Name: Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj elektrofizjologiczną metodę rejestracji aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium larwalnym. Technika umożliwia badanie toksykologii owadów i odkrywanie nowych mechanizmów działania insektycydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Pani Rui Chen za rozbiór i zdjęcia ośrodkowego układu nerwowego Drosophila pokazane na rysunkach.

1. Sprzęt i materiały
<ol>
	<li>Przygotować wymagane elementy (wymienione w Tabeli Materiałów) stanowiska do elektrofizjologii do wykonywania zapisów elektrody ssącej CNS. 
	UWAGA: Przed przystąpieniem do eksperymentów konieczne jest skonstruowanie komór do preparowania ośrodkowego układu nerwowego Drosophila oraz do kąpieli zwojów w soli fizjologicznej podczas nagrań. Poniżej znajduje się zarys budowy studzienki krok po kroku.</li>
	<li>Przygotuj komorę larwalną.
	<ol>
		<li>Rozpuść wosk za pomocą gorącej płyty.</li>
		<li>Wlej 2 ml stopionego wosku do komory o maksymalnej objętości 2 - 2,5 ml.</li>
		<li>Pozostaw wosk do ostygnięcia i stwardnienia przez około 2 godziny.</li>
		<li>Za pomocą żyletki wydrąż otwór w utwardzonym wosku, który pomieści objętość 500 μl, który ma powierzchnię około 0,5cm2 i głębokość około 0,25 cm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja sprzętu i oprogramowania
UWAGA: Konfiguracja nagrania zewnątrzkomórkowego jest pokrótce opisana poniżej.
<ol>
	<li>Przygotuj sprzęt do sekcji i nagrywania.
	<ol>
		<li>Umieść preparat tkankowy, mikroskop, elektrodę ssącą, mikromanipulatory, źródło światła wewnątrz klatki Faradaya, aby zredukować hałas i wyeliminować zewnętrzne pola elektryczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
		<li>Podłącz (najlepiej) przewody uziemiające i dodatnie do ekranowanych zacisków krokodylkowych, które zostaną podłączone odpowiednio do wanny i uchwytu mikroelektrody. 
		UWAGA: Lutowane i odsłonięte przewody można przykryć folią aluminiową w celu zmniejszenia hałasu.</li>
		<li>Podłącz przewody uziemiające i dodatnie do wejścia 1 wzmacniacza różnicowego AC/DC.</li>
		<li>Podłącz system akwizycji danych do wzmacniacza różnicowego AC/DC, podłączając Bayonet Neill-Concelman (BNC) z wejścia 1 systemu akwizycji danych do wyjścia kanału 1 amplifier. 
		UWAGA: Zaleca się włączenie eliminatora szumów 50/60 Hz między oprogramowaniem do akwizycji danych a amplifier. Wymagane jest użycie trójnika BNC.</li>
		<li>W razie potrzeby dołącz monitor audio do konfiguracji, podłączając wejście 1 monitora audio do wejścia 1 oprogramowania do akwizycji danych.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml solą fizjologiczną i podłącz ją do portu ciśnieniowego uchwytu elektrody. 
		UWAGA: Upewnij się, że między strzykawką, granulką Ag/AgCl i otworem elektrody nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj oprogramowanie do sekcji i nagrywania. 
	UWAGA: Zarys metod konfiguracji oprogramowania opiera się na oprogramowaniu do akwizycji/analizy wymienionym w Tabeli materiałów, które zdigitalizuje surową moc elektryczną i przekonwertuje dane na częstotliwość skoków. Można jednak użyć innego oprogramowania i użyć wielu konwersji nagrań.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji/analizy.</li>
		<li>Kliknij "ustawienia" na głównym pasku narzędzi i wybierz "ustawienia kanału", co otworzy okno dialogowe.</li>
		<li>Zmniejsz łączną liczbę kanałów do trzech.</li>
		<li>Dla kanału 1 wybierz zakres 100 mV. </li>
		<li>W przypadku kanału 2 kliknij zakładkę "obliczenia", która otworzy menu rozwijane. Wybierz "pomiary cykliczne", co otworzy drugie okno dialogowe.</li>
		<li>Wybierz kanał 1 jako źródło. Następnie w menu rozwijanym pomiar wybierz skok jednostki na wydarzeniach. Na koniec w obszarze ustawień wykrywania z menu rozwijanego wybierz prosty próg. </li>
		<li>Aby przeliczyć aktywność elektryczną na wykres szybkości wyrażony w hercach, 3. kanał musi być ustawiony w trybie arytmetycznym: W oknie wejściowym wpisz "1000*smoothsec(ch2,2)". Następnie wybierz jako menu rozwijane jednostki hertz. 
