Synteza i oznaczanie struktury izomerów PIIIA μ-konotoksyny o różnych połączeniach dwusiarczkowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie syntezy peptydów, takie jak synteza peptydów bogatych w dwusiarczki i określenie odpowiadającego im wzoru mostka dwusiarczkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na selektywną syntezę różnych izomerów peptydów dwusiarczkowych i ich późniejszą charakterystykę chemiczną i strukturalną. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ każdy peptyd bogaty w dwusiarczki zachowuje się inaczej.

Synteza i analiza mogą wymagać częściowej optymalizacji dla poszczególnych peptydów lub białek. Przenieś odczynniki wymienione w protokole tekstowym do odpowiednich naczyń i umieść je w odpowiednich rakietach syntezatora peptydów w fazie stałej. Następnie dodaj 100 miligramów suchej żywicy do kolumn reakcyjnych i umieść je w rakietce syntezatora.

Rozpocznij syntezę peptydów w fazie stałej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zakończeniu syntezy żywicę liofilizowano przez noc. Teraz odetnij peptyd od żywicy i wykonaj głęboką ochronę łańcuchów bocznych.

W tym celu połącz wysuszoną żywicę w 12-mililitrowej tubie i schłodzić ją do zera stopni Celsjusza na lodzie. Najpierw dodaj 150 mikrolitrów mieszanki zmiatającej, a następnie dodaj jeden mililitr 95% kwasu trifluorooctowego na 100 miligramów żywicy. Pozostaw mieszaninę delikatnie wstrząsającą przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Teraz przefiltruj mieszaninę przez frytę szklaną. Zebrać filtrat do probówek, indywidualnie wypełnionych lodowatym eterem dietylowym w ilości jednego mililitra mieszaniny rozszczepiającej na osiem do 10 mililitrów eteru dietylowego. Peptyd wytrąca się w postaci białego ciała stałego.

Po wypłukaniu i odwirowaniu probówek zgodnie z opisem w protokole tekstowym, peptydy należy wysuszyć na zimno. Aby oczyścić prekursor liniowy za pomocą chromatografii półpreparatywnej, dodaj około 70 miligramów surowego peptydu do 15-mililitrowej probówki. Następnie rozpuść surowy peptyd w 0,1% TFA i acetonitryl jeden do jednego w wodzie.

Oddzielić mieszaninę peptydów, stosując gradient od zera do 50% eluentu B przez 120 minut przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę. Zbierz frakcje w poszczególnych probówkach tak, jak się pojawiają i przygotuj wybrane frakcje do spektrometrii mas i analizy HPLC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Frakcje liofilizuj i połącz frakcje rówieśnicze.

Rozpocznij selektywne tworzenie wiązań dwusiarczkowych, wykonując pierwsze utlenianie. W tym celu należy rozpuścić 15 miligramów liofilizowanego peptydu liniowego w 105 mililitrach mieszaniny wody izopropanolowej. Pozostaw mieszaninę mieszającą na powietrzu w podstawowych warunkach na 12 do 48 godzin.

Procedura stopniowego utleniania jest bardzo ważna. Kontrole reakcji są podejmowane we wszystkich trzech etapach utleniania, aby zapewnić indywidualne tworzenie bogate w dwusiarczki. Trzecie utlenianie jest najważniejsze, ponieważ mieszanie dwusiarczkowe może nastąpić po przekroczeniu optymalnego czasu reakcji.

Teraz wykonaj drugie utlenianie. Rozpuść 15 miligramów liofilizowanego peptydu w 105 mililitrach wody izopropanolowej, jednej molowej mieszaninie kwasu solnego. Dodać do roztworu 158 mikrolitrów 0,1 molowego roztworu jodu w metanolu.

Mieszaj reakcję w temperaturze pokojowej, aż do zakończenia utleniania. Następnie zatrzymaj reakcję, dodając 79 mikrolitrów jednego molowego kwasu askorbinowego do wody. Na koniec wykonaj trzecie utlenianie.

Rozpuść 15 miligramów liofilizowanego peptydu w 5,5 mililitrze TFA zawierającym mieszaninę zmiataczy. Wytrącić peptyd w probówkach zawierających zimny eter dietylowy w jednym mililitrze roztworu reakcyjnego na osiem do dziesięciu mililitrów eteru dietylowego. Przeprowadzić oczyszczanie peptydowe przy 15 miligramach liofilizowanego produktu surowego do 15-mililitrowej probówki.

Rozpuścić surowy produkt w objętości pętli próbki HPLC przy użyciu mieszaniny 0,1% TFA i acetonitrylu w stosunku jeden do jednego z wodą. Po wirowaniu aż do całkowitego rozpuszczenia, odwirować roztwór od jednej minuty w temperaturze 3400 razy G. Pobrać mieszaninę o objętości 3,6 mililitra do strzykawki o pojemności 5 mililitrów i wstrzyknąć próbkę bez pęcherzyków powietrza do pętli iniekcyjnej. Rozpocząć wstrzykiwanie do systemu HPLC.

Oczyść mieszaninę peptydów przy użyciu gradientu od zera do 50% eluentu B przez 120 minut przy natężeniu przepływu 10 mililitrów na minutę. Zbierz frakcje w poszczególnych probówkach, gdy się pojawią. Po zakończeniu przebiegu należy przygotować wybrane frakcje do analizy MS i HPLC zgodnie z opisem w tekście.

