Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu
28 września 2018
Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące składu i dynamicznej organizacji fotosyntetycznych kompleksów białkowych w błonie tylakoidów roślinnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę oddziaływań funkcjonalnych między natywnymi kompleksami białkowymi i wyjaśnia plastyczność organizacji kompleksu białkowego w różnych warunkach środowiskowych. Ustaw płytki żelowe o wymiarach osiem centymetrów na 10 centymetrów zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą dystansów 0,75 milimetra.
Umieść mieszalnik gradientowy na płytce mieszającej i połącz go z pompą perystaltyczną za pomocą rurek. Przymocuj igłę strzykawki do drugiego końca rurki i umieść igłę między szklaną a aluminiową płytką. Umieść mieszadło magnetyczne w ciężkiej komorze.
Przygotować 3,5% i 12,5% roztwory akrylamidu w 15-mililitrowych stożkowych probówkach wirówkowych, jak opisano w protokole tekstowym, do wykorzystania do gradientu żelu separacyjnego. Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji, podczas przygotowywania roztworów należy trzymać probówki wirówkowe na lodzie. Dodaj 5%APS i TEMED tuż przed pipetowaniem roztworów do mieszalnika gradientowego.
Odpipetować 12,5% roztwory do ciężkiej komory. Usunąć pęcherzyki powietrza z kanału łączącego komorę lekką i ciężką, otwierając zawór łączący dwie komory umożliwiający przedostanie się roztworu do komory świetlnej. Zamknąć zawór i odpipetować ślady roztworu z powrotem do ciężkiej komory.
Na koniec odpipetować 3,5% roztwór do komory świetlnej. Włączyć mieszadło magnetyczne. Otwórz zawory i włącz pompę perystaltyczną.
Pozwól, aby roztwory żelu przepływały między szklaną i aluminiową płytką z prędkością przepływu około 0,5 mililitra na minutę. Igła musi przez cały czas znajdować się nad płynem. Gdy komory ciężkie i lekkie zostaną opróżnione, napełnij je ultraczystą wodą.
I pozwól, aby woda delikatnie pokryła powierzchnię żelu. Polimeryzacja żelu trwa około jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Przygotować 3% roztwór akrylamidu do żelu do układania w stos w temperaturze pokojowej.
Odpipetować żel do układania w stos na wierzchu spolimeryzowanego żelu separacyjnego i umieścić grzebień żelowy do próbki między szkłem a aluminiową płytką, unikając pęcherzyków powietrza. Po pozostawieniu żelu do polimeryzacji przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wyjmij grzebień pod ultraczystą wodą. W tym momencie żel może być przechowywany w temperaturze dodatnich czterech stopni Celsjusza w wilgotnych warunkach przez kilka dni.
Rozcieńczyć wyizolowane tylakoidy lodowatym buforem 25BTH20G do końcowego stężenia chlorofilu wynoszącego jeden miligram na mililitr. Przygotuj dwie probówki dla każdej próbki tylakoidu, aby przeprowadzić zarówno solubilizację beta-DM, jak i digitoniny. Teraz dodaj równą objętość bufora detergentu.
Delikatnie wymieszać detergent i próbkę tylakoidów za pomocą pipety i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Rozpuszczaj tylakoidy przez dwie minuty na lodzie w celu rozpuszczania beta-DM. Lub 10 minut w temperaturze pokojowej z ciągłym delikatnym mieszaniem na bujaku lub shakerze w celu rozpuszczania digitoniny.
Po inkubacji usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 18 000 g przez 20 minut w temperaturze dodatniej do czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać 1/10 objętości buforu Coomassie w kolorze brylantowym do próbki. Ustaw żel w pionowym systemie elektroforezy.
Napełnij górną komorę buforową niebieskim buforem katodowym i wlej bufor anodowy do dolnej komory buforowej. Załaduj próbki tylakoidów do studzienek. Rozpocznij elektroforezę i stopniowo zwiększaj napięcie zgodnie z podaniem w protokole tekstowym.
Uruchom żel w dodatnich czterech stopniach Celsjusza, korzystając z chłodni lub regulując temperaturę żelu za pomocą systemu chłodzenia. Zmień bufor niebieskiej katody na przezroczysty bufor katody, gdy przód próbki przesunął się o około 1/3 żelu. Po przebiegu elektroforetycznym zeskanuj żel za pomocą skanera fotograficznego w celu archiwizacji obrazu.