		UWAGA: Udane nagrania można wykonać z wieloma różnymi ustawieniami nagrywania, ale "Skok jednostki przy zdarzeniach i prosty próg" jest prawdopodobnie najłatwiejszy, ponieważ pozwala na dostosowanie progu powyżej aktywności w tle dla każdego pojedynczego nagrania. Nagrania z ustawieniem "Wejście ze źródła niestandardowego" zwiększają odtwarzalność danych, przy założeniu, że aktywność w tle nie różni się między nagraniami.</li>
		<li>Zamknij okna dialogowe, aby powrócić do ekranu głównego. Oś y powinna być wyrażona w Hz, a oś x w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozwiń i przygotuj larwy Drosophila CNS
UWAGA: Metody preparacji ośrodkowego układu nerwowego larw są wyraźnie zilustrowane w Hafer and Schedl27, ale te wcześniej opublikowane metody zmniejszają długość zstępujących neuronów, które są ważne dla pomiaru częstotliwości skoków. W tym miejscu przedstawiono dodatkową metodę wycinania larwalnego OUN, który utrzymuje długie, nienaruszone neurony zstępujące.
<ol>
	<li>Przygotowanie soli fizjologicznej.
	<ol>
		<li>Przygotować sekcję i zapis soli fizjologicznej do następujących składników w mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 kwas 2-[4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-ylo]etanosulfonowy (HEPES); miareczkować pH do 7,25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj larwę Drosophila CNS.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj i wyekstrahuj wędrującego Drosophila melanogaster w trzecim stadium z fiolki hodowlanej i umieść w 200 μl soli fizjologicznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Chwyć haczyki do ust parą cienkich kleszczy i chwyć brzuch robaka drugą parą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
		UWAGA: Nie wywieraj zbyt dużego nacisku na brzuch, ponieważ może to spowodować rozerwanie cienkiej warstwy kutykularnej robaka.</li>
		<li>Delikatnie pociągnij haczyki do ust i brzuch w różnych kierunkach, aby oddzielić ogonowy koniec robaka od obszaru głowy i odsłonić wnętrzności robaka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C). 
		UWAGA: OUN będzie spleciony z tchawicą i przewodem pokarmowym. Nie odcinaj OUN od żadnej tkanki, aby zapobiec przecięciu zstępujących nerwów obwodowych.</li>
		<li>Oczyść OUN z przewodu pokarmowego i tchawicy za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Ryc. 3D).</li>
		<li>W razie potrzeby przerwij barierę krew-mózg, ręcznie przecinając OUN tylnie do płatów mózgowych za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas. 
		UWAGA: Należy to zrobić w oparciu o właściwości fizykochemiczne stosowanej substancji chemicznej. Czerwona linia w Rysunek 4A to sugerowany punkt przecięcia i przecięty OUN z nienaruszonymi opadającymi pniami nerwów obwodowych pokazany na Rysunek 4B. Przecięty OUN jest gotowy do eksperymentów po wykonaniu kroku 3.2.5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zewnątrzkomórkowy zapis ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.
<ol>
	<li>Przygotuj CNS do nagrywania.
	<ol>
		<li>Wyciągnąć szklaną elektrodę pipetową z kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji 5-15 mΩ.</li>
		<li>Włożyć przecięty OUN do komory woskowej zawierającej 200 μl soli fizjologicznej. Clamp niepowlekaną szpilkę przeciw owadom z zaciskiem krokodylkowym przylutowanym do przewodu uziemiającego i włóż szpilkę do soli fizjologicznej, aby zakończyć obwód.</li>
		<li>Za pomocą mikromanipulatorów skieruj elektrodę na ogonowy koniec przeciętego OUN. Wyeliminuj nagrywanie szumów tła, dostosowując poziom progowy w oprogramowaniu do akwizycji/analizy przed kontaktem z obwodowymi pniami nerwowymi.</li>
		<li>Wciągnąć wszelkie dogodne nerwy obwodowe do elektrody ssącej, wywierając lekki podnacisk na strzykawkę. 
