Name: Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj selektywną syntezę peptydów bogatych w mostki dwusiarczkowe i ich analizę strukturalną przy użyciu spektroskopii NMR oraz MS/MS. Ta metoda umożliwia badanie wzorców mostków dwusiarczkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować A. Resemannowi, F. J. Mayerowi i D. Suckau z Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts i C. Thiele z Uniwersytetu Technicznego w Darmstadt; O. Ohlenschläger z FLI Jena, M. Engeser z Uniwersytetu w Bonn; K. Kramer, A. Harzen i H. Nakagami z Instytutu Badań nad Hodowlą Roślin im. Maxa Plancka, Kolonia; Susanne Neupert z Instytutu Zoologii w Kolonii; oraz Zakładom Spektroskopii Biomolekularnego Rezonansu Magnetycznego Uniwersytetu we Frankfurcie w celu uzyskania wsparcia technicznego, modułów szkoleniowych i dostępu do instrumentów. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe udzielone D.I. przez Uniwersytet w Bonn.

<ol><li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+therapeutics%3A+Current+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li>
<li>Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li>
<li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201107011">Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li>
<li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+%CE%B1-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bridges%3A+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li>
<li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.jbc.org/content/277/30/27247.full">Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li>
<li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29397705">Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li>
<li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins%3A+Underlying+causes+and+folding+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li>
<li>Böhm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li>
<li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ejoc.201402149">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li>
<li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr800323s?journalCode=chreay">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li>
<li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9353723">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li>
<li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Helvetica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li>
<li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+%28RGS%29+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li>
<li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Letters%22%5BJournal%5D)">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li>
<li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B4-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li>
<li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li>
<li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Solid-Phase-Synthesis-A-Practical-Guide/Albericio/p/book/9780824703592">Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide</a>. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15143746">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w niniejszym dokumencie metoda syntezy peptydów bogatych w cysteinę, takich jak μ-PIIIA, umożliwia selektywne wytwarzanie izomerów związanych dwusiarczkiem z tej samej sekwencji aminokwasów. W związku z tym zastosowano sprawdzone metody, takie jak synteza peptydów w fazie stałej na bazie Fmoc18 oraz zdefiniowana strategia grupy ochronnej dla regioselektywnego tworzenia wiązań dwusiarczkowych16. Synteza peptydów w fazie stałej może wytwarzać sekwencje aminokwasów na ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58368/synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with">Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities</a>. The Protocol and Materials sections were updated.
Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 &#956;mol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 &#956;mol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 &#181;mol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 &#181;L; 0.6 M in DMF; 270 &#181;mol; 9.6 eq.), NMM (125 &#181;L; 50% in DMF; 568 &#181;mol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 &#181;L; 0.6 M in DMF; 249 &#181;mol; 9 eq.), NMM (112 &#181;L; 50% in DMF; 510 &#181;mol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 0.6 M in DMF; 252 &#181;mol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc Rink amide resin</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>855001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin</td>
			<td>Varian, Inc.</td>
			<td>PL3867-3764</td>
			<td>AmphiSpheres 40 RAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58368/synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with">Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities</a>. The Protocol and Materials sections were updated.