Wszystkie frakcje liofilizuj i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić analityczną HPLC, przenieś próbki frakcji peptydowych lub kontroli reakcji do fiolki HPLC i rozpuść ją w mieszaninie 0,1% TFA w acetonitrylu jeden do jednego do jednego do wody. Umieścić fiolkę HPLC w automatycznym próbniku analitycznego zestawu HPLC z odwróconymi fazami, aby wstrzyknąć 250 mikrolitrów każdej próbki.

Użyj gradientowego systemu elucji 0,1% TFA w wodzie jako eluentu A w 0,1% TFA w acetonitrylu jako eluentu B. Przeanalizuj peptyd przy użyciu gradientu od 10% do 40% eluentu B przez 30 minut przy natężeniu przepływu 1,0 mililitra na minutę. Aby przeprowadzić analizę aminokwasów, przenieś 100 mikrogramów czystego peptydu do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki i rozpuść proszek w 200 mikrolitrach sześciomolowego HCL. Po przelaniu roztworu do szklanej ampułki zamknij ampułkę, podgrzewając szyjkę płomieniem palnika Bunsena.

Następnie umieść szklaną rurkę trzymającą ampułkę w bloku grzewczym na 24 godziny w temperaturze 110 stopni Celsjusza w celu hydrolizy. Po 24 godzinach otwórz ampułkę i przenieś roztwór do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Odwirowywać roztwór przez sześć godzin w temperaturze sześćdziesięciu stopni Celsjusza i 210 razy G w rotacyjnym koncentratorze próżniowym.

Następnie rozpuścić zhydrolizowany produkt w 192 mikrolitrach buforu rozcieńczającego do pobierania próbek i przenieść roztwór do mikrofiltra odśrodkowego. Po odwirowaniu próbki przez jedną minutę w temperaturze 2300 razy G, przenieść 100 mikrolitrów filtratu do probówki z próbką do analizy aminokwasów. Umieść probówkę w analizatorze aminokwasów i rozpocznij analizę.

Podczas tego ostatniego protokołu redukcji ważne jest, aby przeprowadzić kilka kontroli reakcji w celu uzyskania dwukrotnie lub czterokrotnie metylowanych gatunków kappa mido, które są niezbędne do późniejszej analizy dwusiarczku za pomocą spektrometrii mas. Najpierw rozpuść 600 mikrogramów czystego peptydu w 1,2 mililitra 0,05 molowego buforu cytrynianowego zawierającego TCEP. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej, pobierając kilka 100 mikrolitrowych próbek kontrolnych reakcji w zakresie od zera do 30 minut.

Wymieszać próbki w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki z 300 mikrolitrami buforu alkilacyjnego, aby zatrzymać reakcję i przeprowadzić metylację karbonylową wolnych grup tiolowych. Zatrzymaj reakcję po pięciu minutach, dodając 100 mikrolitrów 10% TFA i wody, a następnie przechowuj próbki na suchym lodzie. Teraz wykonaj HPLC na próbkach zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przenieś niewielką ilość każdej zebranej frakcji do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej w celu analizy MS/MS utlenionych form. Rozpuść pozostały peptyd w 0,1% TFA w wodzie i dodaj odpowiednią objętość do 100-milimolowego roztworu TCEP, aby uzyskać końcowe stężenie TCEP 10 milimolowe. W tym momencie selektywne alkilowanie cysteiny można sprawdzić za pomocą sekwencjonowania peptydów.

Dzięki dwóm peptydom w środku możliwe jest określenie wzoru mostka dwusiarczkowego. Przeprowadza się analizę NMR różnych izomerów w celu ujawnienia poszczególnych struktur peptydowych. Pokazano 20 struktur o najniższych energiach, a także połączenia dwusiarczkowe różnych izomerów.

Warto zauważyć, że połączenie fragmentacji MS/MS HPLC w odwróconej fazie i analizy NMR jest wymagane do jednoznacznej identyfikacji łączności dwusiarczkowej. Porównanie wartości odchylenia średniej kwadratowej pierwiastka wyjaśniło, że sztywny peptyd w większości prowadzi do lepiej rozdzielczej struktury NMR. Ten film powinien dać ci przykład, jak selektywnie syntetyzować peptydy o pożądanym wzorze wiązań dwusiarczkowych.

Pokazuje również możliwość sprawdzenia prawidłowego połączenia dwusiarczkowego za pomocą tenderowej spektrometrii mas oraz uzyskania trójwymiarowej struktury za pomocą spektroskopii NMR. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się syntezą peptydów do zbadania znaczenia wzorów wiązań dwusiarczkowych dla trójwymiarowej struktury, a w konsekwencji dla aktywności takich izomerów peptydowych. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak ASAS aktywności, w celu uzyskania wglądu w relacje między strukturą a aktywnością różnych izomerów peptydowych w określonym celu biologicznym.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w syntezę i analizę konotoksyn, można ją również zastosować do innych peptydów i białek mostkowych dwusiarczku, takich jak fenzeny, bogate w dwusiarczki toksyny zwierzęce i inne liczne cząsteczki zawierające cysteinę.