Aby wykonać 2-SDS PAGE, zmontuj pionowy system elektroforezy za pomocą jednomilimetrowych przekładek. Przygotuj standardowy żel SDS za pomocą grzebienia 2D zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Odetnij pas z żelu BN i umieść go w pięciomililitrowej tubce.
Następnie dodaj dwa mililitry buforu Laemmli i inkubuj pasek przez 45 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Umieść pas za pomocą przekładki na wierzchu żelu, unikając pęcherzyków powietrza. Odpipetować pięć mikrolitrów markera masy cząsteczkowej na wąskim kawałku bibuły filtracyjnej i umieścić bibułę w standardowej studzience.
Aby uszczelnić pasek żelu BN i papier markerowy, wlej 0,5% agarozę w buforze do biegania na wierzch paska żelu i pozwól mu zastygnąć. Wykonaj elektroforezę zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przebiegu elektroforetycznym zobrazuj białka za pomocą barwienia rubinowego SUPRO lub srebrze
.Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki wzorców kompleksów białek tylakoidów w próbkach rozpuszczonych w beta-DM i digitoninie. Małe kompleksy migrują szybciej podczas przebiegu elektroforetycznego i dlatego znajdują się w dolnej części żelu. Natomiast duże kompleksy znajdują się w górnej części żelu.
Digitonina na ogół zachowuje kompleksy białkowe w większych zespołach, podczas gdy beta DM zakłóca labilne interakcje białko-białko między kompleksami. Przedstawiono skład podjednostkowy kompleksów białkowych tylakoidów rozlubionych w beta-DM i digitoninach. Podjednostki każdego kompleksu znajdują się od linii pionowej poniżej wyrównanego kompleksu.
Zasadniczo każde miejsce w żelu 2D reprezentuje indywidualne białko. Ale w praktyce kilka białek o tej samej masie cząsteczkowej może być obecnych w jednym miejscu. Identyfikacja plam opiera się na analizie spektrometrii mas.
Po zastosowaniu tej procedury można kontynuować inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa i analiza pojedynczych cząstek kompleksów białkowych wymytych z niebieskiego natywnego żelu, w celu uzyskania strukturalnego wglądu w kompleksy białkowe. Aby zidentyfikować nieznane podjednostki białkowe, poszczególne plamki białkowe z dwuwymiarowej SDS PAGE mogą być analizowane za pomocą specyfikacji masy. Nie zapominaj, że praca z akrylamidem i digitoniną może być niezwykle szkodliwa i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic ochronnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół analizy organizacji i składu kompleksów białkowych tylakoidów roślinnych z wykorzystaniem nieodbarwionej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) oraz 2D-SDS-PAGE. Chociaż metoda została zoptymalizowana dla Arabidopsis thaliana, można ją zaadaptować do innych gatunków roślin.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Fotosynteza
- Analiza kompleksów białkowych
Wprowadzenie
- Zrozumienie składu fotosyntetycznych kompleksów białkowych jest kluczowe dla biologii roślin.
- Błony tylakoidów odgrywają kluczową rolę w procesie fotosyntezy.
- Organizacja kompleksów białkowych może się różnić w zależności od warunków środowiskowych.
- Metoda BN-PAGE umożliwia analizę natywnych kompleksów białkowych.
Cel badania
- Wyjaśnienie organizacji i składu kompleksów białkowych tylakoidów.
- Zbadanie oddziaływań funkcjonalnych pomiędzy kompleksami białkowymi.
- Ocena plastyczności organizacji kompleksów białkowych.
Zastosowane metody
- Elektroforeza w natywnych żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE)
- Dwuwymiarowa elektroforeza w żelach SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE)
- Konfiguracja mieszalnika gradientowego do przygotowania żelu
- Zastosowanie pompy perystaltycznej i mieszadła magnetycznego do odlewania żelu
Główne wyniki
- Protokół skutecznie ujawnia skład kompleksów białkowych tylakoidów.
- Można analizować funkcjonalne oddziaływania między natywnymi kompleksami białkowymi.
- Dynamiczną organizację kompleksów białkowych można oceniać w zmiennych warunkach.
