Name: Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj dwufotonową mikroskopię przyżyciową do analizy interakcji komórkowych w błonie śluzowej tchawicy myszy podczas zakażenia wirusem grypy. Ta metoda umożliwia obserwację dynamiki neutrofili i komórek dendrytycznych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Szwajcarskiej Fundacji Narodowej (SNF) (176124, 145038 i 148183), Grant Reintegracyjny Marie Curie Komisji Europejskiej (612742) oraz SystemsX.ch o grant dla D.U.P. (2013/124).

<ol><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Fein, M. R., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+revealing+the+metastatic+process+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Pulendran, B., Maddur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Sensing+and+Response+to+Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Sensing and Response to Influenza.</a> Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-+specific+CD8+%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways.</a> Science. 349 (6252), (2015).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Kretschmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+multiphoton+microscopy+for+visualization+of+tissue+morphology+and+cellular+dynamics+in+murine+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Lung.</a> Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Dendritic+Cells+in+Respiratory+Viral+Infection+and+Asthma%3A+From+Protection+to+Immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology.</a> Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).</li>
<li>Camp, J. V., Jonsson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neutrophils+in+viral+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role for neutrophils in viral respiratory disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+immune+modulation+of+dendritic+cells+through+glycosylation-dependent+interactions+between+Mac-1+and+DC-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN.</a> The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).</li>
<li>Gonzalez, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+influenza+by+medullary+dendritic+cells+via+SIGN-R1+is+essential+for+humoral+immunity+in+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes.</a> Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).</li>
<li>Lindquist, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+V%CE%B39V%CE%B42-T+cells+efficiently+kill+influenza+virus-infected+lung+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells.</a> Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).</li>
<li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+transgenic+cyan+fluorescent+protein+%28CFP%29-expressing+nude+mouse+for+%26%2334%3Btechnicolor%26%2334%3B+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for &#34;technicolor&#34; cancer imaging.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).</li>
<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+regimens%2C+variability%2C+and+complications+associated+with+using+repeat-bolus+dosing+to+extend+a+surgical+plane+of+anesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
<li>Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5872394/">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).</li>
<li>Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19834485">Analysing immune cell migration.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).</li>
<li>Keller, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+cell+shape%2C+and+locomotion+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility%22%5BJournal%5D)">Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes.</a> Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15357943">Intravital Microscopy.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Lambert Emo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Influenza+Infection+of+the+Trachea+Reveals+Dynamic+Regulation+of+CD8%2B+T+Cell+Motility+by+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen.</a> PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy przedstawiono szczegółowy protokół generowania obrazów 4D pokazujących migrację adoptywnie przenoszonych neutrofili i ich interakcje z prądem stałym podczas infekcji grypowej w tchawicy myszy. Opisany model 2P-IVM będzie przydatny do badania dynamiki komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.
Ostatnio opracowano kilka modeli opartych na wizualizacji dynamiki komórek w drogach oddechowych 9,10,11,12,13,14,15,16.<...