Erratum: Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Wykorzystanie bioaktywnych peptydów w badaniach i rozwoju farmaceutycznym jest wysoko cenione, ponieważ reprezentują one silne i wysoce selektywne związki dla określonych celów biologicznych1. Jednak ze względu na ich bioaktywność trójwymiarowa struktura ma ogromne znaczenie w celu przeprowadzenia badań zależności struktura-aktywność2,3,4. Oprócz pierwszorzędowej sekwencji aminokwasów, która wpływa na ogólną konformację, wiązania dwusiarczkowe znacząco stabilizują strukturę peptydów bogatych w cysteinę5. Wiele peptydów dwusiarczkowych obejmuje konotoksyny, takie jak μ-PIIIA z Conus purpurascens, który zawiera sześć cystein w swojej sekwencji. Ta wysoka zawartość cysteiny teoretycznie pozwala na tworzenie 15 izomerów dwusiarczku. Prawidłowa łączność dwusiarczkowa jest bardzo ważna dla aktywności biologicznej6,7. Nasuwa się jednak pytanie, czy istnieje więcej niż jedna bioaktywna konformacja naturalnie występujących peptydów, a jeśli tak, to który z tych izomerów ma najwyższą aktywność biologiczną? W przypadku μ-konotoksyn celami biologicznymi są kanały jonowe sodu bramkowane napięciem, a w szczególności μ-PIIIA jest najsilniejsza dla podtypów NaV1.2, NaV1.4 i NaV1.73.
Synteza peptydów z mostkami dwusiarczkowymi może być osiągnięta przy użyciu różnych metod. Najwygodniejszą metodą tworzenia wiązań dwusiarczkowych w peptydzie jest tak zwane podejście samozawijające się oksydacyjnie. W tym przypadku liniowy prekursor pożądanego peptydu cyklicznego jest syntetyzowany najpierw za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej, która następuje po rozszczepieniu z nośnika polimerowego poddanego utlenianiu w układzie buforowym. Środki aktywne redoks, takie jak zredukowany i utleniony glutation (GSH/GSSG), są często dodawane w celu promowania tworzenia wiązań dwusiarczkowych. Główną wadą samofałdowania wspomaganego buforem jest to, że wiązania dwusiarczkowe nie są tworzone selektywnie w sposób stopniowy. W porównaniu z natywnym peptydem, dla którego często opisywany jest tylko jeden konkretny izomer dwusiarczkowy, możliwe jest otrzymanie wielu innych izomerów za pomocą tego podejścia8. Wykazano już, że μ-PIIIA powoduje co najmniej trzy różnie pofałdowane izomery po samofałdowaniu w poprzednim badaniu3. Rozdzielenie takiej mieszaniny izomerów jest raczej trudne ze względu na podobne czasy retencji przy użyciu metod oczyszczania chromatograficznego9. Ukierunkowana synteza określonego izomeru jest zatem korzystna. Aby specyficznie wytworzyć izomer o zdefiniowanym łączeniu dwusiarczkowym, wymagana jest specjalna strategia, w której wiązania dwusiarczkowe są kolejno zamykane. W związku z tym na nośniku polimerowym syntetyzuje się liniowy prekursor przenoszący odrębne grupy ochronne w poszczególnych parach cysteiny. Po eliminacji pary cysteiny są pojedynczo i kolejno dechronione i łączone w reakcji utleniania w celu uzyskania pożądanych wiązań dwusiarczkowych10,11,12,13,14,15,16. Po syntezie i oczyszczeniu produktu reakcji wymagane jest potwierdzenie tożsamości i połączenia dwusiarczkowego za pomocą odpowiednich metod analitycznych. Dostępnych jest wiele metod analitycznych do wyjaśnienia sekwencji aminokwasów pierwszorzędowych, np. MS/MS, podczas gdy oznaczanie połączeń dwusiarczkowych nadal pozostaje znacznie mniej zbadane. Oprócz złożoności takich peptydów z wieloma wiązaniami dwusiarczkowymi, zanieczyszczenia związane z produktem (np. z mieszania dwusiarczkowego), wynikające z przygotowania i obróbki próbki, mogą jeszcze bardziej skomplikować analizę. W niniejszej pracy pokazujemy, że zastosowanie kombinacji różnych technik analitycznych jest niezbędne do jednoznacznego wyjaśnienia tożsamości wiązań dwusiarczkowych w izomerach μ-PIIIA. Połączyliśmy metody chromatograficzne ze spektrometrią mas i dostarczyliśmy te same próbki do spektroskopii NMR. W analizie MS / MS wspomaganej matrycą desorpcji/jonizacji laserowej (MALDI) zidentyfikowaliśmy wiązania dwusiarczkowe za pomocą częściowej redukcji i derywatyzacji jodoacetamidowej, ponieważ analiza odgórna nie jest możliwa dla tego peptydu. Przeprowadzono eksperymenty 2D NMR w celu uzyskania trójwymiarowej struktury każdego izomeru. W ten sposób, łącząc różne wyrafinowane metody analityczne, możliwe jest prawidłowe wyjaśnienie łączności dwusiarczkowej i trójwymiarowej struktury złożonych peptydów z wieloma wiązaniami dwusiarczkowymi7.

