Name: Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj analizę kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy BN-PAGE i 2D-SDS-PAGE. Ta metoda pozwala badać interakcje funkcjonalne między natywnymi kompleksami białkowymi u roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane finansowo przez Akademię Fińską (projekty nr 307335 i 303757) oraz umowę grantową Marie Skłodowska-Curie (675006) na wykorzystanie energii słonecznej na biomasę (SE2B). Protokół jest oparty na reference3.

1. Przygotowanie BN Gel1,2,3
<ol>
	<li>Zestaw kółek żelowych z płytkami o wymiarach 8 cm x 10 cm (prostokątne szkło i płytka z tlenku glinu) należy ustawić zgodnie z instrukcją producenta za pomocą dystansów 0,75 mm.</li>
	<li>Umieść mieszalnik gradientowy na płytce mieszającej i połącz go z pompą perystaltyczną za pomocą rurki. Przymocuj igłę strzykawki do drugiego końca rurki i umieść igłę między szklaną a aluminiową płytką. Umieścić mieszadło magnetyczne w "ciężkiej" komorze (H).</li>
	<li>Przygotować 3,5% (v/v) i 12,5% (v/v) roztwory akrylamidu (AA) w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml do gradientu żelu rozdzielającego (patrz przepisy w tabeli 1). Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji, podczas przygotowywania roztworów należy trzymać probówki wirówkowe na lodzie. 
	UWAGA: Akrylamid jest neurotoksyczny i rakotwórczy, należy nosić odzież ochronną i rękawice.</li>
	<li>Dodaj 5% APS i TEMED bezpośrednio przed pipetowaniem roztworów do mieszalnika gradientowego. Odpipetować 12,5% roztwór do komory H.
	<ol>
		<li>Usunąć pęcherzyki powietrza z kanału łączącego komorę "lekką" (L) i H, otwierając zawór łączący dwie komory, umożliwiając przedostanie się roztworu do komory L. Zamknij zawór i odpipetuj ślady roztworu z powrotem do komory H.</li>
		<li>Na koniec odpipetuj 3,5% roztwór do komory L.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włączyć mieszadło magnetyczne (prędkość mieszania nie jest krytyczna, ale powinna zapewnić prawidłowe wymieszanie ciężkich i lekkich roztworów), otworzyć zawory i włączyć pompę perystaltyczną. Pozwól, aby roztwory żelu przepływały między szklaną a aluminiową płytą, natężenie przepływu powinno wynosić około 0,5 ml / min. Igła musi cały czas znajdować się nad płynem, można ją przymocować do górnej części szklanej płytki za pomocą taśmy.</li>
	<li>Gdy komory H i L zostaną opróżnione, napełnij je ultraczystą wodą i pozwól, aby woda delikatnie pokryła powierzchnię żelu. Polimeryzacja żelu trwa około 1-2 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 3% roztwór akrylamidu (patrz przepis w Tabeli 1) dla żelu do układania w stosie w temperaturze pokojowej. Odpipetować żel do układania na wierzchu spolimeryzowanego żelu separacyjnego (przed odlaniem żelu do układania należy usunąć wodę pokrywającą powierzchnię żelu) i umieścić grzebień żelowy do próbki między szklaną a aluminiową płytką, unikając pęcherzyków powietrza.
	<ol>
		<li>Pozostawić do polimeryzacji na 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyjmij grzebień pod ultraczystą wodą. Przechowywać żel w temperaturze +4 °C. 
		Punkt pauzy. Żel można przechowywać w temperaturze +4 °C przez kilka dni. Żel należy przechowywać w wilgotnych warunkach, aby uniknąć wysuszenia studzienek i powierzchni żelu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Solubilizacja tylakoidów1,2,3
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane przy bardzo słabym oświetleniu. Próbki i należy przechowywać na lodzie.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć wyizolowane tylakoidy lodowatym buforem 25BTH20G do końcowego stężenia chlorofilu 1 mg / ml. Do analizy 2D-BN-SDS-PAGE odpowiednie jest około 4-8 μg chlorofilu/próbkę. 
