Name: Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę obrazowania sygnalizacji wapniowej w komórkach mięśniowych i Schwanna na synapsie przepony myszy. Technika umożliwia badanie dynamiki wapnia podczas stymulacji nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta funduszami z National Institutes of Health (NIH) GM103554 i GM110767 do (T.W.G.) oraz z National Center for Research Resources 5P20RR018751 i National Institute of General Medical Sciences 8P20 GM103513 (do G.W.H.).

Hodowla zwierząt i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz IACUC na Uniwersytecie Nevady.
1. Przygotowanie przepony i nerwów przeponowych od myszy transgenicznych
<ol>
	<li>Kup transgeniczne myszy i startery oligonukleotydowe, aby genotypować te myszy. 
	Uwaga: Startery są wymienione na stronie "Informacje" dla każdej z tych myszy.
	<ol>
		<li>Wyhoduj mysz w wieku od 3 do 6 miesięcy z ekspresją jednej kopii odpowiedniego transgenicznego/knock-in allelu Cre-driver i zerowymi kopiami warunkowego allelu GCaMP3/6 z drugą myszą w tym samym wieku z ekspresją jednej lub dwóch kopii warunkowego allelu GCaMP3/6 i zerowymi kopiami allelu Cre-driver.</li>
		<li>Genotyp szczeniąt i oznaczanie tych, które mają zarówno allele Cre, jak i warunkowe GCaMP3/6 - będą one odtąd nazywane podwójnie transgenicznymi myszami (np. Myf5-Cre, warunkowe GCaMP3)6. 
		Uwaga: W ten sposób wszystkie dane będą pochodzić od myszy wyrażających jedną kopię zarówno alleli Cre, jak i warunkowych GCaMP3/6. Jest to szczególnie ważne, gdy dodaje się inne zmutowane myszy (np. nokauty) do tych krzyżówek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kiedy podwójnie transgeniczne myszy są w odpowiednim wieku (np. 0 lub 5 dzień po urodzeniu [P0 lub P5] lub dorosły), należy poddać myszy eutanazji poprzez odcięcie im głów nożyczkami (dla myszy młodszych niż P10) lub umieszczenie ich w komorze inhalacyjnej izofluranu – gdy nie reagują już na szczypanie ogona parą kleszczy, Są gotowi do poświęcenia.</li>
	<li>Poświęć zwierzę przez ścięcie nożyczkami.</li>
	<li>Przekrój poprzeczny w poprzek całego zwierzęcia tuż pod wątrobą i tuż nad sercem i płucami za pomocą nożyczek do irydektomii.</li>
	<li>Wypreparuj wątrobę, serce i płuca, uważając, aby utrzymać długość nerwu przeponowego, która jest wystarczająco długa, aby można ją było wciągnąć do elektrody ssącej (tj. 1 - 2 cm). 
	Uwaga: Lewy nerw przeponowy można zidentyfikować jako biały fragment tkanki, który wchodzi do przyśrodkowej części lewej przepony. Nie wolno go przecinać podczas usuwania płuc. Prawy nerw przeponowy biegnie w kawałku powięzi, który zawiera również żyłę główną górną i jest cieńszy i bielszy niż żyła główna. Razem oba przenikają do prawej przepony przyśrodkowej.</li>
	<li>Następnie usuń klatkę piersiową i kręgosłup, z wyjątkiem cienkiego grzbietu wokół przepony.</li>
	<li>Umieścić membranę i próbkę nerwu przeponowego w probówce do mikrodymu z roztworem Krebsa-Ringera z 1 μg/ml 594-αBTX na 10 minut w ciemności. 
	Uwaga: To stężenie 594-αBTX znakuje receptory ACh (AChR) bez blokowania ich funkcji (obserwacja osobista).</li>
</ol>
2. Stymulacja i rejestracja potencjałów czynnościowych mięśni
<ol>
	<li>Za pomocą szpilek unieruchamionych unieruchamić membranę, przypinając ją do 6-centymetrowego naczynia pokrytego silikonowym żelem dielektrycznym i wypełnionego ~8 ml natlenionego roztworu Krebsa-Ringera i umieść go na stoliku mikroskopu. Ukrwić membranę większą ilością roztworu Krebsa-Ringera (8 ml/min) przez 30 min. 
	Uwaga: Powoduje to wypłukanie niezwiązanego 594-αBTX, a także wyrównanie tkanki po rozwarstwieniu.</li>
	<li>Wykonaj elektrodę ssącą zgodnie z ustalonymi metodami7.