<table><tbody><tr><td>PS PEG2000 Fmoc Rink-amid Resin</td><td>Varian, Inc.</td><td>PL3867-3764</td><td>AmphiSpheres 40 RAM</td></tr><tr><td>Pyr(Boc)</td><td>Bachem</td><td>A-3850</td><td></td></tr><tr><td>Arg(Pbf)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1010</td><td></td></tr><tr><td>Asn(Trt)</td><td>Bachem</td><td>B-1785</td><td></td></tr><tr><td>Asp(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSP1020</td><td></td></tr><tr><td>Hyp(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FAA1627</td><td></td></tr><tr><td>Lys(Boc)</td><td>Bachem</td><td>B-1080</td><td></td></tr><tr><td>Ser(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1190</td><td></td></tr><tr><td>Gln(Trt)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1043</td><td></td></tr><tr><td>Glu(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSP1045</td><td></td></tr><tr><td>Trp(Boc)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSC1225</td><td></td></tr><tr><td>Tyr(tBu)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47623</td><td></td></tr><tr><td>Thr(tBu)</td><td>Iris Biotech</td><td>FSP1210</td><td></td></tr><tr><td>His(Trt)</td> <td>Iris Biotech</td><td>FDP1200</td><td></td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloironioheksofluorfosforan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8510060</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td>Łatwopalny, toksyczny</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37</td><td>Racerotwórcza</td></tr><tr><td>piperydyna</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12442</td><td>łatwopalny, toksyczny,</td></tr><tr><td>N-metylo-morfolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>224286</td><td></td></tr><tr><td>Cys(Acm)</td><td>Iris Biotech</td><td>FAA1506</td><td></td></tr><tr><td>Cys(Trt)</td><td>Bachem</td><td>E-2495</td><td></td></tr><tr><td>Cys(tBu)</td><td>Bachem</td><td>B-1220</td><td></td></tr><tr><td>kwas trifluoruoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74564</td><td>Toksyczny,</td></tr><tr><td>fenol</td><td>Merck</td><td>1002060</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>tioanizol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>etanedithiol</td><td>Fluka Analytical</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>eter dietylowy</td><td>VWR</td><td>100,921</td><td>Palny</td></tr><tr><td>tert-butanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12338</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>Woda łatwopalna</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>W5</td><td></td></tr><tr><td>izopropanol</td><td>VWR</td><td>ACRO42383</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>AppliChem</td><td>A6579,1000</td><td></td></tr><tr><td>jodoacetamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>jod</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0385</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>110165</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>difenylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P35405</td><td></td></tr><tr><td>anisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>96109</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>trichlorometylosilian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M85301</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>bufor do rozcieńczania próbek</td><td>Laborservice Onken</td><td></td><td></td></tr><tr><td>diwodorofosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>106370</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan disodowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>795410</td><td></td></tr><tr><td>(2-karboksyetylo)chlorowodorek fosfiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>cytrynian sodu dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tris-octan</td><td>Carl Roth,&nbsp;</td><td>7125</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E26282&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>wzorzec kalibracji peptydów II</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>8222570</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa urządzenia</td><td>Firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syntezator peptydów w fazie stałej</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td> Liofilizator <td>EPS 221</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Martin Christ GmbH</td><td>&nbsp; Alpha 1-2 Ldplus</td><td></td></tr><tr><td>semipreparatywny system