	UWAGA: Tyrakoidy użyte w eksperymentach muszą być wyizolowane ze świeżych liści (protokół izolacji tylakoidów, patrz3)</li>
	<li>Dodać równą objętość buforu detergentu, tj. 2% β-DM (w/v) lub 2% digitoniny (w/v). Delikatnie wymieszać detergent z próbką tylakoidów za pomocą końcówki pipety i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Końcowe stężenie detergentu wynosi 1%, a tylakoidów 0,5 mg Chl/ml.
	<ol>
		<li>Rozpuszczaj tylakoidy przez 2 minuty na lodzie (β-DM) lub 10 minut w temperaturze suchej masy, z ciągłym delikatnym mieszaniem na kołysce/wytrząsarce (digitonina). 
		UWAGA: Digitonina i β-DM są powszechnie stosowane do solubilizacji kompleksów białkowych tylakoidów. Jeśli stosowane są inne detergenty niejonowe, należy najpierw zoptymalizować stężenie detergentu i czas solubilizacji. Zwykle stężenie detergentu waha się od 0,5% -5% (v/v). 
		UWAGA: Digitonina jest toksyczna, należy nosić odzież ochronną i rękawice</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g przez 20 minut, w temperaturze +4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 1/10 (v/v) buforu CBB do próbki. 
	UWAGA: Podczas badania ogólnego składu kompleksów białkowych błony tylakoidowej zaleca się określenie wydajności i reprezentowanej domeny tylakoidów frakcji rozpuszczonej. Aby określić wydajność rozpuszczonego materiału, należy pobrać 5 μl supernatantu do nowej probówki (przed dodaniem CBB) i zmierzyć zawartość Chl oraz stosunek Chl a/b5.</li>
</ol>
3. BN-PAGE1,2,3
<ol>
	<li>Ustawić żel w pionowym systemie elektroforezy (np. Hoefer SE 250). Napełnić górną komorę buforową niebieskim buforem katodowym (patrz tabela 1) i wlać bufor anodowy do dolnej komory buforowej.</li>
	<li>Załaduj próbkę tylakoidów (np. 5 μg chlorofilu) do studzienek.</li>
	<li>Rozpocznij elektroforezę i stopniowo zwiększaj napięcie: 75 V przez 30 min, 100 V przez 30 min, 125 V przez 30 min, 150 V przez 1 h i 175 V, aż do całkowitego rozdzielenia kompleksów. Uruchom żel w temperaturze +4°C, korzystając z chłodni lub regulując temperaturę żelu za pomocą systemu chłodzenia. 
	UWAGA: Zmień niebieski bufor katodowy na przezroczysty bufor katody, gdy przód próbki przesunął się o około jedną trzecią żelu.</li>
	<li>Po przebiegu elektroforetycznym zeskanuj żel za pomocą fotoskanera w celu archiwizacji obrazu.</li>
</ol>
4. STRONA 2D-SDS
<ol>
	<li>Zmontuj pionowy system elektroforezy (rozmiar żelu 16 cm x 20 cm). Użyj podkładek dystansowych 1 mm.</li>
	<li>Przygotować standardowy żel SDS (12% akrylamid, 6 M mocznik, patrz przepis w Tabeli 2) za pomocą grzebienia 2D (jedna duża studzienka na pasek i jedna standardowa studzienka na marker masy cząsteczkowej).</li>
	<li>Wytnij pas z żelu BN i umieść go w probówce (5 ml). Dodać 2 ml buforu Laemmli (zawierającego 5% β-merkaptoetanolu) i inkubować pas przez 45 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść pas ruchu, za pomocą np. przekładki, na wierzchu żelu, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Odmierzyć pipetę 5 μl markera masy cząsteczkowej na wąski kawałek bibuły filtracyjnej i umieścić bibułę w studzience wzorcowej.</li>
	<li>Aby uszczelnić pasek żelu BN i papier znacznikowy, wlej 0,5% agarozy (w buforze bieżącym) na wierzch paska żelu i pozostaw do zestalenia.</li>
	<li>Wykonaj elektroforezę zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przebiegu elektroforetycznym zwizualizuj białka za pomocą np. barwienia Sypro Ruby lub barwienia srebrem zgodnie z6.</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Maszyneria konwersji energii fotosyntetycznej składa się z dużych wielopodjednostkowych kompleksów białkowych, które są osadzone w błonie tylakoidów. Protokół ten opisuje podstawową metodę analizy kompleksów białkowych roślinnych tylakoidów z Arabidopsis thaliana z BN-PAGE w połączeniu z 2D-SDS-PAGE. Protokół nadaje się również do analizy kompleksów białkowych tylakoidów z tylakoidów tytoniu i szpinaku, ale może wymagać niewielkich korekt.
