Wizualne warunkowanie klasyczne u mrówek leśnych
5 października 2018
Prezentujemy protokół klasycznego warunkowania mrówek w okiełznaniu, który pozwala badaczom badać wizualne uczenie się i tworzenie pamięci na poziomie analizy niemożliwym dla swobodnie poruszających się osób.
Wspólną zaletą tej techniki jest to, że wspomnienia wzrokowe mogą być badane w kontrolowany sposób u nieruchomych, a nie swobodnie poruszających się mrówek leśnych. Metoda ta może zostać wykorzystana do badania neuronalnych podstaw uczenia się wizualnego w bardzo dobrze ugruntowanym modelu nawigacji owadów. Aby wybrać mrówki, które są zmotywowane do jedzenia, umieść szkiełko z kroplą sacharozy w małym pudełku z płynem pokrywającym ściany.
Następnie umieść każdą wybraną mrówkę w pudełku i poczekaj, aby zobaczyć, czy żywi się kroplą sacharozy. Jeśli mrówka żywi się kroplą sacharozy, natychmiast przenieś ją do pustego pudełka. Następnie przenieś każdą mrówkę do osobnej probówki i na krótko umieść probówkę w zamrażarce, aby unieruchomić mrówki.
Umieść unieruchomioną mrówkę w uchwycie przez nacięcie w kartonie, chwytając ją za staw między głową a klatką piersiową. Następnie użyj szpilek do owadów, aby upewnić się, że czułki pozostają z boku głowy. Za pomocą wykonanego na zamówienie elementu grzejnego rozpuść wosk, aby przykleić końcówkę szpilki do owadów do głowy mrówki, równolegle do kartonu.
Po wyschnięciu wosku usuń szpilki owadów z czułków i ostrożnie wyjmij mrówkę z uchwytu. Następnie zamocuj szpilkę do owadów trzymającą mrówkę w cylindrze z plasteliny i zamocuj pod nią wykonany na zamówienie plastikowy uchwyt. Upewnij się, że mrówka utrzymuje typową postawę stojącą i że całe ciało, z wyjątkiem głowy, może się swobodnie poruszać.
Najpierw umieść aparat z obiektywem makro na białym akrylowym pudełku bezpośrednio nad uchwytem na mrówki i umieść mrówkę w uchwycie wewnątrz pudełka. Następnie przymocuj igłę i strzykawkę wypełnioną sacharozą, bodziec bezwarunkowy, do jasnoniebieskiego prostokąta z tektury, bodźca warunkowego, do użycia jako wskazówkę wizualną. W przypadku treningu sparowanego rozpocznij nagrywanie mrówki na 10 sekund przed przedstawieniem bodźca warunkowego.
Jeśli w tym czasie mrówka wykonuje odruch wyprostu warg sromowych szczęki lub MaLER, odłóż próbę na kilka sekund. Przesuwaj strzykawkę z bodźcem warunkowym przed mrówką przez 10 sekund. Następnie wydychaj pojedynczą kroplę sacharozy ze strzykawki i karm mrówkę przez pięć sekund.
Powtórz procedurę treningu w parach 10 razy z pięciominutowymi przerwami między każdą próbą. W przypadku treningu bez par rozpocznij nagrywanie wideo 10 sekund przed próbą. Następnie przedstaw bodziec warunkowy, jak opisano wcześniej.
Po 2,5 minuty dostarcz bezwarunkowy bodziec sacharozy bezpośrednio do aparatu gębowego mrówki za pomocą strzykawki bez niebieskiego kartonu. Po zakończeniu prób treningowych rozpocznij nagrywanie z kamery na 10 sekund przed fazą testowania. Następnie przedstaw mrówce bodziec warunkowy przez 10 sekund.
Po zakończeniu testu dostarcz mrówce bezwarunkowy bodziec sacharozy, aby potwierdzić, że mrówka jest nadal zmotywowana do żerowania. Korzystając z nagrania wykonanego podczas treningu i testów, oceń reakcje mrówki w ciągu 10 sekund prezentacji bodźca warunkowego. Na koniec podziel reakcje mrówki podczas prezentacji bodźca warunkowego na trzy kategorie: pełne wyprostowanie z ruchem jak podczas karmienia, pełne wyprostowanie bez ruchu lub częściowe wyprostowanie wargi sromowej szczęki lub palpów szczękowych.
W tym protokole mrówki, które przeszły trening w parach, wykonywały coraz więcej MaLER w odpowiedzi na bodziec warunkowy. Wręcz przeciwnie, niesparowane mrówki nie wykazały znaczącego wzrostu MaLER podczas treningu. Aby zbadać ich pamięć krótko- i średniotrwałą, mrówki badano 10 minut lub godzinę po ostatniej próbie treningowej.