HPLC</td><td>Jasco</td><td>PV-987</td><td></td></tr><tr><td>Eurospher 100 C18 kolumna (RP, 5 i mikro; m wielkość cząstek, 100 i Aring; wielkość porów, 250 x 32 mm)</td><td>Knauer</td><td>25QE181E2J</td><td>oczyszczanie liniowej kolumny peptydowej</td></tr><tr><td>Vydac 218TP1022 (RP C18, 10 &micro; m wielkość cząstek, 300 i Aring; wielkość porów, 250 x 22 mm)</td><td>Hichrom-VWR</td><td>HICH218TP1022</td><td>oczyszczanie utlenionego peptydu</td></tr><tr><td>analitycznego HPLC&nbsp;</td><td>System Shimadzu</td><td>LC-20AD</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP54 kolumna (C18 RP, 5 & m wielkość cząstek, 300 i Aring; Wielkość porów, 250 x 4,6 mm)&nbsp;</td><td>Kolumna analityczna</td> <td>Hichrom-VWR</td><td>HICH218TP54</td></tr><tr><td>szlifowana stalowa tarcza (MTP 384)</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>NC0910436</td><td>przygotowanie MALDI&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr o stężeniu C18 (ZipTip)</td><td>Merck KGaA</td><td>ZTC18S096</td><td>preparat MALDI&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy MALDI</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>ultraflex III TOF/TOF</td><td></td></tr><tr><td>analizator aminokwasów</td><td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td><td>LC 3000 system</td><td></td></tr><tr><td>spektrometr NMR Bruker Avance III</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>Bruker Avance III 600 MHz</td><td></td></tr><tr><td>program komputerowy do wizualizacji molekularnej</td><td>YASARA Biosciences GmbH</td><td>Obliczenia struktury Yasara</td><td>NMR</td></tr><tr><td>program komputerowy do analizy danych MALDI&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics GmbH</td><td>flexAnalysis, BioTools</td><td>MS/MS</td></tr><tr><td>analogowy mieszalnik wirowy</td> do fragmentacji <td>VWR</td><td>VM 3000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hettich</td><td>EBA 20</td><td></td></tr><tr><td>Rotacyjny koncentrator próżni</td><td>Christ</td><td>2-18 Waga analityczna Cdplus</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A& D Instrumenty</td><td>GR-202-EC</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza i oznaczanie struktury izomerów piiia μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptydy z dużą ilością cystein są zazwyczaj pod wpływem ich dwusiarczkowej struktury pod wpływem ich dwusiarczkowej struktury. Dlatego bardzo ważne jest, aby uniknąć niepożądanego tworzenia się wiązań dwusiarczkowych podczas syntezy peptydów, ponieważ może to skutkować zupełnie inną strukturą peptydów, a co za tym idzie zmienioną bioaktywnością. Jednak prawidłowe tworzenie wielu wiązań dwusiarczkowych w peptydzie jest trudne do uzyskania przy użyciu standardowych metod samofałdowania, takich jak konwencjonalne protokoły utleniania buforowego, ponieważ może powstać kilka połączeń dwusiarczkowych. Protokół ten stanowi zaawansowaną strategię wymaganą do ukierunkowanej syntezy wielu peptydów z mostkami dwusiarczkowymi, których nie można zsyntetyzować poprzez utlenianie buforowe w wysokiej jakości i ilości. W badaniu wykazano zastosowanie odrębnej strategii grupy ochronnej do syntezy wszystkich możliwych izomerów peptydowych wiązanych 3-dwusiarczkiem μ-konotoksyny PIIIA w ukierunkowany sposób. Peptydy są przygotowywane w procesie syntezy peptydów w fazie stałej na bazie Fmoc przy użyciu strategii grupy ochronnej do tworzenia określonych wiązań dwusiarczkowych. Odpowiednie pary cystein są chronione grupami ochronnymi trytylu (Trt), acetamidometylu (Acm) i tert-butylu (tBu), aby upewnić się, że podczas każdego etapu utleniania tylko wymagane cysteiny są odchronione i połączone. Oprócz ukierunkowanej syntezy stosuje się kombinację kilku metod analitycznych w celu wyjaśnienia prawidłowego fałdowania i generowania pożądanych struktur peptydowych. Porównanie różnych izomerów wiązań 3-dwusiarczkowych wskazuje na znaczenie dokładnego określenia i znajomości połączeń dwusiarczkowych dla obliczenia trójwymiarowej struktury i interpretacji aktywności biologicznej izomerów peptydowych. Charakterystyka analityczna obejmuje dokładne wyjaśnienie wiązań dwusiarczkowych za pomocą analizy tandemowej spektrometrii mas (MS/MS), która jest wykonywana z częściowo zredukowanymi i alkilowanymi pochodnymi nienaruszonego izomeru peptydowego wytwarzanego przez dostosowany protokół. Ponadto struktury peptydowe są oznaczane za pomocą eksperymentów 2D magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz wiedzy uzyskanej z analizy MS/MS.