Do solubilizacji kompleksów białek błonowych ...

Duże wielopodjednostkowe kompleksy białkowe fotosystem PSI i PSII, Cyt b6f i ATPaza koordynują produkcję NADPH i ATP w reakcjach światła fotosyntetycznego. W wyższych chloroplastach roślinnych kompleksy znajdują się w błonie tylakoidowej, która jest strukturalnie niejednorodną strukturą błonową, składającą się z przytłumionych tylakoidów grana i nieprzytłoczonych zrębów. Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) jest szeroko stosowaną metodą w analizie dużych wielopodjednostkowych kompleksów białkowych w ich natywnej i biologicznie aktywnej formie. Metoda została opracowana do preparacji mitochondrialnych kompleksów białkowych błony1, ale później została dostosowana do oddzielania kompleksów białkowych od sieci błony tylakoidowej3. Metoda jest odpowiednia (i) do oczyszczania poszczególnych kompleksów białkowych tylakoidów do analizy strukturalnej, (ii) do określania natywnych interakcji między kompleksami białkowymi oraz (iii) do analizy ogólnej organizacji kompleksów białkowych pod wpływem zmieniających się sygnałów środowiskowych.
Przed separacją, kompleksy białkowe są izolowane z błony za pomocą starannie dobranych detergentów niejonowych, które są na ogół łagodne i zachowują natywną strukturę kompleksów białkowych. Detergenty zawierają miejsca hydrofobowe i hydrofilowe i tworzą stabilne micele powyżej pewnego stężenia, zwanego krytycznym stężeniem micelarnym (CMC). Zwiększenie stężenia detergentu powyżej CMC powoduje zakłócenie oddziaływań lipidowo-lipidowych oraz solubilizację kompleksów białkowych. Wybór detergentu zależy od stabilności interesującego kompleksu białkowego oraz od zdolności solubilizacji detergentu. Rutynowo stosowanymi detergentami są α/β-dodecyl-maltozyd i digitonina. Po rozpuszczeniu kompleksów białkowych w ich stanie naturalnym, nierozpuszczalny materiał jest usuwany przez odwirowanie. U roślin wyższych błona tylakoidowa ma wysoce heterogeniczną strukturę, a niektóre detergenty (np. digitonina) selektywnie rozpuszczają tylko określoną frakcję błony3. Dlatego, aby scharakteryzować organizację kompleksu białkowego lub interakcje między kompleksami białkowymi, ważne jest, aby zawsze określać zdolność rozpuszczania wybranego detergentu poprzez określenie zawartości chlorofilu i stosunku a/b chlorofilu w supernatancie w celu oceny wydajności i reprezentowanej (sub)domeny tylakoidu, odpowiednio, rozpuszczonej frakcji. Stosunek chlorofilu a/b w nienaruszonych tylakoidach roślin aklimatyzowanych do wzrostu wynosi zwykle około 3, podczas gdy wartość chl a/b frakcji tylakoidów wzbogaconych w tylakoidy grana lub zrębowe spada odpowiednio poniżej (~2,5) lub przekracza (~4,5) wartość całkowitych tylakoidów.