- Potwierdzono możliwość adaptacji metody dla różnych gatunków roślin.
Wnioski
- Metoda ta dostarcza wiedzy na temat organizacji kompleksów białek fotosyntetycznych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie zdolności adaptacyjnych białek roślin do zmian środowiskowych.
- Protokół ten może stanowić cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się biologią roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie składu i dynamicznej organizacji fotosyntetycznych kompleksów białkowych dostarcza mechanistycznego wglądu w szlaki konwersji energii istotne dla rozwoju produktów opartych na biomasie. Nieodprążająca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (Blue native PAGE) umożliwia analizę funkcjonalnych oddziaływań natywnych kompleksów wielobiałkowych, co wspiera walidację celów w systemach fotosyntetycznych. Metoda ta pomaga w ograniczaniu ryzyka wczesnych hipotez poprzez wyjaśnienie stabilności i oddziaływań kompleksów w zmiennych warunkach środowiskowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez rozstrzygnięcie składu natywnych kompleksów białkowych oraz organizacji podjednostek w błonach tylakoidów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia redukcję ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację plastyczności i stabilności kompleksów w kontrolowanych warunkach solubilizacji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu poprzez rozróżnianie stabilnych od labilnych oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem detergentów digitonin oraz beta-DM.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje solubilizowane kompleksy tylakoidów do dalszych analiz poprzez standaryzowane rozdzielanie metodą BN-PAGE z powtarzalnymi wzorami migracji.
- Wynik ilościowy: Generuje możliwe do rozdzielenia profile kompleksów, umożliwiając porównanie stanów montażu w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Umożliwia przeprowadzenie analizy uzupełniającej metodą 2D-SDS-PAGE w celu identyfikacji podjednostek, rozszerzając użyteczność poza wstępne profilowanie kompleksów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy organizację kompleksów na etapie odkryć z funkcjonalną wydajnością fotosyntezy w warunkach zmiennego stresu środowiskowego.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia, w jaki sposób zaburzenia środowiskowe wpływają na składanie superkompleksów, co dostarcza informacji do modeli predykcyjnych dotyczących odporności ścieżek metabolicznych.
- Dopasowanie biomarkerów: Umożliwia monitorowanie dysocjacji lub ponownego składania kompleksów jako potencjalnych wskaźników wydajności fotosyntezy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowe etapy procesów odkrywczych, w których wymagane jest zachowanie integralności natywnych kompleksów przed analizą redukcjonistyczną, co umożliwia przejście od izolacji organelli do analizy funkcjonalnej i dalszych badań strukturalnych.
- Biologia odkryć: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących integralności łańcucha transportu elektronów w procesie fotosyntezy poprzez rozdzielenie kompleksów PSII, PSI, Cyt b6f oraz ATPase w ich natywnej formie.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy profile kompleksów z ilościowym rozdzieleniem prążków, co umożliwia analizę porównawczą efektów solubilizacji detergentami.
- Analityka: Generuje odczyty oparte na migracji, które pozwalają zespołom badawczym porównywać stabilność i zawartość kompleksów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy organizację kompleksów z funkcją fotosyntezy, stanowiąc pomost do oceny wyników fenotypowych w warunkach stresowych.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do profilowania kompleksów białek błonowych w systemach roślinnych, którą można dostosować do innych gatunków poprzez modyfikację protokołu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zachowanie natywnych oddziaływań i wyjaśnienie złożonej dynamiki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację dzięki odlewaniu żeli gradientowych i powtarzalnej separacji elektroforetycznej w kontrolowanej temperaturze.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w inżynierii szlaków fotosyntetycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile stabilności i oddziaływań kompleksów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w solubilizacji białek błonowych oraz w natywnych technikach elektroforetycznych.
- Zależność od miksera gradientowego, pompy perystaltycznej oraz pionowych systemów elektroforetycznych z kontrolą temperatury.
- Konieczność standaryzacji protokołów solubilizacji detergentami (beta-DM vs digitoninina) w celu zapewnienia powtarzalnej stabilności kompleksów.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji dla różnych gatunków roślin ze względu na różnice w składzie błon tylakoidów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak destabilizacja labilnych kompleksów przez beta-DM oraz potrzeba zastosowania chłodni lub systemów chłodzących podczas elektroforezy.