		UWAGA: Podstawowa częstotliwość wystrzeliwania jest skorelowana z liczbą neuronów wciągniętych do elektrody, gdzie więcej neuronów często powoduje zwiększoną rezystancję elektrody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij zewnątrzkomórkowy zapis aktywności nerwów zstępujących do OUN.
	<ol>
		<li>Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu do akwizycji danych i monitoruj częstotliwość wypalania linii bazowej. Pozwól, aby szybkość ognia zrównoważyła się przez 5 minut przed zebraniem danych dotyczących podstawowej szybkości ognia.</li>
		<li>Odrzucić przygotowanie i zapis, jeśli wzorzec odpalania leczenia kontrolnego nie jest wzorcem pękania podobnym do pokazanego na <silna klasa="xfig">Rysunek 5A. 
		UWAGA: Zmieniony wzorzec odpalania sugeruje nienormalną lub niestabilną aktywność centralnego generatora wzorców, co może zmienić funkcję neuronalną.</li>
		<li>Po 5 minutach dodaj 200 μl soli fizjologicznej + nośnik, aby zwiększyć całkowitą objętość komory do 400 μl, aby rozpocząć rejestrację kontrolnej szybkości wypalania.</li>
		<li>Po ustaleniu linii podstawowej (3-5 min) pobrać 200 μl soli fizjologicznej i dodać 200 μl czynnika doświadczalnego rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej. 
		UWAGA: Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest zalecanym rozpuszczalnikiem dla związków lipofilowych i nie powinien przekraczać 0,1% v/v.</li>
		<li>Stosuj stężenia leku w sposób seryjny (od niskich do wysokich stężeń) i zapisuj każde stężenie przez wybrany okres czasu (określony przez badacza na podstawie właściwości chemicznych leku29). Oznacz ten punkt czasowy aplikacji leku w oprogramowaniu do akwizycji/analizy, dołączając komentarz zawierający lek i końcowe stężenie. 
		UWAGA: Aktywność wypalania OUN zmniejszy się o około 10-20% po 30-50 minutach od rozwarstwienia, dlatego należy przeprowadzić odpowiednie kontrole bez leczenia, a leczenie farmakologiczne nie powinno przekraczać tego czasu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizowanie danych. 
	UWAGA: Na zebranych danych można przeprowadzić wiele analiz, takich jak zmiany w impulsach potencjału czynnościowego29, amplituda fali skokowej i przebieg w czasie oraz określenie średnich częstotliwości skoków po leczeniu farmakologicznym26,30,31,32. Najczęstszym z nich jest określenie wpływu leku na średnią częstość skoków w określonym czasie, co opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Tabelaryzuj średnie częstości skoków, wybierając cały obszar zainteresowania (tj. okres leczenia lekiem) i określ średnie częstotliwości skoków automatycznie za pomocą "Datapada" znajdującego się na głównym pasku narzędzi oprogramowania do akwizycji/analizy.</li>
		<li>Określić średnią częstość skoków OUN po leczeniu farmakologicznym do średniej częstości skoków w kontroli nośnika (wartość wyjściowa). Oblicz procentową zmianę szybkości wypalania po leczeniu farmakologicznym według wzoru: (częstotliwość leczenia / częstotliwość wyjściowa) × 100.</li>
		<li>Użyj średnich częstotliwości skoków lub procentowego wystrzeliwania kontroli dla każdego stężenia, aby skonstruować krzywą odpowiedzi na stężenie za pomocą standardowego oprogramowania do tworzenia wykresów.</li>
		<li>Przeprowadź analizę statystyczną (np. niesparowany test t), aby określić istotność między punktami czasowymi, stężeniami lub terapiami farmakologicznymi. 