Aby dostarczyć ujemny ładunek do kompleksów białkowych, do rozpuszczonej próbki dodaje się barwnik Coomassie brilliant blue (CBB). Ze względu na przesunięcie ładunku kompleksy białkowe migrują w kierunku anody i są rozdzielane na gradiencie akryloamidu (AA) zgodnie z ich masą cząsteczkową i kształtem. Efektywną separację o wysokiej rozdzielczości uzyskuje się dzięki zastosowaniu liniowego gradientu stężenia akrylamidu. Podczas elektroforezy kompleksy białkowe migrują w kierunku anody, aż osiągną zależny od wielkości limit wielkości porów. Wielkość porów żelu poliakryloamidowego zależy od (i) całkowitego stężenia akrylamidu/bis-akrylamidu (T) oraz (ii) stężenia monomeru bis-akrylamidu sieciującego (C) w stosunku do całkowitych monomerów4. Po rozdzieleniu za pomocą BN-PAGE, kompleksy białkowe mogą być dalej dzielone na ich indywidualne podjednostki białkowe za pomocą drugiego wymiaru (2D)-SDS-PAGE. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół analizy kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Kwas 6-aminokapronowy (ACA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid (AA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>Uwaga: Neurotoksyczny!</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&beta;-D-maltozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu (NaF)</td><td>J.T. Baker</td><td>3688</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td>Uwaga: Toksyczny!</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS (Nadsiarczan amonu)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (Tetrametyloetylenodiamina)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-metyleno)-bis-akryloamid</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie barwiony marker białkowy, szeroki zakres (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>Podwójne kółko żelowe z płytkami 10 x 8 cm</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do gradientów SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podkładki dystansowe T 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>Grzebień żelowy do próbek, 0,75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Potężny mały pionowy system elektroforetyczny SE250</td> Pompa IPC <td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz, wirówka PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Rocker-Shaker</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><<tr><td>br/> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Fotosyntetyczny łańcuch transferu elektronów (ETC) przekształca energię słoneczną w energię chemiczną w postaci NADPH i ATP. Cztery duże kompleksy białkowe osadzone w błonie tylakoidów zbierają energię słoneczną, aby kierować elektrony z wody do NADP+ za pośrednictwem dwóch fotosystemów i wykorzystują utworzony gradient protonów do produkcji ATP. Fotosystem PSII, PSI, cytochrom b6f (Cyt b6f) i ATPaza są kompleksami wielobiałkowymi o odrębnej orientacji i dynamice w błonie tylakoidów. Cenne informacje na temat składu i interakcji kompleksów białkowych w błonie tylakoidów można uzyskać poprzez rozpuszczanie kompleksów z integralności błony za pomocą łagodnych detergentów, a następnie natywne elektroforetyczne rozdzielanie kompleksów w żelu. Elektroforeza w postaci niebieskiego natywnego żelu poliakrylamidowego (BN-PAGE) jest metodą analityczną stosowaną do rozdzielania kompleksów białkowych w ich postaci natywnej i funkcjonalnej. Metoda ta może być stosowana do oczyszczania kompleksów białkowych w celu bardziej szczegółowej analizy strukturalnej, ale zapewnia również narzędzie do analizy dynamicznych interakcji między kompleksami białkowymi. Metoda została opracowana do analizy mitochondrialnych kompleksów białek oddechowych, ale od tego czasu została zoptymalizowana i ulepszona pod kątem rozwarstwiania kompleksów białkowych tylakoidów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy, aktualny protokół analizy labilnych kompleksów białek fotosyntetycznych i ich interakcji z Arabidopsis thaliana.

Reprezentatywny system 2D-BN/SDS-PAGE w Rysunek 1 demonstruje rozdział kompleksów białkowych tylakoidów solubilizowanych za pomocą digitoninny oraz β-DM, a także szczegółowy skład ich podjednostek białkowych. Wzorzec kompleksów białkowych tylakoidów solubilizowanych digitoniną (poziomy żel na górze) Rysunek 1A) zawiera megakompleks PSII-LHCII-PSI, dwa duże superkompleksy PSII-LHCII (sc), superkompleks PSI-LHCII, monomer PSI (m), ...