Mikroskopia dwufotonowa (2P-IVM) jest skuteczną techniką obrazowania w czasie rzeczywistym interakcji międzykomórkowych zachodzących w ich naturalnym środowisku1. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że umożliwia ona badanie procesów komórkowych na większej głębokości próbki (od 500 μm do 1 mm) w porównaniu z innymi tradycyjnymi technikami obrazowania<klasa sup="xref">2. Jednocześnie, zastosowanie dwóch niskoenergetycznych fotonów generowanych przez laser dwufotonowy minimalizuje fotouszkodzenia tkanek zwykle związane z procesem akwizycji obrazu2. W ciągu ostatniej dekady 2P-IVM został zastosowany do badania różnych typów interakcji komórka-komórka w kilku dyscyplinach3,4,5. Badania te były szczególnie istotne dla zbadania komórek odpornościowych, które charakteryzują się wysoką dynamiką i tworzeniem wyraźnych kontaktów podążających za sygnałami generowanymi przez inne komórki i środowisko. 2P-IVM został również zastosowany do badania interakcji między patogenem a host6. Rzeczywiście, wykazano wcześniej, że niektóre patogeny mogą zmieniać rodzaj i czas trwania kontaktów między komórkami odpornościowymi, utrudniając w rezultacie odpowiedź immunologiczną7.
Błona śluzowa dróg oddechowych jest pierwszym miejscem, w którym generowana jest odpowiedź immunologiczna przeciwko patogenom przenoszonym drogą powietrzną8. Dlatego analiza in vivo interakcji patogen-gospodarz w tej tkance ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia inicjacji mechanizmów obronnych gospodarza podczas infekcji. Jednak 2P-IVM dróg oddechowych jest wyzwaniem głównie ze względu na artefakty wytwarzane przez cykl oddychania zwierzęcia, co utrudnia proces pozyskiwania obrazu. Ostatnio opisano różne modele chirurgiczne do obrazowania mysiej tchawicy9,10,11,12 i płuca13,14,15,16. Modele 2P-IVM tchawicy stanowią doskonały zestaw do wizualizacji początkowej fazy reakcji immunologicznej w górnych drogach oddechowych, podczas gdy modele 2P-IVM pęcherzyków płucnych są bardziej odpowiednie do badania późnej fazy infekcji. Opracowane modele płuc wykazują ograniczenie związane z obecnością pęcherzyków płucnych wypełnionych powietrzem, które ograniczają penetrację optyczną lasera i sprawiają, że warstwa śluzówkowa wewnątrzpłucnych dróg oddechowych jest niedostępna dla obrazowania in vivo17. I odwrotnie, struktura tchawicy, utworzona przez ciągły nabłonek, ułatwia akwizycję obrazu.
Tutaj prezentujemy protokół, który zawiera szczegółowy opis kroków wymaganych do przeprowadzenia infekcji grypą, przygotowania chirurgicznego zwierząt i 2P-IVM tchawicy. Ponadto opisujemy specyficzny zestaw eksperymentalny do wizualizacji neutrofili i komórek dendrytycznych (DC), dwóch typów komórek odpornościowych, które odgrywają ważną rolę jako mediatory mechanizmu obronnego przed wirusem grypy18,19. Na koniec opisujemy procedurę analizy oddziaływań neutrofili-DC. Wykazano, że kontakty te modulują aktywację prądu stałego, a następnie wpływają na odpowiedź immunologiczną przeciwko patogenom20.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH</td><td></td><td>4% roztwór</td></tr><tr><td>CD11c-YFP</td><td>myszy Jackson Laboratories</td><td>008829</td><td>myszy zostały wyhodowane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>myszy CK6-ECFP</td><td>Jackson Laboratories</td><td>004218</td><td>myszy zostały wyhodowane we własnym zakresie</td></tr><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco zmodyfikowana bez chorydu wapnia i chlorku magnezu</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco modyfikowana bez choryku wapnia i chlorku magnezu</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td></td><td>Sigma E0414-1L</td><td>Przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec</td><td>Labatec Pharma</td><td>7680632310024</td><td>Sklep w RT, sklep pod adresem 4 & deg; C w roztworze mieszaniny ket/ksyl</td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xylazin)</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej, przechowywać w temperaturze 4 &deg; C w roztworze mieszaniny ket/ksyl</td></tr><tr><td>26 G 1 ml Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0,3 ml BD Strzykawki do insuliny Micro-Fine</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr> 2 <tr><td>mL Strzykawki</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x igły 18 G</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (cewnik)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>Sklep pod adresem 4&deg; C</td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C / kolagenaza (I i II) mieszanina</td></tr><tr><td>DNAzy I</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0649-50KU</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>CellTrace Fioletowa bejca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>PE-10 Mikro rurki medyczne</td><td>2Instrumenty biologiczne SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczna taśma plastikowa</td><td>M Plast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch & Lomb</td><td></td><td>Store w RT</td></tr><tr><td>Plastelina</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe o wysokiej tolerancji 15 mm okrągłe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny system znieczulania zwierząt SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (znieczulenie gazowe i ławka grzewcza)</td><td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SURGICAL BOARD</td><td>Uniwersytet w Bernie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrimScope II Mikroskop dwufotonowy</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Ti:Sa lasery</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 cel do zanurzenia w wodzie</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>The Cube& Komora inkubacyjna Box i regulator temperatury</td> Usługi <td></td><td></td><td>obrazowania życia</td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>płaszczyzny bitowej</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>Oprogramowanie statystyczne</td> <td>GraphPad</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Analiza interakcji komórka-komórka lub komórka-patogen in vivo jest ważnym narzędziem do zrozumienia dynamiki odpowiedzi immunologicznej na infekcję. Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna (2P-IVM) umożliwia obserwację interakcji komórkowych w głębokich tkankach u żywych zwierząt, przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania powstającego podczas akwizycji obrazu. Do tej pory opisano różne modele 2P-IVM narządów limfoidalnych i nielimfatycznych. Jednak obrazowanie narządów oddechowych pozostaje wyzwaniem ze względu na ruch związany z cyklem oddechowym zwierzęcia.
Tutaj opisujemy protokół do wizualizacji in vivo interakcji komórek odpornościowych w tchawicy myszy zakażonych wirusem grypy za pomocą 2P-IVM. W tym celu opracowaliśmy niestandardową platformę obrazowania, która obejmowała chirurgiczne naświetlenie i intubację tchawicy, a następnie akwizycję dynamicznych obrazów neutrofili i komórek dendrytycznych (DC) w nabłonku błony śluzowej. Dodatkowo szczegółowo opisaliśmy kroki potrzebne do przeprowadzenia infekcji donosowej grypy i analizy cytometrycznej przepływowej komórek odpornościowych w tchawicy. Na koniec przeanalizowaliśmy ruchliwość neutrofili i DC, a także ich interakcje w trakcie trwania filmu. Protokół ten pozwala na generowanie stabilnych i jasnych obrazów 4D niezbędnych do oceny interakcji komórka-komórka w tchawicy.