		UWAGA: Istnieją dwie podstawowe metody generowania i analizowania krzywych stężenie-odpowiedź. Pierwsza metoda to jedno stężenie na pojedynczy preparat. W tym przypadku szybkość skoku pojedynczego stężenia jest znormalizowana do wyjściowej szybkości skoku dla każdego preparatu. Korzyści to zmniejszenie zużycia preparatu ze względu na skrócony czas zapisu, podczas gdy pułapki polegają na wydłużeniu czasu preparacji, ponieważ metoda ta będzie składać się z 5-7 pojedynczych preparatów OUN na stężenie oraz większych słupków błędów na uśrednionym zestawie danych. Druga metoda polega na wielokrotnym stężeniu na pojedynczy preparat. W tym przypadku szybkość skoku dla każdego z 3-5 stężeń jest znormalizowana do tej samej wyjściowej szybkości skoku. Korzyściami są krótszy czas preparacji i mniejsza zmienność między powtórzeniami pod względem stężeń leków, podczas gdy pułapki to wymóg szybko działającego leku i nieznany wpływ wcześniejszych terapii skoncentrowanych na leki na kolejne terapie chemiczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sparks, T. C., Nauen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAC%3A+Mode+of+action+classification+and+insecticide+resistance+management%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).</li>
<li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insecticide+resistance-breaking+mosquitocide+targeting+inward+rectifier+potassium+channels+in+vectors+of+Zika+virus+and+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria.</a> Scientific Reports. 6, 36954(2016).</li>
<li>Troczka, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+and+functional+characterisation+of+the+diamondback+moth+ryanodine+receptor+G4946E+variant+conferring+resistance+to+diamide+insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides.</a> Scientific Reports. 5, 14680(2015).</li>
<li>Bloomquist, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2014-1172.ch006">Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides.</a> Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, Washington, DC. 71-81 (2014).</li>
<li>Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+serum+and+ion+channel+block+on+growth+and+hormonally-induced+differentiation+of+Spodoptera+frugiperda+%28Sf21%29+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).</li>
<li>Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+potassium+channels+expressed+after+20-Hydroxyecdysone+treatment+of+a+mosquito+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biolology%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).</li>
<li>Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+FlyAtlas+to+identify+better+Drosophila+melanogaster+models+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease.</a> Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Luan, Z., Li, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+channels+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sheng+Li+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila.</a> Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).</li>
<li>Muenzing, S. E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larvalign%3A+Aligning+gene+expression+patterns+from+the+larval+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster.</a> Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).</li>
<li>Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+patterns+in+primary+neuronal+clusters+of+the+Drosophila+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain.</a> Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+toxicogenomics%3A+Genetic+variation+in+susceptibility+to+heavy+metal+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure.</a> PLoS Genetics. 13 (7), e1006907(2017).</li>
<li>Manev, H., Dimitrijevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+for+in+vivo+pharmacological+analgesia+research%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research.</a> European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+K%2B%2FCl-+cotransporter+gene+kazachoc+%28kcc%29+increase+seizure+susceptibility+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).</li>
<li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).</li>
<li>Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+reveals+motor+neuron+damage+by+human+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).</li>
<li>Rajendra, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+melanogaster+model+of+spinal+muscular+atrophy+reveals+a+function+for+SMN+in+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle.</a> Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).</li>
<li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).</li>
<li>Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+blood-brain+barrier%3A+development+and+function+of+a+glial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 365(2014).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).</li>
<li>Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+the+mesenchymal-epithelial+transition+of+blood-brain+barrier+forming+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila.</a> Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).</li>
<li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+to+predict+drug+permeation+across+the+blood-brain+barrier%2C+and+distribution+to+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).</li>
<li>Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicity+and+mode+of+action+of+N%2C+N-diethyl-meta-toluamide+%28DEET%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET).</a> PLoS One. 9 (8), e103713(2014).</li>
<li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (1), 85(2006).</li>
<li>Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+atracotoxin+at+central+and+peripheral+synapses+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects.</a> Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).</li>
<li>Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neuronal+sensitivity+to+dieldrin+and+picrotoxinin+in+a+cyclodiene-resistant+strain+of+Drosophila+melanogaster+%28Meigen%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).</li>
<li>Mutunga, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicology+of+bis%28n%29-tacrines+on+Blattella+germanica+and+Drosophila+melanogaster+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).</li>
<li>Chen, R., Swale, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+potassium+%28Kir%29+channels+represent+a+critical+ion+conductance+pathway+in+the+nervous+systems+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1617(2018).</li>
<li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2(2016).</li>
<li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitor+profile+of+bis%28n%29-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+and+Phlebotomus+papatasi%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li>
<li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczegóły zawarte w powiązanym filmie i tekście dostarczyły kluczowych kroków w celu zarejestrowania aktywności i częstotliwości wyładowań skokowych ośrodkowego układu nerwowego Drosophila ex vivo. Skuteczność preparacji jest najbardziej krytycznym aspektem metody, ponieważ krótkie lub kilka zstępujących neuronów zmniejszy podstawową szybkość wypalania, co spowoduje duże różnice między powtórzeniami. Jednak po opanowaniu techniki preparacji dane zebrane za pomocą tego testu są wysoce powtarzalne i można...