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące składu i dynamicznej organizacji fotosyntetycznych kompleksów białkowych w błonie tylakoidów roślinnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę oddziaływań funkcjonalnych między natywnymi kompleksami białkowymi i wyjaśnia plastyczność organizacji kompleksu białkowego w różnych warunkach środowiskowych. Ustaw płytki żelowe o wymiarach osiem centymetrów na 10 centymetrów zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą dystansów 0,75 milimetra.Umieść mieszalnik gradientowy na płytce mieszającej i połącz go z pompą perystaltyczną za pomocą rurek. Przymocuj igłę strzykawki do drugiego końca rurki i umieść igłę między szklaną a aluminiową płytką. Umieść mieszadło magnetyczne w ciężkiej komorze.Przygotować 3,5% i 12,5% roztwory akrylamidu w 15-mililitrowych stożkowych probówkach wirówkowych, jak opisano w protokole tekstowym, do wykorzystania do gradientu żelu separacyjnego. Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji, podczas przygotowywania roztworów należy trzymać probówki wirówkowe na lodzie. Dodaj 5%APS i TEMED tuż przed pipetowaniem roztworów do mieszalnika gradientowego.Odpipetować 12,5% roztwory do ciężkiej komory. Usunąć pęcherzyki powietrza z kanału łączącego komorę lekką i ciężką, otwierając zawór łączący dwie komory umożliwiający przedostanie się roztworu do komory świetlnej. Zamknąć zawór i odpipetować ślady roztworu z powrotem do ciężkiej komory.Na koniec odpipetować 3,5% roztwór do komory świetlnej. Włączyć mieszadło magnetyczne. Otwórz zawory i włącz pompę perystaltyczną.Pozwól, aby roztwory żelu przepływały między szklaną i aluminiową płytką z prędkością przepływu około 0,5 mililitra na minutę. Igła musi przez cały czas znajdować się nad płynem. Gdy komory ciężkie i lekkie zostaną opróżnione, napełnij je ultraczystą wodą.I pozwól, aby woda delikatnie pokryła powierzchnię żelu. Polimeryzacja żelu trwa około jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Przygotować 3% roztwór akrylamidu do żelu do układania w stos w temperaturze pokojowej.Odpipetować żel do układania w stos na wierzchu spolimeryzowanego żelu separacyjnego i umieścić grzebień żelowy do próbki między szkłem a aluminiową płytką, unikając pęcherzyków powietrza. Po pozostawieniu żelu do polimeryzacji przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wyjmij grzebień pod ultraczystą wodą. W tym momencie żel może być przechowywany w temperaturze dodatnich czterech stopni Celsjusza w wilgotnych warunkach przez kilka dni.Rozcieńczyć wyizolowane tylakoidy lodowatym buforem 25BTH20G do końcowego stężenia chlorofilu wynoszącego jeden miligram na mililitr. Przygotuj dwie probówki dla każdej próbki tylakoidu, aby przeprowadzić zarówno solubilizację beta-DM, jak i digitoniny. Teraz dodaj równą objętość bufora detergentu.Delikatnie wymieszać detergent i próbkę tylakoidów za pomocą pipety i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Rozpuszczaj tylakoidy przez dwie minuty na lodzie w celu rozpuszczania beta-DM. Lub 10 minut w temperaturze pokojowej z ciągłym delikatnym mieszaniem na bujaku lub shakerze w celu rozpuszczania digitoniny.Po inkubacji usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 18 000 g przez 20 minut w temperaturze dodatniej do czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać 1/10 objętości buforu Coomassie w kolorze brylantowym do próbki. Ustaw żel w pionowym systemie elektroforezy.Napełnij górną komorę buforową niebieskim buforem katodowym i wlej bufor anodowy do dolnej komory buforowej. Załaduj próbki tylakoidów do studzienek. Rozpocznij elektroforezę i stopniowo zwiększaj napięcie zgodnie z podaniem w protokole tekstowym.Uruchom żel w dodatnich czterech stopniach Celsjusza, korzystając z chłodni lub regulując temperaturę żelu za pomocą systemu chłodzenia. Zmień bufor niebieskiej katody na przezroczysty bufor katody, gdy przód próbki przesunął się o około 1/3 żelu. Po przebiegu elektroforetycznym zeskanuj żel za pomocą skanera fotograficznego w celu archiwizacji obrazu.Aby wykonać 2-SDS PAGE, zmontuj pionowy system elektroforezy za pomocą jednomilimetrowych przekładek. Przygotuj standardowy żel SDS za pomocą grzebienia 2D zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odetnij