mikrofluidycznego zespołu płytek, który zapewnia ciągłą perfuzję komórek pożywką wzrostową (Rysunek 1a).
PHH, które w konwencjonalnych systemach hodowli są zazwyczaj stabilne jedynie przez ograniczony czas, mogą zachować funkcjonalność przez dłuższe okresy. Albuminy ludzkie, wydzielane przez funkcjonalne hepatocyty i uznawane za najlepszy marker oceny metabolizmu wątroby, są stabilnie i wysoko ekspresjonowane w hodowlach 3D aż do 40. dnia po wysianiu (Rycina 2). W przypadku kokultur funkcjonalność i żywotność komórek Kupffera można ocenić na podstawie wydzielania specyficznych cytokin (np. IL6 i TNFα). Do pomiaru produkcji cytokin po stymulacji kokultur LPS zaleca się stosowanie metod detekcji opartych na wychwytywaniu (Rycina 3).
Komórki tworzą mikrotkanki wątrobowe, zazwyczaj w ciągu 3 dni od wysiania PHH, wykazując obecność funkcjonalnych kanalików żółciowych oraz pełną polaryzację komórkową (Rycina 2). Oprócz zachowania fizjologicznego metabolizmu komórkowego, hodowle te stają się wyjątkowo podatne na zakażenie HBV. W przeciwieństwie do innych systemów hodowlanych, DNA HBV oraz inne markery wirusowe stają się łatwo wykrywalne od 2. dnia po zakażeniu (Rycina 4). Oprócz wydzielanych markerów zakażenia wirusowego, z hodowli można odzyskać rusztowania zawierające hepatocyty i wykorzystać je do detekcji immunofluorescencyjnej antygenów wirusowych (np. HBsAg, HBcAg) (Rycina 4). Podczas gdy konwencjonalne hodowle hepatocytów wymagają inokulacji co najmniej 500 HBV GE na komórkę oraz dodania 2% DMSO i 4% PEG, w hodowlach 3-D zakażenie może zostać zainicjowane przez zaledwie 0,05 HBV GE bez konieczności stosowania DMSO lub PEG (Rycina 4).
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Układ kultur 3D wątroby na chipie (liver-on-a-chip). (a) Schemat montażu płytki hodowlanej w celu zapewnienia ustanowienia krążenia mikrofluidycznego. (b) Panel przedstawiający zbliżenie dołków hodowlanych, w tym papieru filtracyjnego, rusztowania i pierścienia mocującego. (c) Panel przedstawiający proces równoważenia płytki przed wysiewem kultur. Kolejne dwa panele pokazują proces wysiewu dla (d) monokultur hepatocytów oraz (e) kokultur hepatocytów i komórek Kupffera. (f) Panel przedstawiający etapy płukania podczas wymiany pożywki. (g) Panel przedstawiający układ infekcji HBV, w tym usuwanie inokulum. S.M. = pożywka do wysiewu (seeding medium), M.M. = pożywka podtrzymująca (maintenance medium). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Tworzenie mikro-tkanki wątrobowej i żywotność hepatocytów. (a) Ten panel przedstawia podłużne obrazy w jasnym polu 3D monokultur hepatocytów, wykazujące tworzenie mikro-tkanki po wysiewaniu. (b) Ten panel przedstawia obrazy immunofluorescencyjne kultur dla jąder komórkowych (niebieski) oraz ludzkiej albuminy (zielony). (c) Ten panel przedstawia podłużną całkowitą ilość albuminy, a także produkcję albuminy skorygowaną na jedną komórkę w ciągu 40 dni monokultur hepatocytów, oznaczoną metodą ELISA. Przedstawione dane to średnia ± SD. Rysunek został zaadaptowany z pracy Ortega-Prieto et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Funkcjonalność komórek Kupffera w kokulturach 3D. Panele te przedstawiają sekrecję (a) IL6 oraz (b) TNFα w monokulturach hepatocytów i kokulturach hepatocytów/komórek Kupffera 11 dni po wysiewie w odpowiedzi na egzogennie dodany LPS w 9. dniu po wysiewie, oznaczoną przy użyciu testu Human Magnetic Luminex. Rysunek został zaadaptowany z pracy Ortega-Prieto i wsp.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Infekcja HBV w kulturach typu liver-on-a-chip. (a) Panel ten przedstawia detekcję immunofluorescencyjną HBcAg (czerwony), HBsAg (zielony) oraz jąder komórkowych (niebieski) 10 dni po zakażeniu kultur HBV. (b) Panel ten przedstawia podatność kultur na infekcję HBV przy różnych wielokrotnościach zakażenia (MOI), określoną poprzez ilościowe oznaczenie HBV DNA w nadsączach hodowli. (c) Panel ten przedstawia ilościowe oznaczenie podłużnej akumulacji HBV pgRNA w stosunku do genu referencyjnego RPS11. Przedstawione dane to średnia ± SD. Rycina została zaadaptowana z pracy Ortega-Prieto i wsp.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie infekcji hepatotropowych i chorób wątroby. Takich jak udział populacji komórek zamieszkujących wątrobę w patogenezie wirusa, kinetyka infekcji podłużnych, mechanizmy replikacji wirusa, inwazja immunologiczna, w systemie modelu fizjologicznego i badania nad testami leków. Główną zaletą tej techniki jest zdolność do rekapitulacji mikrośrodowiska wątrobowego.Który może utrzymywać się przez dłuższy czas i jest naturalnie podatny na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B na poziomie fizjologicznym. Wcześniej było to podstawowe ograniczenie w dziedzinie wirusowego zapalenia wątroby typu B. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę zakażenia HBV, ponieważ badania kliniczne mogą być przeprowadzane na platformie fizjologicznej przez dłuższy czas.Pozwala to na ocenę sekwencyjnych terapii lekowych wraz z analizą skuteczności istniejących i nowatorskich strategii leczenia. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu wirusowego zapalenia wątroby typu B, a także może być stosowana w innych badaniach nad chorobami, w tym innymi infekcjami hepatotropowymi, chorobami wątroby lub badaniami metabolizmu leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą walczyć, ponieważ wymaga to zwrócenia uwagi na szczególne szczegóły, aby umożliwić pomyślne utrzymanie tkanki wątroby przez długi czas.A także zapoznanie się ze specjalistycznymi narzędziami i sprzętem. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Łącznie z montażem płytek, a także rozmrażaniem i wysiewaniem komórek.Ponieważ etapy związane z długoterminową hodowlą komórek pochodzących z wątroby są trudne w przypadku korzystania z nowego systemu hodowli. Najpierw włącz zarówno sprężarkę, jak i pompę próżniową powiązaną z platformą chipów wątrobowych. Przejdź do szafki ze szklaną rurką, aby zmontować i zrównoważyć płyty.Umieść sterylną membranę na podstawie płytki, aby rozpocząć aseptyczne składanie płytek mikroprzepływowych. Upewnij się, że sterylna membrana spoczywa gładko na dwóch kołkach płytki podstawy. Następnie dodaj dobrze zawierającą płytę górną.Dodaj sterylną pokrywkę na płytkę. I użyj automatycznego precyzyjnego momentu obrotowego ustawionego na 33 funty. Za pomocą spiralnej sekwencji dokręcania dokręć u podstawy płyty.Używając ręcznego momentu obrotowego, upewnij się, że wszystkie są dokręcone do 35 funtów. Następnie przed kondycją podgrzej pożywkę wysiewającą hepatocytów do 37 stopni Celsjusza. Umieść całkowicie zmontowaną płytę w doku do mycia.I upewnij się, że płytka całkowicie się zatrzasnęła. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki do wysiewu hepatocytów po stronie zbiornika każdej studzienki, aby zagruntować płytkę. Następnie zainicjuj przepływ w górę przez 3,5 minuty z prędkością jednego mikrolitra na sekundę.Czerwone wskaźniki z boku płytki wskażą, czy krążenie mikroprzepływowe działa prawidłowo. Gdy pożywka zostanie przepompowana na stronę płytki przeznaczoną do wzrostu komórek, dodaj dodatkowe 1,2 mililitra pożywki do wysiewu hepatocytów. Ostrożnie przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Zainicjuj przepływ w kierunku do góry z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 16 godzin. Następnie przenieś płytę do doku do mycia. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki.Za pomocą sterylnych kleszczy dodaj sterylną okrągłą bibułę filtracyjną do każdej studzienki. Następnie dodaj rusztowanie do mocowania komórek i pierścień ustalający do każdej studzienki. Użyj sterylnego tłoka, aby wepchnąć każdą studzienkę i zablokować pierścienie ustalające i rusztowania na miejscu.Następnie odessaj całe podłoże. I delikatnie dodaj 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do wysiewu hepatocytów na rusztowanie. Zainicjuj przepływ w dół z prędkością jednego mikrolitra na sekundę przez 3 1/2 minuty.Odessać całe medium wypompowane ze strony zbiornika płytki. Dodaj 1,4 mililitra pożywki do wysiewu hepatocytów do każdej studzienki. Następnie włóż płytkę z powrotem do stacji dokującej, aby całkowita objętość na studzienkę wzrosła do 1,6 mililitra.Najpierw podgrzej pożywkę do rozmrażania hepatocytów i pożywkę do wysiewu hepatocytów do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozmrozić jedną fiolkę z pierwotnymi ludzkimi hepatocytami zgodnie z instrukcjami dostawcy. W szklanej szafce z probówką ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki do wysiewu hepatocytów.Następnie umieść zawieszone komórki na lodzie. Używając błękitu trypanowego, policz komórki, aby upewnić się, że żywotność komórek przekracza 90%Przenieś w pełni zmontowaną płytkę do doku myjącego. I odessać całe podłoże ze studni.Wyjmij komórki z lodu i dodaj 600 000 hepatocytów do każdej studzienki w 500-mikrolitrowej objętości pożywki do wysiewu hepatocytów. Zainicjuj przepływ w dół z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę. Dodaj 900 mikrolitrów pożywki do wysiewu hepatocytów do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość w każdym z nich do 1,6 mililitra.Przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% CO2. Zainicjuj przepływ w dół z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez osiem godzin. Następnie odwróć przepływ w górę z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez osiem godzin.Następnie przenieś płytkę do doku myjącego i odessaj całe medium ze studzienek. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki podtrzymującej hepatocyty do każdej studzienki. I zainicjuj przepływ w dół z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 3 1/2 minuty.Następnie odessać całą pożywkę ze zbiornika i dodać 1,4 mililitra pożywki podtrzymującej hepatocyty. Przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Zainicjuj przepływ w górę z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 48 godzin.Po 48 godzinach umyj płytkę, przenosząc ją do doku myjącego. Odessać całe podłoże ze studzienek. I dodaj 400 mikrolitrów pożywki konserwacyjnej.I zainicjuj przepływ w dół z prędkością jednego mikrolitra na sekundę przez 3,5 minuty. Następnie odessać całe podłoże pojawiające się po stronie zbiornika studzienek. Dodaj 1,4 mililitra pożywki podtrzymującej hepatocyty.Następnie przenieś płytkę z powrotem do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze. Zainicjuj przepływ w górę z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 48 godzin. Wymieniaj podłoże w tym procesie mycia i wymiany co 48 godzin.Pierwotne ludzkie hepatocyty są zwykle stabilne tylko przez ograniczony czas przy użyciu konwencjonalnych systemów hodowli. Jednak korzystając z opisanego tutaj protokołu, mogą być funkcjonalnie utrzymywane przez dłuższy czas. Albumina ludzka jest wydzielana przez funkcjonalne hepatocyty i jest uważana za najlepszy marker do oceny funkcjonalności wątroby.Albumina jest postrzegana jako stabilna i wysoce eksprymowana przez kultury 3D do co najmniej 40 dnia po wysiewie. W przypadku kokultur funkcjonalność i żywotność komórek Kupffera ocenia się poprzez pomiar wydzielania określonych cytokin. Jak widać tutaj, zmierzone poziomy IL-6 i TNF alfa wskazują, że komórki były funkcjonalnie utrzymane i zdolne do życia.Oprócz zachowania fizjologicznego metabolizmu komórkowego, kultury te stały się wyjątkowo podatne na zakażenie HBV. DNA HBV i inne markery wirusowe są łatwo wykrywalne od drugiego dnia po zakażeniu. Podczas gdy konwencjonalne kultury wymagają inokulacji co najmniej 500 odpowiednikami genomu HBV uzupełnionymi DMSO i PEG, te kultury 3D są zakażone zaledwie 05 niesuplementowanymi odpowiednikami genomu.Oprócz wydzielanych markerów infekcji wirusowej, z kultur tych pobierane są rusztowania zawierające hepatocyty. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia, że rusztowania te zawierają antygeny wirusowe. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatności podczas obchodzenia się z hepatocytami przed wysiewem, aby uniknąć śmierci komórki.Dodatkowo ważne jest, aby upewnić się, że płytki są prawidłowo zmontowane, a wszystkie kanały przepływu umożliwiają prawidłową cyrkulację pożywki przed wysiewem hepatocytów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. W tym lokalizacja i częstotliwość występowania zakażonych komórek w tkance.Stan fizjologiczny hepatocytów można również ocenić poprzez barwienie albuminy lub struktur wątrobowych, w tym białka ścisłego połączenia ZO-1. Po tym rozwoju technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie wirusologii do badania infekcji wirusowym zapaleniem wątroby typu B i odpowiedzi immunologicznych w fizjologicznym systemie modelu 3D. Nie zapominaj, że praca z wirusem zapalenia wątroby typu B może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wcześniejsze szczepienie, stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej i praca zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

liver-on-chip-cultures-primary-hepatocytes-kupffer-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Długoterminowy system hodowli organoidów 3D ex vitro został stworzony z mysich hepatocytów. Organoidy te mogą być pasażowane i manipulowane genetycznie przez infekcję lentiwirusem o konstrukcji shRNA/ektopowej, transfekcję siRNA i inżynierię CRISPR-Cas9.

Tworzenie i manipulacja genetyczna organoidów mysich hepatocytów

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Tutaj opisujemy platformę, która umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo sferoidów wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy. Przebieg pracy obejmuje zarówno generowanie sferoid z pierwotnych komórek wątroby, jak i przeszczep do oka myszy oraz obrazowanie in vivo w rozdzielczości komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie in vivo sferoid wątroby wszczepionych do przedniej komory oka myszy

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Poznaj metodę hodowli "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera do badania zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B. Technika umożliwia długoterminowe utrzymanie tkanki wątrobowej w fizjologicznym mikrośrodowisku.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Przeglądaj więcej filmów