Ogólnym celem tego podejścia jest umożliwienie naukowcom szybkiego pomiaru elektrogenezy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u modelowego owada, Drosophila melanogaster. Ta metoda jest niezawodna, szybka i opłacalna w przeprowadzaniu eksperymentów fizjologicznych i toksykologicznych. Ośrodkowy układ nerwowy jest niezbędny do życia, dlatego szlaki fizjologiczne krytyczne dla prawidłowego funkcjonowania neuronów zostały szeroko zbadane w celu zrozumienia lub modyfikacji funkcji neuronalnych. Charakterystyka szlaków sygnałowych w obrębie ośrodkowego układu nerwowego stawonogów umożliwiła odkrycie kilku klas chemicznych insektycydów, które zaburzają funkcje neuronalne bezkręgowców w celu wywołania śmiertelności przy jednoczesnym ograniczeniu konsekwencji poza celem. W związku z tym możliwość pomiaru aktywności neuronalnej owadów jest bardzo interesująca dla dziedziny toksykologii i fizjologii owadów, ponieważ układ nerwowy jest tkanką docelową większości stosowanych insektycydów1. Jednak ciągły rozwój podstawowej i stosowanej wiedzy na temat układu nerwowego owadów wymaga zaawansowanych technik neurofizjologicznych, których wykonalność jest ograniczona, ponieważ obecne techniki są pracochłonne i wymagają dużych kosztów, linie komórek nerwowych owadów są ograniczone i/lub dostęp do centralnych synaps większości stawonogów jest ograniczony. Obecnie charakterystyka większości białek nerwowych owadów wymaga sklonowania celu i heterologicznej ekspresji w celu późniejszego odkrycia leku i zapisów elektrofizjologicznych, jak opisano dla kanałów potasowych prostownika wewnętrznego owadów2, receptor ryanodine owadów3, kanały K+ wrażliwe na napięcie komarów4i inne. Aby złagodzić wymóg ekspresji heterologicznej i potencjał niskiej ekspresji funkcjonalnej, Bloomquist i współpracownicy postawili sobie za cel wywołanie fenotypu neuronalnego w hodowanych komórkach Spodoptera frugiperda (Sf21) jako nowej metody odkrywania insektycydów5,6. Metody te stanowią słuszne podejście do rozwoju nowej chemii, jednak często tworzą one nieprzezwyciężalne wąskie gardło dla charakterystyki środków farmakologicznych, identyfikacji mechanizmów oporności na insektycydy i charakterystyki podstawowych zasad fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę ex vivo, która umożliwia rejestrowanie aktywności elektrycznej modelowego owada o plastycznej genetyce7,8,9 i znanych wzorców ekspresji kompleksów neuronowych10,11,12 w celu umożliwienia scharakteryzowania mechanizmów oporności na poziomie nerwu, sposobu działania nowo opracowanych leków i innych badań toksykologicznych.
Muszka owocowa, D. melanogaster, jest powszechnym organizmem modelowym do definiowania systemów nerwowych owadów lub mechanizmu działania insektycydów i została uznana za dobrze dopasowany organizm modelowy do badań toksykologicznych13, farmakologiczny14,15, neurofizjologiczny16 i patofizjologiczny17,18,19,20 procesów kręgowców. D.melanogaster jest owadem holometabolicznym, który przechodzi całkowitą metamorfozę, w tym stadium larwalne i poczwarkowe przed osiągnięciem dorosłego stadium reprodukcyjnego. W trakcie procesu rozwojowego układ nerwowy ulega znacznej przebudowie na różnych etapach życia, ale ta metodologia skupi się na larwalnym OUN. W pełni rozwinięty larwalny OUN jest anatomicznie prosty z segmentami klatki piersiowej i brzucha, które są zrośnięte i tworzą zwój brzuszny, który reprezentuje szereg powtarzających się i prawie identycznych jednostek neuromerycznych21,22. Zstępujące nerwy ruchowe wywodzą się z ogonowego końca zwojów podprzełykowych i schodzą do unerwienia mięśni ściany ciała i narządów trzewnych larw. <silna klasa="xfig">Rysunek 1 opisuje ogólną anatomię ośrodkowego układu nerwowego larw Drosophila.