pas z żelu BN i umieść go w pięciomililitrowej tubce.Następnie dodaj dwa mililitry buforu Laemmli i inkubuj pasek przez 45 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Umieść pas za pomocą przekładki na wierzchu żelu, unikając pęcherzyków powietrza. Odpipetować pięć mikrolitrów markera masy cząsteczkowej na wąskim kawałku bibuły filtracyjnej i umieścić bibułę w standardowej studzience.Aby uszczelnić pasek żelu BN i papier markerowy, wlej 0,5% agarozę w buforze do biegania na wierzch paska żelu i pozwól mu zastygnąć. Wykonaj elektroforezę zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przebiegu elektroforetycznym zobrazuj białka za pomocą barwienia rubinowego SUPRO lub srebrze.Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki wzorców kompleksów białek tylakoidów w próbkach rozpuszczonych w beta-DM i digitoninie. Małe kompleksy migrują szybciej podczas przebiegu elektroforetycznego i dlatego znajdują się w dolnej części żelu. Natomiast duże kompleksy znajdują się w górnej części żelu.Digitonina na ogół zachowuje kompleksy białkowe w większych zespołach, podczas gdy beta DM zakłóca labilne interakcje białko-białko między kompleksami. Przedstawiono skład podjednostkowy kompleksów białkowych tylakoidów rozlubionych w beta-DM i digitoninach. Podjednostki każdego kompleksu znajdują się od linii pionowej poniżej wyrównanego kompleksu.Zasadniczo każde miejsce w żelu 2D reprezentuje indywidualne białko. Ale w praktyce kilka białek o tej samej masie cząsteczkowej może być obecnych w jednym miejscu. Identyfikacja plam opiera się na analizie spektrometrii mas.Po zastosowaniu tej procedury można kontynuować inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa i analiza pojedynczych cząstek kompleksów białkowych wymytych z niebieskiego natywnego żelu, w celu uzyskania strukturalnego wglądu w kompleksy białkowe. Aby zidentyfikować nieznane podjednostki białkowe, poszczególne plamki białkowe z dwuwymiarowej SDS PAGE mogą być analizowane za pomocą specyfikacji masy. Nie zapominaj, że praca z akrylamidem i digitoniną może być niezwykle szkodliwa i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic ochronnych.

analysis-thylakoid-membrane-protein-complexes-blue-native-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

W tym filmie demonstrujemy technikę elektroforetyczną, zwaną niebieską natywną STRONĄ, do analizy mitochondrialnych kompleksów białkowych układu oddechowego w ich natywnie złożonym i funkcjonalnie aktywnym stanie. Anionowy niebieski barwnik Coomassie powoduje, że kompleksy białkowe stają się naładowane ujemnie, co umożliwia separację na podstawie wielkości i struktury.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Ten protokół opisuje, jak przygotować i przeprowadzić przezroczystą elektroforezę uwięzienia frakcji płynnej z natywną żelową (CN-GELFrEE), natywną technikę separacji niekowalencyjnych zespołów biomolekularnych i białek z heterogenicznych próbek, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek.

CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Tutaj prezentujemy protokół rozdzielania rozpuszczonych kompleksów tylakoidów za pomocą natywnej elektroforezy Zielonego Żelu. Zielone pasma żelowe są następnie charakteryzowane za pomocą skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) i dostarczane są podstawowe kroki do analizy danych.

Separacja kompleksów białek tylakoidów szpinaku za pomocą natywnej elektroforezy zielonego żelu i charakterystyki pasma przy użyciu skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Proteinazy są niezbędne dla patogenezy bakterii, umożliwiając inwazję i unikanie odporności. Jednoetapowa ekstrakcja białek cytoplazmatycznych i błonowych bakterii w ich aktywnej postaci jest wstrząsająca. Ten artykuł wideo przedstawia ekstrakcję całych białek komórkowych Leptospira do analizy zymografii w celu wykrycia i scharakteryzowania żelatynaz.

Jednoetapowa ekstrakcja i analiza zymograficzna żelatynaz bakteryjnych

Poznaj analizę kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy BN-PAGE i 2D-SDS-PAGE. Ta metoda pozwala badać interakcje funkcjonalne między natywnymi kompleksami białkowymi u roślin.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Przeglądaj więcej filmów