Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie infekcji hepatotropowych i chorób wątroby. Takich jak udział populacji komórek zamieszkujących wątrobę w patogenezie wirusa, kinetyka infekcji podłużnych, mechanizmy replikacji wirusa, inwazja immunologiczna, w systemie modelu fizjologicznego i badania nad testami leków. Główną zaletą tej techniki jest zdolność do rekapitulacji mikrośrodowiska wątrobowego.

Który może utrzymywać się przez dłuższy czas i jest naturalnie podatny na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B na poziomie fizjologicznym. Wcześniej było to podstawowe ograniczenie w dziedzinie wirusowego zapalenia wątroby typu B. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę zakażenia HBV, ponieważ badania kliniczne mogą być przeprowadzane na platformie fizjologicznej przez dłuższy czas.

Pozwala to na ocenę sekwencyjnych terapii lekowych wraz z analizą skuteczności istniejących i nowatorskich strategii leczenia. Metoda ta może pomóc w zrozumieniu wirusowego zapalenia wątroby typu B, a także może być stosowana w innych badaniach nad chorobami, w tym innymi infekcjami hepatotropowymi, chorobami wątroby lub badaniami metabolizmu leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą walczyć, ponieważ wymaga to zwrócenia uwagi na szczególne szczegóły, aby umożliwić pomyślne utrzymanie tkanki wątroby przez długi czas.

A także zapoznanie się ze specjalistycznymi narzędziami i sprzętem. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie. Łącznie z montażem płytek, a także rozmrażaniem i wysiewaniem komórek.

Ponieważ etapy związane z długoterminową hodowlą komórek pochodzących z wątroby są trudne w przypadku korzystania z nowego systemu hodowli. Najpierw włącz zarówno sprężarkę, jak i pompę próżniową powiązaną z platformą chipów wątrobowych. Przejdź do szafki ze szklaną rurką, aby zmontować i zrównoważyć płyty.

Umieść sterylną membranę na podstawie płytki, aby rozpocząć aseptyczne składanie płytek mikroprzepływowych. Upewnij się, że sterylna membrana spoczywa gładko na dwóch kołkach płytki podstawy. Następnie dodaj dobrze zawierającą płytę górną.

Dodaj sterylną pokrywkę na płytkę. I użyj automatycznego precyzyjnego momentu obrotowego ustawionego na 33 funty. Za pomocą spiralnej sekwencji dokręcania dokręć u podstawy płyty.

Używając ręcznego momentu obrotowego, upewnij się, że wszystkie są dokręcone do 35 funtów. Następnie przed kondycją podgrzej pożywkę wysiewającą hepatocytów do 37 stopni Celsjusza. Umieść całkowicie zmontowaną płytę w doku do mycia.

I upewnij się, że płytka całkowicie się zatrzasnęła. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki do wysiewu hepatocytów po stronie zbiornika każdej studzienki, aby zagruntować płytkę. Następnie zainicjuj przepływ w górę przez 3,5 minuty z prędkością jednego mikrolitra na sekundę.

Czerwone wskaźniki z boku płytki wskażą, czy krążenie mikroprzepływowe działa prawidłowo. Gdy pożywka zostanie przepompowana na stronę płytki przeznaczoną do wzrostu komórek, dodaj dodatkowe 1,2 mililitra pożywki do wysiewu hepatocytów. Ostrożnie przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Zainicjuj przepływ w kierunku do góry z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 16 godzin. Następnie przenieś płytę do doku do mycia. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wyeliminować wszelkie pęcherzyki.

Za pomocą sterylnych kleszczy dodaj sterylną okrągłą bibułę filtracyjną do każdej studzienki. Następnie dodaj rusztowanie do mocowania komórek i pierścień ustalający do każdej studzienki. Użyj sterylnego tłoka, aby wepchnąć każdą studzienkę i zablokować pierścienie ustalające i rusztowania na miejscu.

Następnie odessaj całe podłoże. I delikatnie dodaj 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do wysiewu hepatocytów na rusztowanie. Zainicjuj przepływ w dół z prędkością jednego mikrolitra na sekundę przez 3 1/2 minuty.

Odessać całe medium wypompowane ze strony zbiornika płytki. Dodaj 1,4 mililitra pożywki do wysiewu hepatocytów do każdej studzienki. Następnie włóż płytkę z powrotem do stacji dokującej, aby całkowita objętość na studzienkę wzrosła do 1,6 mililitra.

Najpierw podgrzej pożywkę do rozmrażania hepatocytów i pożywkę do wysiewu hepatocytów do 37 stopni Celsjusza. Następnie rozmrozić jedną fiolkę z pierwotnymi ludzkimi hepatocytami zgodnie z instrukcjami dostawcy. W szklanej szafce z probówką ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki do wysiewu hepatocytów.