	<ol>
		<li>Przy 4-krotnym powiększeniu, za pomocą mikromanipulatora, przesuń elektrodę ssącą nad lewym nerwem przeponowym i zastosuj ssanie, wyciągając cylinder strzykawki o pojemności 5 ml podłączonej do rurki przymocowanej do elektrody ssącej. 
		Uwaga: Po pomyślnym wciągnięciu do elektrody ssącej nerw przeponowy jest napięty. Włącz stymulator i stymuluj nerw przeponowy, przestawiając przełącznik ręczny 1x.</li>
		<li>Upewnij się, że membrana kurczy się w odpowiedzi na stymulację 1 Hz, badając ją wzrokowo za pomocą oświetlenia w jasnym polu. Jeśli nie, wyreguluj napięcie, stopniowo obracając pokrętło napięcia, aby uzyskać impuls supramaksymalny, który można zweryfikować za pomocą wizualnego badania skurczu mięśni. Jeśli nadal nie jest widoczny, przedmuchaj nerw strzykawką i spróbuj wciągnąć go ponownie, odsysając.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyłączyć perfuzję i dodać specyficzny dla mięśni inhibitor miozyny BHC6 lub bramkowany napięciem antagonistę kanału sodowego μ-konotoksynę8 do końcowego stężenia 100 μM.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać 100 μM BHC, należy odpipetować 4 μl z 200 mM zapasu w DMSO i wstępnie rozcieńczyć w 1 ml roztworu Krebsa-Ringera.</li>
		<li>Usuń 1 ml roztworu Krebsa-Ringera z naczynia.</li>
		<li>Dodaj wstępnie rozcieńczony BHC do naczynia. 
		Uwaga: To wstępne rozcieńczenie pomaga zapobiec indukcji przez nierozcieńczony DMSO nieprzejściowej odpowiedzi fluorescencyjnej w komórkach wykazujących ekspresję GCaMP3.</li>
		<li>Odczekać 30 minut, a następnie włączyć perfuzję świeżego roztworu Krebsa-Ringera na kolejne 20 - 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj elektrodę rejestrującą.
	<ol>
		<li>Zakładając rękawice, umieść szkło z włókna borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej (OD) 1 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 0,4 mm w ściągaczu do mikropipet i dokręć pokrętła, aby zacisnąć je na miejscu. Zamknij drzwiczki ściągacza.</li>
		<li>Za pomocą ściągacza P-97 zaprogramuj następujące ustawienie: ciepło na 900, ciągnięcie na 120, prędkość na 75, czas na 250, ciśnienie na 500 i bez dodatkowych pętli. 
		Uwaga: Rezystancja (R) jest mierzona za pomocą oprogramowania sterującego wzmacniacza: oprogramowanie do akwizycji danych potwierdza rezystancję, rozwiązując wzór V = IR. Sterownik programowy przepuszcza znany prąd (I) (zwykle 1 nA) przez elektrodę i mierzy zmianę napięcia (V), umożliwiając nam w ten sposób rozwiązanie R.</li>
		<li>W przypadku membran embrionalnych należy upewnić się, że rezystancja jest bliska 60 MΩ, a w przypadku starszych membran 10 - 20 MΩ. Załaduj elektrodę rejestrującą 3 M KCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przy 10-krotnym powiększeniu opuść elektrodę do mięśnia, używając drugiego mikromanipulatora po przeciwnej stronie stolika jako elektrody stymulującej.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych, poczekaj, aż spoczynkowy potencjał błonowy zmieni się z 0 na -65 mV lub poniżej.</li>
	<li>Stymulować przy 1 Hz i sprawdzić obecność potencjału czynnościowego mięśni, sprawdzając, czy istnieje duży potencjał, który wykazuje umiarkowane przeregulowanie (potencjał, który wzrasta powyżej 0 mV, gdy zaczyna się od -65 mV lub poniżej). Nie należy mylić artefaktu stymulacji z potencjałem czynnościowym. 