Bariera krew-mózg Drosophila (BBB) rozwija się pod koniec embriogenezy i jest tworzona przez podkrążeniowe komórki glejowe (SPG)21. Komórki SPG tworzą liczne procesy podobne do filopodiów, które rozprzestrzeniają się, tworząc ciągły, bardzo płaski, przypominający śródbłonek arkusz, który pokrywa cały Drosophila CNS23. Skala Drosophila BBB ma podobieństwa do kręgowców BBB, co obejmuje zachowanie homeostazy mikrośrodowiska nerwowego poprzez kontrolowanie wchodzenia składników odżywczych i ksenobiotyków do CNS21. Jest to warunek wstępny niezawodnej transmisji i funkcji neuronalnej, jednak ochrona OUN przez barierę krew-mózg ogranicza przenikanie leków syntetycznych, większości peptydów i innych ksenobiotyków24,25, co wprowadza potencjalne problemy przy charakteryzowaniu potencji modulatorów małocząsteczkowych. Metoda wykorzystuje prostą transsekcję w celu przerwania tej bariery i zapewnienia łatwego dostępu farmakologicznego do centralnych synaps. 
Największą zaletą opisywanej metodyki jest prostota, powtarzalność i stosunkowo wysoka przepustowość charakterystyczna dla tego systemu. Protokół jest stosunkowo łatwy do opanowania, konfiguracja zajmuje niewiele miejsca i wymagany jest tylko początkowy wkład finansowy, który sprowadza się do odczynników i materiałów eksploatacyjnych. Co więcej, opisana metoda jest całkowicie modyfikowalna, aby rejestrować centralną aktywność nerwu zstępującego muchy domowej, Musca domestica26.

<table><tbody><tr><td>Drosophila melanogaster (szczep OR)</td><td>Centrum magazynowe Bloomington Drosophila</td><td>2376</td><td></td></tr><tr><td>Stół do tłumienia drgań</td><td>Kinetic Systems</td><td>serii</td><td></td>9200</tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Kinetic Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny na wysięgniku</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>Można używać wielu lunet; stojak na wysięgniku ma kluczowe</td></tr><tr><td>znaczenie AC/ Wzmacniacz różnicowy DC</td><td>ADInstruments</td><td>AM3000H</td><td>Model 1700 może być używany zamiast monitora audio model 3000</td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>AM3300</td><td></td></tr><tr><td>Hum Bug Noise Eliminator</td><td>A-M Systems</td><td>726300</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System (PowerLab)</td><td>ADInstruments</td><td>PL3504</td><td>Można używać wielu modeli PowerLab.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Lab Chart Pro</td><td>ADInstruments</td><td>N/A - Pobierz</td><td></td>online</tr><tr><td>Lampy światłowodowe</td><td>Edmund Optics</td><td>89-740</td><td>Można stosować różne źródła światła, ale światłowody są najbardziej elastyczne</td></tr><tr>Świat<td>mikromanipulatorów</td><td>Precyzyjne instrumenty</td><td>M325</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt mikroelektrody</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH715</td><td>Dopuszczalne są różne modele</td></tr><tr><td>BNC</td><td>World Precision Instruments</td><td>wielokrotne w zależności od rozmiaru</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>szklane World Precision Instruments</td><td>PG52151-4</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Może również używać Narashige PC-100</td></tr><tr><td>Black Wax</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>974228</td><td></td></tr><tr><td>Niepowlekane szpilki do owadów, rozmiar #2</td><td>Bioquip</td><td>1208S2</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Fince</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

Większość obecnie dostępnych środków owadobójczych celuje w układ nerwowy, a mutacje genetyczne białek nerwowych bezkręgowców często powodują szkodliwe konsekwencje, jednak obecne metody rejestrowania aktywności układu nerwowego poszczególnych zwierząt są kosztowne i pracochłonne. Ten preparat elektrody ssącej ośrodkowego układu nerwowego larw trzeciego stadium rozwojowego Drosophila melanogaster jest elastycznym systemem do badania fizjologicznych skutków czynników neuroaktywnych, określania fizjologicznej roli różnych ścieżek nerwowych do aktywności OUN, a także wpływu mutacji genetycznych na funkcjonowanie neuronów. Ten preparat ex vivo wymaga jedynie umiarkowanych umiejętności preparacyjnych i wiedzy elektrofizjologicznej, aby wygenerować powtarzalne zapisy aktywności neuronalnej owadów. Szeroka gama modulatorów chemicznych, w tym peptydy, może być następnie stosowana bezpośrednio do układu nerwowego w roztworze z solą fizjologiczną w celu zmierzenia wpływu na aktywność OUN. Co więcej, technologie genetyczne, takie jak system GAL4/UAS, mogą być stosowane niezależnie lub w połączeniu ze środkami farmakologicznymi w celu określenia roli określonych kanałów jonowych, transporterów lub receptorów w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego stawonogów. W tym kontekście opisane w niniejszym dokumencie testy są bardzo interesujące dla toksykologów insektycydów, fizjologów owadów i biologów rozwojowych, dla których D. melanogaster jest uznanym organizmem modelowym. Celem tego protokołu jest opisanie metody elektrofizjologicznej umożliwiającej pomiar elektrogenezy ośrodkowego układu nerwowego u modelowego owada Drosophila melanogaster, która jest przydatna do testowania różnorodnych hipotez naukowych.