Zsyntetyzowano i szczegółowo scharakteryzowano 15 różnych izomerów µ-konotoksyny PIIIA z mostkami dwusiarczkowymi (Rysunek 1). Wiązania dwusiarczkowe zidentyfikowano poprzez częściową redukcję i następującą po niej analizę MS/MS (Rysunek 2). W celu ujawnienia poszczególnych struktur peptydowych przeprowadzono analizę NMR różnych izomerów (Rysunek 3). Warto zauważyć, że do jednoznacznej identyfikacji ...

Peptydy bogate w cysteinę składają się w odrębne trójwymiarowe struktury w zależności od ich połączeń dwusiarczkowych. Ukierunkowana synteza pojedynczych izomerów dwusiarczkowych jest wymagana, gdy utlenianie buforu nie prowadzi do pożądanego połączenia dwusiarczkowego. Protokół dotyczy selektywnej syntezy peptydów z wiązaniami 3-dwusiarczkowymi oraz ich analizy strukturalnej z wykorzystaniem badań NMR i MS/MS.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie syntezy peptydów, takie jak synteza peptydów bogatych w dwusiarczki i określenie odpowiadającego im wzoru mostka dwusiarczkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na selektywną syntezę różnych izomerów peptydów dwusiarczkowych i ich późniejszą charakterystykę chemiczną i strukturalną. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ każdy peptyd bogaty w dwusiarczki zachowuje się inaczej.Synteza i analiza mogą wymagać częściowej optymalizacji dla poszczególnych peptydów lub białek. Przenieś odczynniki wymienione w protokole tekstowym do odpowiednich naczyń i umieść je w odpowiednich rakietach syntezatora peptydów w fazie stałej. Następnie dodaj 100 miligramów suchej żywicy do kolumn reakcyjnych i umieść je w rakietce syntezatora.Rozpocznij syntezę peptydów w fazie stałej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu syntezy żywicę liofilizowano przez noc. Teraz odetnij peptyd od żywicy i wykonaj głęboką ochronę łańcuchów bocznych.W tym celu połącz wysuszoną żywicę w 12-mililitrowej tubie i schłodzić ją do zera stopni Celsjusza na lodzie. Najpierw do

synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biofizyczne i biochemiczne badania interakcji między domenami białek osadzonych w błonie napotykają wiele wyzwań technicznych, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniego materiału do badań. W artykule opisano protokół wytwarzania i oczyszczania stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych, które nadają się do analizy strukturalnej za pomocą roztworu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i innych zastosowań analitycznych.

Wytwarzanie stabilizowanych dwusiarczkiem transbłonowych kompleksów peptydowych do badań strukturalnych

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Ten protokół szczegółowo opisuje ważne kroki wymagane do biokoniugacji białka zawierającego cysteinę z maleimidem, w tym oczyszczanie odczynników, warunki reakcji, oczyszczanie biokoniugatu i charakterystykę biokoniugatu.

Synteza biokoniugatów białkowych za pomocą chemii cysteiny-maleimidu

Przedstawiamy protokół budowy spiralnych peptydów tioeterowych/siarczków winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiol-en/tiol-yne.

Konstruowanie peptydów helisowych na uwięzi tioeteru/siarczku winylu za pomocą fotoindukowanej hydrotiolacji tiolu-enu / yny

Protokół syntezy peptydu modyfikowanego 1,2-ditiolanem i charakterystyka struktur supramolekularnych wynikających z samoorganizacji peptydu.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się peptydów modyfikowanych 1,2-ditiolanem

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten protokół przedstawia syntezę cyklicznych peptydów poprzez bissalkilację między cysteiną a metioniną oraz łatwą reakcję tiol-yne wywołaną przez centrum propargylu sulfonium.

Konstruowanie cyklicznych peptydów przy użyciu centrum sulfonowego na uwięzi

Poznaj selektywną syntezę peptydów bogatych w mostki dwusiarczkowe i ich analizę strukturalną przy użyciu spektroskopii NMR oraz MS/MS. Ta metoda umożliwia badanie wzorców mostków dwusiarczkowych.

Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Przeglądaj więcej filmów