	Uwaga: Potencjały są znacznie dłuższe w czasie trwania (~5 ms) niż artefakty stymulacji.</li>
</ol>
3. Obrazowanie fluorescencji próbki
<ol>
	<li>Przy 20-krotnym powiększeniu zlokalizuj pasmo płytki końcowej w środku mięśnia, szukając NMJ znakowanych 594-αBTX pod wzbudzeniem światłem zielono-żółtym (550 nm). Przełącz się na wzbudzenie światłem niebieskim (470 nm), aby zobrazować odpowiedzi Ca2+ w mięśniach, neuronach ruchowych lub komórkach Schwanna.</li>
	<li>W razie potrzeby skonfiguruj rozdzielacz obrazu z filtrami pasmowoprzepustowymi i dichroicznym filtrem jednokrawędziowym do obrazowania o podwójnej długości fali.</li>
	<li>W celu obliczenia maksymalnej fluorescencji (Fmax) wykazywanej przez tkankę wykazującą ekspresję GCaMP3/6, należy dodać 12 μl 3 M chlorku potasu (KCl) do preparatów diafragmy 6.
	<ol>
		<li>Wykonuj eksperymenty z paskiem jasności na pasku tabeli przeglądowej ustawionym na 110% poziomu, przy którym tkanka wykazująca ekspresję GCaMP3/6 wykazuje nasycenie przy 20-krotnym powiększeniu, bez kategoryzacji w odpowiedzi na KCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywaj z szybkością 20 klatek na sekundę, aby nie przegapić żadnych szybkich wydarzeń.</li>
	<li>Stymulować stymulacją nerwów przez 1 - 45 s 20 - 40 Hz, dostarczając ciąg impulsów za pomocą elektrody ssącej lub dodać farmakologicznych agonistów przez kąpiel lub perfuzję i zebrać dynamiczne odpowiedzi fluorescencyjne Ca2+ w jednym podtypie komórki wraz ze statycznym sygnałem NMJ 594-αBTX. 
	Uwaga: Jeśli specyficzne tkankowo czerwone lub dalekie myszy GECI lub GEVI staną się dostępne do użytku w NMJ, można je wykorzystać do zebrania dwóch dynamicznych sygnałów odzwierciedlających dwa odrębne elementy komórkowe w NMJ.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania lub eksperymentów elektrofizjologicznych, ponieważ osiągnięto pożądane wyniki, należy przepuścić wodę przez linie perfuzyjne i zassać wodę 2x - 3x przez elektrodę ssącą, aby upewnić się, że sole nie gromadzą się.</li>
</ol>
4. Eksport i analiza danych za pomocą mapy odchyleń standardowych intensywności fluorescencji (SDiu16)
<ol>
	<li>Nagrywaj sekwencje obrazów nagrane jako 16-bitowe stosy TIFF i ładuj je do żądanego systemu analizy danych obrazowania w celu analizy.</li>
	<li>W menu pliku 8d oprogramowania wybierz Stos obrazów zainteresowania i kliknij, aby załadować.
	<ol>
		<li>Po załadowaniu filmu przeskanuj czas, aby zidentyfikować sekcję, która nie ma komórkowej aktywności fluorescencyjnej. 
		Uwaga: Ten region zostanie użyty do utworzenia próbki tła.</li>
		<li>Przytrzymaj Shift i kliknij, aby narysować pole obszaru zainteresowania (ROI) w obszarze zidentyfikowanym jako próbkowy obszar tła.</li>
		<li>Po utworzeniu pola naciśnij spację, aby wygenerować wykres zmiany aktywności w tle.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy ślad i wybierz wybraną opcję, aby wyświetlić opcję Zrzuć ROI jako tekst, aby utworzyć ślad jako plik tekstowy współrzędnych xy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wracając do interesującego Cię filmu, zeskanuj ponownie, aby zidentyfikować region czasu, w którym występuje interesująca aktywność.
	<ol>
		<li>Za pomocą środkowego przycisku myszy wybierz ten region czasu w żółtym polu czasu.</li>
		<li>Kliknij wideo prawym przyciskiem myszy i wybierz Stack OPS, a następnie opcję mapy statystyk 5. 
		Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie mapy odchyleń standardowych (mapy SD) w lewym oknie.</li>
		<li>Kliknij mapę SD, a następnie naciśnij ] 19x, aby zastosować odpowiednią kolorową mapę cieplną.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy mapę SD i wybierz opcję Załaduj i zapisz STM, co spowoduje wyświetlenie opcji Zapisz stm jako tiff, aby zapisać mapę SD.</li>
		<li>Następnie naciśnij [ 19x, aby powrócić do mapy kolorów w skali szarości.</li>
		<li>Naciśnij C, a następnie D, aby wyświetlić narzędzia do mapowania zagęszczenia. Używając lewego i środkowego przycisku myszy, dostosuj próg, aby uwzględnić całą aktywność fluorescencyjną pokazaną na mapie SD.</li>
		<li>Naciśnij C, aby zamknąć narzędzia zagęszczenia, zachowując ustawienia progu.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy mapę SD i wybierz Cząstki STM, a następnie Znajdź PTCLS. 