W niniejszej pracy opisaliśmy szczegółowy protokół badania in vivo motylości oraz interakcji między neutrofilami a komórkami DC podczas infekcji grypą w tchawce myszy (Rycina 3A). W tym celu wyizolowaliśmy neutrofile CFP+ (czystość 92%; Rycina 3B) z myszy CK6-ECFP i przenieśliśmy je drogą adoptywną do myszy CD1c-YFP zainfekowanej grypą. Następnie, w 3. dniu po infekcji (p.i.), przeprowadziliśmy 2P-IVM tchawki....

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad reakcjami immunologicznymi na patogeny przenoszone drogą powietrzną na dynamikę interakcji komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania jasnych i stabilnych obrazów 4D nabłonka tchawicy podczas prostej operacji. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje neutrofili i komórek litycznych podczas infekcji grypą, może być również stosowana do badania różnych komórek odpornościowych lub patogenów przenoszonych drogą powietrzną.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z utrzymaniem stabilnej i minimalnej operacji stanu zapalnego. Co więcej, analiza obrazu może być trudna ze względu na obecność wad serca. W przypadku donosowego zakażenia grypą umieść znieczuloną sześcio- do ośmiotygodniową mysz CD11c-YFP w pozycji leżącej na plecach i potwierdź głęboką sedację przez brak odpowiedzi na szczypanie palca u nogi.Umieszczając pipetę blisko lewego nozdrza, dozuj małe kropelki do jamy nosowej w odstępie około 20 sekund, aż mysz wdycha całą 15 mikrolitrów objętości inokulatu PR8. Po dwóch do pięciu minutach w ten sam sposób wprowadź 15 mikrolitrów wirusa do prawego nozdrza. Po dostarczeniu całego inokulum należy upewnić się, że mysz oddycha normalnie i umieścić zwierzę w klatce w bocznym odleżynie z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.Trzy dni po zakażeniu usuń zarówno kość udową, jak i piszczel transgenicznej myszy z ekspresją CFP i delikatnie oczyść kości kleszczami. Przeciąć nasadę kości i użyć jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 26, aby przepłukać szpik kostny z każdej kości sterylnym zimnym PBS do 50-mililitrowej probówki na lodzie. Po pobraniu całego szpiku kostnego należy kilkakrotnie odessać szpik przez końcówkę igły i przefiltrować zdysocjowaną zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 40 mikrometrów.Zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach zimnego PBS. Następnie ostrożnie ułóż dwa mililitry każdego z trzech gradientów Percoll w 15-mililitrowej tubie od najbardziej do najmniej skoncentrowanej. Następnie ostrożnie dodaj dwa mililitry zawiesiny komórek szpiku kostnego na górną warstwę gradientu w celu separacji gradientu gęstości odśrodkowej.Pod koniec wirowania ostrożnie usuń pasmo z granicy faz gradientu 64 i 72% i umyj neutrofile w zimnym PBS. Następnie ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżego PBS na lodzie w celu policzenia i ponownie zawiesić komórki w stężeniu pięć razy 10 do szóstych komórek na 100 mikrolitrów PBS do wstrzyknięcia dożylnego do zaszczepionych zwierząt biorców CD11c-YFP. 12 godzin po przeniesieniu adopcyjnym umieść znieczulone zwierzę biorcy na dostosowanej do potrzeb desce chirurgicznej na powierzchni nagrzanej do 37 stopni Celsjusza i usuń włosy z szyi myszy za pomocą golenia i kremu do depilacji.Umieść mysz nad plastikową myszą pozycyjną tak, aby głowa znajdowała się na zewnątrz myszy pod kątem ułatwiającym intubację tchawicy, a kończyny przednie, łapy i ogon zabezpiecz taśmą chirurgiczną. Nałóż maść na oczy i zdezynfekuj odsłoniętą skórę. Następnie wykonaj jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż przyśrodkowej osi szyi między górną częścią klatki piersiowej a linią przechodzącą przez dolny punkt żuchwy i przesuń bocznie łaty skórne i gruczoły ślinowe, aby uwidocznić tchawicę.Użyj kleszczy, aby dokładnie wypreparować tchawicę, zaintubuj mysz cewnikiem i natychmiast rozpocznij sztuczną wentylację. Użyj haczyka chirurgicznego połączonego z prętem na tablicy operacyjnej, aby ustalić wysokość i orientację cewnika, a następnie odsłoń tchawicę aż do podbródka. Otocz tchawicę wazeliną