W obu testach odsetek mrówek wykonujących MaLER w odpowiedzi na bodziec warunkowy był wyższy, gdy przeszły trening w parach. Odpowiedzi MaLER podzielono na trzy kategorie: MES, FE i PE. Zazwyczaj mrówki wykonywały MES lub PE częściej niż FE. Jednak tylko kilka mrówek konsekwentnie wykazywało ten sam rodzaj reakcji. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z mrówkami, aby zmniejszyć poziom stresu i potencjalne uszkodzenia, szczególnie podczas zaprzęgania.
Dostosowując tę procedurę, można wykorzystać różne bodźce wzrokowe w celu zbadania właściwości mrówek leśnych do tworzenia wspomnień wzrokowych. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się neurobiologią owadów i nawigacją do badania wizualnych wspomnień asocjacyjnych z mrówkami drzewnymi dla mikrofa.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół klasycznego warunkowania wykorzystującego uprzężone mrówki, umożliwiając badanie uczenia się wzrokowego i formowania się pamięci w kontrolowanym środowisku. Metoda ta pozwala badaczom na zbadanie podstaw neuronalnych uczenia się wzrokowego u mrówek leśnych, uznawanego modelu dla nawigacji owadów.
Kluczowe Składowe Badania
Dział Neurologii
- Neurobiologia
- Biologia Behawioralna
- Nawigacja Owadów
Tło
- Pamięć wzrokowa może być badana w kontrolowany sposób.
- Uprzężone mrówki stanowią unikalną możliwość do szczegółowej analizy.
- Metoda koncentruje się na Refleksie Rozszerzania Żuwokszczotek (MaLER).
- Mrówki leśne są uznawanym modelem do badania zachowania owadów.
Cel Badania
- Opracowanie protokołu do badania uczenia się wzrokowego u mrówek.
- Zbadanie mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw formowania się pamięci wzrokowej.
- Ocena wpływu treningu sparowanego w porównaniu z niesparowanym na utrzymanie pamięci.
Metody Użyte
- Wybór zmotywowanych mrówek za pomocą kropli sacharozy.
- Immobilizacja i uprzążowanie mrówek do kontrolowanych eksperymentów.
- Wykorzystanie bodźców wzrokowych i bezwarunkowych podczas treningu.
- Rejestracja i ocena reakcji mrówek podczas treningu i testowania.
Główne Wyniki
- Trening sparowany zwiększył reakcje MaLER na bodziec warunkowy.
- Trening niesparowany nie wykazał istotnych wzrostów w MaLER.
- Mrówki wykazywały zróżnicowane reakcje skategoryzowane jako pełne i częściowe rozszerzenia.
- Utrzymywanie pamięci oceniano w różnych odstępach czasu po treningu.
Wnioski
- Protokół umożliwia szczegółowe badanie pamięci asocjacyjnych wzrokowych.
- Techniki obchodzenia się są kluczowe, aby zminimalizować stres u mrówek.
- Metodę można dostosować do różnych bodźców wzrokowych w przyszłych badaniach.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise investigation of visual associative learning in a genetically tractable insect model, supporting mechanistic de-risking of neural targets involved in memory formation. By providing a controlled paradigm to dissect cue-reward associations, it aids in target validation for cognitive pathways with translational relevance to mammalian systems. The approach offers a scalable, reproducible system for early-stage discovery of modulators affecting learning and memory processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of visual cue-reward associations to validate neural targets underlying learning and memory.
- Operational Value: Provides a quantifiable behavioral readout (MaLER) for assessing target engagement in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a standardized assay for measuring associative learning dynamics in response to visual stimuli.
- Operational Value: Supports high-throughput compatibility through fixed-ant preparation and automated response scoring.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking visual stimulus processing to neural pathways conserved across species.
- Operational Value: Enables dose-response testing of compounds on memory retention at defined intervals (10 min, 1 hr).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target hypothesis testing and pathway elucidation precede lead identification, offering a disease-relevant system for cognitive mechanism probing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neural circuits involved in visual associative learning through controlled stimulus presentation.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized training protocols and quantifiable MaLER response metrics.
- Analytics: Enables comparative analysis of learning curves and memory retention across experimental groups using categorical response scoring.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling conserved mechanisms of sensory-triggered memory formation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for testing diverse visual stimuli and pharmacological modulators in a standardized format.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target modulation through measurable changes in learned behavioral responses.
- Operational Value: Standardization of harnessing, stimulus delivery, and scoring reduces inter-experiment variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in cognitive target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on learning and memory retention.
Implementation Considerations
- Expertise in insect handling and neurobehavioral assay techniques.
- Apparatus for visual stimulus delivery, sucrose administration, and video recording.
- Standardization of training intervals, intertrial intervals, and post-training testing times.
- Adaptation considerations for different visual cues and ant species.
- Limitations include potential stress from harnessing and variability in individual motivation levels.