		Uwaga: Pozwoli to zidentyfikować poszczególne komórki wyrażające aktywność fluorescencyjną.</li>
		<li>Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy mapę SD i wybierz opcję Utwórz ROI cząstek. 
		Uwaga: Spowoduje to nałożenie wybranych komórek na oryginalny film, który Cię interesuje.</li>
		<li>Trzymając wciśnięty Shift, kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny z teraz zidentyfikowanych wskaźników ROI cząstek w oryginalnym filmie.</li>
		<li>Wybierz znacznik ROI i zmierz int w ROI. 
		Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie indywidualnych wykresów aktywności fluorescencyjnej dla każdego zidentyfikowanego zwrotu z inwestycji w interesującym Cię filmie. Można je zapisać, klikając prawym przyciskiem myszy dowolny z nich i wybierając Różne, a następnie Zrzuć ROI jako tekst.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać szczegółową logikę leżącą u podstaw tych operacji, zobacz plik kodu źródłowego9.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li>
<li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+%28GECIs%29+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).</li>
<li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).</li>
<li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Undergraduate+Neuroscience+Education%22%5BJournal%5D)">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li>
<li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+geographutoxin+II+%28mu-conotoxin%29+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li>
<li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+Ca2%2B+signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839(2018).</li>
<li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj podajemy kilka przykładów pomiaru odpowiedzi Ca2 + w określonych komórkach w nienaruszonej tkance nerwowo-mięśniowej przy użyciu myszy z ekspresją GECI. Aby pomyślnie przeprowadzić te eksperymenty, konieczne jest, aby nie uszkodzić nerwu przeponowego podczas sekcji. Aby zobrazować odpowiedzi Ca2+ w komórkach Schwanna przy niskiej lub dużej mocy (tj. 20X lub 60X), konieczne jest użycie BHC lub μ-konotoksyny w celu zablokowania ruchu. W przypadku obrazowania odpowiedziCa2+ w ...

NMJ, podobnie jak wszystkie synapsy, składa się z trzech elementów: presynaptycznego zakończenia pochodzącego z neuronu, postsynaptycznego neuronu/komórki efektorowej i perisynaptycznej komórki glejowej1,2. Podczas gdy podstawowe aspekty transmisji synaptycznej zostały po raz pierwszy zademonstrowane w tym synapse3, wiele aspektów tego procesu pozostaje nieznanych, częściowo ze względu na ekspresję tych samych cząsteczek przez odrębne elementy komórkowe tej synapsy. Na przykład receptory zarówno nukleotydu purynoadeninowego ATP, jak i acetylocholiny (ACh), które są współuwalniane przez neurony ruchowe w NMJ kręgowców, są wyrażane przez mięśnie, komórki Schwanna i neurony ruchowe, komplikując w ten sposób interpretację wszelkich efektów funkcjonalnych wywieranych przez te substancje (np. uwolnienie lub odpowiedź nadajnika, wytwarzanie siły mięśniowej)4. Co więcej, chociaż trójdzielne składniki NMJ są proste w porównaniu z, na przykład, neuronami w ośrodkowym układzie nerwowym, które często wykazują wiele wejść synaptycznych, nie jest jasne, czy neurony ruchowe, komórki mięśniowe czy komórki Schwanna różnią się w odpowiedzi na bodźce w oparciu o ich wewnętrzną heterogeniczność (np. pochodzenie embrionalne, podtyp włókna, morfologia). Aby rozwiązać każdy z tych problemów, korzystne byłoby jednoczesne śledzenie odpowiedzi wielu komórek w obrębie jednego elementu synaptycznego, a także jednoczesne śledzenie takiej odpowiedzi w którymkolwiek z pozostałych oddzielnych elementów. Konwencjonalne strategie wykorzystujące barwniki chemiczne do pomiaru sygnalizacji wapniowej nie mogą osiągnąć tych dwóch celów, ponieważ barwnik stosowany w kąpieli jest pobierany przez wiele typów komórek po nałożeniu na tkankę, a barwnik ładowany wewnątrzkomórkowo może być używany tylko do wizualizacji pojedynczych lub małych kohort komórek. Tutaj, wykorzystując transgeniczne myszy eksprymujące GECI zaprojektowane do pomiaru specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej, wraz ze specyficznymi narzędziami do obrazowania i oprogramowania5, demonstrujemy pierwszy z tych dwóch ogólnych celów i omawiamy, w jaki sposób dodanie nowych narzędzi transgenicznych pomogłoby osiągnąć drugi. Technika ta będzie przydatna dla każdego, kto jest zainteresowany śledzeniem dynamiki wapnia lub innych zdarzeń sygnalizacji komórkowej, które można zaobserwować za pomocą kodowanych genów czujników optycznych w wielu populacjach komórek w tym samym czasie.

