Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii i fizjologii owadów poprzez pomiar elektrogenezy ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster. Pozwala to na testowanie szerokiego zakresu hipotez naukowych i pomoc w odkrywaniu nowych sposobów działania insektycydów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prosty, powtarzalny i stosunkowo wysokowydajny system przy minimalnym wkładzie finansowym do badania układu nerwowego Drosophila.

Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie do akwizycji/analizy. Kliknij przycisk Setup (Konfiguracja) na głównym pasku narzędzi i wybierz opcję Channel Settings (Ustawienia kanału), co spowoduje otwarcie okna dialogowego. Zmniejsz łączną liczbę kanałów do trzech.

Kanał pierwszy zarejestruje surowy sygnał ze wzmacniacza w zakresie 100 miliwoltów. Kanał drugi będzie używany do zliczania zdarzeń z kanału pierwszego, które przekraczają dany próg. W tym celu kliknij zakładkę Obliczenia, aby otworzyć menu rozwijane dla kanału drugiego.

Wybierz opcję Pomiary cykliczne, co spowoduje otwarcie drugiego okna dialogowego. Wybierz kanał pierwszy jako źródło. Następnie z menu rozwijanego pomiar wybierz opcję Unit Spike at Events (Skok jednostki w zdarzeniach).

Na koniec w obszarze ustawień wykrywania z menu rozwijanego wybierz opcję Prosty próg. Poziom progowy jest wprowadzany w oknie regulacji wykrywania, który należy ustawić powyżej szumu tła. Aby przeliczyć aktywność elektryczną na wykres szybkości wyrażony w hercach, wybierz Arytmetyka na trzecim kanale.

W nowym oknie wprowadź 1000 razy smoothsec, nawiasy kanał dwa przecinek dwa. Następnie wybierz z menu rozwijanego jednostki częstotliwości herc. Zamknij okna dialogowe, aby powrócić do ekranu głównego.

Oś y kanału trzeciego powinna być wyrażona w hercach, a oś x w czasie. Wypreparuj ośrodkowy układ nerwowy larwy Drosophila, najpierw identyfikując i ekstrahując wędrującego Drosophila melanogaster w trzecim stadium z fiolki hodowlanej i umieszczając go w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej. Następnie chwyć haczyki do ust parą cienkich kleszczy i chwyć brzuch robaka drugą parą kleszczy, z lekkim naciskiem, aby uniknąć rozdarcia cienkiej warstwy kutykularnej.

Delikatnie pociągnij haczyki do ust i brzuch w różnych kierunkach, aby oddzielić ogonowy koniec robaka od obszaru głowy i odsłonić wnętrzności robaka. Ośrodkowy układ nerwowy będzie spleciony z tchawicą i przewodem pokarmowym. Usuń OUN z przewodu pokarmowego i tchawicy za pomocą kleszczy.

Wydzielenie ośrodkowego układu nerwowego Drosophila z robaka jest kluczowym krokiem do sukcesu. Wypreparowane zwoje nerwowe muszą być nienaruszone, bez znaczącego uszkodzenia zstępujących nerwów ruchowych. Większa liczba nerwów ruchowych przyczepionych do zwojów zwiększy podstawowe częstotliwości odpalania.

W razie potrzeby przerwij barierę krew-mózg poprzez ręczną transekcję OUN za płatami mózgowymi za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas. Przekrój powinien być wykonany w oparciu o właściwości fizykochemiczne stosowanej substancji chemicznej. Czerwona linia to sugerowany punkt przecięcia i przecięty OUN z nienaruszonymi zstępującymi pniami nerwów obwodowych pokazanymi tutaj.

Aby rozpocząć, najpierw wyciągnij szklaną elektrodę pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji od pięciu do 15 megaomów. Włóż przecięty OUN do komory woskowej zawierającej 200 mikrolitrów soli fizjologicznej. Zaciśnij niepowlekaną szpilkę przeciw owadom z zaciskiem krokodylkowym przylutowanym do przewodu uziemiającego i włóż szpilkę do soli fizjologicznej, aby zakończyć obwód.

Za pomocą mikromanipulatorów skieruj elektrodę na ogonowy koniec przeciętego OUN. Wyeliminuj szum tła, dostosowując poziom progowy w oprogramowaniu do akwizycji/analizy przed podłączeniem obwodowych pni nerwowych. Zastosować lekkie podciśnienie na strzykawce, aby wciągnąć nerwy obwodowe do elektrody ssącej.

Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu do akwizycji danych i ustaw podstawową szybkość wypalania, aby zrównoważyć się przez pięć minut przed zebraniem danych o podstawowej szybkości wypalania. Po pięciu minutach dodaj 200 mikrolitrów soli fizjologicznej i pojazdu, aby całkowita objętość komory wynosiła 400 mikrolitrów, aby rozpocząć rejestrowanie kontrolnej szybkości wypalania. Odrzucić przygotowanie i zapis, jeśli schemat odpalania środka kontrolnego nie jest podobny do pokazanego tutaj przykładu.

Gdy linia podstawowa zostanie ustalona po trzech do pięciu minutach rejestracji, pobrać 200 mikrolitrów soli fizjologicznej i dodać 200 mikrolitrów środka doświadczalnego rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej. Oznacz ten punkt czasowy aplikacji leku w oprogramowaniu do akwizycji/analizy, dołączając komentarz zawierający lek i końcowe stężenie. Pokazany tutaj jest reprezentatywny ślad wydzieliny nerwowej przed i po ekspozycji na DMSO.

Strzałka wskazuje czas aplikacji. Obserwuje się ograniczoną odpowiedź na DMSO. Zwiększanie dawek propoksuru wzmacniało częstotliwość wyładowań skokowych w przeciętym ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila w sposób zależny od stężenia, podczas gdy neurodepresyjny GABA zmniejszał częstotliwość wyładowań kolców w sposób zależny od stężenia.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jest to eksperyment ex vivo, a zatem warunki soli fizjologicznej, takie jak pH i temperatura, mają kluczowe znaczenie dla przedłużonej aktywności preparatu ośrodkowego układu nerwowego. Podobnie, brak zewnętrznej aktywności elektrycznej, skuteczna klatka Faradaya i redukcja szumów 60-hercowych mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tego testu. Dane zebrane za pomocą tego testu mogą pomóc w określeniu konkretnego sposobu działania insektycydów.

Można następnie przeprowadzić walidację tych danych za pomocą innych metod, takich jak elektrofizjologia cęgów napięciowych, analizy biochemiczne i dodatkowe testy farmakologiczne.