Następnie umieść zawieszone komórki na lodzie. Używając błękitu trypanowego, policz komórki, aby upewnić się, że żywotność komórek przekracza 90%Przenieś w pełni zmontowaną płytkę do doku myjącego. I odessać całe podłoże ze studni.

Wyjmij komórki z lodu i dodaj 600 000 hepatocytów do każdej studzienki w 500-mikrolitrowej objętości pożywki do wysiewu hepatocytów. Zainicjuj przepływ w dół z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę. Dodaj 900 mikrolitrów pożywki do wysiewu hepatocytów do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość w każdym z nich do 1,6 mililitra.

Przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% CO2. Zainicjuj przepływ w dół z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez osiem godzin. Następnie odwróć przepływ w górę z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez osiem godzin.

Następnie przenieś płytkę do doku myjącego i odessaj całe medium ze studzienek. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki podtrzymującej hepatocyty do każdej studzienki. I zainicjuj przepływ w dół z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 3 1/2 minuty.

Następnie odessać całą pożywkę ze zbiornika i dodać 1,4 mililitra pożywki podtrzymującej hepatocyty. Przenieś płytkę do stacji dokującej w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Zainicjuj przepływ w górę z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 48 godzin.

Po 48 godzinach umyj płytkę, przenosząc ją do doku myjącego. Odessać całe podłoże ze studzienek. I dodaj 400 mikrolitrów pożywki konserwacyjnej.

I zainicjuj przepływ w dół z prędkością jednego mikrolitra na sekundę przez 3,5 minuty. Następnie odessać całe podłoże pojawiające się po stronie zbiornika studzienek. Dodaj 1,4 mililitra pożywki podtrzymującej hepatocyty.

Następnie przenieś płytkę z powrotem do stacji dokującej w nawilżanym inkubatorze. Zainicjuj przepływ w górę z natężeniem przepływu jednego mikrolitra na sekundę przez 48 godzin. Wymieniaj podłoże w tym procesie mycia i wymiany co 48 godzin.

Pierwotne ludzkie hepatocyty są zwykle stabilne tylko przez ograniczony czas przy użyciu konwencjonalnych systemów hodowli. Jednak korzystając z opisanego tutaj protokołu, mogą być funkcjonalnie utrzymywane przez dłuższy czas. Albumina ludzka jest wydzielana przez funkcjonalne hepatocyty i jest uważana za najlepszy marker do oceny funkcjonalności wątroby.

Albumina jest postrzegana jako stabilna i wysoce eksprymowana przez kultury 3D do co najmniej 40 dnia po wysiewie. W przypadku kokultur funkcjonalność i żywotność komórek Kupffera ocenia się poprzez pomiar wydzielania określonych cytokin. Jak widać tutaj, zmierzone poziomy IL-6 i TNF alfa wskazują, że komórki były funkcjonalnie utrzymane i zdolne do życia.

Oprócz zachowania fizjologicznego metabolizmu komórkowego, kultury te stały się wyjątkowo podatne na zakażenie HBV. DNA HBV i inne markery wirusowe są łatwo wykrywalne od drugiego dnia po zakażeniu. Podczas gdy konwencjonalne kultury wymagają inokulacji co najmniej 500 odpowiednikami genomu HBV uzupełnionymi DMSO i PEG, te kultury 3D są zakażone zaledwie 05 niesuplementowanymi odpowiednikami genomu.

Oprócz wydzielanych markerów infekcji wirusowej, z kultur tych pobierane są rusztowania zawierające hepatocyty. Mikroskopia immunofluorescencyjna ujawnia, że rusztowania te zawierają antygeny wirusowe. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatności podczas obchodzenia się z hepatocytami przed wysiewem, aby uniknąć śmierci komórki.

Dodatkowo ważne jest, aby upewnić się, że płytki są prawidłowo zmontowane, a wszystkie kanały przepływu umożliwiają prawidłową cyrkulację pożywki przed wysiewem hepatocytów. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. W tym lokalizacja i częstotliwość występowania zakażonych komórek w tkance.

Stan fizjologiczny hepatocytów można również ocenić poprzez barwienie albuminy lub struktur wątrobowych, w tym białka ścisłego połączenia ZO-1. Po tym rozwoju technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie wirusologii do badania infekcji wirusowym zapaleniem wątroby typu B i odpowiedzi immunologicznych w fizjologicznym systemie modelu 3D. Nie zapominaj, że praca z wirusem zapalenia wątroby typu B może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak wcześniejsze szczepienie, stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej i praca zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.