<table><tbody><tr><td>Myf5-Cre</td> myszy <td>Jax</td><td>#007893</td><td>Napędzają ekspresję komórek mięśniowych już w klasie E13<sup="xref">6</td></tr><tr><td>Wnt1-Cre myszy</td><td>Jax</td><td>#003829</td><td>Napędza ekspresję we wszystkich&nbsp; Komórki Schwanna w E13, ale nie P209</td></tr><tr><td>Myszy Sox10-Cre</td><td>Jax</td><td>#025807</td><td>Napędzają ekspresję komórek Schwanna w starszym wieku</td></tr><tr><td>Warunkowe myszy GCaMP3</td><td>Jax</td><td>#029043</td><td>Wyraża GCaMP3 w sposób specyficzny dla komórki</td></tr><tr><td>Warunkowe myszy GCaMP6f</td><td>Jax</td><td>#024105</td><td>Wyraża GCaMP6f w sposób</td></tr> <tr><td>specyficzny dla komórkiBHC (3-(N-butyletanimidoyl)-4-hydroksy-2H-chromen-2-on)</td><td>Hit2Lead</td><td>#5102862</td><td>Blokuje miozynę mięśni szkieletowych, ale nie neurotransmisję6</td></tr><tr><td>CF594-&alpha;-BTX</td><td>Biotium</td><td>#00007</td><td>Etykiety klastry receptora acetylocholiny w NMJ</td></tr><tr><td>&mikro;-konotoksyna GIIIb</td><td>Peptydy Int'l</td><td>#CONO20-01000</td><td>Blokuje Nav1.4 zależny od napięcia kanał sodowy8</td></tr><tr><td>Silikonowy żel dielektryczny; alias Sylgard</td><td>Ellswoth Adhesives</td><td># Sil Dielec Gel .9KG&nbsp;</td><td>Pozwala na unieruchomienie membrany za pomocą maleńkich kołków</td></tr><tr><td>Kołki Minutien (średnica 0,1 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Unieruchamia membranę na silikonowym żelu dielektrycznym</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Eclipse FN1&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MBA74100</td><td>Umożliwia klasyfikację i obserwację próbki</td></tr><tr><td>Podstawowa platforma mikroskopu stałego z ręcznym translatorem mikroskopu XY&nbsp;</td><td>Autom8</td><td>MXMScr</td><td>Umożliwia przemieszczanie próbki</td></tr><tr><td>Mikromanipulator ręczny&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>Posiada elektrody rejestrujące i stymulujące&nbsp;</td></tr><tr><td>Wzmacniacz mikroelektrod&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Axoclamp 900A</td><td>Umożliwia ostry wewnątrzkomórkowy zapis elektrofizjologiczny</td></tr> System <tr><td>akwizycji danych o niskim poziomie szumów Mikroelektrody</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1550&nbsp;</td><td>Umożliwia akwizycję danych elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>System analizy danych mikroelektrodowych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>PCLAMP 10 Standard</td><td>Wykonuje analizę danych elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Stymulator fali prostokątnej</td><td>Trawa</td><td>S48</td><td>Stymuluje nerwy do pobudzenia mięśni</td></tr><tr><td>Jednostka izolacji bodźców</td><td>Trawa</td><td>PSIU6</td><td>Redukuje&nbsp; artefakty stymulacyjne</td></tr><tr><td>Włókna borokrzemianowe, średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>FG-GBF100-50-15</td><td>Nabija na pal i rejestruje potencjały mięśniowe wywołane przez nerwy</td></tr><tr><td>Włókna borokrzemianowe, średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 1,17 mm&nbsp;</td><td>Sutter</td><td>BF150-117-15</td><td>Przedłużony i używany do elektrody ssącej</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter</td><td>P-97&nbsp;</td><td>Wyciąga i przygotowuje elektrody rejestrujące</td></tr><tr><td>1200x1200 pikseli, podświetlana kamera cMOS&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95b</td><td>Czuła kamera, która umożliwia szybkie obrazowanie w wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Lumencor</td><td>Spectra X</td><td>Zapewnia oświetlenie z diod LED w celu obserwacji