Spontaniczną aktywność zstępujących nerwów obwodowych wywodzących się z ośrodkowego układu nerwowego Drosophila można rejestrować za pomocą przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych z powtarzalną precyzją. Spontaniczna aktywność wyciętego i przeciętego OUN Drosophila generuje cykliczny wzorzec serii impulsów, w którym 1-2 s wyładowań przeplata się z około 1 s stanu niemal całkowitego wyciszenia. Na przykład OUN pozostaje w stanie niemal całkowitego wyciszenia (1-2 Hz) ...

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii i fizjologii owadów poprzez pomiar elektrogenezy ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster. Pozwala to na testowanie szerokiego zakresu hipotez naukowych i pomoc w odkrywaniu nowych sposobów działania insektycydów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prosty, powtarzalny i stosunkowo wysokowydajny system przy minimalnym wkładzie finansowym do badania układu nerwowego Drosophila.Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie do akwizycji/analizy. Kliknij przycisk Setup (Konfiguracja) na głównym pasku narzędzi i wybierz opcję Channel Settings (Ustawienia kanału), co spowoduje otwarcie okna dialogowego. Zmniejsz łączną liczbę kanałów do trzech.Kanał pierwszy zarejestruje surowy sygnał ze wzmacniacza w zakresie 100 miliwoltów. Kanał drugi będzie używany do zliczania zdarzeń z kanału pierwszego, które przekraczają dany próg. W tym celu kliknij zakładkę Obliczenia, aby otworzyć menu rozwijane dla kanału drugiego.Wybierz opcję Pomiary cykliczne, co spowoduje otwarcie drugiego okna dialogowego. Wybierz kanał pierwszy jako źródło. Następnie z menu rozwijanego pomiar wybierz opcję Unit Spike at Events (Skok jednostki w zdarzeniach).Na koniec w obszarze ustawień wykrywania z menu rozwijanego wybierz opcję Prosty próg. Poziom progowy jest wprowadzany w oknie regulacji wykrywania, który należy ustawić powyżej szumu tła. Aby przeliczyć aktywność elektryczną na wykres szybkości wyrażony w hercach, wybierz Arytmetyka na trzecim kanale.W nowym oknie wprowadź 1000 razy smoothsec, nawiasy kanał dwa przecinek dwa. Następnie wybierz z menu rozwijanego jednostki częstotliwości herc. Zamknij okna dialogowe, aby powrócić do ekranu głównego.Oś y kanału trzeciego powinna być wyrażona w hercach, a oś x w czasie. Wypreparuj ośrodkowy układ nerwowy larwy Drosophila, najpierw identyfikując i ekstrahując wędrującego Drosophila melanogaster w trzecim stadium z fiolki hodowlanej i umieszczając go w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej. Następnie chwyć haczyki do ust parą cienkich kleszczy i chwyć brzuch robaka drugą parą kleszczy, z lekkim naciskiem, aby uniknąć rozdarcia cienkiej warstwy kutykularnej.Delikatnie pociągnij haczyki do ust i brzuch w różnych kierunkach, aby oddzielić ogonowy koniec robaka od obszaru głowy i odsłonić wnętrzności robaka. Ośrodkowy układ nerwowy będzie spleciony z tchawicą i przewodem pokarmowym. Usuń OUN z przewodu pokarmowego i tchawicy za pomocą kleszczy.Wydzielenie ośrodkowego układu nerwowego Drosophila z robaka jest kluczowym krokiem do sukcesu. Wypreparowane zwoje nerwowe muszą być nienaruszone, bez znaczącego uszkodzenia zstępujących nerwów ruchowych. Większa liczba nerwów ruchowych przyczepionych do zwojów zwiększy podstawowe częstotliwości odpalania.W razie potrzeby przerwij barierę krew-mózg poprzez ręczną transekcję OUN za płatami mózgowymi za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas. Przekrój powinien być wykonany w oparciu o właściwości fizykochemiczne stosowanej substancji chemicznej. Czerwona linia to sugerowany punkt przecięcia i przecięty OUN z nienaruszonymi zstępującymi pniami nerwów obwodowych pokazanymi tutaj.Aby