i nawodnij tchawicę kilkoma kroplami ciepłego PBS.Następnie przyklej szkiełko nakrywkowe do metalowego uchwytu i przykręć uchwyt do translatora XYZ, aby umożliwić umieszczenie szkiełka nakrywkowego na preparacie chirurgicznym. Bardzo ważne jest, aby odpowiednio naświetlić i wysunąć tchawicę oraz lekko docisnąć ją szkiełkiem nakrywkowym, aby utrzymać tkankę stabilną wystarczająco długo do obrazowania. W przypadku obrazowania poklatkowego in vivo umieść deskę chirurgiczną w komorze inkubacyjnej mikroskopu dwufotonowego o temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj kroplę wody do szkiełka nakrywkowego.Po wyśrodkowaniu konfiguracji i skupieniu się na tkance tchawicy ustaw częstotliwość skanowania na 800 Hz z 520 na 520 pikseli, polem widzenia 440 na 440 mikrometrów i średnią liniową wynoszącą jeden. Ustaw lasery tytanowo-szafirowe na odpowiednią długość fali i procent mocy zgodnie z fluoroforami wzbudzenia, a następnie ustaw tryb akwizycji 3D i poklatkowej z jednoczesnym wzbudzeniem. Następnie zdefiniuj zakres 50 mikrometrów wzdłuż osi z krokiem o wielkości trzech mikrometrów i rejestruj obrazy co 30 sekund przez 30 minut.Po tej eksperymentalnej konfiguracji, stabilne obrazy 4D mogą być rejestrowane in situ w zakażonej tchawicy przez 30-minutowy okres śledzenia. Analiza obrazów 4D ujawnia znaczące różnice między ruchem komórek dendrytycznych a rekrutowanych neutrofili, przy czym te ostatnie wykazują znacznie większą prędkość. Złożona morfologia komórek dendrytycznych powoduje częste błędy w śledzeniu komórek, co z kolei powoduje powstawanie śladów o skróconym czasie trwania i zwiększonej wariancji mierzonego zachowania kierunkowego.W związku z tym stworzono solidną metrykę do pomiaru kierunkowości poprzez uwzględnienie czasu trwania ścieżki, ujawniając znaczącą różnicę w kierunkowości neutrofili w porównaniu z komórkami dendrytycznymi. Ponadto obliczenie odległości między neutrofilami a komórkami dendrytycznymi pozwala na wykrycie i analizę ich kontaktów w czasie, przy czym niektóre neutrofile w tym reprezentatywnym eksperymencie tworzą wiele krótkich kontaktów z komórkami dendrytycznymi, a niektóre nie tworzą żadnego kontaktu z komórkami dendrytycznymi w okresie obrazowania. Co więcej, badanie średniego trendu odległości między neutrofilami a komórkami dendrytycznymi w czasie ułatwia badanie ogólnego położenia komórek, podczas gdy badanie trendu w określonych komórkach pozwala na scharakteryzowanie zachowania każdej pojedynczej komórki.Znając tę procedurę, można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa tchawicy, w celu oceny kwantyfikacji i charakterystyki rekrutacji różnych komórek odpornościowych w zakażonej tchawicy. Nie zapominaj, że praca z jakimkolwiek szczepem wirusa grypy, nawet przystosowanym do myszy, może być niebezpieczna, dlatego każda procedura powinna być wykonywana w warunkach drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego.

imaging-cell-interaction-tracheal-mucosa-during-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej może być wykorzystana do badania interakcji leukocytów-śródbłonka i perfuzji naczyń włosowatych w czasie rzeczywistym. Protokół ten opisuje metody obrazowania i ilościowego oznaczania tych parametrów w mikrokrążeniu płucnym za pomocą stabilizowanego próżniowo systemu obrazowania płuc.

Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna szerokokątnego mikrokrążenia płucnego w eksperymentalnym ostrym uszkodzeniu płuc z wykorzystaniem systemu obrazowania stabilizowanego próżniowo

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące podawania IAV w ciągu nosa oraz dalszej analizy uszkodzeń płuc myszy i związanych z tym zmian transkrypcyjnych typów komórek płucnych.

Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Poznaj dwufotonową mikroskopię przyżyciową do analizy interakcji komórkowych w błonie śluzowej tchawicy myszy podczas zakażenia wirusem grypy. Ta metoda umożliwia obserwację dynamiki neutrofili i komórek dendrytycznych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Przeglądaj więcej filmów