fluorescencji</td></tr><tr><td>&nbsp; Obiektywy fluorescencyjne z korekcją nieskończoności, W.D. 2mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>CFI60</td><td>Zapewnia duże odległości robocze do wizualizacji próbki</td></tr><tr><td>Oświetlacz światłowodowy z lampą halogenową</td><td>Sumita</td><td>LS-DWL-N</td><td>Zapewnia oświetlenie do obserwacji w jasnym polu</td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu W-View Gemini&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>Wyświetla 1 parę obrazów o podwójnej długości fali oddzielonych dichroicznym do pojedynczego aparatu</td></tr><tr><td>Jednopasmowe filtry pasmowo-przepustowe&nbsp; (512/25-25 i 630/92-25)&nbsp;</td><td>SemRock</td><td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td><td>Umożliwia obrazowanie dwuzakresowe</td></tr><tr><td>560 nm Jednokrawędziowy dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Sem Rock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Lustro dichroiczne, które oddziela wiązki światła, aby umożliwić obrazowanie o podwójnej długości fali</td></tr><tr><td>System akwizycji danych obrazowych</td><td></td><td>Nikon NIS Elements - MQS31000</td><td>Umożliwia akwizycję danych obrazowych</td></tr><tr><td>Moduł kontroli długości fali</td><td>Nikon</td><td>MQS41220</td><td>Moduł do danych obrazowych acquiytion</td></tr><tr><td>Moduł sprzętowy rozdzielacza emisji&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS41410</td><td>Moduł do pozyskiwania danych obrazowych</td></tr><tr><td>System analizy danych obrazowych</td><td>NA</td><td>Volumetry 8D5, Fidżi</td><td>Umożliwia analizę intensywności fluorescencji i innych danych obrazowych</td></tr></tbody></table>

ex vivo obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Aktywność elektryczna komórek w tkankach może być monitorowana za pomocą technik elektrofizjologicznych, ale zazwyczaj ograniczają się one do analizy pojedynczych komórek. Ponieważ wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia (Ca2+) w cytozolu często występuje z powodu aktywności elektrycznej lub w odpowiedzi na niezliczone inne bodźce, proces ten można monitorować poprzez obrazowanie komórek obciążonych fluorescencyjnymi barwnikami wrażliwymi na wapń. Jednak trudno jest zobrazować tę reakcję w pojedynczym typie komórki w całej tkance, ponieważ barwniki te są pobierane przez wszystkie typy komórek w tkance. W przeciwieństwie do tego, genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) mogą być wyrażane przez pojedynczy typ komórki i fluoryzować w odpowiedzi na wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2 +, umożliwiając w ten sposób obrazowanie sygnalizacji Ca2 + w całych populacjach poszczególnych typów komórek. Tutaj stosujemy użycie GECI GCaMP3 / 6 do mysiego połączenia nerwowo-mięśniowego, trójdzielnej synapsy między neuronami ruchowymi, mięśniami szkieletowymi i końcowymi / perisynaptycznymi komórkami Schwanna. Pokazujemy przydatność tej techniki w klasycznych preparatach tkankowych ex vivo. Za pomocą rozdzielacza optycznego wykonujemy obrazowanie dynamicznych sygnałów Ca2+ o podwójnej długości fali i statycznej etykiety połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w podejściu, które można łatwo dostosować do jednoczesnego monitorowania dwóch specyficznych dla komórki GECI lub genetycznie kodowanych wskaźników napięcia (GEVI). Na koniec omówimy procedury używane do tworzenia przestrzennych map intensywności fluorescencji. Razem, te techniki optyczne, transgeniczne i analityczne mogą być wykorzystane do badania aktywności biologicznej różnych subpopulacji komórek w NMJ w wielu różnych kontekstach.

