Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad reakcjami immunologicznymi na patogeny przenoszone drogą powietrzną na dynamikę interakcji komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania jasnych i stabilnych obrazów 4D nabłonka tchawicy podczas prostej operacji. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje neutrofili i komórek litycznych podczas infekcji grypą, może być również stosowana do badania różnych komórek odpornościowych lub patogenów przenoszonych drogą powietrzną.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z utrzymaniem stabilnej i minimalnej operacji stanu zapalnego. Co więcej, analiza obrazu może być trudna ze względu na obecność wad serca. W przypadku donosowego zakażenia grypą umieść znieczuloną sześcio- do ośmiotygodniową mysz CD11c-YFP w pozycji leżącej na plecach i potwierdź głęboką sedację przez brak odpowiedzi na szczypanie palca u nogi.

Umieszczając pipetę blisko lewego nozdrza, dozuj małe kropelki do jamy nosowej w odstępie około 20 sekund, aż mysz wdycha całą 15 mikrolitrów objętości inokulatu PR8. Po dwóch do pięciu minutach w ten sam sposób wprowadź 15 mikrolitrów wirusa do prawego nozdrza. Po dostarczeniu całego inokulum należy upewnić się, że mysz oddycha normalnie i umieścić zwierzę w klatce w bocznym odleżynie z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.

Trzy dni po zakażeniu usuń zarówno kość udową, jak i piszczel transgenicznej myszy z ekspresją CFP i delikatnie oczyść kości kleszczami. Przeciąć nasadę kości i użyć jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby przepłukać szpik kostny z każdej kości sterylnym zimnym PBS do 50-mililitrowej probówki na lodzie. Po pobraniu całego szpiku kostnego należy kilkakrotnie odessać szpik przez końcówkę igły i przefiltrować zdysocjowaną zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 40 mikrometrów.

Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach zimnego PBS. Następnie ostrożnie ułóż dwa mililitry każdego z trzech gradientów Percoll w 15-mililitrowej tubie od najbardziej do najmniej skoncentrowanej. Następnie ostrożnie dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek szpiku kostnego na górną warstwę gradientu w celu separacji gradientu gęstości odśrodkowej

Pod koniec wirowania ostrożnie usuń pasmo z granicy faz gradientu 64 i 72% i umyj neutrofile w zimnym PBS. Następnie ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżego PBS na lodzie w celu policzenia i ponownie zawiesić komórki w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na 100 mikrolitrów PBS do wstrzyknięcia dożylnego do zaszczepionych zwierząt biorców CD11c-YFP. 12 godzin po przeniesieniu adopcyjnym umieść znieczulone zwierzę biorcy na dostosowanej do potrzeb desce chirurgicznej na powierzchni nagrzanej do 37 stopni Celsjusza i usuń włosy z szyi myszy za pomocą golenia i kremu do depilacji.

Umieść mysz nad plastikową myszą pozycyjną tak, aby głowa znajdowała się na zewnątrz myszy pod kątem ułatwiającym intubację tchawicy, a kończyny przednie, łapy i ogon zabezpiecz taśmą chirurgiczną. Nałóż maść na oczy i zdezynfekuj odsłoniętą skórę. Następnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż przyśrodkowej osi szyi między górną częścią klatki piersiowej a linią przechodzącą przez dolny punkt żuchwy i przesuń bocznie łaty skórne i gruczoły ślinowe, aby uwidocznić tchawicę.

Użyj kleszczy, aby dokładnie wypreparować tchawicę, zaintubuj mysz cewnikiem i natychmiast rozpocznij sztuczną wentylację. Użyj haczyka chirurgicznego połączonego z prętem na tablicy operacyjnej, aby ustalić wysokość i orientację cewnika, a następnie odsłoń tchawicę aż do podbródka. Otocz tchawicę wazeliną i nawodnij tchawicę kilkoma kroplami ciepłego PBS.

Następnie przyklej szkiełko nakrywkowe do metalowego uchwytu i przykręć uchwyt do translatora XYZ, aby umożliwić umieszczenie szkiełka nakrywkowego na preparacie chirurgicznym. Bardzo ważne jest, aby odpowiednio naświetlić i wysunąć tchawicę oraz lekko docisnąć ją szkiełkiem nakrywkowym, aby utrzymać tkankę stabilną wystarczająco długo do obrazowania. W przypadku obrazowania poklatkowego in vivo umieść deskę chirurgiczną w komorze inkubacyjnej mikroskopu dwufotonowego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj kroplę wody do szkiełka nakrywkowego.

Po wyśrodkowaniu konfiguracji i skupieniu się na tkance tchawicy ustaw częstotliwość skanowania na 800 Hz z 520 na 520 pikseli, polem widzenia 440 na 440 mikrometrów i średnią liniową wynoszącą jeden. Ustaw lasery tytanowo-szafirowe na odpowiednią długość fali i procent mocy zgodnie z fluoroforami wzbudzenia, a następnie ustaw tryb akwizycji 3D i poklatkowej z jednoczesnym wzbudzeniem. Następnie zdefiniuj zakres 50 mikrometrów wzdłuż osi z krokiem o wielkości trzech mikrometrów i rejestruj obrazy co 30 sekund przez 30 minut.

Po tej eksperymentalnej konfiguracji, stabilne obrazy 4D mogą być rejestrowane in situ w zakażonej tchawicy przez 30-minutowy okres śledzenia. Analiza obrazów 4D ujawnia znaczące różnice między ruchem komórek dendrytycznych a rekrutowanych neutrofili, przy czym te ostatnie wykazują znacznie większą prędkość. Złożona morfologia komórek dendrytycznych powoduje częste błędy w śledzeniu komórek, co z kolei powoduje powstawanie śladów o skróconym czasie trwania i zwiększonej wariancji mierzonego zachowania kierunkowego.

W związku z tym stworzono solidną metrykę do pomiaru kierunkowości poprzez uwzględnienie czasu trwania ścieżki, ujawniając znaczącą różnicę w kierunkowości neutrofili w porównaniu z komórkami dendrytycznymi. Ponadto obliczenie odległości między neutrofilami a komórkami dendrytycznymi pozwala na wykrycie i analizę ich kontaktów w czasie, przy czym niektóre neutrofile w tym reprezentatywnym eksperymencie tworzą wiele krótkich kontaktów z komórkami dendrytycznymi, a niektóre nie tworzą żadnego kontaktu z komórkami dendrytycznymi w okresie obrazowania. Co więcej, badanie średniego trendu odległości między neutrofilami a komórkami dendrytycznymi w czasie ułatwia badanie ogólnego położenia komórek, podczas gdy badanie trendu w określonych komórkach pozwala na scharakteryzowanie zachowania każdej pojedynczej komórki.

Znając tę procedurę, można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa tchawicy, w celu oceny kwantyfikacji i charakterystyki rekrutacji różnych komórek odpornościowych w zakażonej tchawicy. Nie zapominaj, że praca z jakimkolwiek szczepem wirusa grypy, nawet przystosowanym do myszy, może być niebezpieczna, dlatego każda procedura powinna być wykonywana w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.