rozpocząć, najpierw wyciągnij szklaną elektrodę pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego do rezystancji od pięciu do 15 megaomów. Włóż przecięty OUN do komory woskowej zawierającej 200 mikrolitrów soli fizjologicznej. Zaciśnij niepowlekaną szpilkę przeciw owadom z zaciskiem krokodylkowym przylutowanym do przewodu uziemiającego i włóż szpilkę do soli fizjologicznej, aby zakończyć obwód.Za pomocą mikromanipulatorów skieruj elektrodę na ogonowy koniec przeciętego OUN. Wyeliminuj szum tła, dostosowując poziom progowy w oprogramowaniu do akwizycji/analizy przed podłączeniem obwodowych pni nerwowych. Zastosować lekkie podciśnienie na strzykawce, aby wciągnąć nerwy obwodowe do elektrody ssącej.Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu do akwizycji danych i ustaw podstawową szybkość wypalania, aby zrównoważyć się przez pięć minut przed zebraniem danych o podstawowej szybkości wypalania. Po pięciu minutach dodaj 200 mikrolitrów soli fizjologicznej i pojazdu, aby całkowita objętość komory wynosiła 400 mikrolitrów, aby rozpocząć rejestrowanie kontrolnej szybkości wypalania. Odrzucić przygotowanie i zapis, jeśli schemat odpalania środka kontrolnego nie jest podobny do pokazanego tutaj przykładu.Gdy linia podstawowa zostanie ustalona po trzech do pięciu minutach rejestracji, pobrać 200 mikrolitrów soli fizjologicznej i dodać 200 mikrolitrów środka doświadczalnego rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej. Oznacz ten punkt czasowy aplikacji leku w oprogramowaniu do akwizycji/analizy, dołączając komentarz zawierający lek i końcowe stężenie. Pokazany tutaj jest reprezentatywny ślad wydzieliny nerwowej przed i po ekspozycji na DMSO.Strzałka wskazuje czas aplikacji. Obserwuje się ograniczoną odpowiedź na DMSO. Zwiększanie dawek propoksuru wzmacniało częstotliwość wyładowań skokowych w przeciętym ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila w sposób zależny od stężenia, podczas gdy neurodepresyjny GABA zmniejszał częstotliwość wyładowań kolców w sposób zależny od stężenia.Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jest to eksperyment ex vivo, a zatem warunki soli fizjologicznej, takie jak pH i temperatura, mają kluczowe znaczenie dla przedłużonej aktywności preparatu ośrodkowego układu nerwowego. Podobnie, brak zewnętrznej aktywności elektrycznej, skuteczna klatka Faradaya i redukcja szumów 60-hercowych mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tego testu. Dane zebrane za pomocą tego testu mogą pomóc w określeniu konkretnego sposobu działania insektycydów.Można następnie przeprowadzić walidację tych danych za pomocą innych metod, takich jak elektrofizjologia cęgów napięciowych, analizy biochemiczne i dodatkowe testy farmakologiczne.

electrophysiological-recording-central-nervous-system-activity-third

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

System Gigantycznych Włókien jest prostym obwodem neuronalnym u dorosłych Drosophila melanogaster, zawierającym największe neurony w organizmie muchy. Opisujemy protokół monitorowania przekaźnictwa synaptycznego w tej ścieżce poprzez rejestrację potencjałów postsynaptycznych w mięśniach grzbietowych podłużnych (DLM) i tergotrochanteralnych (TTM) po bezpośredniej stymulacji interneuronów Gigantycznych Włókien.

Rejestracje elektrofizjologiczne z drogi włókna olbrzymiego D. melanogaster

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Poznaj elektrofizjologiczną metodę rejestracji aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium larwalnym. Technika umożliwia badanie toksykologii owadów i odkrywanie nowych mechanizmów działania insektycydów.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Przeglądaj więcej filmów