Użyteczność tego podejścia wykazują liczne przykłady zmian intensywności fluorescencji, wywoływanych wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w określonych typach komórek połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). Wyniki te przedstawiono w formie przestrzennych map intensywności fluorescencji, które wskazują lokalizację reagujących komórek oraz intensywność ich odpowiedzi, co pozwala na ocenę liczby komórek reagujących oraz stopnia reakcji każdej z nich na konkretny bodziec. Na pr...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nerwowo-mięśniowej, takie jak rola sygnalizacji wapniowej w mięśniach lub komórkach Schwanna w odpowiedzi na stymulację nerwów. Główną zaletą tej techniki jest to, że można zobrazować aktywację określonych typów komórek w odpowiedzi na stymulację nerwów. Na początek zdobądź transgeniczne myszy i genotypuj je zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Po eutanazji przekrój poprzeczny w poprzek całego zwierzęcia tuż pod wątrobą i tuż nad sercem i płucami za pomocą nożyczek do irydektomii. Wypreparuj wątrobę, serce i płuca. Uważaj, aby utrzymać długość nerwu przeponowego, która jest wystarczająco długa, aby można ją było wciągnąć do elektrody ssącej.Następnie usuń klatkę piersiową i kręgosłup, z wyjątkiem cienkiego grzbietu wokół przepony. Umieścić membranę i próbkę nerwu przeponowego w probówce do mikrofugi z roztworem Krebsa-Ringera zawierającym jeden mikrogram na mililitr fluorescencyjnie znakowanej alfa bungarotoksyny. Pozostawić próbkę do inkubacji w roztworze przez 10 minut w ciemności.Za pomocą szpilek minterienów unieruchamiaj membranę, przypinając ją do sześciocentymetrowej czaszy pokrytej silikonowym żelem dielektrycznym i wypełnionej około ośmioma mililitrami natlenionego roztworu Krebsa-Ringera. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu. Następnie należy przepełnić membranę większą ilością roztworu Krebsa-Ringera z prędkością ośmiu mililitrów na minutę przez 30 minut.Przy czterokrotnym powiększeniu, za pomocą mikromanipulatora, przesuń elektrodę ssącą po lewym nerwie przeponowym Zastosuj ssanie, wyciągając cylinder pięciomililitrowej strzykawki podłączonej do rurki przymocowanej do elektrody ssącej. Upewnij się, że membrana kurczy się w odpowiedzi na stymulację jednym hercem, badając ją wzrokowo za pomocą oświetlenia jasnego pola.Jeśli nie, wyreguluj napięcie, stopniowo obracając pokrętło napięcia, aby uzyskać impuls supramaksymalny, który można zweryfikować za pomocą wizualnego badania skurczu mięśni. Jeśli nadal nie jest widoczny, przedmuchaj nerw strzykawką i spróbuj wciągnąć go ponownie, odsysając. Teraz wyłącz perfuzję, aby dodać specyficzny dla mięśni inhibitor miozyny BHC lub bramkowaną napięciem antagonistę kanału sodowego mu-konotoksynę.Przygotować wstępne rozcieńczenie BHC, pipetując cztery mikrolitry 200-milimolowego podstawowego BHC w DMSO w jednym mililitrze roztworu Krebsa-Ringera. Usuń jeden mililitr roztworu Krebsa-Ringera z naczynia. Następnie dodaj wstępnie rozcieńczony BHC do naczynia.Po 30 minutach włącz perfuzję świeżego roztworu Krebsa-Ringera na kolejne 20 do 30 minut. W rękawiczkach przygotuj elektrodę rejestrującą, umieszczając szkło z włókna borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej jednego milimetra i średnicy wewnętrznej 0,4 milimetra w ściągaczu do mikropipet. Dokręć pokrętła, aby clamp go na miejscu i zamknij drzwiczki ściągacza.Następnie zaprogramuj ściągacz zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku membran embrionalnych należy zmierzyć rezystancję za pomocą oprogramowania sterującego wzmacniacza. Upewnij się, że rezystancja jest bliska 60 megaomów, a w przypadku starszych membran od 10 do 20 megaomów.Teraz załaduj elektrodę rejestrującą trzema molowymi chlorkami potasu. Przy 10-krotnym powiększeniu opuść elektrodę do mięśni za pomocą drugiego mikromanipulatora po przeciwnej stronie stolika jako elektrody stymulującej. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych, poczekaj, aż spoczynkowy potencjał błony zmieni się od zera do minus 65 miliwoltów lub mniej.Stymuluj z częstotliwością jednego herca i sprawdź obecność potencjału czynnościowego mięśni, sprawdzając duży potencjał, który wykazuje umiarkowane przeregulowanie. Nie należy mylić artefaktu stymulacji z potencjałem czynnościowym. Przy 20-krotnym powiększeniu zlokalizuj pasmo płytki końcowej w środku mięśnia, szukając fluorescencyjnie znakowanych połączeń nerwowo-mięśniowych alfa bungarotoxin pod wzbudzeniem zielonym żółtym światłem.Przełącz się na wzbudzenie światłem niebieskim, aby zobrazować reakcje wapnia w mięśniach, neuronach ruchowych lub komórkach Schwanna. W tym przykładzie GCaMP trzy ulega ekspresji w komórkach mięśniowych. W razie potrzeby skonfiguruj rozdzielacz obrazu z filtrami pasmowoprzepustowymi i dichroicznym filtrem jednokrawędziowym do obrazowania o podwójnej długości fali.Wykonuj eksperymenty z paskiem jasności na pasku tabeli przeglądowej ustawionym na 110% poziomu, przy którym genetycznie kodowany wskaźnik wapnia wyrażający tkankę wykazuje nasycenie przy 20-krotnym powiększeniu bez kategoryzacji w odpowiedzi na chlorek potasu. Nagrywaj z prędkością 20 klatek na sekundę, aby nie przegapić żadnych szybkich wydarzeń. Stymuluj stymulacją nerwów od jednej do 45 sekund od 20 do 40 Hz, dostarczając ciąg impulsów za pomocą elektrody ssącej i zbieraj dynamiczne fluorescencyjne odpowiedzi wapnia w jednym podtypie komórki wraz ze statycznym, znakowanym fluorescencyjnie sygnałem połączenia nerwowo-mięśniowego alfa bungarotoksyny.Agoniści farmakologiczni mogą być również dodawani przez kąpiel lub perfuzję, a dynamiczne fluorescencyjne reakcje wapnia mogą być zbierane w ten sam sposób. Po zakończeniu obrazowania lub eksperymentów elektrofizjologicznych, ponieważ osiągnięto pożądane wyniki, należy przepuścić wodę przez linie perfuzyjne i zassać wodę dwa do trzech razy przez elektrodę ssącą, aby upewnić się, że sole nie gromadzą się. Mapa przestrzenna odpowiedzi komórek Schwanna na stymulację nerwu przeponowego przepony trzech przepony myszy Wnt jeden GCaMP w siódmym dniu po urodzeniu wykazuje ograniczenie do końcowych parasynaptycznych komórek Schwanna w połączeniu nerwowo-mięśniowym.Ta sama membrana została zobrazowana po znakowaniu fluorescencyjnie znakowaną alfa bungarotoksyną, która wiąże się, aby umożliwić receptory acetylocholiny połączenia nerwowo-mięśniowego. Ta sama membrana została również zobrazowana w oświetleniu Brightfield, aby skierować elektrodę rejestrującą do obszaru postsynaptycznego mięśnia przez połączenie nerwowo-mięśniowe. Pokazano tutaj przestrzenne rozgraniczenie oznaczonych kolorami komórek lub obszarów zainteresowania pobranych do analizy poszczególnych stanów przejściowych wapnia.Mapa przestrzenna odpowiedzi komórek mięśniowych na wapń trzech przepony myszy mth 5 GCaMP przy P czterech na stymulację nerwów przeponowych w obecności inhibitora miozyny BHC pokazuje odpowiedź w całym regionie wszystkich komórek mięśniowych przepony. W przeciwieństwie do tego, stymulacja tej samej przepony w obecności mu-konotoksyny powoduje przestrzennie ograniczoną odpowiedź wapniową w obszarze przyśrodkowym wszystkich komórek mięśniowych przepony, co odpowiada pasmu płytki końcowej wzbogaconej w klaster acetylocholiny. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak immunohistochemia lub immunoblotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaki jest profil molekularny komórek zidentyfikowanych za pomocą elektrofizjologii lub obrazowania wapnia?Metoda ta może dostarczyć informacji na temat reakcji populacji komórek Schwanna i komórek mięśniowych na stymulację nerwów u normalnych noworodków myszy. Może być również stosowany do badania starszych myszy lub do badania myszy z ekspresją białek związanych z chorobą nerwowo-mięśniową.

ex-vivo-imaging-cell-specific-calcium-signaling-at-tripartite-synapse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Heredia, D. J., et. al. Obrazowanie ex vivo specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy. J. Vis. Exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u transgenicznej myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. NJM jest identyfikowany przez fluorescencyjnie znakowane receptory acetylocholiny w przeponie z nerwem przeponowym . Rozdzielacz obrazu służy do...

Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych w przeponie transgenicznej myszy

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Poznaj metodę obrazowania sygnalizacji wapniowej w komórkach mięśniowych i Schwanna na synapsie przepony myszy. Technika umożliwia badanie dynamiki wapnia podczas stymulacji nerwowej.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Przeglądaj więcej filmów